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Isoenzimas de la fosfatasa alcalina : su utilidad en la clínica

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(1)

TESIS DOCTORAL

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR

María del Carmen Coca Martín

Madrid, 2015

© María del Carmen Coca Martín, 1980

Isoenzimas de la fosfatasa alcalina : su utilidad en la clínica

(2)

M3 d e l Carmen Coca M a r t i n

1 ^ 5 0

5 3 0 9 8 5 3 3 3 X

UNIVERSIDAD CO M PLU TEN SE

ISOENZIMAS DE LA FOSFATASA ALCALINAs SU UTILIDAD EN LA CLINICA

D e p a r t a m e n t o d e F i s i o l o g l a G e n e r a l F a c u l t a d d e M e d l c i n a

U n i v e r s i d a d C o m p lu te n s e d e M a d rid 1980

ofBLiorecA

(3)

X e r o x 9 2 0 0 XB 480

D e p 6 a i t o L e g a l : M-14<^^4-1980

(4)

U N I V E R S I D A D C O M P L U T E N S E D E M A D R I D

F A C U L T . A D D E M E D I C I N A

I S O E N Z I M A S DE LA F O S F A T A S A A L C A L I N A

S U U T I L I D A D E N L A C L I N I C A

T e s i s n r e s e n t a d a p a r a o p t a r a l g r a d o de D o c t o r en M e d i c i n a .

A u t o r :

Ma. d e l Carmen Coca M a r t i n D i r e c t o r :

P r o f . D r. D. J o r g e T a m a r i t T o r r e s

M a d r i d , mayo 1 .9 79.

(5)

D. JORGE TAMARIT TORRES, CATEDRATICO DE FISIOLOGIA GENERAL, QUIMICA BIOLOGICA Y FISIOLOGIA ESPECIAL DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTEN SE DE MADRID.

C E R T I P I C O : Que Da. Ma. DEL CARMAN COCA MARTIN, h a d e s a r r o l l a d o b a j o mi d i r e c c i ô n e l t r a b a j o " I s o e n z i m a s de F o s f a t a s a a l c a l i n a , s u u t i l i d a d e n c l l n i c a " , a p t o a mi j u i c i o p a r a s e r p r e s e n t a d o como t e s i s d o c t o r a l ,

Y p a r a q u e c o n s t e y a o e t i c i o n d e l i n t e r e s a d o , e x p i d o e l p r e s e n t s c e r t i f i c a d o en M a d rid a d i e c i o c h o de mayo de m i l n o v e c i e n t o s s e t e n t a y n u e v e .

CATEDPJUIK BiOQUlMICA y F ISIO L O G IA

CATcSHAÏlCO P t û ï . Hr. TA'-lAÂlT

l A C U L T A D D E M E D I C I N A M A T) J ! » "

(6)

A mi e s D o s o y a m is h i j o s

(7)

En e s t e c a s o t a l p r o y e c t o c i e n t î f i c o s é r i a e l r é s u l t a d o de u n e s f u e r z o p e r s o n a l q u e s a l i e n d o d e l a t a r e a p r o f e s i o n a l s e h a d e d i c a d o mucho t i e m p o e x t r a a l a c o n s e c u c l ô n d e e s t a memo r i a .

P e r o t a m b i ê n s e e n t i e n d e c o n f r e c u e n e i a l a t e s i s d o c t o r a l como e l i n i c i o o p r i m e r e n s a y o de i n v e s t i g a c i ô n . E s t a t e s i s no e s e l u m b r a l d e mi t a r e a i n v e s t i g a d o r a . V a r i e s e n s a y o s o i e n t ^ f i c o s , a n t e r i o r m e n t e p u b l i c a d o s , h a b l a n d i s c i p l i n a d o m e t o d o l ô g i - c a m e n t e mi p e n s a m i e n t o , a l a p a r q u e me f a m i l i a r i z a b a c o n e l m i - t o d o c i e n t î f i c o . Es é v i d e n t e a s i m i s m o q u e no t e n g o l a p r e t e n s i ô n d e q u e e s t a i n v e s t i g a c i ô n s e a u n a o b r a d e f i n i t i v e en l a l l n e a de l a p e r f e c c i ô n , n i q u e e l l a s e c o n v i e r t a e n e l e x p o n e n t s û l t i m o y d e c i s i v e d e mi d e d i c a c i ô n y a p o r t e c i e n t î f i c o , y a q u e a m e d i d a qu e p r o f u n d i z a b a e n e l e s t u d i o de l a s I s o e n z i m a s de l a F o s f a t a s a A l c a l i n a mSs h i p ô t e s i s s u r g i a n y mas d i f l c i l s e h a c l a e s t a b l e c e r s u f i n a l , h a s t a e l p u n t o q u e a h o r a , a l t é r m i n o , p i e n s o q u e e s t a t e s i s p u e d e s e r un p r o y e c t o e s t i m u l a n t e p a r a p r o s e g u i r e n l a a r d u a t a r e a d e l a i n v e s t i g a c i ô n i n i c i a d a .

S i t u v i e r a q u e d é f i n i r e s t a t e s i s , yo s e f l a l a r l a l a s s i - g u i e n t e s n o t a s mSs c a r a c t e r l s t i c a s : e s a n t e t o d o un t r a b a j o s e r i o , f r u t o d e l a l e n t a m a d u r a c i ô n de muchas h o r a s , d l a s , m e se s y afios de e s t u d i o y r e f l e x i ô n . Se t r a t a de u n a a p o r t a c i ô n c i e n t l f i c a , en l a q u e e l m ôtodo e x p e r i m e n t a l s e h a s e g u i d o con t o d o e l r i g o r que e l e x i g e . Mis r e p e t i d a s y p r o v e c h o s a s e n t r e v i s t a s co n e l D i r e c t o r d e l a T e s i s , P r o f . D r . J . T a m a r i t h i c i e r o n q u e l o s a s p e c t o s m etodo l ô g i c o s c o b r a r a n l a i m p o r t a n c i a p r i m o r d i a l q u e l e c o r r e s p o n d î a .

(8)

O t r a c a r a c t e r î s t i c a e s l a c o m p l e j i d a d que i m p o r t a un t r a b a j o de e s t a n a t u r a l e z a . Los m i l e s de c a s o s a n a l i z a d o s y e s t u d i a d o s b a n r e q u e r i d o de d o m p l i c a d o s y s o f i s t i c a d o s i n t r u m e n t o s a f i n d e s o m e t e r l o s a l a s mSs v a r i a s c o m p r o b a c i o n e s t ê c n i c a s . S i n d u d a q u e mi p e r t e n e n c i a a un c e n t r e de g r a n d e s d i m e n s i o n s s y s u f i e i e n t e s m e d io s m a t e r i a l e s h a h e c h o p o s i b l e e s t a t e s i s . E s t a misma d i f i c u l t a d me f u e r z a a l g r a t î s i m o d e b e r de h a c e r m e n c iô n de a q u e l l o s que m e d i a t a o i n m e d i a t a m e n t e b a n b e c h o p o s i b l e e s t a t e s i s . En l a d i s - t e n d i d a s i e m b r a de i n q u i e t u d e s i n t e l e c t u a l e s , g r a n a d a s a b o r a en l a t e s i s q u e p r e s e n t o , e s de j u s t i c i a r e c o r d a r e n p r i m e r l u g a r a mi p a d r e J o s é A n d r é s C o c a , m é d ic o a n a l i s t a d e M ed in a d e l Campo a s u l a d o y e n s u r u d i m e n t a r i o l a b o r a t o r i o me f a m i l i a r i z ô co n l o s i n s t r u m e n t e s y t é c n i c a s mâs e l e m e n t a l e s , A l l î e l e s f u e r z o y l a i n t u i c i é n t e n î a n q u e s u p l i r l a s d e f i c i e n c i e s p r o p i a s de e s t e t i p o d e c e n t r e s .

D u r a n t e t r è s afios de r o t a t o r i o que p a s ô e n e l l a b o r a t o r i o d e l H o s p i t a l C l î n i c o San C a r l o s de M a d r id e l D r. R. V a l o r Pe r e a a n im a mi e s f u e r z o e n l o s p r i m e r o s p a s o s de l a i n v e s t i g a c i ô n . O t r o s co m pafieros de a q u e l l a e p o c a me b r i n d a n s u s c o n o c i m i e n t o s y e x p e r i e n c i a s . En a q u e l l a i n s t i t u c i ô n t e n g o e l p r i m e r c o n t a c t e em p î r i c o co n l a s I s o e n z i m a s d e l a LDH b a j o l a g u î a d e l D r. A. E r r o z .

Soy c o n s c i e n t e de l a s v a l i o s î s i m a s a p o r t a c i o n e s q u e me b i c i e r o n t o d o s l o s p r o f e s o r e s d e l a F a c u l t a d d e M e d i c i n a de V a l l a d o l i d y M a d r id con l o s q u e t u v e c o n t a c t e e n mi c a r r e r a . A e s t o s p r o f e s o r e s u n i v e r s i t a r i o s q u i e r o t a m b i é n d e d i c a r l e s mi p r i m e r r e - c u e r d o .

S u p e r a d a e s t a f a s e d e i n i c i a c i ô n y f o r m a c i ô n y y a e n l a e t a p a mâs p r ô x i m a de p r e p a r a c i ô n d e l a t e s i s mi s i n c e r e r e c o n o c i - m i e n t o a l D r. A. M a r t i n e z ( J e f e d e l S e r v i c i o de B i o q u î m i c a de l a C . S . 1° de O c t o b r e ) , p o r s u d e c i s i v e e s t i m u l o p a r a s u p e r a r l a r u -

(9)

mo p o r l a i n v e s t i g a c i ô n , s u e x p e r i e n c i a c i e n t l f i c a , s u c o l a b o - r a c i ô n c o n s t a n t e y l a f e c u n d i d a d de s u s a b e r . Como a n t e r i o r m e n t e h e d i c h o l o s s a b i o s c o n s e j o s y l a s a c e r t a d a s o r i e n t a c i o n e s d e l d i r e c t o r d e l a t e s i s . P r o f . D r. J . T a m a r i t , h a n p o s i b i l i t a do c u l m i n a r co n e x i t o l a r e a l i z a c i ô n de e s t e t r a b a j o de i n v e s ­ t i g a c i ô n .

Quede t a m b i l n c o n s t a n c i a d e mi r e c u e r d o e n t r a f i a b l e y a g r a d e c i d o a l D r . A. P a l a c i o s p o r s u s a c e r t a d a s e x p l i c a c i o n e s d e s d e l a p e r s p e c t i v a d e l a c l î n i c a s o b r e l o s m u l t i p l e s c a s o s e s t u d i a d o s y a n a l i z a d o s , a s i como a l D r . J . P u c h e , a l a D r a . C. D î a z R u b io y a t o d o s l o s co m p afiero s d e l l a b o r a t o r i o d e l a C l i n i c a P r i m e r o d e O c t u b r e , n o s o l o p o r s u d i r e c t s c o l a b o r a c i ô n e n l a s o l u c i ô n d e m u l t i p l e s p r o b l è m e s q u e e l te m a i m p l i c a b a s i n o t a m b i é n p o r q u e c o n u n a enorm e c o n d e s c e n d e n c i a h a n l l e n a d o l a s o b l i g a d a s a u s e n c i a s que p o r mi t r a b a j o q u e d a b a n s i n c u b r i r .

(10)

I N D I C E

1 . - DESCRIPCION GENERAL Y ANTECEDENTES HISTORICOS DE LA FOSFATASA ALCALINA

P r ô l o g o

I n t r o d u c c i ô n ... 1

1 . 1 . - PROPIEDADES FISICO-QUIMICAS DE LAS FOS- FATASAS ALCALINAS 1 . 1 . 1 . - C o m p o s l c i ô n ... 6

1 . 1 . 2 . - E s t a b i l i d a d ... 9

1 . 1 . 2 . 1 . - T e m p e r a t u r a ... 10

1 . 1 . 2 . 2 . - U r e a ... 12

1 . 1 . 2 . 3 . - l o n e s y a g e n t e s q u e l a n t e s . . . 13

1 . 1 . 2 . «t.- pH... 14

1 . 1 . 3 . - I n h i b i d o r e s y a c t i v a d o r e s ... 15

1 . 1 . 4 . - E s t u d i o c i n ë t i c o y m ecanism o de a c c i ô n e n z i m â t i c a ... 17

1 . 1 . 4 . 1 . - E s p e c i f i c i d a d d e s u s t r a t o y c o n s t a n t e d e MICHAELIS... 18

1 . 1 . 4 . 2 . - I n f l u e n c i a e n t r e pH y s u s t r a t o s ... ... 21

1 . 1 . 5 . - G r u p o s e s e n c i a l e s e n l o s c e n t r o s a e t i v o s de l a e n z i m a ... 25

1 . 1 . 6 . - M ecanism o d e c a t â l i s i s de l a f o s f a t a s a a l c a l i n a ... 26

2 . - ISOENZIMAS DE LA FOSFATASA ALCALINA 2 . 1 . - GENERALIDADES... 30

2 . 2 . - PROCEDIMIENTOS PARA LA SEPARACIDN DE ISO ENZIMAS... 32

2 . 2 . 1 . - M éto d o s e l e c t r o f o r é t i c o s de s é p a r a c i 6 n de i s o e n z i m a s ... 3 3 2 . 2 . 1 . 1 . - E l e c t r o f o r e s i s e n p a p e l ... 33

2 . 2 . 1 . 2 . - E l e c t r o f o r e s i s e n g e l de a l m i - d ô n ... 34

(11)

2 . 2 . 1 . 5 . E l e c t r o f o r e s i s e n g e l d e a c r i l a m i -

d a . ... 36

2 . 2 . 2 . - O t r o s m é to d o s d e s e p a r a c i ô n d e i s o e n z i m a s 37 E l e c t r o f o r e s i s e n g e l de S e p h a d e x E l e c t r o i s o f o c u s i n g T é c n i c a s c r o m a t o g r â f i c a s 2 . 3 . - METODOS DE IDENTIFICACION DE LAS ISOENZIMAS 39 2 . 3 . 1 . - I d e n t i f i c a c i é n d e i s o e n z i m a s p o r l a p o s i - c i é n d e l a s b a n d a s ... 40

2 . 3 . 2 . - M étodos de i d e n t i f i c a c i é n de i s o e n z i m a s b a s a d o s e n l a e s t a b i l i d a d ... 42

2 . 3. 2 . 1 . - E s t a b i l i d a d a l c a l o r ... 43

2 . 3 . 2 . 2 . - E s t a b i l i d a d a l a c o n c e n t r a c i ô n de h i d r o g e n i o n e s . ... 45

2 . 3. 2. 3 . - I n a c t i v i d a d p o r u r e a ... 46

2 . 3 . 3 . - I n h i b i c i é n p o r L - f e n i l a l a n i n a ... 47

2 . 3 . 4 . - T r a t a m i e n t o c o n n e u r o a m i n i d a s a ... 49

2 . 3 . 5 . - G t r o s p r o c e d i m i e n t o s de i d e n t i f i c a c i é n de i s o e n z i m a s ... 50

EDTA A c t i v i d a d r e l a t i v e a s u s t r a t o s P r o p i e d a d e s i n m u n o q u l m i c a s 2 . 4 . - APLICACIONES DE LAS ISOENZIMAS EN C LINICA.. 52

3 . - PROPOSITO DE LA T E S I S ... 58

4 . - METODOLOGIA... 61

4 . 1 . - PREPARACION DE LAS MUESTRAS... 62 S u e r o s

Homogenados de o r g a n o s B i o p s i e s

(12)

N e c r o p s i a s p â g . P r e p a r a c i ô n d e l b u f f e r c a r b o n a t o - b i c a r b o n a t e

4 . 2 . - METODO PARA LA DETERMINACION DE LA FOSFATA­

SA ALCALINA... 65

F u n d a m e n to R e a c t i v o s B u f f e r pH 1 0 , 1 S u s t r a t o 2 m g /m l. P r o c e d i m i e n t o C u r v a d e a b s o r b a n c i a d e l p - n l t r o - f e n o l 4 . 2 . 1 . - P r e c i s i ô n d e l m ë t o d o ... 67

M ë to d o a u t o m â t i c o M ë to d o m a n u a l 4 . 2 . 2 . - L i n e a l i d a d e n l a d e t e r m i n a c i ô n d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a ... 70

R e c t a d e r e g r e s i ô n 4 . 3 . - SEPARACIDN DE ISOENZIMAS... 72

4 . 3 . 1 . - Fundcunento d e l m â t o d o ... 73

4 . 3 . 2 . - M a t e r i a l ... 73

4 . 3 . 3 . - R e a c t i v o s ... 74

B u f f e r d e l g e l S o l u c i ô n d e a c r i l a m i d a ( P o r o 9%) S o l u c i ô n d e a c r i l a m i d a ( P o r o 7%) S o l u c i ô n d e a c r i l a m i d a ( P o r o 4%) S o l u c i ô n d e p e r s u l f a t o a m ô n ic o B u f f e r r e s e r v o r i o S o l u c i ô n d e s a c a r o s a S o l u c i ô n d e cro m ô g e n o 9 . 3 . 4 . - L i m p i e z a d e l m a t e r i a l d e v i d r i o ... 75

4 . 3 . 5 . - P r e p a r a c i ô n d e l g e l ... 76

S o l u c i o n e s de l o s p o r o s 4 . 3 . 6 . - E l e c t r o f o r e s i s e n e l g e l ... 79

(13)

m é t r o ... 82 4 . 3 . 8 . 2 . = P r e c i s i ô n e n l a d e n s i t o m e t r î a

d e l o s g e l e s ... ... 84 4 . 3 . 9 . - P r e c i s i ô n en l a s e p a r a c i o n d e l a s

i s o e n z i m a s ... ... 86 5 . - RESULTADOS EXPERIMENTALES... 31

G e n e r a l i d a d e s

5 . 1 . -SUEROS NORMALES... 9 3 I n t r o d u c c i ô n

V a r i a b i l i d a d d e l r e c o r r i d o de l a b a n d a a n ô d i c a

Nûmero d e b a n d a s e n e l g e l

A j u s t e a u n a c u r v a d e l n û m ero de b a n d a s en l o s g e l e s

V a r i a b i l i d a d de l a a c t i v i d a d e n z i m â t i c a ge n e r a l y s e g û n nûm ero de b a n d a s

5 . 1 . 1 . P o s i c i o n de l a s b a n d a s e n e l g e l d e l o s

s u e r o s n o r m a l e s ... 101 D i s t r i b u c i ô n d e f r e c u e n c i a s y p o s i c i ô n

de b a n d a s

P o s i c i ô n de b a n d a s e n g e l e s d e t r è s b a n d a s

P o s i c i ô n de l a s b a n d a s e n g e l e s d e c u a - t r o b a n d a s

P o s i c i ô n de l a s b a n d a s e n g e l e s d e c i n - c o b a n d a s

P o s i c i ô n d e l a s b a n d a s e n g e l e s c o n s e i s b a n d a s

' P o s i c i ô n d e l a s b a n d a s e n g e l e s d e s i e t e b a n d a s

(14)

pâg.

5 . 1 . 2 . - A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a e n l o s g e l e s

de l o s s u e r o s n o r m a l e s ... 111 A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a de t o d a s l a s

b a n d a s d e l g e l

A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a d e g e l e s c o n d o s b a n d a s

A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a d e g e l e s c o n t r è s b a n d a s

A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a d e g e l e s c o n c u a t r o b a n d a s

A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a de g e l e s c o n c i n c o b a n d a s

A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a d e g e l e s co n s e i s b a n d a s

A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a de g e l e s co n s i e t e b a n d a s

5 . 1 . 3 . I n f l u e n c i a d e l s e x o e n e l e s p e c t r o

e l e c t r o f o r â t i c o e n s u e r o s n o r m a l e s 121 A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a e n s u e r o s n o r

m a i e s s e g û n s e x o

P o s i c i ô n d e l a s b a n d a s e n l o s g e l e s s e g û n s e x o

A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a d e l o s g e l e s s e g û n s e x o

5 . 1 . 4 . I n f l u e n c i a d e l a e d a d e n e l e s p e c t r o

e l e c t r o f o r â t i c o e n s u e r o s n o r m a l e s 135 P o s i c i ô n d e b a n d a s y d i a g r a m a s

A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a d e l o s g e l e s s e g û n l a e d a d

5 . 1 . 5 . I n f l u e n c i a d e l o s g r u p o s s a n g u i n e o s e n e l e s p e c t r o e l e c t r o f o r â t i c o d e

s u e r o s n o r m a l e s 141

A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a d e l o s s u e r o s r e s p e c t o a g r u p o s s a n g u î n e o s

(15)

g r u p o s s a n g u î n e o s

Nûmero d e b a n d a s e n l o s g e l e s e n r e l a c i ô n a l o s g r u p o s s a n g u î n e o s

P r u e b a de x 2 p a r a d e c i d i r l a d e p e n d e n c i a d e l n ûm ero d e b a n d a s y g r u p o s s a n g u î n e o s

P o s i c i ô n y AF d e l a s b a n d a s e n l o s ge l e s s e g û n l o s g r u p o s s a n g u î n e o s

A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a de l a s b a n d a s e n l o s g e l e s

5 . 2 . - HOMOGENADOS DE ORGANOS SANOS 152

5 . 2 . 1 . A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a d e l o s h o m o g e n a d o s 152 5 . 2 . 2 . N ûmero, r e c o r r i d o y p o s i c i ô n p r e f e r e n c i a l

de l a s b a n d a s e n e l g e l ... 15 3 5 . 2 . 3 . A c t i v i d a d f o s f a t â s i c a d e l a s b a n d a s d e l

g e l ... 157

5 . 2 . 4 . E s t u d i o d e m e z c l a s d e h o m o g e n a d o s y s u e ­ r o s n o r m a l e s ... 161

5 . 2 . 5 . E s t u d i o d e m e z c l a s d e h o m o g e n a d o s d e Ô r - g a n o s ... ... 169

5 . 3 . SUEROS PATOLOGICOS... 172

5 . 3 . 1 . S u e r o s de e n f e r m e d a d e s h e p â t i c a s ... 174

5 . 3 . 2 . S u e r o s d e e n f e r m e d a d e s ô s e a s ... 180

5 . 3 . 3 . S u e r o s de e n f e r m o s c o n p a n c r e a t i t i t i s . . 187

5 . 3 . 4 . S u e r o s d e e n f e r m e d a d e s r e n a l e s ... 189

5 . 3 . 5 . S u e r o s d e e n f e r m e d a d e s p u l m o n a r e s ... 197

5 . 3 . 6 . S u e r o s de n e o p l a s i a s ... 202

5 . 3 . 7 . E s t u d i o d e m e z c l a s d e s u e r o s p a t o l ô g i c o s 212 5 . 3 . 8 . E s t u d i o d e m e z c l a s d e h o m o g e n a d o s de ô r - g a n o s y s u e r o s p a t o l ô g i c o s ... 218

5 . 4 . ENSAYOS SOBRE INHIBICIONES... 227

(16)

p â g r....

G . - DISCUS ION GENERAL... 247 6 . 1 . ELECCION DE METODICA... 248

6 . 2 . HODELOS ELECTROFORETICOS DE SUEROS NORMALES. 254

6 . 3 . MODELOS ELECTROFORETICOS DE HOMOGENADOS DE

ORGANOS... 284 6 . 4 . MODELOS ELECTROFORETICOS DE SUEROS PATOLOGI­

COS... 269 S u e r o s de e n f e r m o s h e p â t i c o s ... 270 S u e r o s de e n f e r m e d a d e s ô s e a s y n i f i o s ... 27 3 S u e r o s de e n f e r m e d a d e s p a n c r e â t i c a s 275 S u e r o s de e n f e r m e d a d e s r e n a l e s ... 277 S u e r o s d e e n f e r m e d a d e s p u l m o n a r e s ... 279 S u e r o s p r o c e d e n t e s d e n e o p l a s i a s ... 2 82 6 . 5 . ENSAYOS CON INHIBIDORES... 286 6 . 6 . MEZCLA DE SUEROS HOMOGENADOS... 290 6 . 7 . IDENTIFICACION DE BANDAS EN EL GEL... 294 6 . 8 . TRABAJOS QUE PUEDEN DESARROLLARSE COMO CONTE

NUACI0N A ESTA MEMORIA... 297 7 . - CONCLUSIONES... 300

8 . - BIBLIOGRAFIA... 307

9 . - ANEXO

ANEXO n * l : SUEROS NORMALES... 340 ANEXO n ° 2 : SUEROS PATOLOGICOS:

a ) S u e r o s d e e n f e r m e d a d e s h e p â t i c a s . . . 35 8 b ) S u e r o s d e e n f e r m e d a d e s ô s e a s y n i f i o s

n o r m a l e s ... 36 3 c ) S u e r o s d e e n f e r m o s c o n p a n c r e a t i t i s 365 d ) S u e r o s d e e n f e r m e d a d e s r e n a l e s 366 e ) S u e r o s d e e n f e r m e d a d e s p u l m o n a r e s . . 370 f ) S u e r o s de c â n c e r ... .... ... 37 3

(17)

ANEXO n®6: ESTUDIOS DE MEZCLAS DE HOMOGENADOS DE ORGANOS... 382 ANEXO n ° 7 : ESTUDIO DE MEZCLAS DE HOMOGENADOS DE OR

GANOS Y SUEROS NORMALES... 383

ANEXO n®8: CALCULO DE A .F . EN LAS MEZCLAS DE HOMO GENADOS Y SUEROS... 385

(18)

1. DESCRIPCION GENERAL Y ANTECEDENTES HISTORICOS

(19)

DESCRIPCION GENERAL Y ANTECEDENTES HISTORICOS

La f o s f a t a s a a l c a l i n a , c u y a n o m e n c l a t u r a a c t u a l e s l a d e o r t o f o s f ô r i c o m o n o e s t e r f o s f o h i d r o l a s a ( E . C . 3 , 1 , 3 , 1 ) , com­

p r e n d s u n g r u p o d e e n z i m a s q u e c a t a l i z a n l a h i d r O l l s l s d e c a s l ! t o d o s l o s mon o ë s t e r e s d e f o s f a t o s d a n d o l u g a r a f o s f a t o i n o r g S n l c o , P ^ , Y e l c o r r e s p o n d i e n t e a l c o h o l , f e n o l o a z u c a r .

L as f o s f a t a s a s a l c a l l n a s p r o c e d e n t e s d e t e j i d o s d e l o g m a m i f e r o s , p a r t l c u l a r m e n t e d e l r i n f i n y l a m u c o s a I n t e s t i n a l ,

d r o l i z a n n u c l e ô t i d o s , f o s f a t o s d e h e x o s a s , g l i c e r o f o s f a t o s , e t c . , (FERNLEY, 1 9 7 1 ) .

La d e m o s t r a c i D n d e q u e e l c a r t l l a g o o s i f i c a d o e r a u n a f u e n t e r i c a e n f o s f a t a s a a l c a l i n a ra a rc 6 e l c o m i e n z o d e u n a é p o - c a d e i n t e n s a i n v e s t i g a c i ô n , d e s a r r o l l â n d o s e l a h i p ô t e s i s d e q u e l a f o s f a t a s a i n t e r v e n i a e n e l p r o c e s o d e l a c a l c i f i c a c i ô n

(ROBISON, 1923) (FERNLEY, 1 9 7 1 ) . P o s t e r i o r m e n t e s e d e m o s t r ô q u e l a f u e n t e p r i n c i p a l d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a s e e n c u e n t r a e n l o s o s t e o b l a s t o s d e l h u e s o y e s e x c r e t a d a p o r l a b i l i s (GUTMAN, 1959) (WILKINSON, 1970) (CHEN, 1 9 7 6 ) .

A p a r t é d e l h u e s o h a y o t r o s rouchos t e j i d o s r i c o s e n f o £ f a t a s a a l c a l i n a como s o n e l h i g a d o , l a m u co sa i n t e s t i n a l , e l r ^ n ô n , l a p l a c e n t a , e t c . S u s a c t i v i d a d e s e n z i m â t i c a s h a n s i d o o b - j e t o d e u n e s t u d i o p r o f u n d o p o r muchos a u t o r e s (BODANSKY, 1937)

(CLOETENS, 1939) (BODANSKY, 1 9 48) (AHMED y KING, 1959) (HODSON y o t r o s , 1 962) (FISHMAN y C o l . , 1962) (MOSS y KING, 1962) (WIL­

KINSON, 1 971) (CHEN, 1976) (SUBRAMONIAM, 1978) e t c .

La f o s f a t a s a ô s e a t i e n e s u mâxima a c t i v i d a d e n z i m â t i c a a pH c o m p r e n d i d o e n t r e 8 , 4 y 9 , 4 (ROBINSON y SOAMES, 1 9 2 4 ) ; s i -

(20)

3 -

m i l a r c o m p o r t a m l e n t o t l e n e l a f o s f a t a s a r e n a l y d e l a m u c o sa i n t e s t i n a l (MARTLAND y ROBISON, 1926) (FISHMAN y GHOSH, 1967)

(FERNLAY, 1971) p r é s e n t e s e n e l s u e r o s a n g u i n e o .

En 1927 s e o b s e r v ô q u e l a f o s f a t a s a r e n a l d e s p u ê s de s e r d i a l i z a d a n e c e s i t a l a p r e s e n c i a d e i o n e s Mg p a r a r é c u p é r a r l a a c t i v i d a d e n z i m â t i c a i n i c i a l . E s t e h e c h o h a s i d o c o n f i r m a d o e n t r a b a j o s p o s t e r i o r e s y d e s d e e n t o n c e s s e a g r e g a e l i â n Mg, e n f o rm a s i s t e m â t i c a , e n l a d e t e r m i n a c i ô n d e l a a c t i v i d a d e n z i ­ m â t i c a d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a c o n i n d e p e n d e n c i a d e s i l a s mues

t r a s h a n s i d o d i a l i z a d a s o n o y d e l Ô rg a n o e n s a y a d o (FERNLEY, 1 9 7 1 ) .

En c l î n i c a , d e s p e r t ô i n t e r ë s l a f o s f a t a s a a l c a l i n a e n d e t e r m i n a d a s s i t u a c i o n e s p a t o l ô g l c a s , t a i e s como i c t e r î c i a s o b £

t r u c t i v a s (ROBERTS, 1930) (ROBERTS, 1933) (DALGAARD, 1 9 5 1 ) (MI- THOEFER y RAPOPORTj 1951) (SARLES, 1953) (CARLSTEN, 1961) (BEC­

KER y STAUFFER, 1962) (SEBESTA y c o l . , 1964) (SHERLOCK, 1963) (POPE, 1 966) (KLEIN, 1968) (CHEN, 1 9 7 2 , 1 9 7 3 ) (RIGHETTI, 1 9 7 4 ) , e n a l g u n a s e n f e r m e d a d e s ô s e a s como e l r a q u i t î s m o (KAY, 1929)

(DOOSE, 1 9 60) (CHEN, 1 9 7 6 ) , e n h i p e r p a r a t i r o i d î s m o (DENT y HAR­

PER, 1962) , e n h i p e r f o s f a t a s i s i d e o p â t i c a (STEMMERMANN, 1966) (THOMPSON y c o l . , 1 9 6 9 ) .

La f o s f a t a s a a l c a l i n a t i e n e t a m b i ô n i m p o r t a n c i a p a r a d ^ l u c i d a r l a p a t o g e n i a y l a p r o g n o s i s d e d i v e r s e s e n f e r m e d a d e s r e ­ n a l e s (BÜRGEN, 1947) (FISHMAN y GHOSH, 1 9 6 7 ) , a s î , h a a d q u i r i d o g r a n i m p o r t a n c i a e n l a n e c r o s i s t u b u l a r , e n l o s s i n d r o m e s n e f r ô - t i c o s y e n l a a g u d i z a c i ô n d e l o s c u a d r o s n e f r î t i c o s (BUTTERWORTH y MOSS, 1963) (BUTTERWORTH y c o l . , 1 965) (FISHMAN y GHOSH, 1 9 6 8 ) .

La f o s f a t a s a p l a c e n t a r i a t u v o g r a n i m p o r t a n c i a e n e l va l o r d i a g n ô s t i c o d e u n f r a c a s o p l a c e n t a r i o (HUNTER, 1969) (AIDA y SOTO, 1 9 7 2 ) , s i n e m b a r g o , e n l a a c t u a l i d a d s e c r e e q u e e l v a l o r

(21)

d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a p l a c e n t a r i a s o l o t i e n e i m p o r t a n c i a e n c a s o s a i s l a d o s como e n e m b a r a z o s s o m e t i d o s a un c o n t r o l p e r i ô - d i c o ; e n t o n c e s , r é s u l t a s i g n i f i c a t i v e c u a n d o s e p r o d u c e u n a e l e v a c i ô n b r u s c a d e l a a c t i v i d a d e n a l g d n m em ento d e t e r m i n a d o

(BRANDAU, 1 9 7 6 ) .

En i n f a r t o s p u l m o n a r e s s e p r o d u c e t a m b i é n un i n c r e m e n - t o d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a (NIKKIIA, 1959) (DIJKMAN y KLOPPEN- BORG, 1 9 6 6 ) .

Se c o n s i d é r a l a f o s f a t a s a a l c a l i n a d e g r a n u t i l i d a d e n e l d i a g n ô s t i c o de e n f e r m o s q u e p a d e c e n H b - E - T a l a s e m i a , e n l a q u e l a a c t i v i d a d f o s f a t â s i c a s e e n c u e n t r a e l e v a d a mâs d e t r è s v e c e s r e s p e c t o a l a a c t i v i d a d n o r m a l (NATH y GHOSH, 1 9 6 7 ) .

F i n a l m e n t e , e s b i e n c o n o c i d a l a h i p e r f o s f a t a s e m i a e n l a s n e o p l a s i a s d e o r i g e n ô s e o y s u s m e t â s t a s i s , e n e l c â n c e r h a p â t i c o y su m e t â s t a s i s , a s î como e n e l c â n c e r p a n c r e â t i c o

(SCHLANG y MCHENRY, 1962) (FISHMAN y GHOSH, 1 9 6 7 ) (CHEN, 1976) y c a r c i n o m a g a s t r o i n t e s t i n a l (CROFTON y SMITH, 1 9 7 8 ) .

La u t i l i z a c i ô n d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a p a r a f i n e s d ia g [ n ô s t i c o s p r é c i s a l a d e t e r m i n a c i ô n c o r r e c t s d e l a m is m a , l o q u e d i ô l u g a r a q u e f u e s e n d é s a r r o i l a d o s m é to d o s s e n s i b l e s p a r a l a m e d i d a d e l a a c t i v i d a d f o s f a t â s i c a (KING y ARMSTRONG, 1 9 3 4 ) . Los m fo d o s a n a l î t i c o s p u e d e n c l a s i f i c a r s e e n d o s t i p o s : a ) M ed id a d e l i ô n f o s f a t o l i b e r a d o y b) M e d id a d e l a l c o h o l p r o d u c i d o .

H i s t o r i c a m e n t e , e l p r i m e r e s t e r u t i l i z a d o como s u s t r a t o , f u é e l b e t a - g l i c e r o - f o s f a t o (BODANSKY, 1933) . En e s t e m ë t o d o , d e s p u é s d e l a i n c u b a c i ô n d e l s u e r o c o n e l s u s t r a t o h a y u n a l i b e -

r a c i ô n d e i ô n f o s f a t o , e l c u a l , e s m e d id o e n una s e g u n d a f a s e p o r e l m ë to d o de F i s k e - S u b b a r o w (FISKE y SOBBAROW, 1925) . M ëtodo

(22)

- 5 -

s i m i l a r a l a n t e r i o r f u é e m p l e a d o p o r v a r i o s a u t o r e s (SHINOWARA y c o l . , 1942) (DRIER y c o l . , 1957) (LOWRY y LOPEZ, 1 9 4 6 ) .

En e l g r u p o de m é t o d o s q u e m id e n e l a l c o h o l l i b e r a d o , l o s c u a l e s , s o n l o s mSs u t i l i z a d o s e n l a a c t u a l i d a d e n l o s l a ­ b o r a t o r i e s d e Q u im ic a C l î n i c a , e l p r i m e r p r o c e d i m i e n t o u s a d o f u é e l d e K in g y A r m s t r o n g (KING y ARMSTRONG, 1 9 3 4 ) , e n e l q u e e l f e n o l l i b e r a d o d e l s u s t r a t o f e n i l f o s f a t o s e m id e p o r e l m ê- t o d o d e F o l i n - C i o c a l t e a u ( 1 9 2 9 ) . Mâs t a r d e , f u e r o n e m p l e a d o s m é t o d o s e n l o s c u a l e s e l a l c o h o l l i b e r a d o p r é s e n t a c o l o r , como

e l u s a d o p o r e l m é to d o B e s s e y (BESSEY y c o l . , 1946) d o n d e e l s u s t r a t o e s e l p - n i t r o f e n i I f o s f a t o . En e s t a misma l î n e a s e h a u t i l i z a d o como s u s t r a t o l a f e n o l f t a l e i n a - d i f o s f a t o (KLEIN, READ, RABSON, 1 9 6 0 ) . T am b ién s e h a n u t i l i z a d o s u s t r a t o s q u e t r a s l a h i d r o l i s i s e n z i m â t i c a s e o r i g i n a n p r o d u c t o s f l u o r e s c e n t e s t a l e s como b e t a - n a f t i l f o s f a t o (GREENBERG, 1962) y 4 , m e t i l , u m b e l i f e r i l f o s f a t o (FERNLEY y WALKER, 1 9 6 5 ) .

Las f o s f a t a s a s a l c a l i n a s p e r t e n e c e n a l g r u p o d e l a s t r a n s f e r a s a s e n l a s c u a l e s un r e s i d u e f o s f o r i l e s t r a n s f e r i d o d i r e c t a m e n t e d e un é s t e r f o s f a t o a un a l c o h o l a c e p t o r (FERNLEY, 1 9 7 1 ) . P o r o t r a p a r t e , s e h a d e m o s t r a d o (ENGSTRON, 1962) q u e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a p e r t e n e c e a l g r u p o de l a s h i d r o l a s a s . En e l t r a b a j o u l t i m a m e n t e m e n c i o n a d o , s e i n t r o d u j o e n e l g r u p o s e r i n a d e l a e n z i m a , un f o s f a t o m a r c a d o co n f ô s f o r o 32 y l a f o s f o s e r i - n a m a r c a d a p u d o s e r a i s l a d a , d e s p u é s d e s u i n c u b a c i é n , e n l a g l u c o s a - 6 - f o s f a t o ( 3 2 P ) , l l e g â n d o s e a s î a l a e v i d e n c i a d e q u e l a e n z i m a - f o s f o r i l e s un i n t e r m e d i o e n l a h i d r o l i s i s de l o s mo- n o é s t e r e s f o s f a t o s .

E l e s t u d i o d e q u e u n i ô n m é t a l e r a n e c e s a r i o e n l a e s - t r u c t u r a d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a f u é r e a l i z a d o p o r v a r i o s a u t o r e s (MATHIES, 1958) (ENGSTRON, 1 9 6 1 ) . La f o s f a t a s a d e l E. C o l i

(23)

e s una m e t a l o e n z l m a c o n 2 - 3 g r d e Zn p o r m o l d e e n z i m a . E l m é t a l e s e s e n c l a l p a r a l a a c t i v i d a d c a t a l i t i c a y t a m b i é n p a r a e l m a n te n i m i e n t o d e l a e s t r u c t u r a d e l a e n z i m a (FISHMAN y GHOSH, 1967)

(FERNLEY, 1971) (CHEN, 1 9 7 6 ) .

Ha s i d o un te m a muy d e b a t i d o d u r a n t e muchos a n o s l a s d i f e r e n t e s f o s f a t a s a s a l c a l i n a s p r o c e d e n t e s de c a d a t e j i d o , e s t o e s , l a s i s o e n z i m a s d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a (BELPANTI, 1 9 3 5 ) . La i n d i v i d u a l i z a c i ô n e i d e n t i f i c a c i ô n d e é s t g ^ e s un p r o b l e m s q u e o f r e c e d i f i c u l t a d e s e x p é r i m e n t a l e s . Se h a n u t i l i z a d o p a r a e s t e e s t u d i o l a s t é c n i c a s e m p l e a d a s p a r a e s t a c l a s e d e t r a b a j o s t a i e s como l a r e s p u e s t a d e l a e n z i m a a l o s i n h i b i d o r e s (BODANSKY, 1 9 3 7 ) , m é t o d o s in m u n o q u î m i c o s (SCHLAMOWITZ y BODANSKY, 1959) (SUSSMAN y c o l . , 1 9 6 8 ) , e t c . L a s t é c n i c a s e l e c t r o f o r é t i c a s h a n m o s t r a d o l a e x i s t e n c i a d e d i f e r e n c i a s f i s i c a s e n t r e l a s f o s f a t a s a s a l c a l i n a s d e l o s t e j i d o s . S i n e m b a r g o , afin n o e s t é c l a r a , n i p r é c i s a , l a s d i f e r e n c i a s e x i s t e n t e s e n t r e e l l e s , q u i z é s e l c o n t e n i d o e n â c i d o s i â l i c o s e a l a c a u s a d e e s t a s d i f e r e n c i a s (SCHLAMOWITZ y BODANS­

KY, 1959) (MOSS y c o l . , 1961) (HODSON ÿ c o l . , 1962) (ROBISON y PIERCE, 1964) (MOSS y c o l . , 1966) (FERNLEY, 1 9 7 1 ) .

1 . 1 . PROPIEDADES FISICO-QUIMICAS DE LAS FOSFATASAS ALCALINAS

1 . 1 . 1 . C o m p o s i c i ô n

L a s f o s f a t a s a s a l c a l i n a s de l o s m a m f f e r o s h a n s i d o muy e s t u d i a d a s s o b r e t o d o e n l o q u e c o n c i e r n e a s u s p r o p i e d a d e s f J - s i c a s . Los e s t u d i o s s e h a n e f e c t u a d o p r i n c i p a l m e n t e en l a muco­

s a i n t e s t i n a l d e l a t e r n e r a , r i n ô n d e l c a b a l l o , h i g a d o d e l o s b o v i d o s , e t c .

R e s p e c t o a l a f o s f a t a s a a l c a l i n a hum ana, l a mâs e s t u d i a

(24)

- 7 -

d a h a s i d o l a p l a c e n t a r i a , l a c u a l , h a p o d i d o s e r p u r i f i c a d a y c r i s t a l i z a d a (GHOSH y FISHMAN, 1 9 68) (SUSSMAN y c o l . , 1 9 6 8 ) . Los ho m o g e n a d o s d e l a e n z i m a f u e r o n e s t u d i a d o s m e d i a n t e u l t r a f i l t r a - c i 6 n , i n m u n o e l e c t r o f o r e s i s y e l e c t r o f o r e s i s d e d i s c o e n g e l d e a c r i l a m i d a , d e m o st r â n d o s e q u e é s t a e n z i m a e s un d l m e r o d e p e s o m o l e c u l a r c o m p r e n d i d o e n t r e 1 1 6 0 0 0 a 1 2 5 0 0 0 (HARKNESS, 1968)

(SUSSMAN y GOTTLIEB, 1 9 6 9 ) (FERNLEY, 1 9 7 1 ) . E s t e d l m e r o e s t S f o r mado p o r d o s m o n ô m e r o s , l o s c u a l e s , n o t i e n e n q u e s e r n e c e s a r i a - m e n te i d é n t i c o s , d e p e s o s m o l e c u l a r e s d e 58000 (SUSSMAN y c o l . ,

1968) (MARSHALL y KAPLAN, 1972) (CHEN, 1 9 7 6 ) , Los e s t u d i o s g e n ê - t i c o s i n d i c a n q u e e x i s t e n 3 s u b u n i d a d e s , l a F ( f a s t ) , I ( i n t e r m e d i e ) y S ( s l o w ) , l a s c u a l e s p u e d e n c o m b i n a r s e d a n d o l u g a r a 6 va r i a n t e s e l e c t r o f o r é t i c a s d i f e r e n t e s , F F , I I , S S , F I , FS y IS

(ROBSON y HARRIS, 1967) (CHEN, 1 9 7 6 ) . A d e m â s, s e h a e n c o n t r a d o u n a v a r i a n t e p o c o f r e c u s n t e l l a m a d a D, l a c u a l , s e e n c u e n t r a e n i n d i v i d u o s d e G r e c i a , Haway, S u i z a y N i g e r i a (CHEN, 1 9 7 6 ) . E s t a s v a r i a c i o n e s d e t i p o g e n é t i c o n o h a n s i d o o b s e r v a d a s e n o t r o s t e ­

j i d o s r i c o s e n f o s f a t a s a a l c a l i n a . P a r a o t r o s i n v e s t i g a d o r e s , h a y t r è s i s o e n z i m a s p l a c e n t a r l a s h u m a n a s , s e p a r a d a s e n g e l d e a l m id ô n , p e r o e n s u e r o d e e m b a r a z a d a s s o l o s e h a n e n c o n t r a d o d o s b a n d a s (BOYER, 1961) (FISHMAN y GHOSH, 1 9 6 7 ) . E s t a c o n t r a d i c i ô n , p a r a a l g u n o s a u t o r e s , p u e d e n s e r d è b i d a s a d i f e r e n c i a s e n p e s o s m o l e c u l a r e s (BOYER, 1963) (GHOSH y FISHMAN, 1968) (HARKNESS, 1968) (SUSSMAN y GOTTLlER, 1 969) (GHOSH, 1969) CHEN, 1 9 7 6 ) .

La f o s f a t a s a a l c a l i n a p l a c e n t a r i a e s u n a g l i c o p r o t e i n a q u e c o n t i e p e f r u c t o s a , m a n o s a , g a l a c t o s a y s i e t e r e s i d u e s d e é c i d o s i â l i c o , e s t o s d l t i m o s p u e d e n s e r e l i m i n a d o s p o r i n c u b a ­ c i ô n c o n n e u r o a m i n i d a s a (ROBINSON y PIERCE, 1964) (GHOSH, 1969)

(MARSHALL y KAPLAN, 1 9 7 2 ) .

E l Zn e s u n e l e m e n t o e s e n c l a l d e l a e n z i m a y s u c o n t e n ^ d o e n l a f o s f a t a s a p l a c e n t a r i a e s d e l 0,15% (HARKNESS, 1 9 6 8 ) .

(25)

AMINOACIDOS EN LA FOSFATASA PLACENTARIA

AMINOACIDOS CANTIDAD DE: RESIDUOS AMINOACIDOS CANTIDAD

A l a n i n a 123 104 L i s i n a 49 - 52

A r g i n i n a 65 - 60 M e t i o n i n a 24 - 24

A s p a r a g i n a 109 - 100 P h e n i l a l a n i n a 39 - 36

C y s t e i n a 14 - - P r o l i n a 56 - 60

G l u t a m i n a 112 - 108 S e r i n a 52 - 64

G l i c o c o l a 100 - 100 T r e o n i n a 68 - 68

H i s t i d i n a 31 - 28 T r i p t o f a n o - - -

I s o l e u c i n a 38 - 36 T i r o s i n a 37 - 36

L e u c i n a 87 - 88 V a l i n a 70 - 80

E l â c i d o s i â l i c o s e e n c u e n t r a p r é s e n t e e n l a s f o s f a t a s a s a l c a l i n a s p r o c e d e n t e s d e l h u e s o , r i n ô n , h i g a d o y p l a c e n t a , h a l l â n d o s e a u s a n t e e n l a f o s f a t a s a i n t e s t i n a l (ROBINSON y PIERCE, 1964)

(GHOSH, 1969) (WILKINSON, 1970) (MARSHALL y KAPLAN, 1972) (CHEN, 1 9 7 6 ) .

E l c o e f i c i e n t e d e l a v e l o c i d a d d e s e d i m e n t a c i ô n d e l a s f o s f a t a s a s a l c a l i n a s d e h u e s o , h i g a d o e i n t e s t i n e , d e t e r m i n a d a s p o r g r a d i e n t s d e c e n t r i f u g a c i ô n e n s a c a r o s a e s s i m i l a r e n t o d a s , a p r o x i m a d a m e n t e de 7 , 5 S. C o r r e s p o n d e a u n o s p e s o s m o l e c u l a r e s d e a l r e d e d o r d e 1 5 0 . 0 0 0 (KAPLAN, 1 9 7 2 ) . E l p e s o m o l e c u l a r d e l a f o s ­ f a t a s a a l c a l i n a r e n a l e s d e 1 3 0 . 0 0 0 (BOYER, 1 9 6 1 ) . La f o s f a t a s a e n

(26)

- 9 -

c o n t r a d a e n l a o r l n a e s l a m i t a d , e n p e s o m o l e c u l a r , q u e l a r e n a l (BUTTERWORT, 1 9 6 5 ) .

M e d i a n t e l a t é c n l c a d e f i l t r a c l d n , e n c o lu m n a d e S e p h a - d e x G - 2 0 0 , l e s p e s o s m o l e c u l a r e s d e l a s f o s f a t a s a s e n l o s t e j i d o s d e h î g a d o , i n t e s t i n e , h u e s o y r i n ô n s o n d e 2 2 5 . 0 0 0 , 1 9 0 . 0 0 0 , 1 8 0 . 0 0 0 y 1 7 0 . 0 0 0 r e s p e c t i v a m e n t e (MOSS, 1 9 7 0 ) . Se d e s c o n o c e l a c a u s a d e e s t a d i f e r e n c i a e n l o s p e s o s m o l e c u l j u r e s e n t r e u l t r a c e n -

t r i f u g a c i d n y c o l u m n a s d e S e p h a d e x ; p o s i b l e m e n t e , s e a d e b i d o a l p o r c e n t a j e d e c a r b o h i d r a t o s (KAPLAN, 1972) .

Con t é c n i c a s i r a n u n o l 6 g i c a s s e o b s e r v a n d i f e r e n c i a s e s - t r u c t u r a l e a . C uando s e i n y e c t a n a l c o n e j o h o m o g en ad o s d e l o s t e ­ j i d o s , s e o b s e r v a n t r è s g r u p o s a n t i g é n l c o s : e l p r i m e r g r u p o I n d u y e h i g a d o , h u e s o , b a z o y r i n 6 n , e l s e g u n d o l a f o s f a t a s a i n t e s t i ­ n a l y e n e l t e r c e r o l a p l a c e n t a r i a . Se e n c o n t r ô una b a j a e s p e c i f i c i d a d p r o t r a t a r s e d e u n a r e a c c i d n c r u z a d a e n t r e l o s a n t i g è n e s y a n t i c u e r p o s d e l o s d i f e r e n t e s t e j i d o s (BOYER, 1963) (KAPLAN, 1 9 7 2 ) . S i s e u s a n como a n t l g e n o s t e j i d o s p u r i f i c a d o s s e h a c o m p r o b a d o u n a m a y o r e s p e c i f i c i d a d d e l a f o s f a t a s a c o r r e s p o n d i e n t e a l t e j i d o c o n - s i d e r a d o . A s l , s e e n c u e n t r a q u e l o s a n t i c u e r p o s d e l a f o s f a t a s a h e p S t i c a y p l a c e n t a r i a e r a n e s p e c i f i c o s d e s u s r e s p e c t i v e s h o m d l o g o s , p r e s e n t a n d o p o r e l l o , e s p e c i f i c i d a d d e d r g a n o y n o p r e s e n t a n d o r e a c c i d n c o n l a s f o s f a t a s a s a l c a l i n e s de h u e s o , i n t e s t i n e y r i n Ô n

(SUSSMAN y c o l . , 1 9 6 8 ) .

1 . 1 . 2 . E s t a b i l i d a d

La e s t a b i l i d a d s e p u e d e c o n s i d é r e r como l a r e s i s t e n c i a q u e o f r e c e l a e n z i m a a l a p e r d i d a d e s u a c t i v i d a d c a t a l i t i c a p o r d e t e r m i n a d o s a g e n t e s . E s t a p é r d i d a de a c t i v i d a d p u e d e s e r t o t a l o r e c u p e r a r s e p a r c i a l m e n t e u n a v e z q u e h a c e s a d o l a a c c i ô n d e l

(27)

a g e n t e . G e n e r a l m e n t e , l a e s t a b i l i d a d e s t S l i g a d a a c a m b i o s e s t r u c t u r a l e s , como fo rm a t e r c i a r i a de l a p r o t e i n a o b i é n b l o g u e o s zona l e s .

Los a g e n t e s p u e d e n s e r d e v a r i o s t i p o s : F l s i c o s : T e m p e r a t u r e , t i e m p o .

F î s i c o - q u ï m i c o s ; pH, u r e a , i o n e s m e t  l l c o s , q u e l a n t e s . Q u î m i c o s : N e u r o a m i n i d a s a , a m i n o â c i d o s .

E l c o n o c i m i e n t o d e l a e s t a b i l i d a d d e l a s e n z i m a s f r e n t e a l a a c c i ô n d e d i v e r s e s a g e n t e s t i e n e i m p o r t a n c l a a n a l î t i c a y p o r t a n t o c l l n i c a .

1 . 1 . 2 . 1 . T e m p e r a t u r a

A l a t e m p e r a t u r a a m b i a n t e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a e s g e n e ­ r a l m e n t e muy a s t a b l e e n s o l u c i ô n n e u t r e o l i g e r a m e n t e a l c a l i n a . A l a u m e n t a r l a t e m p e r a t u r a l a e n z i m a s u f r e t r a n s f o r m a c i o n e s q u e p u e d e n l l e g a r a s e r i r r é v e r s i b l e s .

E l e f e c t o d e l a t e m p e r a t u r a f u é e s t u d i a d o c o n f i n e s d i a £ n ô s t i c o s p a r a d i s t i n g u i r l o s o r î g e n e s d e l a s d i f e r e n t e s f o s f a t a ­ s a s (MOSS, 1 9 7 0 ) , (WILKINSON, 1970) (FERNLEY, 1971) (KAPLAN, 1972)

(TSUNG, 1974) (BOTEY, 1975) (LILLIAN, 1976) (KAZUMASA, 1 9 7 7 ) .

La f o s f a t a s a 6 s e a p r o c e d e n t e d e s u e r o s d e p a c i e n t e s c o n e n f e r m e d a d e s ô s e a s q u e d a p r S c t i c a m e n t e i n a c t i v a d a a l a t e m p e r a t u ­ r a d e 5 6 °C d u r a n t e 15 m i n û t o s . La f o s f a t a s a h e p â t i c a e s a l g o mâs r e s i s t e n t e a l c a l o r . L as i s o e n z i m a s p l a c e n t a r i a e i n t e s t i n a l s o n mucho mSs r e s i s t e n t e s a l c a l o r q u e l a s i s o e n z i m a s ô s e a y h e p â t i - c a . La a c t i v i d a d e n z i m S t i c a r e s i d u a l d e s p u d s de 15 m i n u t e s a 5 6 “C

(28)

11 -

- e s d e 2 1 , 1 1 , 90 y 87$ r e s p e c t e a l a a c t i v i d a d i n i c i a l , p a r a l a s f o s f a t a s a s h e p & t i c a , 6 s e a , I n t e s t i n a l y p l a c e n t a r i a (KAPLAN, 1 9 7 2 ) . La i s o e n z i m a h e p a t o b i l l a r p r é s e n t a a l c a l o r u n a r e s i s t e n ­ c i a a l g o m ayor q u e l a I s o e n z i m a h e p d t l c a , p o s i b l e m e n t e d e b i d o a q u e l a e n z i m a h e p a t o b i l l a r a l d e r i v a r d e l a i s o e n z i m a h e p â t i c a p o r a d i c i ô n d e u n g r u p o f o s f a t i d i l c o l l n a a s u m o l é c u l a , a l c a n c e u n a e s t r u c t u r a mâs a s t a b l e (KAPLAN, 1972) (CHEN, 1 9 7 6 ) .

La f o s f a t a s a a l c a l i n a p l a c e n t a r i a s e d i s t i n g u e d e l a s o t r a s f r a c c i o n e s p o r s u a l t a e s t a b i l i d a d a l c a l o r , s u a c t i v i d a d n o c a m b i a d e s p u â s d e 30 m i n u t e s a 70®C (NEALE y c o l . , 1 9 6 5 ) . E l s u e r o d e l a e m b a r a z a d a e n e l d l t i m o t r i m e s t r e p o s e e u n a g r a n r e s i s t e n c i a a l c a l o r , p o r l o c u a l , s u f o s f a t a s a s e c o n s i d é r a c a s i i n t e g r a m e n t e d e o r i g e n p l a c e n t a r i o (MCMASTER y c o l . , 1964)

(CHIANDÜSI y c o l . , 1962) (LATNER, 1 9 6 5 ) . A l a s mism as c o n c l u s i o n é s s e h a l l e g a d o a p l i c a n d o t â c n i c a s i n m u n o l ô g i o a s (BIRKEC y c o l . , 1 9 6 6 ) . E l s u e r o d e l f e t o n o c o n t i e n s f o s f a t a s a s a l c a l i n a s a s t a b l e s a l c a l o r , d e l o q u e s e i n f i e r e q u e s u a c t i v i d a d f o s f a - t â s i c a n o t i e n e un o r i g e n p l a c e n t a r i o (KITCHENER y c o l . , 1 9 6 5 ) .

La e s t a b i l i d a d a l c a l o r d e l a f o s f a t a s a p l a c e n t a r i a h a s i d o a p r o v e c h a d a p a r a s e g u i r e l c u r s o d e l a f u n c i ô n p l a c e n t a r i a . A s l , un f a l l o m a t e r n e f e t a l e n e l d l t i m o t r i m e s t r e d e u n a g e s t a - c i 6 n d a l u g a r a u n a b a j a a c t i v i d a d f o s f a t â s i c a p l a c e n t a r i a e n e l s u e r o , l o c u a l , s e e n c u e n t r a d e a c u e r d o c o n e l e s t r i o l u r i n a r i o

(MESSER, 1967) (CURZEN y MORRIS, 1 9 6 8 ) .

La d e t e r m i n a c i ô n d e l a v i d a m e d ia d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a p l a c e n t a r i a p u e d e e f e c t u a r s e m e d i a n t e un m â to d o b a s a d o e n s u e s t a b i l i d a d t é r m i c a , e n s a y a n d o s u a c l a r a m i e n t o t r a s s e r i n y e c t a - d a i n t r a v e n o s a m e n t e e n s u j e t o s n o r m a l e s . Se ha e n c o n t r a d o q u e en l a c i r c u l a c i ô n s a n g u î n e a l a d u r a c i ô n d e l a i s o e n z i m a p l a c e n t a r i a s i g u e u n a e c u a c i ô n m u l t i f â s i c a e x p o n e n c i a l p a r e c i d a a l a c l a r a -

(29)

m i e n t o d e l a s p r o t e i n a s s a n g u l n e a s i n y e c t a d a s (CLUBB y c o l . , 1 9 6 5 ) .

La e s t a b i l i d a d a l c a l o r d e l a s i s o e n z i m a s R e g a n y N a g a o e s a l t a y s i m i l a r a l a p l a c e n t a r i a (FISHMAN, 1968) (NAKAYAMA y c o l . , 1 9 70) (CHEN, 1976) (KAZUMASA, 1 9 7 7 ) . I g u a l e s t a b i l i d a d a l c a l o r l a t i e n e n l a f o s f a t a s a d e s u j e t o s c o n c S n c e r b r o n c o g é n i c o y m e t â s t a s i s s e c u n d a r i a s e n l a s c â p s u l a s s u p r a r e n a l e s , b a z o , n ô n y c e r e b r o ; s e a p a r t a d e e s t e c o m p o r t a m i e n t o e l c â n c e r d e hjC

g a d o y h u e s o .

1 . 1 . 2 . 2 . U re a

La i n a c t i v a c i ô n de l o s h o m o g e n a d o s d e t e j i d o s r l c o s e n f o s f a t a s a p o r t r a t a m i e n t o c o n u r e a h a s i d o e x t e n s a m e n t e e s t u d i a d o (BUTTERWORTH y MOSS, 1967) (BAHR y WILKINSON, 1967) (BIRKETT y c o l . , 1967) (MOSS, 1970) (FERNLEY, 1971) (ESBRIT y c o l . , 1975)

(CHEN, 1 9 7 6 ) .

S e ha o b s e r v a d o q u e l o s h o m o g e n a d o s d e h i g a d o y l o s s u e r o s d e e n f e r m o s c o n l e s i o n e s h e p â t i c a s t r a t a d o s c o n u r e a a b a j a c o n c e n t r a c i ô n s e p r o d u c e u n a a c t i v a c i ô n d e l a e n z i m a , m i e n t r a s q u e c o n c o n c e n t r a c i o n e s de u r e a mSs a l t a s t i e n e n l u g a r u n a i n a ç t i v a c i ô n , d e p e n d i e n d o ê s t a d e l t i e m p o d e i n c u b a c i ô n , pH y de l a t e m p e r a t u r a (WILKINSON, 1 9 7 0 ) .

L a s f o s f a t a s a s mâs r e s i s t e n t e s a l t r a t a m i e n t o c o n u r e a s o n l a i n t e s t i n a l y l a p l a c e n t a r i a , m i e n t r a s q u e l a s f o s f a t a s a s r e n a l , h e p â t i c a y 6 s e a s o n mâs s e n s i b l e s a d i c h a s u s t a n c i a (WIL KINSON, 1 9 7 0 ) .

La f o s f a t a s a p l a c e n t a r i a a 3 7 °C t i e n e u n a v i d a m e d ia de

(30)

- 13 -

■3 h o r a s e n u r e a 8 M, m i e n t r a s q u e l a e n z im a ô s e a e n u r e a 3 M t i e n s una v i d a m e d ia d e s o la m e n te 7 m i n u t o s , y l a i n t e s t i n a l t i e n e u n a V id a m e d ia i n t e r m e d i a (FERNLEY, 1 9 7 1 ) .

P a r a l a d e t e r m i n a c i ô n d e l o s ô r g a n o s d e p r o c e d e n c i a de l a f o s f a t a s a a l c a l i n a e n e l l a b o r a t o r i o r e s u l t a n mucho mâs f â c i - l e s l o s e n s a y o s b a s a d o s e n e l c a l o r q u e l o s c ô r r e s p o n d i e n t e s c o n s o l u c l o n e s d e u r e a . E s t e ô l t l m o p r o c e d i m i e n t o n o p r é s e n t a v e n t a - j a s y l a s c o n c l u s i o n e s a q u e s e l l e g a s o n a n â l o g a s a l a s o b t e n i - d a s m e d ia n te c a l o r (CHEN, 1976) .

1 . 1 . 2 . 3 . I o n e s y a g e n t e s q u e l a n t e s

La f o s f a t a s a a l c a l i n a r e a c c i o n a d e fo rm a v a r i a d a a l a d i - c i o n a r l e m e t a l e s d i v a l e n t e s . Se o b s e r v a u n a a c t i v a c i ô n d e l a e n ­ zim a a l a d i c i o n a r l e l o s i o n e s C o, Mg y Mn (MORTON, 1955) (PORT- MAN, 1957) (AHMEN.y KING, 1960) (FERNLEY, 1 9 7 1 ) . E l EDTA, como c o R ip le ja n te d e â s t o s m e t a l e s , a c t ô a como un i n a c t i v a d o r d e l a e n

zim a (AIDA y SOTO, 1 9 7 2 ) .

No to d o s l o s i o n e s m e t â l i c o s p r o d u c e n l a m ism a v a r i a c i ô n d e l a a c t i v i d a d o i g u a l c o n c e n t r a c i ô n d e l o s i o n e s a d i c i o n a d o s , a s l l o s i o n e s Be y Zn o r i g i n a n i n h i b i c i o n e s s i g n i f i c a t i v a s m ie n - t r a s q u e l o s i o n e s C a, N i y Cd t i e n e n un e f e c t o i n h i b i t o r i o m âs d â b i l q u e l o s a n t e r i o r e s (FERNLEY, 1 9 7 1 ) .

L as f o s f a t a s a s Ô sea y h e p â t i c a so n i n h i b i d a s , a p ro x im a d a m e n te e l 70%, c o n e l i ô n N i lO "^ M, (AIDA y SOTO, 1 9 7 2 ) . La i n h i b i c i ô n p r o d u c i d a p o r e l iÔn Zn e s i n d e p e n d i e n t e d e l o r i g e n d e

l a s f o s f a t a s a s (AIDA y SOTO, 1 9 7 2 ) . En p r e s e n c i a d e g l i c i n a n o s e ha o b s e r v a d o i n h i b i c i ô n p o r e l i ô n Zn (HARKNESS, 1968) (FERN LEY, 1 9 7 1 ) . La i n h i b i c i ô n o b t e n i d a c o n e l i ô n Be e s t â e n i n t i m a

(31)

d e p e n d e n c l a d e l o s s u s t r a t o s (FERNLEY, 1 9 7 1 ) . La i n h i b i c i ô n p o r l o s i o n e s Be y Zn e s r e v e r s i b l e p o r a d i c i ô n d e l i ô n Mg (MORTON, 1 9 5 5 ) . La c i n é t i c a d e i n h i b i c i ô n p o r e l i ô n Zn s e d e s c o n o c e , p u e d e s e r u n a i n h i b i c i ô n no c o m p e t i t i v a o b i e n u n a m e z c la d e c o m p e -

t i t i v a y n o c o m p e t i t i v a (FERNLEY, 1 9 7 1 ) .

Ha s i d o e s t u d i a d a l a c i n Ô t i c a p o r a d i c i ô n d e l i ô n Mg (MORTON, 1955) (FERNLEY, 1 9 7 1 ) . La r e a c c i d n d e l a f o s f a t a s a p o r e l i ô n Mg, p r é s e n t a u n a a c t i v a c i ô n c o n s t a n t e h a s t a l l e g a r a l a c o n c e n t r a c i ô n d e 500 gM. E l iô n Mg n o p r e s e n t s n in g u n a a f i n i d a d co n e l s u s t r a t o , s i n e m b a rg o , p r o d u c e e f e c t o s d i f e r e n t e s s e g d n e l pH d e l roism o. En o b s e r v a c i o n e s p o s t e r l o r e s , s e h a c o m p ro b a d o q u e l a i n h i b i c i ô n d e l a f o s f a t a s a p l a c e n t a r i a p o r l a L - f e n i l - a l a n i n a s e r é c u p é r a s u a c t i v i d a d , p o r l a a d i c i ô n d e l i ô n Mg, e l c u a l , i n c r e m e n t a e n fo rm a n o t a b l e e l n û m ero d e c e n t r o s a c t i v e s ,

(FERNLEY, 1 9 7 1 ) . A p a r t é d e ô s t a a c c i ô n , h a y q u e c o n s i d e r a r l a hi^

p ô t e s i s d e q u e e l i ô n Mg, f a c i l i t e l a r e d i s t r i b u c i ô n d e l i ô n Zn d e l o s c e n t r o s a c t i v e s d e l a e n z im a (FERNLEY, 1 9 7 1 ) .

L os a g e n t e s q u e l a n t e s como e l EDTA, 8 - h i d r o x i q u i n o l i n a , o r t o - f e n a n t r o l i n a , a - a ' d i p i r i d i l , e t c . , s e c o m p o r ta s como f u e r - t e s i n h i b i d o r e s . La a c t u a c i ô n d e l EDTA s e p r o d u c e a l s e r co m p le ja d o e l m é t a l , a u n q u e l a r e a c c i ô n p u e d e s e r r e v e r s i b l e c o n aUmen t o d e l a s c o n c e n t r a c i o n e s d e Zn (PLOCKE y c o l . , 1 9 6 2 ) .

1 . 1 . 2 . 4 . pH

A l a t e m p e r a t u r a a m b i a n t e , l a f o s f a t a s a a l c a l i n a e s g e n e r a l m e n t e muy a s t a b l e e n s o l u c i ô n n e u t r a o l i g e r a m e n t e a l c a l i n a , p e r o e n c a m b io , e s muy p o c o a s t a b l e e n m e d io s S c id o s co n l a co n s i g u i e n t e p é r d i d a d e a c t i v i d a d (FERNLEY, 1 9 7 1 ) . A s f , un pH 3 ,5 d u r a n t e 20 m in u to s a 0 °C , c a u s a c a s i l a c o m p lé ta i n a c t i v a c i ô n d e

(32)

15

l a e n z im a o s e a , m l e n t r a s q u e l a e n z im a h e p â t i c a , e n l a s m ism as c o n d i c i o n e s , p r é s e n t a u n a a c t i v i d a d r e s i d u a l d e l 50% (WILKINSON, 1 9 7 0 ) . C uan d o l a f o s f a t a s a a l c a l i n a s e in c u b a a pH 3 ,3 o p o r d e b a j o d e â l l a I n a c t i v a c i ô n e s c a s i t o t a l , s i e n d o l a r e a c t i v a c i ô n a pH 7 muy p e q u e n a . La f o s f a t a s a p l a c e n t a r i a , d e s p u é s d e l t r a t a ­ m ie n to a pH 2 ,3 y 4*C, q u e d a c o m p le ta m e n te i n a c t i v a d a (SUSSMAN y -GOTTLIEB, 1969) (FERNLEY, 1 9 7 1 ) .

E l t r a t a m i e n t o p r o l o n g a d o c o n â c i d o s p r o d u c e e n l a e n z i ­ ma c a m b io s c o n f o r m a c i o n a l e s e n l a e s t r u c t u r a de l a p r o t e i n a

(SUSSMAN y GOTTLIEB, 1969) (WILKINSON, 1970) (FERNLEY, 1 9 7 1 )-

1 . 1 . 3 . I n h i b i d o r e s y a c t i v a d o r e s

E x i s t e n u m e ro s a l i t e r a t u r a s o b r e i n h i b i d o r e s y a c t i v a d o r e s d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a co n e l p r o p ô s i t o d e d i l u c i d a r q u e t e j i d o s l a p r o d u c e n y s u d i f e r e n c i a c i ô n .

Los p r i m e r o s e s t u d i o s d e i n h i b i c i ô n p o r c i a n u r o f u e r o n r e a l i z a d o s e n a n i m a l e s (CLOEETENS, 1939) (DRILL y RIGGS, 1946) . La i n h i b i c i ô n p o r c i a n u r o ta m b ié n h a s i d o r e a l i z a d a e n l a f o s f a t a s a i n t e s t i n a l h u m an a; s e t r a t a d e u n a i n h i b i c i ô n d e t i p o com - p e t i t i v o (SCHMIDT y THANHAUSER, 1 9 4 3 ) .

E l p r i m e r i n h i b i d o r e s t u d i a d o d e l a f o s f a t a s a ô s e a f u e ­ r o n l a s s a l e s b i l i a r e s . Se o b s e r v ô q u e Ô s t a s s a l e s n o i n h i b f a n l a s f o s f a t a s a s i n t e s t i n a l n i l a p l a c e n t a r i a (BODANSKY, 1937)

(FISHMAN, 1 9 6 7 ) .

Los a m in o â c id o s s e c o n s i d e r a n como i n h i b i d o r e s e s p e c i f i

C O S d e ô r g a n o (CHEN, 1 9 7 6 ) . La f o s f a t a s a a l c a l i n a i n t e s t i n a l e s i n h i b i d a p o r l a L - f e n i l - a l a n i n a , p e r o no p o r l a D - f e n i l - a l a n i n a .

(33)

(FISHMAN y c o l . , 1963) (POSEN y c o l . , 1967) (GHOSH y FISHMAN, 1968) (NAGODE y c o l . , 1969) (FERNLEY y WALKER, 1970) (USATEGUI QDMEZ, 1974) (CHEN, 1 9 7 6 ) (LILLIAM, 1976) ( KAZUMASA y c o l . , 1 9 7 7 ) . La is o e n z im a p l a c e n t a r i a e s i n h i b i d a p o r l a l - f e n i l - a l a n i n a (FISHMAN y GHOSH, 1 9 6 7 ) , p o r e l L - t r i p t Ô f a n o (LIN y c o l . , 1 9 7 1 ) , y p o r 1 - l e u c i n a (NAKAYAMA y c o l . , 1970) (LILLIAM, 1 9 7 6 ) . La f o s f a t a s a a l c a l i n a ô s e a y h e p â t i c a s o n i n h i b i d a s p o r l o s s i - g u i e n t e s a m i n o â c i d o s : L - h o m o a r g i n i n a (KELLEN y LUSTING, 1971)

(LILLIAM, 1 9 7 6 ) , p o r e l i m i d a z o l (BRUNEL y CATHALA, 1972) y p o r e l l e v a m i s o l (BELLE y VAN, 1 9 7 2 ) , l a L - h i s t i d i n a p r o d u c e u n d e s p l a z a m i e n t o e n g e n e r a l d e l pH ô p tim o d e l a a c t i v i d a d e n z i m â t i c a

(BODANSKY, 1948) (FISHMAN y c o l . , 1963) (BODANSKY y SCHWARTZ, 1 9 6 3 ) . T o d a s â s t a s i n h i b i c i o n e s s o n de t i p o n o c o m p e t i t i v e y e £ t e r e o e s p e c î f i c o (FISHMAN, 1 9 7 4 ) .

La e s t a b i l i d a d a l a t e m p e r a t u r a d e l a s f o s f a t a s a s s â r i - c a s y e n h o m o g en ad o s s e u t i l i z a f r e c u e n t e m e n t e e n e l l a b o r a t o r i o p a r a c o n o c e r l a p r o c e d e n c i a d e l a s I s o e n z i m a s . E s t e t r a t a m i e n t o e s de g r a n i m p o r t a n c i a e n e l c a s o d e l a s is o e n z i m a s h e p â t i c a s y ô s e a s , l a s c u a l e s t i e n e n u n a m o v i l i d a d e l e c t r o f o r é t i c a muy p a r e c i d a e n e l g e l . E l p r o c e d i m i e n t o p a r a d i f e r e n c i a r l a s c o n s i s t e en c a l e n t a r e l s u e r o a 5 5 “C , e n s u e r o s p r o c é d a n t e s d e s u j e t o s c o n e n f e r m e d a d e s ô s e a s y h e p â t i c a s y d e t e r m i n a r l a v i d a m e d ia d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a ; é s t a s s o n d e 112 s e g u n d o s p a r a l a Ô sea y 456 s e g u n d o s p a r a l a h e p â t i c a (MOSS, 1 9 7 6 ) . O tr o e n f o q u e e s c o n s i d e ­ r a r l a i n a c t i v a c i ô n t o t a l a l a t e m p e r a t u r a a n t e r i o r m e n t e i n d i c a - d a , p r o d u c i ë n d o s e p a r a l a i s o e n z im a ô s e a e n 5 a 6 m i n u t o s , d e 30 a 40 m in u to s l a h e p â t i c a y a l r e d e d o r d e 60 m in u to s l a i n t e s t i n a l , q u e d a n d o s i n a f e c t a r l a p l a c e n t a r i a (MOSS, 1 9 7 0 ) .

La i n h i b i c i ô n p o r l a u r e a fuÔ e s t u d i a d a p o r B i r k e t y c o l . e n 1 9 6 7 , s e g d n e s t o s a u t o r e s , l a s r e c u p e r a c i o n e s e n t a n t o s p o r

(34)

- 17 -

c i e n t o d e a c t i v i d a d r e s i d u a l p a r a l a s d i f e r e n t e s is o e n z i m a s e s d e 7 4 , 5 2 , 38 y 1 7 , p a r a l o s s i g u i e n t e s g r u p o s e s t u d i a d o s , s u e r o d e e m b a r a z a d a , s u e r o d e e n f e r m o s h e p â t i c o s , s u e r o d e s u j e t o s n o r m a l e s , s u e r o d e e n f e r m o s co n e n f e r m e d a d e s ô s e a s . E l e x p e r i - m e n to l o b a c l a p r e v i a i n c u b a c i ô n d e 14 m in u to s e n 3 M d e u r e a .

En h o m o g e n a d o s, l a f o s f a t a s a i n t e s t i n a l e s mâs r e s i s t e n t e a l a a c c i ô n d e l a u r e a q u e l a f o s f a t a s a r e n a l (BUTTERWORTH y MOSS, 1 9 6 7 ) .

Un p o t e n t e i n h i b i d o r d e l a s f o s f a t a s a s so n l a s s a l e s d e EDTA q u e a c o n c e n t r a c i o n e s d e 10/mM i n h i b e l a s i s o e n z im a s h e p â ­ t i c a , ô s e a , r e n a l , i n t e s t i n a l , s o l o e s r e s i s t e n t e a e s t e t r a t a ­ m i e n t o l a is o e n z i m a p l a c e n t a r i a (WILKINSON, 1 9 7 0 ) .

E n t r e l o s a c t i v a d o r e s s e e n c u e n t r a l a u r e a , q u e a c o n ­ c e n t r a c i o n e s d e 0 , 5 M p r é s e n t a m a rc a d a a c t i v a c i ô n e n l o s e s t r a c t o s h e p â t i c o s y o c a s i o n a l m e n t e e n l o s s u e r o s p r o c e d e n t e s d e e n ­ fe r m e s h e p â t i c o s (WILKINSON, 1 9 7 0 ) . E l i ô n Mg e s un a c t i v a d o r d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a p e r o s u a c c i ô n d i f i e r e d e l a p r o c e d e n ­ c i a d e l a e n z im a (FISHMAN, 1 9 6 7 ) . L os a m in o â c id o s a a l t a s c o n c e n t r a c i o n e s p r e s e n t a n a c t i v a c i o n e s d e l a e n z im a (AKAMATSU y KOBA- YASHI, 1951) (BODANSKY, 1 9 4 9 ) . M uchos p r o d u c t o s a c e p t o r e s d e f o s f a t o s s e c o m p o r ta s como a c t i v a d o r e s , e n v i r t u d d e e l i m i n a r e l i ô n f o s f a t o im p id le n d o l a r e a c c i ô n i n v e r s a (FISHMAN, 1 9 6 7 ) .

1 . 1 . 4 . E s t u d l o c i n ë t i c o y m é c a n ism e d e l a a c c i ô n e n z i ­ m â t i c a

Hay u n a c o n s i d e r a b l e l i t e r a t u r a r e s p e c t e a e s t u d i o s c i n é t i c o s (CLOETENS, 1939) (PORTMANN, 1957) (BINKLEY, 1961) (LAZDUNS K l y OULLET, 1961) (SARASWATHI y BACHBAWAT, 1963) (ARION y NORD-

(35)

D IE , 1964) (JENKINS y D 'A R I, 1966) (SARASWATHI y BACHBAWAT, 1966) (WOLF y c o l . , 1969) (FERNLEY, 1971) (BERGERMAN y BLETHEN, 1972) (EWEN, 1974) (KAZUMASA y c o l . , 1977) (OTANS y c o l . , 1 9 7 8 ) .

1 . 1 . 4 . 1 . E s p e c i f I c i d a d d e s u s t r a t o s y c o n s t a t e d e MICHAELIS

La f o s f a t a s a a l c a l i n a p e r t e n e c e a un g r u p o d e e n z im a s q u e p r e s e n t a n u n a b a j a e s p e c i f i c i d a d r e s p e c t e a l s u s t r a t o .

R oche y S e a r l e s (1 9 5 1 ) s u g i e r e n q u e l a a c t i v i d a d d e c a d a u n a d e l a s f o s f a t a s a s p o r l o s s u s t r a t o s p u e d e s e r v i r p a r a i n d i c a r

l a p r o c e d e n c i a d e l a s m is m a s .

C ada u n a d e l a s f o s f a t a s a s h u m an as t i e n e c i e r t a p r e f e r e n - c i a p o r un d e t e r m i n a d o s u s t r a t o . A s l , l a f o s f a t a s a i n t e s t i n a l h i - d r o l l z a e l 0 - c a r b o x i f e n i l f o s f a t o mâs r a p i d a m e n t e q u e o t r o s s u s t r a t o s (FISHMAN y c o l . , 1 9 6 2 ) , l a f o s f a t a s a a l c a l i n a p l a c e n t a r i a e s mâs a c t i v a p a r a e l p - n i t r o f e n i I f o s f a t o (SADOVSKI y ZUCKERMAN, 1 9 6 5 ) , l a f o s f a t a s a h e p â t i c a h i d r o l i z a p r e f e r e n t e m e n t e a l a e t a n o ^ a m i n a f o s f a t o (FISHMAN, 1 9 6 2 ) .

La v e l o c i d a d d e h i d r o l i s i s d i f i e r e c o n l o s s u s t r a t o s , e s r e l a t i v a m e n t e r â p i d a c o n l o s e s t e r a s d e l o s f o s f a t o s y m âs l e n t a c o n e s t e r a s d e p i r o f o s f a t o s y f o s f a t o s d e n u c l e o t i d o s (FISHMAN y -GHOSH, 1 9 6 7 ) (CHEN, 1 9 7 6 ) .

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