Relación del perfil de ácidos grasos del cachalote (Physeter macrocephalus) y el calamar gigante (Dosidicus gigas) en el Golfo de California

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RELACIÓN DEL PERFIL DE ÁCIDOS GRASOS DEL CACHALOTE (Physeter macrocephalus) Y EL CALAMAR GIGANTE (Dosidicus

gigas) EN EL GOLFO DE CALIFORNIA

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS

CON ESPECIALIDAD EN

MANEJO DE RECURSOS MARINOS

PRESENTA:

BIOL. MAR. MELISA CRUZ VIZCAÍNO

Noviembre del 2005. LA PAZ, B.C.S., MÉXICO

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS

DEPARTAMENTO DE PESQUERÍAS Y BIOLOGÍA MARINA

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ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE DE TABLAS………... II ÍNDICE DE FIGURAS……… II ÍNDICE DE ANEXOS Y APÉNDICES…….. ………. IV GLOSARIO ………... V RESUMEN………... VI ABSTRACT………... VII

I. INTRODUCCIÓN……… 1

II. ANTECEDENTES………... 5

III. JUSTIFICACIÓN ……… 8

IV. OBJETIVOS……….… 9

V. ÁREA DE ESTUDIO ……….. 10

VI. MATERIALES Y MÉTODOS VI.1 Trabajo de campo ………. 13

VI.2 Trabajo de laboratorio………... 14

VI.3 Tratamiento estadístico de los datos ……….……… 18

VII. RESULTADOS VII.1 Cachalote VII.1.2 Cachalote varado ……… 20

VII.1.3 Biopsias ……… 29

VII.1.4 Biopsias vs. varado ……… 35

VII.2 Calamar VII.2.1 Músculo mandíbula ………... 35

VII.2.2 Músculo mandíbula vs. manto ……… 37

VII.3 Relación trófica depredador-presa VII.3.1 Cachalotes hembras y jóvenes vs. músculo de la mandíbula de calamar ……….. 39

VII.3.2 Cachalotes hembras y jóvenes vs. manto de calamar ……… 42

VII.3.3 Cachalotes Machos vs. Calamar ………. 43

VII.3.4 Cachalote varado vs. calamar ………. 44

VIII. DISCUSIÓN ……… 46

IX. CONCLUSIONES……… 57

X. RECOMENDACIONES Y ESTUDIOS A FUTURO ………..………. 58

XI. LITERATURA CITADA……….. 59

XII. ANEXOS ……….. 66

XIII. APÉNDICES ………... 68

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I Ácidos grasos cuantificados en los estratos externo e interno de la región cefálica, media y

caudal del cachalote varado 22

Tabla II Ácidos grasos cuantificados en biopsias de la aleta caudal de cachalotes hembras y jóvenes y en machos adultos en dos temporadas. Letras diferentes significan diferencias entre temporadas de las hembras y jóvenes.

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Tabla III Ácidos grasos cuantificados en músculo de la mandíbula de calamar gigante de diferentes

tallas. Letras diferentes significan grupos diferentes 36

Tabla IV Ácidos grasos cuantificados en músculo de la mandíbula y manto de calamar gigante de

diferentes tallas 39

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1 Área de estudio. Los puntos indican donde se tomaron las biopsias de cachalote 11 Figura 1.2 El Mogote, la marca indica el área donde fue encontrado el cachalote varado 12 Figura 2 Micrografía de corte histológico del cachalote varado. Tinción Hematoxilina-eosina. 40 X.

Región: a) Cefálica b) Media y c) Caudal 20

Figura 3 Micrografía de corte histológico de la región cefálica del cachalote varado. Fosfolípidos ( ), triglicéridos ( ). Tinción Sudán Negro. 10 X

21

Figura 4 Porcentaje de ácidos grasos cuantificados en los estratos externo e interno de la región

cefálica del cachalote varado 24

Figura 5 Porcentaje de ácidos grasos cuantificados en estrato externo e interno de la región media del cachalote varado

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Figura 6 Porcentaje de ácidos grasos cuantificados en estrato externo e interno de la región caudal de un cachalote varado

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Figura 7 Análisis de Componentes Principales de los ácidos grasos cuantificados en todas las regiones y estratos del cuerpo del cachalote varado. 1)R. cefálica, estrato externo 2)R.

cefálica, estrato interno 3)R. Media, estrato externo 4)R. Media, estrato interno 5)R.

caudal, estrato externo y 6)R. caudal, estrato interno

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Figura 8 Análisis de Función Discriminante de los ácidos grasos cuantificados en biopsias de la aleta caudal de cachalotes hembras y jóvenes. Los círculos indican la separación de las muestras por temporada cálida y fría

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Figura 9 Perfil de ácidos grasos cuantificados en biopsias de cachalotes machos adultos en

temporadas fría y cálida 31

Figura 10 Análisis de Componentes Principales de los ácidos grasos cuantificados en biopsias de la aleta caudal de cachalotes hembras y jóvenes y de machos adultos en dos temporadas. Los círculos punteados indican la separación de las muestras por temporada.

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Figura 11 Clasificación de las muestras de las tres regiones del cuerpo y estratos obtenidas del cachalote varado vs. las biopsias de cachalotes de vida libre de acuerdo a la similitud de sus ácidos grasos. Las líneas puenteadas representan el nivel de corte para delimitar los grupos.

35

Figura 12 Análisis de componentes principales con los ácidos grasos cuantificados en las

diferentes tallas de calamar. 37

Figura 13 Análisis de componentes principales con los ácidos grasos cuantificados en músculo de la mandíbula y manto de calamar de diferentes tallas. Los círculos punteados indican diferentes grupos.

39

Figura 14 Análisis de Función Discriminante de los ácidos grasos cuantificados en músculo de la mandíbula de diferentes tallas de calamar y cachalotes de dos temporadas. Los círculos punteados indican grupos diferentes.

41

Figura 15 Análisis de componentes principales de los ácidos grasos cuantificados en músculo de la mandíbula y manto de calamar de diferentes tallas y de cachalote de dos temporadas Los círculos punteados indican grupos diferentes.

42

Figura 16 Análisis de componentes principales de los ácidos grasos cuantificados en músculo de la mandíbula de calamar de diferentes tallas y machos cachalotes adultos. Los círculos punteados indican grupos diferentes.

43

Figura 17 Análisis de componentes principales de los ácidos grasos cuantificados en músculo de la mandíbula y manto de calamar de diferentes tallas y machos cachalotes adultos. Los círculos punteados indican grupos diferentes.

44

Figura 18 Análisis de componentes principales de los ácidos grasos cuantificados en músculo de la mandíbula y manto de calamar de diferentes tallas y estratos externo e interno de la región cefálica, media y caudal de un cachalote varado. Los círculos punteados indican grupos diferentes.

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ÍNDICE DE ANEXOS Y APÉNDICES

ANEXO A.1. Descripción de la técnica de Hematoxilina-Eosina (Humason, 1979; Sheehan y Hrapchak, 1973)

72

ANEXO A.2. Descripción de la técnica de Sudán Negro Para Grasas (Bayliss, 1984) 73

APÉNDICE A.1 Ácidos grasos identificados en el estrato externo e interno de la región cefálica, media

y caudal de un cachalote varado 78

APÉNDICE A.2 Ácidos grasos encontrados en biopsias de la aleta caudal de cachalotes hembras y jóvenes de dos temporadas del 2002

75

APÉNDICE A.3 Ácidos grasos encontrados en biopsias de la aleta caudal de machos adultos de dos temporadas del 2002

76

APÉNDICE B.1 Ácidos grasos encontrados en biopsias de músculo de la mandíbula de calamar de

diferentes tallas 82

APÉNDICE B.2 Ácidos grasos encontrados en biopsias de músculo de la mandíbula y manto de

calamar de diferentes tallas 83

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GLOSARIO

Ácido graso: Es un ácido orgánico formado por una cadena de átomos de carbono de longitud variable que tiene en un extremo un radical carboxilo, lo que le confiere el carácter de ácido orgánico.

Ácido graso de cadena corta: Es aquel ácido graso que tiene una cadena con 4 a 6 átomos de carbono.

Ácido graso de cadena larga: Es aquel ácido graso que tiene una cadena con 12 ó más átomos de carbono.

Ácido graso esencial: Es aquel ácido graso que no puede ser sintetizado por los mamíferos y solo puede ser obtenido de su dieta. En organismos marinos se les considera también esenciales a aquellos ácidos grasos con una tasa de síntesis muy baja.

Dimorfismo sexual: Diferencias fenotípicas evidentes entre los sexos de una misma especie.

Fosfolípido: lípido estructural fosforilado formado por un glicerol al que se le unen dos ácidos grasos y un grupo fosfato.

Lípidos de reserva: Son la principal reserva energética del organismo. Un gramo de grasa produce 94 kilocalorías en las reacciones metabólicas de oxidación, mientras que proteínas y glúcidos sólo producen 41 kilocaloría/gr.

Lípidos estructurales: Forman las bicapas lipídicas de las membranas. Recubren órganos y le dan consistencia, o protegen mecánicamente como el tejido adiposo de pies y manos.

Monoinsaturado: Ácido graso que posee una doble ligadura.

Poliinsaturado: Ácido graso que posee más de una doble ligadura.

Saturado: Ácido graso donde los átomos de carbono están unidos por enlaces sencillos.

Triglicérido: Lípido de reserva formado por tres cadenas de ácidos grasos unidas por medio del grupo carboxilo al oxhidrilo (OH) de un glicerol.

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RESUMEN

El perfil de ácidos grasos (AG) ha sido utilizado para determinar relaciones depredador-presa en lípidos de reserva y para separar stocks utilizando lípidos estructurales. El objetivo general de este estudio fue determinar si el perfil de AG del calamar gigante Dosidicus gigas se reflejaba directamente en la grasa de su depredador el cachalote Physeter macrocephalus. Se utilizaron biopsias de la aleta caudal de cachalote hembras y jóvenes (n= 10) y de machos adultos (n= 2) así como de músculo de la mandíbula y el manto del calamar de diferentes tallas (n=26) colectados en 2002. Asimismo se utilizaron cortes histológicos de un cachalote varado para determinar la estratificación del tejido y la proporción de fosfolípidos y triglicéridos según la técnica histoquímica de Sudán negro y análisis de imágenes. Los lípidos totales se extrajeron mediante la técnica de Blingh and Dyer (1959), se metilesterificaron de acuerdo con Sato y Murata (1988) y se inyectaron en un cromatógrafo de gases (GC-MS). Para la región cefálica, media y caudal se encontraron dos estratos verticales, las dos primeras regiones presentaron 75.1 y 76.6% de triglicéridos (lípidos de reserva) y la región caudal 78.6% de fosfolípidos (lípidos estructurales). Los perfiles de AG en biopsias de la aleta caudal de los cachalotes formaron dos grupos que correspondieron a biopsias tomadas en la temporada cálida y fría. Los AG que generaron la separación fueron los monoinsaturados 16:1n9, 16:1n7, 20:1 n11, 20:1n9 y 22:1 n11 (P<0.05). La idea de la existencia de al menos dos sub- poblaciones de cachalotes en el Golfo de California coincide con los altos números de recapturas entre cachalotes foto-identificados entre la misma temporada de diferentes años en contraste con bajas foto-recapturas entre temporadas del mismo año. Se encontraron diferencias entre las hembras y jóvenes y los machos adultos de cachalote, lo que podría reflejar diferencias en las condiciones ecológicas en las que viven ambos sexos. Los calamares no presentaron diferencias por tallas ni temporada donde los perfiles de AG no se reflejaron directamente en ninguna de las regiones y estratos del cachalote, lo que sugiere que incluso la región media que presenta más triglicéridos sufre modificaciones metabólicas. En contraste nuestros resultados sugieren que el perfil de AG en biopsias de la aleta caudal, la cual posee más AG estructurales, puede ser utilizado como una herramienta para identificar sub-poblaciones de cachalotes.

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ABSTRACT

Fatty acids (FA) profile analysis in reserve lipids has been used to determine prey-predator relationships and for the separation of fish and cetaceans stocks using structural lipids. The main objective of this study was to determine if the FA profile permits to relation the sperm whale with its main prey the jumbo squid Dosidicus gigas. We use fluke biopsies of females and immature (n=10) and adult males (n=2) sperm whale we used too muscle from the mandible and mantle from its prey the jumbo squid of different sizes (n=26) collected during the two seasons of the 2002 in the Gulf of California. We also utilize histological slides of one stranded whale were used to determine the phospholipids and triglycerides proportion using black Sudán technique and image analysis. We extract the total lipids using the Blingh and Dyer technique (1959) and they were metilesterificated according with Sato and Murata 1988), and then were injected in a gas chromatographer (GC-MS).

For the cephalic, middle and caudal regions we found two vertical layers, the first two regions presented more triglycerides or reserve lipids and the caudal region more phospholipids or structural lipids. The FA profiles in fluke biopsies of the sperm whales formed 2 groups corresponding to the warm and cold season. The monounsaturated FA that produced the separation were 16:1n9, 16:1n7, 20:1n11, 20:1n9 y 22:1n11 (P<0.05). The idea of the existence of at least two groups of sperm whales in the Gulf matches with the high numbers of photo-recapture, among the sperm whales photo identified between the same season of different years in contrast with low photo-recaptures between seasons of the same year. We found differences between the females and inmature and the adult males of sperm whale, which reflects the ecological differences between the sexes. The squids didn’t present differences among FA tissues, sizes, and seasons, and neither was found a relationship with the whales, that indicates there isn’t a direct transfer of the FA from the prey to the predator, at least in the analyzed tissues. In contrast our results suggests that the FA profile in fluke biopsies, which presents more structural FA, can be used as an identification tool of groups of whales.

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Melisa Cruz-Vizcaíno Introducción

I. INTRODUCCIÓN

El cachalote (Physeter macrocephalus) es un odontoceto perteneciente a la familia Physeteridae. Es el más grande de los odontocetos, alcanza una longitud registrada máxima de 18.3 m en los machos y 12.5 m en las hembras (Rice, 1989). Este cetáceo es una especie cosmopolita que se distribuye en todos los océanos del mundo. Las hembras son gregarias y se encuentran en grupos constituidos por hembras adultas, crías y jóvenes inmaduros distribuyéndose entre los 42°N y 40°S; los machos dejan el grupo de hembras entre los 3 y 15 años de edad comenzando a tener un movimiento gradual dentro de las altas latitudes entre los 60°N y 65°S (Rice, 1989; Whitehead et al., 1991; Whitehead, 2003). Los machos maduros son solitarios (Whitehead et al., 1991;

Christensen et al., 1992) y pueden llegar a formar pequeños grupos (Best, 1974). Estos sólo regresan a los grupos de hembras durante algunas horas para aparearse (Rice, 1989; Whitehead, 2003).

La dieta del cachalote se encuentra compuesta principalmente de calamares mesopelágicos y batipelágicos que varían en tamaño, desde los pequeños como Chiroteuthidae e Histioteuthidae, hasta grandes como Architeuthidae y Ommastrephidae (Clarke et al., 1976; Okutani et al., 1976;

Clarke et al., 1988; Kawakami 1980; Rice, 1989; Santos et al., 1999; Whitehead, 2003). En ocasiones su dieta abarca una gran variedad de presas (Whitehead, 2003) como peces, cangrejos y en raras ocasiones otros cefalópodos como pulpos (Okutani et al., 1976; Clarke, et al., 1988; Rice, 1989). Los peces son más consumidos por los machos adultos que por las hembras, lo que concuerda con las diferencias en su distribución, ya que los machos se encuentran más cercanos a las aguas poco profundas y bucean hasta el fondo (Whitehead, 2003). Sin embargo se ha encontrado que la dieta de ésta especie varía dependiendo la localidad alimentándose aparentemente de la especie de calamar que sea más abundante en la zona donde se encuentre (Okutani, et al., 1976 Clarke, 1983, 1986, 1996) sin embargo, en algunas zonas el cachalote parece alimentarse principalmente de una presa específica, como en la región del Pacífico Sudeste, donde el calamar gigante (Dosidicus gigas) es muy abundante, es objeto de pesquerías comerciales y parece ser la presa principal del cachalote (Clarke et al., 1988; Clarke y Paliza, 2000).

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En el Golfo de California se tienen reportes de varamientos de cachalotes (Vidal y Findley, 1984; Vidal et al., 1993) que han confirmado su presencia en esta área. Actualmente se sabe que existe una alta abundancia de cachalotes (Jaquet y Gendron, 2002) los cuales se han registrado durante todo el año en la parte central del golfo (Gendron, 2000). También se ha encontrado una alta proporción de crías y machos adultos lo que sugiere al Golfo de California como zona de reproducción y alimentación (Jaquet et al., 2003). Sin embargo se desconoce si estos pertenecen a una misma población y si las mismas agregaciones permanecen todo el año en el golfo. Al parecer, los cachalotes que se observan durante la temporada cálida son diferentes a los que se observan en la temporada fría, ya que se ha observado que existen bajas recapturas entre temporadas de un mismo año y un alto número de recapturas entre cachalotes entre la misma temporada de diferentes años a pesar del esfuerzo de búsqueda realizado en ambas temporadas (Jaquet y Gendron, datos no-publicados) lo que sugiere que 2 sub-poblaciones de cachalotes pueden utilizar el Golfo de California durante diferentes temporadas o que existe una segregación temporal o espacial de los cachalotes en el Golfo de California.

El calamar gigante es una especie abundante que soporta grandes pesquerías en el Golfo de California (Hernández-Herrera y Morales-Bojórquez, 1998; Morales-Bojórquez et al., 2001) y al parecer se encuentra presente durante todo el año (Gilly, comm. pers.) debido a esto y al comportamiento oportunista del cachalote es factible que éste sea una presa importante en su dieta.

La asociación espacial de cachalotes con las áreas de abundancia establecidas del calamar gigante (Jaquet y Gendron 2002; Jaquet et al., 2003) fortalece esta idea. Además, el análisis de contenido estomacal de un cachalote varado en esta zona confirmó la presencia de picos de calamar gigante (Ruiz-Castro, 2002). Recientemente, mediante isótopos estables se encontró un nivel de enriquecimiento en δ¹³C y δ¹⁵N en la piel descamada de cachalote (1.1‰ y 2.7‰ respectivamente) consistente con una dieta de calamar gigante de tallas grandes (38-84 cm de longitud de manto) (Ruiz-Cooley, et al., 2004). Aunado a esto, se encontró muy poca variación entre los valores de δ¹³C y δ¹⁵N en la piel de hembras y jóvenes de cachalote lo que sugiere un número pequeño de tipos presa de diferentes niveles tróficos (δ¹⁵N) con un rango espacial restringido (δ¹³C) (Ruiz- Cooley et al, 2004), lo que fortalece la idea de que el cachalote en el Golfo de California se alimenta principalmente de calamar gigante.

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Los estudios ecológicos basados en isótopos estables sin embargo, presentan limitaciones en cuanto a la interpretación de resultados, debido a que no se conoce el tiempo de recambio del tejido analizado y a que los isótopos reflejan el nivel trófico pero no especifica a presas particulares.

Así, la alimentación de diferentes presas del mismo nivel trófico no podrá ser diferenciada mediante esta técnica. Además, a pesar de que se han realizado estudios con isótopos estables de carbono y nitrógeno en varias especies, existen dudas sobre la validez de la interpretación de los resultados, por lo que las aproximaciones con este tipo de resultados deben de ser acompañados de múltiples marcadores como ácidos grasos, aminoácidos y otros compuestos orgánicos persistentes (Gannes et al., 1997).

El análisis del perfil de ácidos grasos es una técnica que ha sido utilizada como una herramienta para indicar aspectos de la dieta principalmente en mamíferos marinos (Iverson et al., 1997a; Dahl et al., 2000; Bradshaw et al., 2003), sin embargo una serie de estudios no han encontrado tal relación (Grahl-Nielsen y Mjaavatten, 1991; Grahl-Nielsen et al., 2000; Olsen y Grahl- Nielsen, 2003; Grahl-Nielsen et al., 2003; Grahl-Nielsen et al., 2004). Por otra parte, esta técnica ha sido útil para identificar stocks de peces como Gadus morhua (Joensen, et. al., 2000) y Sebastes mentalla (Joensen y Grahl-Nielsen, 2004 en: Grahl-Nielsen, 2004), pinnípedos como la foca de Groenlandia (Phoca groenlandica) (Grahl-Nielsen, et al., 1993 en: Grahl-Nielsen, 2004) y cetáceos como la ballena minke (Balaenoptera acutorostrata) (Olsen y Grahl-Nielsen, 2003).

La controversia existente entre utilizar o no el perfil de ácidos grasos como indicador de la dieta se debe, en parte, a que existen factores que pueden confundir la interpretación de la información obtenida mediante este análisis, tal como el desconocimiento de la dieta del depredador, por lo que se tendrían que analizar una gran cantidad de presas potenciales y sería difícil relacionarlo con alguna de ellas. Otro factor importante es la falta de consideración de los distintos estratos de la grasa, o la falta de conocimiento sobre las clases de lípidos de las muestras analizadas, entre otros.

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El presente estudio tiene buenos índices sobre la dieta del depredador, por lo que se planteó complementar este conocimiento con un análisis de los perfiles de ácidos grasos. En una primera fase, se definió la estratificación del tejido hipodérmico y la clase de lípidos provenientes de tejidos de diferentes regiones de un cachalote varado. Esto permitió validar el tipo de información que puede proporcionar el uso de biopsias de la aleta caudal de cachalote de vida libre y definir si dichas biopsias muestran un perfil de ácidos grasos relacionados con su presa el calamar gigante. Esta relación como se verá a continuación, no fue tan clara como se esperaba, no obstante, se encontró que el perfil de ácidos grasos obtenido de las biopsias de la aleta caudal del cachalote resulta útil primeramente para separar hembras y jóvenes de machos adultos, así como para identificar sub- poblaciones de cachalotes que visitan el Golfo de California.

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Melisa Cruz-Vizcaíno Objetivos

II. ANTECEDENTES

Los estudios de hábitos alimenticios en mamíferos marinos se encuentran basados principalmente en las técnicas de contenido estomacal y de heces, debido a la dificultad de utilizar otros métodos en organismos de vida libre como observaciones in situ, experimentos en laboratorio, entre otros. Los estudios realizados mediante el contenido estomacal contribuyen con información valiosa, sin embargo sólo se conoce sobre las presas que consumieron recientemente (Iverson et al., 1997a; Santos et al., 1999). Por lo regular, en el contenido estomacal del cachalote se encuentran principalmente gran número de picos de cefalópodos, debido a que estas estructuras son muy difíciles de digerir y tienden a quedar atrapados en los dobleces del revestimiento del estómago (Clarke et al., 1976; Santos et al., 1999). Por su parte, los peces que también llegan a constituir la dieta de este odontoceto, a pesar de que su carne es digerida más lentamente que la de los cefalópodos (Bigg y Fawcett, 1985), sus restos óseos y otolitos se digieren casi completamente, lo que hace casi imposible su identificación, mientras que los picos de cefalópodos raramente son digeridos (Pierce et al., 1993; Tollit et al., 1997). Debido a esto, la importancia de los cefalópodos en la dieta de los cachalotes puede ser sobreestimada (Santos et al., 1999). Por otro lado, los calamares de tallas pequeñas y/o los de consistencia gelatinosa (p. ej. Histioteuthidae) son digeridos más rápidamente que los de tallas grandes y/o los que presentan forma más musculosa (p. ej.

Ommastrephidae), por lo que estos últimos pueden ser sobreestimados en aquellos organismos que son examinados varias horas después de su muerte (Smith y Whitehead, 2001).

Este método también presenta sesgos debido a que se han encontrado restos de organismos, los cuales no fueron ingeridos directamente por el depredador estudiado sino por la presa de este, p.ej., se han encontrado picos de calamar que no fueron consumidos por el cachalote sino por un calamar más grande, el cual a su vez fue la presa del cetáceo (Walker, 1981; Santos et al., 1999; Smith y Whitehead, 2001).

El análisis de las heces es otra técnica que puede llegar a subestimar la abundancia de los calamares grandes en la dieta de este odontoceto, ya que al momento de tomar las muestras los picos más grandes de cefalópodos se hunden rápidamente y no pueden ser recolectados (Smith y Whitehead, 2000; Whitehead, 2003). Por otro lado, los picos muy pequeños encontrados en las

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heces pueden ser como ya se mencionó presas de la presa y, por el contrario, los picos muy grandes se ha observado que pueden ser regurgitados y por tanto no encontrarse al momento de colectar las heces (Smith y Whitehead, 2000).

El análisis del perfil de ácidos grasos es una técnica que surgió como una alternativa para determinar relaciones depredador-presa bajo el supuesto de que el perfil de ácidos grasos del tejido de la presa se reflejan en el tejido del depredador con mínimas modificaciones (Iverson et al., 1997a). Algunos autores han encontrado éste tipo de relación argumentando que se cumple este supuesto, además de que algunas proporciones de los ácidos grasos esenciales 18:2 n6 y 18:3 n3 y de otros ácidos grasos que no son esenciales pero que presentan una tasa de síntesis muy baja principalmente en organismos marinos como el EPA, DHA y ARA se conservan en el paso de un nivel trófico a otro por lo que es posible utilizarlos como trazadores trficos (Graeve et al., 1994;

Iverson et al., 1997a; Dahl et al., 2000; Hooker et al., 2001; Bradshaw et al., 2003).

Así, se han realizado experimentos en laboratorio para verificar el potencial del perfil de ácidos grasos como biomarcadores, utilizando para ello copépodos herbívoros. Con base en estos se ha concluido que existe una clara incorporación y acumulación de los ácidos grasos de la dieta en los depósitos lipídicos de los copépodos, mostrando una evidencia del potencial de esta técnica (Graeve et al., 1994). Aunado a esto, Iverson et al. (1997a) determinaron que, a través de los ácidos grasos de la leche de hembras de lobos antárticos (Arctocephalus gazella) se pueden indicar los cambios en la alimentación a lo largo del periodo de lactancia. Así, concluyeron que estos cambios son consistentes con estudios de alimentación de esta especie mediante análisis de heces, indicando el valor potencial de los ácidos grasos en organismos de vida libre. Hooker et al. (2001) encontraron que los ácidos grasos de los zífidos nariz de botella (Hyperoodon ampullatus) presentaron características similares a las de los calamares adultos de Gonatus spp., género que se encontró como presa principal en el análisis de contenido estomacal, sin embargo el número de muestra de calamar fue pequeño (n=3) y de estos solo 2 se relacionaron con el depredador, por lo que se debe tomar con cautela estos resultados.

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Algunos estudios ecológicos en pinnípedos han utilizado esta técnica para distinguir cambios en la dieta a nivel estacional (Bradshaw, et al., 2003), interanual (Lea et al., 2002), para identificar el tamaño de las presas (Iverson et al., 2001; Best et al., 2003), así como para diferencias en el hábitat (Iverson et al., 1997b).

En el caso de cetáceos, se han encontrado diferencias en el perfil de ácidos grasos entre la ballena jorobada (Megaptera novaeangliae) y ballena de aleta (Balaenoptera physalus) que se alimentan en el Atlántico occidental, estas diferencias se atribuyeron al consumo diferencial de presas (Borobia et al., 1995). Cambios en los porcentajes del perfil de ácidos grasos permitieron a Olsen y Grahl-nielsen (2003), diferenciar dos stocks de ballenas minke del Atlántico, definidos previamente por la Comisión Internacional Ballenera (IWC). Estos mismos autores sin embargo, no encontraron diferencias en los ácidos grasos de la presa que pudiera explicar los cambios en los porcentajes de ácidos grasos de las ballenas; atribuyendo estas diferencias a cambios debido al metabolismo especifico de cada población.

Por otra parte, estudios recientes indican que existe una estratificación vertical de los ácidos grasos de reserva o triglicéridos en la capa de grasa en algunos mamíferos marinos, por lo que el desconocimiento de esta estratificación puede dificultar la interpretación de los resultados. De esta manera, Koopman et al. (1995) analizaron cuatro zonas del cuerpo de marsopa común (Phocoena phocoena) y encontraron una composición uniforme a lo largo del cuerpo, con la excepción del pedúnculo caudal, en donde se presentó una segregación evidente en dos estratos verticales de la capa de grasa. Por su parte Best et al. (2003) encontraron que el elefante marino (Mirounga leonina) presenta dos estratos de grasa diferenciados entre si por las proporciones de ácidos grasos. Grahl- Nielsen et al. (2003) encontraron una diferencia significativa en los ácidos grasos entre los dos estratos de grasa en el oso polar. Asimismo, Andersen et al. (2004) encontraron diferencias significativas en la composición de ácidos grasos en tres estratos de la capa de grasa de la foca común (Phoca vitulina). La estratificación vertical de los ácidos grasos a lo largo de la capa de grasa ha sido observado en algunos cetáceos como en la ballena de aleta, rorcual de Sei (B. borealis) (Ackman et al., 1975), zífidos nariz de botella (Hooker et al., 2001), ballena minke (Olsen y Grahl- Nielsen, 2003). Sin embargo, algunas de estas divisiones se realizaron meramente dividiendo el

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tejido en partes iguales, por lo que podrían quedar dos estratos juntos y enmascarar los resultados obtenidos.

Otros estudios sin embargo, no han encontrado ningún tipo de relación trófica utilizando ésta técnica, argumentando que los ácidos grasos provenientes de la presa experimentan transformaciones en el proceso de la digestión, asimilación, e incorporación al tejido del depredador, lo que impide un paso directo de los ácidos grasos de un nivel trófico a otro (Grahl-Nielsen y Mjaavatten, 1991; Grahl-Nielsen et al., 2000; Olsen y Grahl-Nielsen, 2003; Grahl-Nielsen et al.,2003;

Grahl-Nielsen, 2004). Así, Grahl-Nielsen et al. (2003) al comparar los perfiles del tejido adiposo del oso polar (Ursus maritimus) y sus presas, concluyen que estos tienen una composición de ácidos grasos única que no es producto de la mezcla de las presas que consume, sino que es resultado de los procesos selectivos antes y durante la depositación de los lípidos en el tejido. Andersen et al.

(2004) compararon los ácidos grasos de la foca común y sus presas principales, sin encontrar una relación clara entre estos, sugiriendo que existen procesos selectivos sistemáticos en la incorporación de los ácidos grasos de la presa al tejido del depredador.

En estudios controlados tampoco se ha encontrado tal relación, como es el caso del estudio de Grahl-Nielsen y Mjaavatten (1991), quienes analizaron los ácidos grasos provenientes de la grasa de foca gris (Halichoerus grypus) y de foca común en cautiverio, a las cuales se les sometió a un cambio de alimentación de sardinas a macarelas. Ellos, encontraron que la composición en ácidos grasos de la grasa fue significativamente diferente a los ácidos grasos de las presas, determinando que el efecto de la dieta es insignificante, comparado con los efectos metabólicos que ocurren antes de que se depositen estos como grasa.

III. JUSTIFICACIÓN

En la última década, los estudios de varamiento y posteriormente de distribución permitieron inferir sobre la ecología trófica del cachalote en el Golfo de California. Actualmente, se tiene conocimiento de que este se encuentra presente todo el año y que existe una alta abundancia de crías y machos adultos lo que sugiere también al Golfo de California como zona de reproducción

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(Jaquet et al. 2003). Existe un estudio relevante (Ruiz-Cooley, et al., 2004) basado en isótopos estables de carbono y nitrógeno que indican que las hembras y jóvenes se alimentan de calamar gigante de tallas grandes. Sin embargo la variabilidad inherente de los estudios isotópicos hace preciso aproximar el problema de ecología trófica del cachalote con el uso de moléculas específicas como los biomarcadores lipídicos. En este estudio se pretende contribuir al conocimiento de la dieta de este odontoceto en el Golfo de California aplicando para este propósito el análisis del perfil de ácidos grasos, donde una posible correlación podría confirmar al calamar gigante como su presa principal.

Por otro lado, es necesario conocer si diferentes regiones del cuerpo del cachalote presenta el mismo perfil de ácidos grasos, si existe una estratificación y si varía el tipo de ácidos grasos que se encuentran en él. Según los resultados será entonces posible inferir de manera más precisa sobre la información que nos provee una biopsia de la aleta caudal de cachalote de vida libre lo cual proporcionará información valiosa para trabajos futuros.

Actualmente se tiene evidencia que sugiere que en el Golfo de California existen 2 sub- poblaciones de cachalotes, sin embargo se desconoce si presentan movimientos temporales y/o espaciales, por lo que este trabajo aporta información necesaria para que, en conjunto con otros estudios ayuden a contestar esta interrogante.

IV. OBJETIVO GENERAL

El objetivo general de este estudio fue determinar si el perfil de ácidos grasos permite relacionar al cachalote con su presa el calamar gigante.

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OBJETIVOS PARTICULARES

Para la consecución del objetivo, fue necesario conducir los análisis sobre la base de los siguientes objetivos particulares:

• Conocer si existe estratificación vertical en el tejido hipodérmico en diferentes regiones del cuerpo de un cachalote varado mediante técnicas histológicas y análisis de imágenes, así como determinar su perfil de ácidos grasos y la proveniencia de los mismos

• Determinar el perfil de ácidos grasos en biopsias de aleta caudal de cachalote

• Comparar los perfiles de las hembras y jóvenes vs. los machos adultos de cachalote

• Explorar si el perfil de ácidos grasos de biopsias de la aleta caudal permite identificar sub- poblaciones de cachalotes

• Determinar la composición de ácidos grasos del calamar gigante de diferentes tallas en el músculo de la mandíbula y el manto

V. ÁREA DE ESTUDIO

El Golfo de California es una cuenca marina de forma alargada ubicada en la región noroccidental de México entre los 31°53' - 20°27' latitud norte y los 114°54' - 105°38' longitud oeste.

Presenta una orientación de noreste a sureste, estando limitada al oeste por la Península de Baja California y al este por los estados de Sonora, Sinaloa, Nayarit y Jalisco (Roden, 1964).

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Melisa Cruz-Vizcaíno Área de estudio

Según sus características morfológicas el Golfo de California puede ser dividido en dos regiones: norte y sur (Roden, 1964). La región norte es la más somera y se encuentra marcadamente separada de la región sur por la isla Ángel de la Guarda e isla Tiburón, en esta región existen cuencas someras con cordilleras de 200 a 300 m. La región sur presenta aguas profundas con algunas cuencas separadas entre ellas por cordilleras transversales. Las cuencas llegan a alcanzar más de 3000 m. La cuenca de Guaymas es la más extensa de ellas, cubriendo un área de 240 por 60 km y teniendo una profundidad máxima de casi 2,100 m. (Shepard, 1950; Roden, 1958; Rusnak et al., 1964). El área donde fueron tomadas las muestras comprendió la zona de las grandes islas y la zona sur del golfo (Fig. 1.1).

Figura 1.1 Área de estudio. Los puntos indican donde se tomaron las biopsias de cachalote.

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Melisa Cruz-Vizcaíno Área de estudio

En la región sur del Golfo de California se encuentra la Ensenada de La Paz, la cual es una laguna costera que se encuentra separada de la Bahía de La Paz por una flecha arenosa denominada El Mogote (Fig. 1.2) la cual se extiende de occidente a oriente, con una longitud promedio de 11 km y un ancho que varía entre 0.3 y 3 km. (Lankford, 1977);

Figura 1.2 El Mogote, la marca indica el área donde fue encontrado el cachalote varado

(23)

Melisa Cruz-Vizcaíno Materiales y Métodos

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

VI.1 Trabajo de campo

Se realizaron salidas dentro del Golfo de California con especial énfasis en la región sur de las grandes islas del Golfo de California mediante una lancha de 26 pies con motor diesel o una panga de 26 pies con motor fuera de borda realizando censos no sistemáticos en busca de cachalotes. Estas salidas fueron realizadas durante la temporada fría (diciembre a mayo) y cálida (junio a noviembre) del 2002.

En presencia de cachalotes, se procedió a seguirlos hasta su inmersión antes de la cual levantan la aleta caudal y se tomaron fotografías de la parte ventral de esta para identificar a cada individuo (Arnborm, 1987). Después de varias horas de seguimiento del grupo de cachalotes y con varios individuos foto-identificado se procedió a tomar biopsias, para de esta manera saber a que organismo le pertenece la biopsia. Las biopsias de piel y tejido hipodérmico de cachalote se colectaron por medio de un dardo de 3 cm de largo y 6 mm de diámetro externo el cual estaba atornillado a una flecha con un flotador para facilitar su recuperación. La flecha era disparada a la aleta caudal del animal al momento que este realizaba una inmersión mediante el uso de una ballesta. Para la temporada fría las biopsias se guardaron en papel aluminio, se colocaron dentro de viales y se congelaron a –20 ºC hasta su traslado a -80ºC en el CICIMAR. Para la temporada cálida las biopsias fueron colocadas dentro de viales con Dimetil sulfóxido (DMSO) al 20% saturada con sal de mesa (Amos y Hoelzel, 1991) y posteriormente fueron almacenadas a -80ºC en el CICIMAR.

En total se analizaron 12 biopsias de aleta caudal de cachalote, 6 de las cuales correspondieron a la temporada de fría y al área sur del golfo y 6 a la temporada de cálida y área de las grandes islas del año 2002 (Fig 1.1). Una biopsia de cada temporada correspondió a un macho adulto identificado en campo debido a las diferencias sexuales tan marcadas en esta especie y las biopsias restantes correspondieron a hembras adultas y/o jóvenes. Cabe mencionar que no existieron foto-recapturas entre los organismos muestreados entre las temporadas.

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En la temporada fría del 2002 en la región sur del Golfo de California se recolectaron organismos enteros de calamar gigante D. gigas de diferentes tallas mediante el uso de poteras. A estos se les extrajo el aparato mandibular (n=17). En la temporada cálida del 2004 se recolectaron organismos enteros de D. gigas de diferentes tallas en la región central del golfo a los cuales se les extrajo el aparato mandibular (n=7) y una muestra de músculo del manto (n=9). Para obtener la máxima resolución de variabilidad de ácidos grasos entre tallas de calamar, las muestras fueron divididas en 4 intervalos de tallas según la longitud del manto (LM): 1. Chicos (0 – 25 cm), 2.

Medianos (25 – 50 cm), 3. Grandes (50 - 75 cm) y 4. Muy grandes (75 - 100 cm). Todas las muestras fueron etiquetadas y congeladas a –20 ºC hasta que fueron analizadas.

El 17 de mayo del 2003 se encontró un cachalote varado en la playa del Mogote (24°10´23´´N y 110°22´48´´W) (Fig. 1.2). El cuerpo del animal fue dividido en 3 regiones: cefálica, media y caudal. De cada región se tomó una muestra de tejido desde la epidermis hasta el músculo.

Las muestras fueron guardadas en papel aluminio, se etiquetaron y se congelaron a –20 ºC hasta su análisis.

VI.2 Trabajo de laboratorio Histología

Con el fin de determinar si existían cambios en el perfil de ácidos grasos a lo largo del cuerpo del cachalote, así como posibles variaciones en los estratos del tejido hipodérmico del mismo se realizaron series de cortes de las 3 regiones del cuerpo de un cachalote varado, desde la epidermis hasta el músculo, para determinar si existía un acomodo vertical diferencial del tejido y de los lípidos presentes en este.

Una sección de los tejidos congelados fue fijada en solución de Davidson, posteriormente se colocaron en casetes para deshidratar el tejido en una serie de alcoholes de menor a mayor concentración (70, 80, 90 y 100%); después los tejidos fueron aclarados en xileno e incluidos en Paraplast X-Tra. De las inclusiones se obtuvieron cortes de 3 µm de grosor mediante un microtomo

(25)

de rotación. Posteriormente se aplicó la técnica de tinción Hematoxilina-Eosina (Anexo A.1) para identificar el tipo de tejido de las muestras.

Para detectar la presencia de lípidos insolubles se utilizó la técnica de tinción Sudán Negro B para grasas (Bayliss, 1984), para lo cual se utilizaron cortes histológicos por congelación.

Los tejidos de las 3 regiones del cuerpo del espécimen fueron congelados e incluidos en tissue tek para después realizar cortes en frío de 10 µm de grosor en un plano transversal con ayuda de un criostato a -25°C. Los cortes se tiñeron después con la técnica de Sudán Negro para grasas, mediante esta técnica de tinción los triglicéridos se tiñen de azul oscuro a negro y los fosfolípidos de gris (Anexo A.2).

Los cortes de tejidos teñidos con las técnicas de tinción descritas fueron analizados con un sistema de análisis de Imágenes Image ProPlus (versión 4.5.19), integrado a un microscopio compuesto Olympus BX41 y una cámara digital CoolSNAP-Pro conectada a una computadora Pentium III. Las imágenes de los tejidos fueron digitalizadas a 40X. El análisis cuantitativo de los triglicéridos y fosfolípidos presentes en los tejidos fueron analizados siguiendo la metodología propuesta por Rodríguez-Jaramillo, 2004.

Se detectaron diferentes estratos en cada región del cuerpo, esto basado en la consistencia del tejido; en el tipo de acomodo de los triglicéridos y fosfolípidos en el tejido conjuntivo, así como en el porcentaje de cobertura de triglicéridos y fosfolípidos, el cual se obtuvo mediante mediciones que consistieron primero en la calibración del sistema de análisis de imágenes mediante una reglilla micrométrica para el objetivo 40X. Una vez definida el área a analizar, se utilizó la herramienta del programa que identifica sólo los colores azul oscuro y negro, y cuantifica mediante la suma de píxeles del área ocupada por estos tonos de color, correspondientes a los triglicéridos. Por último, se cuantificaron de la manera ya descrita los tonos de color gris, que corresponden a los fosfolípidos.

Para cada estrato de cada una de las regiones del cachalote varado se estimó el porcentaje de cobertura de triglicéridos y fosfolípidos, mediante las siguientes formulas (Rodríguez-Jaramillo, 2004):

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área de cobertura de trigliceridos

área de cobertura de fosfolípidos + área cobertura trigliceridos

área de cobertura de fosfolípidos

área de cobertura de fosfolípidos + área cobertura trigliceridos

Ácidos grasos

Las muestras de tejido de cachalote y calamar fueron liofilizadas con ayuda de un liofilizador Freezone 6 marca Labconco. Una vez liofilizadas se pulverizaron con ayuda de un mortero.

Posteriormente, los viales fueron sellados en atmósfera de nitrógeno para evitar la oxidación de los lípidos. A estos, se les colocó una tapa de aluminio y se sellaron con parafilm. Por último, se almacenaron en un congelador a -80ºC hasta su procesamiento.En los casos donde la cantidad de muestra fue suficiente el análisis de ácidos grasos se trabajó por duplicado.

Extracción de lípidos

La extracción de los lípidos totales de las muestras se realizó mediante una modificación de la técnica de Bligh y Dyer (1959). Se pesaron 50 mg de las muestras de tejido de calamar y 100 mg de cachalote. Esta muestra fue sometida a un proceso de extracción utilizando 3 ml de una mezcla de cloroformo:metanol (CHCI3:CH3OH) (1:2, v/v). A cada muestra se les agregó 10 µl de BHT 0.1%

con una microjeringa para evitar la oxidación. Las muestras fueron sonicadas en frío durante 3 ciclos de 5 min. En un limpiador ultrasónico Branson 200. Posteriormente, se guardaron en oscuridad y en refrigeración a 4°C durante 48 horas. Pasado este tiempo las muestras fueron sonicadas nuevamente y se centrifugaron a 5000 rpm durante 20 min a 7°C con una centrifuga marca Beckman; el extracto lipídico resultante, se separó por medio de una pipeta Pasteur y se filtró con de

* 100 ICT=

ICP =

* 100

(27)

fibra de vidrio. La pastilla celular sobrante se lavó de 2 a 3 veces con la misma mezcla cloroformo:metanol (1:2, v/v) éstos lavados fueron filtrados también y se colectaron en un tubo de ensayo de 10 ml. Después de esto se agregó agua destilada (el doble del volumen de cloroformo:metanol). Posteriormente se agitó con ayuda de un Vortex marca Baxter modelo S/P durante 10 seg. Se le adicionó 1 ml de cloroformo y se volvió a agitar por 10 seg. La fase clorofórmica o lipídica se separó por centrifugación a 5000 rpm durante 15 mm a 7°C, recuperándose con una pipeta Pasteur.

Para la obtención total de los lípidos, se hicieron de 2 a 3 lavados con cloroformo hasta que la fase clorofórmica quedó transparente. Se recogieron todos los lavados en un tubo con un peso conocido y se llevaron a sequedad con una corriente de nitrógeno gaseoso. Después de secarse se dejaron en un desecador al vacío, protegido de la luz por media hora y pasado este tiempo se pesaron de nuevo los tubos para obtener el peso de los lípidos.

Determinación de ácidos grasos

Para determinar los ácidos grasos presentes en la muestra, se realizó un paso previo que consistió en la derivatización analítica de los lípidos (Knapp, 1979, Sato & Murata, 1988), en donde los lípidos totales fueron sometidos a metanolisis adicionando 2.5 ml de una mezcla de HCI:CH3OH (5:95 v/v) durante 2.5 horas en baño Maria a 85°C. Los metil-ésteres obtenidos de la reacción de metanolisis se extrajeron con 1 ml de hexano (C5H12, grado HPLC), repitiendo este paso dos veces hasta su total extracción. Al extracto obtenido se le adicionó agua destilada; originando la formación de dos fases, la fase inferior compuesta por agua destilada y la superior con hexano y metil-ésteres.

El agua destilada se separó con pipeta pasteur. Este lavado se realizó dos veces, con la finalidad de quitar las impurezas que hubieran quedado de la derivatización. Los metil-ésteres contenidos en el hexano se separaron con pipeta Pasteur, pasándose a otro tubo y se llevaron a sequedad con una corriente de nitrógeno gaseoso.

Los ácidos grasos se resuspendieron en 250 µl de hexano (C6H12) y se colocaron en un vial que fue sellado para su análisis en un cromatógrafo de gases-espectrómetro de masas (GC-MS) Hewlett Packard Series G1800B, con una columna Omegawax TM 250 de sílica fundida (Supelco)

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de 30 m x 0.25 mm diámetro externo x 0.25 µ de diámetro interno. Las condiciones fueron:

temperatura inicial 110 ºC; tiempo inicial 3 min Incremento de 110ºC a 165 ºC a una tasa de 30 ºC/min hasta llegar a una temperatura de 165 ºC donde permanece durante 2 min para incrementar de 165 a 220 ºC a una tasa de 1.4 ºC/min hasta llegar a una temperatura de 220 ºC durante 15 min.

La identificación de cada ácido graso presente en las muestras se realizó mediante la comparación de los tiempos de retención (tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra para que el pico del analito alcance el detector) de los picos de los ácidos grasos de las muestras con los de un multiestándar de 28 ácidos grasos comerciales y abundantes en organismos marinos. Esta identificación se confirmó con el software HP Chem Station, mediante la interpretación de los espectros de masas generados y su comparación con los espectros contenidos en la biblioteca NIST98, NBS75K y una biblioteca creada con 28 estándares de ácidos grasos metil esterificados.

Cabe mencionar que para la identificación de cada ácido graso se consideró que el pico fuera 3 veces mayor al ruido basal y para la cuantificación que fuera 10 veces mayor al ruido, como lo sugiere la validación de métodos cromatográficos. La concentración de los ácidos grasos presentes en las muestras se realizó mediante la interpolación con una curva de calibración que relaciona el área bajo los picos con concentraciones conocidas de 28 estándares de ácidos grasos.

Los ácidos grasos fueron expresados como el porcentaje del total de ácidos grasos y fueron nombrados según la nomenclatura abreviada, la cual consiste en una C, seguida de dos números, separados por dos puntos. El primer número indica la longitud de la cadena hidrocarbonada, mientras que el segundo indica el número de dobles enlaces que contiene.

VI.3 Tratamiento estadístico de los datos

Debido a que los porcentajes de los ácidos grasos no presentaron una distribución normal y no son variables continuas, fueron tratados utilizando la transformación angular ( ( )

arcsin 100

´ x

x= ⁾para

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reducir la heterogeneidad de las variancias y poder realizar las pruebas estadísticas (Sokal y Rohlf, 1981).

Para determinar diferencias en la composición de tallas y tejido de calamar, así como grupos de hembras de cachalote se utilizó un análisis de varianza (ANDEVA) y posteriormente una prueba de comparación de medias de Tukey, o una prueba Kruskal-Wallis, en caso de que los requisitos de normalidad (prueba de Kolmogorov-Smirnoff) y homogeneidad de varianzas (prueba de Levene) no se cumplieran.

Para obtener información de todos los ácidos grasos encontrados simultáneamente se utilizó el análisis de componentes principales (ACP). Este método utiliza correlaciones lineares que suman los datos, existiendo muy poca perdida de información. Cada muestra es posicionada en un espacio multidimensional descrito por las variables (ácidos grasos) los dos ejes (componentes principales, CP) que describen la más grande (CP1) y segunda más grande (CP2) variancia entre las muestras.

Para la confirmación o significancia de los grupos obtenidos mediante el ACP se utilizó el Análisis de Función Discriminante (AFD).

La similitud entre las biopsias de organismos de vida libre y el cachalote varado se examinó a partir de un análisis de grupos. Para realizar el análisis de agrupamiento de las muestras, se utilizaron los porcentajes de cada ácido graso. Se utilizó la distancia euclidiana para medir la similitud entre grupos. Como regla de ligamiento se utilizó el método de Ward. Para todas las pruebas estadísticas se utilizó el software STATISTICA ver 6. Un valor de P < 0.05 fue considerado como estadísticamente significativo.

Debido a que las muestras analizadas del cachalote varado pertenecían a un solo individuo, fue imposible realizar pruebas estadísticas para determinar si existían diferencias significativas entre los estratos de cada región así como entre regiones.

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Melisa Cruz-Vizcaíno Resultados

VII. RESULTADOS

VII.1 CACHALOTE

VII.1.2 Cachalote Varado

Se determinó que el cachalote varado en la playa del Mogote era una hembra adulta de 10.3 m de longitud total. No presentó heridas externas aparentes en el costado expuesto ya que descansaba sobre el otro. Además no se presentaron signos de descomposición avanzada, ya que al observar la grasa esta tenía consistencia firme, en su mayor parte era de color grisáceo claro y moderadamente aceitoso, según Geraci y Lounsbury (1998) este tipo de muestra puede permanecer casi sin alteraciones hasta 7 ó 9 días después de la muerte.

Se observó al analizar los cortes de las tres regiones teñidos con la técnica de hematoxilina- eosina que el tejido era conjuntivo (Fig. 2).

Figura 2. Micrografía de corte histológico del cachalote varado. Tinción Hematoxilina-eosina. 40 X. Región: a) Cefálica b) Media y c) Caudal

Al analizar los cortes histológicos por congelamiento, se encontró que en cada una de las regiones analizadas existía una estratificación evidente del tejido hipodérmico, esto basado en la consistencia del tejido; en el tipo de acomodo de los triglicéridos en el tejido conjuntivo así como en el porcentaje de cobertura de triglicéridos y fosfolípidos. A continuación se detallan cada uno de estos estratos para las tres regiones:

a b c

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E.

E x t e r n o

E.

I n

t e r n o

Región cefálica

La región cefálica midió de la epidermis al músculo aproximadamente 4.4 cm. En esta se localizaron dos estratos verticales, el primero denominado externo, donde se encontró la epidermis la cual mostró ondulaciones epiteliales delgadas y de consistencia dura (Fig. 3). Este estrato presentó una profundidad aproximada de 0.4 cm. Se determinó que el porcentaje de lípidos totales (PLT) obtenido mediante la técnica de Bligh y Dyer fue de 2.5%, el porcentaje de cobertura de triglicéridos y fosfolípidos (PCT y PCF) obtenidos mediante la aplicación de las formulas a las imágenes digitales indican que el 75.1% fueron triglicéridos y el 24.9% fosfolípidos.

Región cefálica Región media Región caudal

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Figura 3. Micrografía de corte histológico de la región cefálica del cachalote varado. Fosfolípidos ( ), triglicéridos ( ). Tinción Sudán Negro. 10 X.

El estrato interno se distinguió claramente del primero ya que este presentó un acomodo del tejido de manera un poco más laxa, presentando pequeñas condensaciones de pigmento, el cual es indicativo de triglicéridos (Fig. 3). Se estimó su profundidad en 4 cm. Se determinó que el porcentaje de lípidos totales (PLT) fue de 3.2%, donde el PCT y el PCF indicaron que el 62.3% fueron triglicéridos y el 37.3% fosfolípidos. El estrato interno presentó un mayor porcentaje de lípidos, lo que indica una clara estratificación en esta zona del cuerpo.

En el estrato externo de la región cefálica se identificaron un total de 52 ácidos grasos, de los cuales 19 se cuantificaron. Para el estrato interno se identificaron el mismo tipo y número de ácidos grasos que en el estrato externo, de los cuales 17 fueron cuantificados (Apéndice A.1).

Al comparar los estratos externo e interno de esta región se puede observar una tendencia a presentar los mismos porcentajes (± 0.5% de diferencia) en 7 de los ácidos grasos cuantificados, lo que comprende casi la mitad de ellos. Cabe resaltar que de estos 7 ácidos grasos, 2 fueron esenciales (20:4n6 y 22:6n3) (Tabla I).

Tabla I. Ácidos grasos cuantificados en los estratos externo e interno de la región cefálica, media y caudal del cachalote varado

Región Cefálica Región Media Región Caudal Ácido graso

Estrato Externo Interno Externo Interno Externo Interno 12:0 ausente ausente traza 1.15 ± 0.1 1.24 ± 0.1 Traza 14:0 1.73± 0.2 1.41 ± 0.1 3.32 ± 0.1 4.39 ± 0.2 4.39 ± 0.1 4.87 ± 0.0 14:1n9 ausente ausente traza 1.48 ± 0.0 2.16 ± 0.2 1.70 ± 0.0 14:1n7 ausente ausente traza 1.34 ± 0.0 1.61 ± 0.1 1.07 ± 0.0 14:1n5 ausente ausente 2.33 ± 0.0 4.19 ± 0.1 4.46 ± 0.4 3.04 ± 0.0 16:0 12.78 ± 0.3 9.90 ± 0 8.05 ± 0.3 6.29 ± 0.5 7.65 ± 0.1 10.05 ± 0.0 16:1n11 ausente ausente ausente ausente 1.37 ± 0.0 1.37 ± 0.1 16:1n9 2.53 ± 0.1 2.81 ± 0.2 4.39 ± 0.1 5.91 ± 0.1 7.46 ± 0.2 8.35 ± 0.0 16:1 n7 7.25 ± 0.1 8.81 ± 0.6 18.43 ± 0.4 24.33 ± 0.1 25.56 ± 0.6 22.45 ± 0.2 iso 16:1 ausente ausente traza 1.03 ± 0.0 Traza 1.25 ± 0.0 18:0 9.30 ± 0.0 6.51 ± 0.1 2.67 ± 0.4 traza 1.01 ± 0.1 1.13 ± 0.0 18:1 n9 21.91 ± 0.2 21.50 ± 0.3 25.82 ± 0.1 22.75 ± 0.4 24.41 ± 0.4 22.40 ± 0.1

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18:1 n7 2.52 ± 0.0 1.37 ± 0.0 1.74 ± 0.1 0.96 ± 0.0 1.09 ± 0.0 1.08 ± 0.0 18:2 n6 1.13 ± 0.1 Traza ausente ausente ausente ausente 20:0 1.63 ± 0.1 0.99 ± 0.1 ausente ausente ausente ausente 20:1 n11 6.40 ± 0.1 6.42 ± 0.0 6.01 ± 0.2 3.93 ± 0.3 3.67 ± 0.5 3.57 ± 0.0 20:1 n9 3.66 ± 0.0 3.29 ± 0.1 6.12 ± 0.6 6.13 ± 0.1 3.71 ± 0.3 4.26 ± 0.2 20:2 n6 1.01 ± 0.6 Traza ausente ausente ausente ausente 20:4 n6 4.42 ± 0.4 5.90 ± 0.2 2.11 ± 0.4 traza ausente ausente 20:5 n3 2.05 ± 0.2 2.62 ± 0.2 3.28 ± 0.2 3.71 ± 0.1 Traza 1.52 ± 0.1 22:1 n11 3.97 ± 0.3 5.48 ± 0.0 3.40 ± 0.2 2.02 ± 0.3 1.58 ± 0.2 2.60 ± 0.0 22:1 n9 ausente ausente Traza 0.98 ± 0 ausente ausente 23:0 2.40 ± 0.7 8.86 ± 0.9 ausente ausente ausente ausente 22:3 n3 traza 1.36 ± 0.1 ausente ausente ausente ausente

22:5 1.07 ± 0.1 Traza ausente ausente ausente ausente

22:6 n3 1.21 ± 0.2 1.79 ± 0.1 ausente ausente ausente ausente 24:1n9 3.40 ± 0.1 1.76 ± 0.0 1.01 ± 0.3 ausente ausente ausente

Sin embargo se observó que algunos ácidos grasos se encontraron en mayor porcentaje en un estrato mientras que otros se encontraban en mayor porcentaje en el otro, así por ejemplo el 18:2 n6, 20:2 n6 y 22:5 n3 presentaron porcentajes cuantificables en el estrato externo mientras que el estrato interno aparecieron como traza, por el contrario el 22:3n3 y 23:0 presentaron mayores porcentajes en el interno. De esta manera examinando todos los ácidos grasos cuantificados se puede concluir que el estrato interno presentó 8 ácidos grasos con porcentajes menores y solo 5 con porcentajes mayores en relación al externo (tabla I, Fig. 4).

(34)

Figura 4. Porcentaje de ácidos grasos cuantificados en los estratos externo e interno de la región cefálicadel cachalote varado

Región media

La región media midió de la epidermis al músculo aproximadamente 10.5 cm. La cual presentó dos estratos verticales, el externo e interno. El externo se extendió desde la epidermis hasta aproximadamente 0.5 cm de longitud. En este estrato las ondulaciones epiteliales fueron más gruesas y cortas, así como también más flexibles en comparación con las que presentó la región cefálica (Fig. 3). Este estrato presentó un porcentaje de lípidos totales de 7.06%, donde el PCT y el PCF indican que el 76.6% fueron triglicéridos y el 23.4% fosfolípidos.

El estrato interno midió aproximadamente 10 cm de longitud; presentó pigmentaciones en el tejido que iban de tamaño pequeño a mediano (Fig. 3). El porcentaje de lípidos totales (51.73%) fue considerablemente mayor que en el estrato externo, donde el PCT y el PCF indican que el 82%

fueron triglicéridos y el 18% fosfolípidos. En esta región, también puede distinguirse una clara estratificación del tejido conjuntivo y los triglicéridos.

En el estrato externo de la región media se identificaron un total de 56 ácidos grasos (Apéndice A.1), de los cuales 13 fueron cuantificados y 42 se encontraron en proporciones traza. En

0 5 10 15 20 25

14:0 16:0 16:1n9 16:1 n7 18:0 18:1 n9 18:1 n7 18:2 n6 20:0 20:1 n11 20:1 n9 20:2 n6 20:4 n6 20:5 n3 22:1 n11 23:0 22:3 n3 ´22:5 22:6 n3 24:1n9

ÁCIDOS GRASOS

E. externo E. interno

(35)

el estrato interno de la región media se identificaron un total de 53 ácidos grasos (Apéndice A.1), de los cuales 16 fueron cuantificados y 37 se encontraron en proporciones traza (Tabla I). Cabe mencionar que en los dos estratos se identificaron los mismos ácidos grasos con excepción de cuatro que se encontraron ausentes en el estrato interno y uno en el externo.

El comportamiento de los estratos en esta región fue un tanto diferente al anterior, ya que al comparar los estratos externo e interno solo el 20:1n9 y 20:5n3 presentaron relativamente los mismos porcentajes (± 0.5% de diferencia), siendo este ultimo un ácido graso esencial.

Así se observó que el estrato interno presentó 8 ácidos grasos con porcentajes menores en comparación con el externo, de los cuales el 18:0 y el 20:4n6 se encontraron como traza y el 24:1n9 se encontró ausente en este estrato. Por el contrario el estrato interno presentó 9 ácidos grasos con porcentajes mayores al estrato externo, de los cuales el 12:0, 14:1n9, 14:1n7, iso16:1 y el 22:1n9 se encontraron como trazas en este ultimo, ocasionando las diferencias entre estratos (tabla I, Fig. 5).

Figura 5. Porcentaje de ácidos grasos cuantificados en estrato externo e interno de la región media del cachalote varado

0 5 10 15 20 25 30

12:0 14:0 14:1n9 14:1n7 14:1n5 16:0 16:1n9 16:1n7 iso 16:1 18:0 18:1n9 18:1n7 20:1n11 20:1n9 20:4n6 20:5n3 22:1n11 24:1n9

ÁCIDOS GRASOS

Estrato externo Estrato interno

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Región caudal

La región caudal midió de la epidermis al músculo aproximadamente 4.5 cm. y se encontraron dos estratos verticales. El estrato externo se ubicó desde la epidermis hasta aproximadamente 2.5 cm. de profundidad (Fig. 3). Este presentó pigmentaciones pequeñas a lo largo de todo el estrato. El porcentaje de lípidos totales fue de 17.32% donde el PCT y PCF indican que el 21.4% fueron triglicéridos y el 78.6% fosfolípidos.

El estrato interno presentó una estructura más laxa que el estrato externo. Se estimó la longitud de este estrato en 2 cm. (Fig. 3), de manera general se presentaron pequeñas fibras pigmentadas, sin embargo el porcentaje de lípidos totales fue de 34.68% donde según el PCT y el PCF indican que el 2.2% fueron triglicéridos y el 97.8% fosfolípidos.

En el estrato externo se cuantificaron un total de 54 ácidos grasos (Apéndice A.1), de los cuales 15 pudieron ser cuantificados y 39 se presentaron de manera traza. Para el estrato interno se cuantificaron también 55 ácidos grasos (Apéndice A.1), de los cuales al igual que en el estrato externo, 16 fueron cuantificados y 39 se encontraron de manera traza (Tabla I).

En esta región del cuerpo se observó una tendencia en la mitad de los ácidos grasos cuantificados a mantener su porcentajes similares (± 0.5% de diferencia) entre los dos estratos.

Así también algunos ácidos grasos variaron sus porcentajes entre los estratos donde el interno presentó 4 ácidos grasos en porcentajes menores a los del estrato externo, de los cuales el 12:0 se cuantificó para el estrato externo y se encontró como traza en el interno. Por el contrario, este mismo estrato presentó 5 ácidos grasos con porcentajes mayores al estrato externo de los cuales el iso16:1 y el 20:5n3 se cuantificaron para el estrato interno y aparecieron como traza en el externo (Tabla I, Fig. 6).

0 5 10 15 20 25 30

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Figura 6. Porcentaje de ácidos grasos cuantificados en el estrato externo e interno de la región caudal del cachalote varado

Se compararon también los estratos externos de la región cefálica, media y caudal donde se observó que algunos ácidos grasos saturados presentaban mayor porcentaje en la región cefálica (16:0, 18:0, 20:0, 23:0) a diferencia de las otras 2 regiones, mientras que los saturados 12:0 y 14:0 se presentaron en mayor porcentaje en la región media y caudal, por el contrario estas ultimas presentaron mayor porcentaje en los ácidos grasos monoinsaturados 14:1n5, 16:1n9, 16:1n7, 18:1n9 y 20:1n9 que la región cefálica, mientras que esta última presentó mayor porcentaje en el 18:1n7 y 24:1n9. Los ácidos grasos esenciales 18:2n6, 20:4n6 y 22:6n3 se presentaron en porcentajes mayores en la región cefálica, mientras que el 20:5n3 fue mayor en la región media.

De esta manera se puede observar primeramente que la región media y caudal fueron más similares y que tanto los ácidos grasos saturados, monoinsaturados y esenciales presentan diferencias entre porcentajes al comparar las regiones.

Al comparar los estratos internos de la región cefálica, media y caudal se observó que el número de ácidos grasos identificados (52, 53 y 55 respectivamente) y cuantificados (17, 16 y 16 respectivamente) fue similar entre todas las regiones, además los porcentajes de los ácidos grasos 16:0 18:1n9 y 18:1n7 fue similar entre las tres regiones.

Se encontró al igual que en el estrato externo, que el estrato interno de la región media y caudal presentaron mayor similitud entre si en comparación con la región cefálica, ya que las primeras dos regiones presentaron porcentajes similares en 8 ácidos grasos dentro de los cuales el 14:1n9, 14:1n7, 14:1n5 e iso16:0 los presentó la región cefálica pero en forma traza. También puede observarse como el 16:1n7 presentó porcentajes altos en estas dos regiones (24.3% y 22.4%

respectivamente) a diferencia de la región cefálica (8.8%). Por el contrario la región cefálica presentó porcentajes cuantificables del 23:0 22:3n3 y 22:6n3, los cuales para la región media se encontraron en manera traza y para la región caudal los dos primeros no se encontraron y el ultimo se presentó en forma traza.

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Se realizó una exploración estadística de los ácidos grasos cuantificados en todas las regiones y estratos del cuerpo del cachalote varado para determinar si se presentaba algún patrón entre estos para lo que se utilizó un ACP, encontrándose que los Factores 1, 2 y 3 explican el 89.1%

de la varianza total del sistema, contribuyendo con 64.4%, 13.2% y 11.3% respectivamente.

Como puede observarse el Factor 1 separó a la región cefálica de las otras dos regiones por los valores negativos del 16:0, 18:0, 18:1n7, 20:0, 20:1n11, 20:4n6, 22:1n11, 23:0, 22:6n3 y 24:1n9 y por los valores positivos del 14:0 y sus monoinsaturados, 16:1n9 y n7 e iso 16:1 respectivamente. El factor 2 agrupó a los dos estratos de la región media y al estrato interno de la región cefálica por los valores negativos del 20:5n3. Mientras que el Factor 3 agrupa a los dos estratos de la región caudal por los valores positivos del 22:3n3 (Fig. 7).

1 2

5

4 6

3

Figura 7. Análisis de Componentes Principales de los ácidos grasos cuantificados en todas las regiones y estratos del cuerpo del cachalote varado. 1)R. cefálica, estrato externo 2)R. cefálica, estrato interno 3)R. Media, estrato externo 4)R. Media, estrato interno 5)R. caudal, estrato externo y 6)R. caudal, estrato interno