FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
TESIS DOCTORAL
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
José Vicente García Ramos
Madrid, 2015
© José Vicente García Ramos, 1980
Estudio por métodos espectroscópicos de la interacción de aminoácidos y homopéptidos con componentes cristalinos de
cálculos renales
Jomi Vicente Garcia Ramos
oqs
Y -
5
$ ""00i\Lj
tf 2 - YESTUDIO FOR MBTODOS BSPECTROSCOPICOS DE LA INTERAC CION DE AMINOACIDOS T HOMOPEPTIDOS CON C O W O N E N T E S
CRISTALINOS DB CALCULOS RENALES
Departamento de Bspectroscopla Facultad de Cienclas Qulmlcas Unlversidad Complutense de Madrid
1980
BIBLiq
?ECA
Complutenae de Madrid. Servicio de Reprografla Noviciado, 3 Madrid-8
Madrid, 1980 Xerox 9200 XB 480
Dep6aito Legal: M—19930—1980
E S T U D I O F O R M E T O D O S E S P E C T R O S C O P I C O S DE LA I N T E R A C C I O M DE A M I N O A C I D O S Y H O M O P E P T I D O S C O N C O M P O N E N T E S C R I S T A L I N O S DE C A L C U L O S R E N A L E S .
D i r e c t o r ; P e d r o C a r m o n a H e r n a n d e z . D o c t o r en C i e n c i a s Q u î m i c a s . C o l a b o r a d o r C i e n t î f i c o del I n s t i t u t e de O p t i c a . C . S . I . C .
Ü N I V E R S I D A D C O M P L U T E N S E DE M A D R I D F a c u l t a d de C i e n c i a s Q u î m i c a s . D e p a r t a m e n t o de E s p e c t r o s c o p î a .
E n e r o , 1 9 8 0
c o p i a M o l e c u l a r del I n s t i t u t e d e O p t i c a " D a z a d e V a l d e s " , del C o £ s e j o S u p e r i o r d e I n v e s t i g a c i o n e s C i e n t f f i c a s .
D e b o e x p r e s a r mi g r a t i t u d al Dr. P. C a r m o n a p o r la d i r e c c i ô n d e e s t e t r a b a j o y su s c o n t i n u a s o r i e n t a c i o n e s d u r a n t e la r e a l i z a c i ô n del misrao. Al Dr. A. H i d a l g o , D i r e c t o r del I n s t i t u t e de O p t i c a , p o r l as f a c i l i d a d e s e n c o n t r a d a s y, s o b r e t o d o , p o r su s v a l i o s a s sugereji c i a s e i n t e r é s .
Al Dr. L. C i f u e n t e s - O e l a t t e de la F u n d a c i ô n " J i m e n e z D i a z " , c u y o e n t u s i a s m o y d e d i c a c i ô n al t e m a f a c i l i t a r o n en g r a n p a r t e la r e a l i z a c i ô n de e s t e t r a b a j o . Al Dr. P. F. G o n z i l e z - D î a z p o r su s c o £ t t n u a s o r i e n t a c i o n e s d u r a n t e la e j e c u c i ô n del m i s m o . A la D r a . C.
de L o z é del " L a b o r a t o i r e d e S p e c t r o c h i m i e I n f r a r o u g e et R a m a n . del C . N . R . S . T h i a i s ( F r a n c i a ) p o r las f a c i l i d a d e s e n c o n t r a d a s en su ls[
b o r a t o r i o p a r a la r e a l i z a c i ô n e i n t e r p r e t a c i ô n de 1 os e s p e c t r o s IR d e las m a c r o m o l ê c u l a s e s t u d i a d a s .
Q u i e r o e x p r e s a r t a m b i é n mi g r a t i t u d a la D r a . J. Bel 1 a n a t o p o r sus c o n t i n u o s c o n s e j o s , s u g e r e n c i as y d e d i c a c i ô n .
A s i m i s m o , d e b o mi g r a t i t u d al P r o f . Dr. J. M o r c i l l o , p o r h ^ b e r a c e p t a d o s e r p o n e n t e de e s t a T e s i s .
Q u i e r o a d e m S s e x p r e s a r ml a g r a d e d m l e n t o a 1 os D o c t o r e s : C.
O r t i z , del I n s t i t u t e de O p t i c a , p o r s u s o r i e n t a c i o n e s en el e s t u d i o de la s m u e s t r a s m e d1 a n t e m i c r o s c o p l a e l e c t r ô n i c a d e t r a n s m i s i ô n ; J. A. L e a l , d el I n s t i t u t e d e I n m u n o l o g l a y B i o l o g i a M i c r o b i a n a , p o r p e r m i t i r n o s r e a l i z a r 1 os a n S l i s i s d e a m i n o â c i d o s en su L a b o r a t o r l o , y F. M o r a l e s , del I n s t i t u t e d e C e r â m i c a y V i d r i o , p o r el u s e del con^
t a d o r de p a r t i c u l e s .
A g r a d e z c o t a m b i é n a F. L ô p e z el i n t e r é s d e m o s t r a d o en la e ^ c r i t u r a a m â q u i n a d e e s t a T e s i s .
INDICE
1.- INTRODUCCION. JUSTIFICACIÜN DE ESTE TRABAJO,
Pag.
2.- ANTECEDENTES B I B L I 06RAFIC0S.
3.- PARTE EXPERIMENTAL... 8
3 .1 .- Muestras estudiadas... . 9
3 .1 *1 .— câlculos reuales. . . .... . ... .. ... . . ... . . ... . . . 9
3 .1.2.— Muestras s i n t &ticas ... . .. ... 9
3 .1.5.1.- Hidruxll-apatita no estequiornétrica ... 9
3 .1 .2 .2.- MolSculas modèle adsorbidas sobre la hidroxi1-apa^ t i t a ... 10
3 .2 .- Métodos utilizados para la separacion de la fracciôn orgânica de les cAlculos r e n a l e s ... 11
3 .2 ..1.- Cllculos consti tuidos f undament aiment e por carbona- to-apatita y fosfato amônico magnêsico hexahidrato. 11 5.2.J3.- CAlculos constituidos fundamentalmente por oxala- to cAlcico. ... 11
3 .2 .3 .- CAlculos constituidos fundamentalmente por cistina. 12 3 .3 .- Método utilizado para la hidrôli si s de las prote^nas contenidas en la fracciôn o r g ô n i c a ... 12
3 .4 .- Anôlisls c o l o r imôtricos ... . . . . ... 13
3 .4 .1 .- Determinaciôn colorimétrica de aminoacidos y pépti — do s ... 13
3 .4 .2 .- De termina ci ôn colorimétri ca del f ô s f o r o ... 13
3 .5 .- Slntesis de la hidroxil-apatita no e s t equiométrica... 14
3 .6 .- Calcinaciôn de muestras de a p a t i t a ... 14
3.7>~ Muestras d e u t e r a d a s ... 14
3. 7.1. - N-metil acetamida N-deuterada ... 14
3.7.2.- Acidb poli-L-glutSmico N - d e u t e i a d o ... . 15
3 .7 .3 .- Poli-L-glutamate cAlcico N - d e u t o r a d o ... 15
3 .7 .3 .1 .- Preparociôn del nitrate cAlcico atihidro... 15
3 .7 .3 .2.- Obtencion del poli-L-glutamato côlcico N-deute- r a d o ... 15
3 .7 .4 .- Apatitas d e u t e r a d a s ... 16
3 .7 .4.1.- Preparacion de P O ^ D N a ^ . ... 16
3 .7.4.2.— Preparacion de apatitas d e u t e r a d a s . ... 16
3 .8 .- Determineci6n de los parSmetros de la red de la h i droxil-apati ta no es t e q u i o m é t r i c a . . ... 16
3 .9 .- Nucleaciôn de cristales de hidroxil-apatita no este— q u i o m é t r i c a . . . . ... 17
3 .9 .1 .- I'ateriales... 17
3 .9 .1.1.- Preparacién de las disoluciones de d o r u r e cSl- ciCO y fosfato d i s o d i c o ... 17
3 .9 .1.2.- Preparacién de las disoluciones de las molecu les m o d e l o ... 17
3 .9 .2 .- Pre ci pi ta ci on de la hidroxil-apati t a ... 18
3 .9 .3 .- Nucleaciôn de cristales de b r u s h i t a ... 20
3 .9 .3 .1 .- Preparacion de las disoluciones de cloruro cél- cico y fosfato d i s ô d i c o ... 20
3 .9 .3 .2.- Preparacién de las disoluciones de las moléculas m o d e l o ... . 20
3 .9 .3 .3 .- Pr eci ni ta ci on de la b r u s h i t a ... 21
3 .1 0 .3 .- Adsorclén de pépt i d o s . . . ... 25
3 .1 0 .3 .1 .- P o l i - g l l c l n a ... 25
3 .1 0 .3 .2 .- Acldb Poll-L-aspârtico... 25
3 .1 0 .3 .3 .- Acido P o l l - t-glutémico... 26
3 .1 0 .4 .- Croclmlento de cristales de hidroxil-apatita no estequiométrica... « ... 27
3 .1 1 .- Técnicas instrumentales ... 28
3 .1 1 .1 .- Espectroscopîa de absorciôn in f r a r r o j a ... 28
3 .1 1 .1 .1 .- Preparacién de m u e s t r a s ... 28
3 .1 1 .1 .1 .1 .- Muestras s é lidas ... 28
3 .1 1 .1 .1 .2 .- Muestras l i q u i d a s ... 31
3 .1 1 .1 .1 .3 .- Disoluciones... 31
3 .1 1 .1 .2 .- Anélisis cualitativo... ... 31
3 .1 1 .1 .3 .- Anélisis cuantitativo... 32
3 .11.1 .3 .1 .- Dosificacién de los componentes cristalinos de los câlc u l o s... 35
3 .1 1 .2 .- Espectroscopîa UV y v i s i b l e ... ... 40
3 .1 1 .3 .- Espectroscopîa de absorcién a t é m i c a ... 4O 3 .1 1 .4 .- Difraccién de Rayos X. ... ... 4 1 3 .1 1 .5 .- Difraccién de Rayos X a bajo é n g u l o ... 41
3 .1 1 .6 .- Cromatografla de camblo i é n i c o ... 42
3 .1 1 .7 .- Medida de superficies especlficas ... 42
3 .1 1 .8 .- Medida de agregacién de c r i stales ... 43
3.11.9.- Microscopla electrénica... . 45
4.- CALCULOS TEORICOS... 46
4.1.- Detorminaci6n de la conformaciôn mSs eatable del l6n a s p a r t a t o ... 47
4.2.- Conforma ci 6n de las roacromol'éculas modelo y célculo de las distancias interaniônicas. ... 47
4.2.1.- Homopéptidos. ... 51
4.2.2.- Acido poliecrllico... 53
3.-RESULTAD0S... 55
5.1.- Anélisis de las fraccionos orgénicas de célculos re n a l e s ... 56
5.2.- Nucleacién de hidroxil-apatita no estequiométrica 59 5.3.- Adsorcién de moléculas modelo. ... 65
5. 3.1.- N-metil a c e tamida... 65
5 .3 .2 .- Acidos L-aspértico y L-glutémico. ... 65
5 .3 .2 .1 .- Espectros infrarrojos de las muestras calcinadas.. 79
5 .3 .2.2.- Superficies especlficas... 79
5 . 3 . 2. 3 . - Medida de las relaciones C a / P ... 79
5 .3 .3 .- L-arginina... 82
5 .3 .3 .1 .- Espectro infrarrojo de la muestra calcinada ... 86
5 .3 .3 .2.- Superficies especlficas ... 86
5 .3 .3 .3 .- Medida s de las relaciones C a / P ... 86
5 .3 .4 .- Ilomopéptidos... ... . 91 5 .3 .4.1.- Poli-glicina... g ^
Pég- 5 .3-4.2.- Acido poli- L - a s p a r t i C O ... 91 3 .3 .4 .3 .- Acido poli-L-glutAmico. . ... 94 5 .3 .5 .- Difraccién de Rayos X a bajo é n g u l o ... ^03 5 .3 .6 .- Microscopla e l o c t r é n i c a ... j04 5 .3 .7 .- Crecimiento de cristales de hidroxi1-apatita no es^
tequiométri c a . . . ... » 1Q9 5 .3 .8 .- Agregacién de cristales de hidroxil-apatita no es
tequiométrica ... . . ... 121
6.- D I S C U S I O N ... 126 6.1.- Mecanismo de la nucleacién de la h i d r oxil-apatita no
estequio m é t r i c a ... 127 6.1.1.- Influencia de la estructura de las moléculas m o d e
l o ... 128 6.1.1.1.- Relacién entre las distancias interaniénicas de
las macromoléculas y las distancias intercatié- nicas de la celdilla unidad de la h i droxil-apa
t i t a ... 129 6.1.1.2.- Nûmero de particules y su relacién con el meca
nismo de nucleacién heterogénea de la hidroxil- apati t a ... 136 6 .1 .1 .3 .- Influencia de la concentracién de las moléculas
modelo con respecto a las de calcio y fésforo.... 137 6.2.- Crecimiento de cristales de hidroxil-apatita no es
t e quiométrica... 139
6.2.1.- Naturaleza de la in t era c ci én de las moléculas mo-
delo estudiadas con la hidroxil-apatita no este- quiomêtrica y su conformaclén en la superficie
ap atltica.. ... 141
6.2.1.1.- N-metil acetamida. ... 141
6 .2.1.2.- Acidos L-aspértico y L - glutémico... 147
6.2.1.3 .- L-arginina . . . 155
6.2.1.4.- ; Poli-glicina... 157 6 .2.1 .3 .- Acidos poli-L-aspértico y poll-L-glutémico...i ... 15g 6.2.8.- Influencia de la estructura de las macromoléculas
estudiadas en el crecimiento de cristales de hidro^
x i l-apatita... 152
6 .3 .- Agregacién de cristales de hidroxil-apatita no este
quiométrica... 166 6.4.- Composicién qulmica de la fraccién orgénica de los
célculos renales y su relacién con los componentes
cristalinos de aqué l l o s ... ... 169
7.- CONCLUSIONES... 175
8 .- BIBLIOGRAFXA ... .. igi
e n f e r m e d a d e s m S s f r e c u e n t e s p a d e c i d a s p o r el N o m b r e , y a p e s a r de los e s t u d l o s r e a l I z a d o s s o b r e e s t e t e m a , q u e d a n p o r a c l a r a r n u m e r o s a s cues^
t i o n e s r e l a t i v e s a l a s c a u s a s q u e d e t e r m i n a n la f o r m a c i ô n de a q u e l l o s . A c e r c a del m e c a n i s m o d e f o r m a c i ô n de l o s c â l c u l o s , la h i p ô t e s i s m â s a c e p t a d a s u p o n e q u e en d i c h o m e c a n i s m o t r a n s c u r r e n d o s f a s e s . P r i m e r ^ m e n t e t i e n e l u g a r u n a f a s e de n u c l e a c i ô n d u r a n t e la c u a l se f o r m a n mj_
c r o c r i s t a l e s en el m e d i o s o b r e s a t u r a d o d e la sal p r e c i p i t a b l e . En se- g u n d o l u g a r , lo s e m b r i o n e s c r i s t a l i n o s f o r m a d o s c r e c e n y se a g r e g a n pa ra f o r m e r p a r t i c u l a s m a y o r e s , q u e p u e d e n s e r r e t e n i d a s en el a p a r a t o u r i n a r i o .
U n o de l os p r i n c i p a l e s p r o b l è m e s en el e s t u d i o de la n u c l e ^ c i ôn d e l as s a l e s c o r a p o n e n t e s de lo s c â l c u l o s se r e f i e r e a d e t e r m i n a r si e s a n u c l e a c i ô n es e s e n c i a l m e n t e h o m o g é n e a (es d e c i r , si t i e n e l u g a r e s p o n t â n e a m e n t e en un m e d i o s o b r e s a t u r a d o de d i c h a s a l ) o es h e t e r o g é n e a , o s e a , si t i e n e l u g a r s o b r e o t r a f a s e d i s t i n t a al c o m p o n e n t e pre^
ci pi t a d o o s o b r e u n e m a t r i z o r g â n i c a . P a r a e l l o , 1o i de a l s é r i a d i s p £ n e r de las f r a c e i o n e s o r g â n i c a s de lo s c â l c u l o s y r e a l i z a r " in v i t r o "
c r i s t a l i z a c i o n e s en p r e s e n c i a de a q u e l l a s . P e r o el û n i c o p r o c e d i m i e n - to a c c è s i b1e a las c i t a d a s f r a c e i o n e s o r g â n i c a s ( c u y a e s t r u c t u r a no se c o n o c e ) es la d e s m i n e r a1i z a c i ô n d e lo s c â l c u l o s , c o n las p o s i b l e s al - t e r a c i o n e s de la e s t r u c t u r a q u e e s t e p r o c e d i m i e n t o c o m p o r t a . P o r e l l o . u n o de los obj et i v os d e e s t e t r a b a j o h a s i do el e s t u d i o de la n u c l e a -
h1ta) en p r e s e n d a de a l g u n a s m o l é c u l a s m o d e l o s i e g i d a s s o b r e la b a s e del a n é l i s i s d e a m i n o â c i d o s de l a s f r a c c i o n e s o r g â n i c a s de c â l c u l o s u r i n a r i o s . E s t a s s u s t a n c i a s s o n l o s â c i d o s L - a s p â r t i c o , L - g 1 u t â m 1 c o , p o l i - L - g l u t â m i c o y p o i i a c r Î 1 i c o ; L - a r g i n i n a , N - m e t i 1 a c e t a m i d a y p o l i - L - g l i c i n a .
P o r o t r a p a r t e , es de s o b r a c o n o c i d o q u e la a d i c i ô n d e ciejr t o s c o m p u e s t o s o i o n e s a un m e d i o c r i s t a l i z a b l e p u e d e t e n e r u n a c o n s1_ d e r a b l e i n f1u e n c i a en la v e l o c i d a d de c r e c i m i e n t o d e l o s c r i s t a l e s y s o b r e su c o m p o s i c i ô n . La p r e s e n c i a o a u s e n c i a de t a i e s s u s t a n c i a s en la o r i n a p u e d e e x p l i c a r t a m b i é n la a p a r i c i ô n o n o d e c â l c u l o s . L o s in^
h i b i d o r e s p u e d e n p r é v e n i r o d i s m i n u i r la cri s t a l i z a c i ô n p o r v a r i e s p r £ c e d i m i e n t o s , p r i n c i p a l m e n t e p o r la f o r m a c i ô n de c o m p l e j o s s o l u b l e s e £ t a b l e s , y p o r a d s o r c i ô n s o b r e c i e r t a s c a r a s de lo s cri s t a l e s , c a u s a n - do as i u n a m o d i f i c a c i ô n de la m o r f o l o g i a de ê s t o s y u n a a 1t e r a c i ôn de la v e l o c i d a d de c r e c i m i e n t o cri s t a l i n o . La d e t e r m i n a c i ôn del c o m p o r t a m i e n t o q u e e s t e a s p e c t o t e n g a la f r a c c i ô n o r g â n i c a de la o r i n a v i e n e d i f i c u l t a d a p o r la c o m p l e j i d a d d e la c o n f o r m a c i ô n de l as m a c r o m o l é c u las e x i s t a n t e s en d i c h o m e d i o y p o r la d i v e r s i d a d d e l o s g r u p o s f u n c i o n a l e s . P o r t a n t o , p a r e c e m â s a p r o p i a d o c o n s i d e r a r m o l é c u l a s s e n c i l i a s c o n c i e r t o s g r u p o s f u n c i o n a l e s y u n a c o n f o r m a c i ô n d e t e r m i n a d a . L os a m i n o â c i d o s a n t e r i o r m e n t e c i t a d o s p u e d e n e x i s t i r en la o r i n a b i e n l i b r e s 0 c o m b i n a d o s f o r m a n d o p a r t e de c i e r t a s p r o t e i n a s . P o r c o n s i g u i e £ t e, o t r o de l os o b j e t i v o s de e s t e t r a b a j o ha s i do e s t u d i a r la influer^
c u n d a r i a . F i n a l m e n t e , en e s t e t r a b a j o se ha e s t u d i a d o la a g r e g a c i é n c r i s t a l i n a de h i d r o x i1- a p a t i t a en p r e s e n c i a d e a l g u n a s d e las m o l é - cul as m o d e l o c i t a d a s .
( 1 - 5 ) , q u e e n c o n t r a r o n q u e la f r a c c i ô n o r g â n i c a e s t â uni f o r m e m e n te d i s t r i b u i d a en t o d o s l o s c â l c u l o s e s t u d i a d o s , c o n s t i t u y e n d o a i r e d e d o r del 2 . 5 % del p e s o d e c a d a c â l c u l o . A p a r t i r de e s t u d i o s h i £ t o q u f m i C O S ( 1 - 4 ) e s t e s a u t o r e s i n d i c a r o n q u e la f r a c c i ô n o r g â n i c a d e l os c â l c u l o s r e n a l e s e s u n a c o m b i n a c i ô n de m u c o p r o t e i n a s y poli_
s a c â r i d o s y q u e l o s d o s t e r c i o s de la c i t a d a f r a c c i ô n e s t â n f o r m £ d o s p o r m a t e r i a l p r o t e i c o . I d e n t i fi c a r o n los s i g u e n t e s m o n o s a c â r i d o s m a n o s a , g l u c o s a , f u c o s a y r a m n q s a :. F i n a l m e n t e , los c i t a d o s a u t o r e s (5) s e n a l a r o n q u e la s f r a c c i o n e s o r g â n i c a s de c a l c u l os de di f e r e £ te c o m p o s i c i ô n c r i s t a l i n a s o n 1o s u f i c i e n t e m e n t e s i mi 1 a r e s c o m o p a r a s u g e r i r la e x i s t e n c i a de un p r e c u r s o r c o m û n , al q u e l l a m a r o n s u s t a £ c i a " A " , e n c o n t r a d a p o r e l 1 o s en t o d o s lo s c â l c u l o s e s t u d i a d o s mediaji te t é c n i c a s i n m u n o l ô g i c a s . S i n e m b a r g o , en o t r o t r a b a j o de la litera_
t u r a (6) en el q u e se a n a l i z a r o n los a m i n o â c i d o s de l a s f r a c c i o n e s o r g â n i c a s de c â l c u l o s de d i f e r e n t e c o m p o s i c i ô n i ôn i ca a p a r e c e n n o t £ b l e s d i f e r e n c i as en la c o m p o s i c i ô n d e d i c h a s f r a c c i o n e s .
N o se ha l l e g a d o a e s t u d i a r , p o r t a n t o , la c o m p o s i c i ô n q u î m i c a de la s f r a c c i o n e s o r g â n i c a s de los c â l c u l o s p a r a i n t e n t e r e s t a b l e c e r u n a r e l a c i ô n e n t r e la c o m p o s i c i ô n de d i c h a s f r a c c i o n e s y la c o m p o s j_
c i ôn c r i s t a l i n a de l o s m i s m o s c â l c u l o s . Si e s a r e l a c i ô n e x i s t i e s e se s u g e r i r î a la e x i s t e n c i a de a l g u n a s m a c r o m o l é c u l a s q u e p o s e e n u n a a f i n i d a d e s p e c f f i c a p a r a un d e t e r m i n a d o c o m p o n e n t e cri s t a l i no de los c â l c u l o s . De ah i q u e , i n d e p e n d i e n t e m e n t e de q u e h a y a m o s a n a l i z a d o los
e l e g i r l as m o l é c u l a s m o d e l o u t i l l z a d a s e n e s t e t r a b a j o . h a y a m o s in t e n t a d o c o r r e l a c i o n a r e n a l g u n o s c â l c u l o s s u s r e s p e c t i v e s r e s u l t £ d o s a n a l f t i c o s c o n l o s p o r c e n t a j e s en p e s o de s u s c o m p o n e n t e s c r i £ t a l i n o s ( h i d r o x i l - a p a t i t a y b r u s h i t a ) , d e t e r m i n a d o s p o r e s p e c t r o s c £ p i a 1n f r a r r o j a m e d i a n t e un m é t o d o p u e s t o a p u n t o en n u e s t r o 1a b o r a t £ rio.
En 10 q u e r e s p e c t a a la i n t e r a c c i ô n e n t r e m o l é c u l a s p r o t e i c a s y la h i d r o x i l - a p a t i t a , H l a d y y F ü r e d i - M i l h o f e r (7) h a n e s t u d i a d o la a d s o r c i ô n de s e r o a l b ü m i n a h u m a n a s o b r e h i d r o x i l - a p a t i t a . La a d s o r c i ô n r é s u l t é s e r i r r e v e r s i b l e p o r d i l u c i ô n , l a s r e s p e c t i v a s i s o t e r m a s no r e s u l t a r o n s e r de t i p o L a n g m u i r y la c a n t i d a d de p r o t e i n a a d s o £ b i da d e p e n d i a del pH y de la f u e r z a i ô n i c a . O t r o s e s t u d i o s c r o m a t £ g r â f i c o s ( 8 , 9 ) i n d i c a n q u e l as p r o t e i n a s de t i p o â c i d o se a d s o r b e n de m a n e r a s e l e c t i va s o b r e la h i d r o x i l - a p a t i t a . P o r o t r a p a r t e , se ha e s t u d i a d o la a d s o r c i ô n de a m i n o â c i d o s s o b r e e s t e f o s f a t o c â l c i co (10) p e r o e s t a n d o a q u é l l o s en di s o l u c i ô n a pH 3 . 3 - 4 . 5 . T o d o s e s t o s t r a b £ j o s c a r e c e n de un e s t u d i o s o b r e la n a t u r a l e z a de la i n t e r a c c i ô n de la h i d r o x i l - a p a t i t a c o n la s m o l é c u l a s a d s o r b i d a s s o b r e e s t e f o s f a t o c â l c i c o y s o b r e la i n f1u e n c i a de e s a s m o l é c u l a s en el c r e c i m i e n t o c r i s t a l i n o de la h i d r o x i l - a p a t i t a .
F i n a l m e n t e y en 1 o q u e c o n c i e r n e a la a g r e g a c i é n c r i s t a l i n a d e h i d r o x i l - a p a t i t a H a n s e n y c o l a b o r a d o r e s (11) h a n e s t u d i a d o la a g r e g a c i é n d e c r i s t a l e s de e s t e f o s f a t o e n p r e s e n c i a de â c i d o h i a l £
p o r c i o n a d o s p o r el L a b o r a t o r l o d e U r o l i t i a s i s d e la F u n d a c i ô n J i m ê n e z O T a z . La c o m p o s i c i ô n c r i s t a l i n a de e s t o s c â l c u l o s s e h a d e d u c t d o c o n la a y u d a de la e s p e c t r o s c o p î a i n f r a r r o j a , c o m p a r a n d o el e s p e c t r o d e l c â l e u 10 c o n el d e c a d a u n a de l a s s u s t a n c i a s p a t r ô n .
En lo s c a t o r c e c â l c u l o s e s t u d i a d o s , la c o m p o s i c i ô n c r i s t a l i n a no es la m i s m a , h a b i é n d o s e e n c o n t r a d o q u e c i n c o c o n t i e n e n c o m o p r i n c £ pal c o m p o n e n t e el a m i n o â c i d o c i s t i n a , o c h o c â l c u l o s e s t â n f o r m a d o s f u £ d a m e n t a l m e n t e p o r c a r b o n a t o - a p a t i ta A - B ( 1 2 ) , a c o m p a ô a d a d e f o s f a t o a m ô n i c o m a g n ô s i c o h e x a h i d r a t a d o , q u e c o r r e s p o n d e al m i n e r a i es t r u v i ta ; y c o n t i e n e n a d e m â s , e n a l g u n o s c a s o s , o x a l a t o c â l c i c o m o n o h i d r a t o . El c â l c u l o r e s t a n t e e s t â c o m p u e s t o c as i en su t o t a l i d a d p o r o x a l a t o câlci^
co m o n o h i d r a t o .
A s i m i s m o , se h a n e s t u d i a d o c u a t r o c â l c u l o s p r o s t i t i c o s c u y o c o m p o n e n t e m a y o r i t ar i o es la c a r b o n a t o - a p a t i t a A - B .
3.1.2. - M u e s t r a s s i n t ë t i c a s .
3 . 1 . 2 . 1 . - H i d r o x i l - a p a t i t a n o e s t e q u i o m é t r i c a .
Se ha e l e g i d o la h i d r o x i l - a p a t i t a no e s t e q u i o m é t r i c a c o m o so p o r t e d e los e x p e r i m e n t o s d e a d s o r c i ô n de las d i s t i n t a s m o l é c u l a s mo d e l o
La e s t r u c t u r a c r i s t a l i n a de la h i d r o x i l - a p a t i t a ha s i d o b i e n e s t a b l e c i da (13) y a u n q u e no es m u y f r e c u e n t e en l o s c a l c u l os r e n a l e s .
p u e d e c o n s l d e r a r s e c o m o o r i g e n d e las c a r b o n a t o - a p a t i t a s q u e si 1o s o n
E s t a r a z ô n , u n i d a al h e c h o d e q u e el e s p e c t r o d e la h i d r o x i l - a p a t i t a no p r é s e n t a b a n d a s d e a b s o r c i ô n e n la r é g i ô n en q u e a p a r e c e n la s m a s c a r a c t e r î s t i c a s de la f r a c c i ô n o r g â n i c a , f a c i l i t a la i de nt i fi a c a c l ô n t e n i e n d o e n c u e n t a q u e d i c h a f r a c c i ô n es u n c o m p o n e n t e m i n o r i t y r i o , de l 3 al 6%.
La f ô r m u l a g e n e r a l de la h i d r o x i l - a p a t i t a no e s t e q u i o m é t r i c a f u é e s t a b l e c i d a p o r B e r r y ( 13 ) c o m o :
C»10-xC04)6-x(0")2,-xCV)x ' >‘«2°
d o n d e el p a r â m e t r o " x " , q u e se l l a m a g r a d o de d é f i ci e nc i a , p u e d e v £ r i a r e n t r e c e r o y d os .
3 . 1 . 2 . 2 . - M o l é c u l a s m o d e l o a d s o r b i d a s s o b r e la h i d r o x i l - a p a t i t a . Del a n â l i s i s d e la f r a c c i ô n o r g â n i c a d e los c â l c u l o s r e n a l e s se h a n o b t e n i d o u n o s r e s u l t a d o s , q u e se d e s c r i b e n m â s a d e l a n t e , s o b r e la b a s e de lo s c u a l e s h e m o s e l e g i d o , p o r u n a p a r t e , lo s â c i d o s l - a £ p â r t i c o , L - g l u t â m i c o , p o l i - L - a s p â r t i c o y p o l i - L - g l u t â m i c o c o m o p o r t £ d o r e s del g r u p o c a r b o x i1o y de u n a s e s t r u c t u r a s s e c u n d a r i as péri ôdi c as q u e p u e d e n e x p l i c a r a l g u n o s f e n ô m e n o s q u e se d e s c r i b e n p o s t e r i o r m e n t e ; p o r o t r a p a r t e , h e m o s e l e g i d o la N - m e t i l a c e t a m i d a y p o l i - g l i c i n a c o m o m o l é c u l a s p o r t a d o r a s del g r u p o p e p t f d i c o . F i n a l m e n t e , h e m o s uti_
l i z a d o L - a r g i n i n a c o m o a m i n o â c i d o d e c a r â c t e r b â s i c o .
E x c e p t o la N - m e t i l a c e t a m i d a , t o d a s l as d e m â s s u s t a n c i a s h a n si d o s u m i n i s t r a d a s p o r la firraa S i g m a C h e m i c a l Co. La N - m e t i l acetamj^
da se ha s i n t e t i z a d o p o r el p r o c e d i m i e n t o de H o f m a n n (14 ) p u r i f i c â n d £
la p o r d e s t l l a c i ô n de v a c l o ( p. f . 2 8 “C) r e p e t i d a s v e c e s .
3 . 2 . - M é t o d o s u t i l i z a d o s p a r a la s e p a r a d ô n d e la f r a c c i ô n o r g â n i c a de los c â l c u l o s r e n a l e s .
T o d o s l o s m é t o d o s u t i l i z a d o s p a r a s e p a r a r la f r a c c i ô n o r g â n £ ca de l os c â l c u l o s r e n a l e s se b a s a n en d i sol v e r la p a r t e c r i s t a l ^ n a de l os m i s m o s , p r o c u r a n d o , en lo p o s i b l e , d e j a r I n t a c t a la f r a c c i ô n o r g â n i c a . L a d e s m i n e r a l i z a c i ô n se ha c o n t r o l a d o p o r e s p e c t r o s c o p î a i n f r a r r o j a .
3 . 2 . 1 . - C â l c u l o s c o n s t i t u i d o s f u n d a m e n t a l m e n t e p o r c a r b o n a t o - a p a t i t a y f o s f a t o a m ô n i c o m a g n é s i c o h e x a h i d r a t o .
El m é t o d o s e g u i d o { 14 ) se b a s a en s o m e t e r el c â l c u l o a u n a d £ s o l u c i ô n a c u o s a q u e c o n t i e n e â c i d o n î t r i c o al 5% y f o r m a i d e h i d o al 15%. La d e s m i n e r a l i z a c i ô n se h a c e j p a t e n t e p o r la m e n o r d e n s i d a d de la f r a c c i ô n o r g â n i c a s e p a r a d a . D e b i d o a la p o s i b l e d e g r a d a c i ô n de p a r t e de la m a t e r i a o r g â n i c a p o r el â c i d o , se s u s t i t u y ô el â c i d o n £ tri co p o r un a g e n t e q u e l a t a n t e c o m o el E D T A ( e t i l e n d i a m i na t e t r a £ céta.to) a pH 8, ( l ) el c u a l a c t û a de f o r m a e x c e s i v a m e n t e 1 e n t a y p o r e l l o , t e n i e n d o en c u e n t a q u e lo s r e s u l t a d o s f u e r o n i d é n t i c o s , se ha e m p l e a d o el â c i d o n î t r i c o .
3.2.2. - C â l c u l o s c o n s t i t u i d o s f u n d a m e n t a l m e n t e p o r o x a l a t o c â l c i c o . i La e l i m i n a c i ô n d e la p a r t e c r i s t a l i n a en e s t e t i p o de c â l c £ ! l o s , se ha l l e v a d o a c a b o c o n E D T A ( i ) al 5% y f o r m a l d e h i d o al
1 5 % , a j u s t a n d o el pH a 8 y n a n t e n 1 ë n d o l o en f r i o d u r a n t e un t i e m p o q u e o s c i l a e n t r e 10 y 40 s é m a n a s .
3 . 2 . 3 . - C â l c u l o s c o n s t i t u i d o s f u n d a m e n t a l m e n t e p o r c i s t i n a .
La c i s t i n a ha s i d o e l i m i n a d a t r a t a n d o l o s c â l c u l o s c o n u n a dj^
s o l u c i ô n a c u o s a d e N a O H a j u s t a d a a un p H=8 d u r a n t e 50 s e m a n a s . A e s t a s o l u c i é n se le a ü a d e n u n a s g o t a s d e f o r m a l d e h i d o , p a r a e v i t a r la d e s n a t u r a l i z a c i ô n de la p r o t e i n a .
El pH se m a n t i e n e a l r e d e d o r de 8 d u r a n t e t o d o el p r o c e s o p o r a d i c i ô n de N a O H .
3 . 3 . - M é t o d o u t i l i z a d o p a r a la h i d r ô l i si s de l a s p r o t e i n a s c o n t e n i d a s en la f r a c c i ô n o r g â n i c a .
U n a v e z s e p a r a d a la f r a c c i ô n o r g â n i c a , se p e s a n u n o s 6 m g de la m i s m a , se c o l o c a n en un t u b o T h u n b e r g ; se a ô a d e 1 ml d e Cl H 6N, d e j â n d o l0 en el f r i g o r î f i c o d u r a n t e 10 m i n u t e s . A c o n t i n u a c i ô n , se c o l o c a el t u b o en un b a n o de hi e l o y se le h a c e el v a c i o d u r a n t e 2 m i n u t e s . La m u e s t r a se s o m e t e e n t o n c e s a 1 1 0 ° C d u r a n t e 24 h o r a s ; al c a b o de e s t e t i e m p o , se c o l o c a en un r e c i p i e n t e a b i e r t o d e n t r o de un d e s e c a d o r a v a c i o c o n 1 e n t e j as de N a O H c o n el f i n de e l i m i n a r el Cl H . D e s p u é s de 24 h o r a s , se l l e v a a un v o l u m e n de u n o s 6 ml co n C I H 0. G I N , a j u s t a n d o el pH a 2 c o n N a O H O . O I N . Si el h i d r o l i z a d o p r é s e n t a p a r t i c u l a s en s u s p e n s i ô n , se f i l t r a a n t e s de s o m e t e r l o a a n â l i s i s p o r c r o m a t o g r a f l a de c a m b i o i ô n i c o .
3 . 4 . - A n S l i s I s c o l o r i m ë t r l c o s
3 . 4 . 1 . - D e t e r m l n a c i ô n co l o r i m ë t r i c a d e a m i n o â c i d o s y p ë p t i d o s .
Se ha s e g u i d o el m é t o d o d e S t e i n y S p i e s ( 1 6 ) , ( 17 ) q u e c o n s i s t e e n t r a t a r 0.1 ml d e a m i n o â c i d c ô p é p t i d o h i d r o l i z a d o c on 1 roi de u n a d 1 s o l u c 1 6 n d e n i n h i d r i n a e n m e t i l c e l l o s o l v e a h a d i d a s o b r e o t r a de c l o r u r o e s t a n n o s o en t a m p o n c i t r a t o ( p H = 5 ) . El t u b o se c a l l en ta d u r a n t e 2 0 m i n u t e s en un b a h o de a g u a h i r v i e n d o . A con^
t i n u a c i ô n , se a M a d e n 5 ml d e p r o p a n o l : a g u a ( 1 : 1 ; v / v ) a c a d a t u b o , se a g i t a y d e s p u é s de 15 m i n u t e s se l e e la a b s o r b a n c i a a 5 7 0 n m en un e s p e c t r o f o t ô r a e t r o U V .
La c o n c e n t r a c i ô n en a m i n o â c i d o s se d é t e r m i n a m e d i a n t e u n a c u r va s t a n d a r d c o n m u e s t r a s d e a m i n o â c i d o s p a t r o n .
3 . 4 . 2 . - D e t e r m i n a c i S n col o r i m é t r i c a del f ô s f o r o
El f ô s f o r o en f o r m a d e a n i ô n f o s f a t o , se ha d e t e r m i n a d o p o r el m é t o d o de F i s k e y S i f c b a r o w ( 1 8 ) , q u e c o n s i s t e en c o m b i n e r el f ô ^ f o r e q u e c o n t i e n e el m e d i o c o m o a n i ô n f o s f a t o c o n el â c i d o m ol îb d jL ce en p r e s e n c i a de s u l f û r i c o . El f o s f o m o l i b d a t o o b t e n i d o se r e d u c e c o n â c i d o 1 , 2 , 4 a m i n o n a f t o s u l f ô n i c o , m i d i e n d o la t r a n s m i t a n c i a del c o m p l e j o a z u l a 7 0 0 nm .
La c o n c e n t r a c i ô n d e f ô s f o r o se d é t e r m i n a m e d i a n t e u n a c u r
va s t a n d a r d c o n m u e s t r a s d e P O ^ H g K .
3. s . - S f n t e s i s d e la h i d r o x i l - a p a t i t a n o e s t e q u i o m é t r i c a .
La h i d r o x l 1 - a p a t i t a no e s t e q u i o m é t r i c a se ha si n t e t i z a d o si - g u i e n d o el m é t o d o de W i n a n d ( 19 ) m o d i f i c a d o p o r G o n z â l e z - D i a z ( 2 0 ).
Se a h a d e g o t a a g o t a u n a d i s o l u c i d n de P O ^ H N a g .E H g O q u e c o £ t i e n e 3 . 6 g e n 1 0 0 ml de a g u a s o b r e o t r a d e 6.8 g de C l g C a .2H2O en 3 0 0 ml. El pH se a j u s t a a 8 c o n N H ^ O H a 10 l a r g o d e t o d o el p r o c e s o .
L a s u s p e n s i o n a s f o b t e n i d a se f i l t r a a v a c T o ; el p r e c i p i t a d o se l a v a c o n 100 ml de a g u a h i r v i e n d o y s e s e c a en e s t u f a a 6 0 ° C .
3.6. - Cal ci n a c i On de m u e s t r a s d e a p a t i t a .
C o n o b j e t o d e d e t e r m i n e r si h a y s u s t i t u c i d n d e i o n e s negati_
v o s en la a p a t i t a p o r i o n e s a s p a r t a t o 0 g l u t a m a t o , y p a r a cal c u l a r 1 os p a r â m e t r o s d e la r e d a p a t i ti c a , se h a n c a l e n t a d o en un h o r n o a 8 0 0 ° C y d u r a n t e 2 h o r a s v a r i a s m u e s t r a s de a p a t i t a i n t r o d u c i d a s e n cri sol es de p o r c e l a n a .
3.7. - M u e s t r a s d e u t e r a d a s :
3.7.1, - N - M e t i 1 a c e t a m i d a N - d e u t e r a d a .
La d e u t e r a c i ô n de e s t a su s t a n c i a se ha r e a l i z a d o m e d i a n t e in t e r c a m b i 0 i s o t d p i c o c o n a g u a p e s a d a y s e c a d o a v a c î o en p r e s e n c i a de P g O g . La o p e r a c i ô n se ha r e p e t i d o t r è s v e c e s e n u n a c a j a de g u a n t e s h a s t a c o m p r o b a r p o r e s p e c t r o s c o p f a i n f r a r r o j a ( r e g i o n e s 2 6 0 0 - 2 0 0 Ù . y 1 6 0 0 - 1 5 0 0 c m ' l ) q u e la s u s t a n c i a f ue d e u t e r a d a en u n a p r o p o r c i ôn m a y o r del 98*.
E s t a s u s t a n c i a a d q u l r l d a en f o r m a de sal s ô d i c a ( p e s o molecti 1 a,r c o m p r e n d i d o e n t r e 5 0 0 0 0 y 1 0 0 0 0 0 ) se ha a j u s t a d o a pH 8 c o n N a O H 0 .
me
IN en d i s o l u c l d n a c u o s a p a r a e v l t a r u n a p o s l b l e h i d r ô H s i s del pol_f ro. P o s t e r l o r m e n t e la s o l u c l ô n se s e e d a v a c î o e n p r e s e n d a de P g O g y d e s p u é s se a f i a d i e r o n u n o s m l l l l l t r o s d e D g O . La s o î u c l d n se d e j ô en u n a c a j a d e g u a n t e s d u r a n t e 1 h. A l t e r n a t i v a m e n t e se s e c ô en v a c î o y
sJ
a h a d l e r o n u n o s m l l l l l t r o s de D g O h a s t a c o m p r o b a r , p o r e s p e c t r o s c o p î a I n f r a r r o j a , u n a d e u t e r a c î ô n m a y o r del 9 8 % .3 . 7 . 3 . - P o l i - L - g l u t a m a t o c â l c l c o N - d e u t e r a d o . 3 . 7 . 3 . 1 . - P r e p a r a c i O n d el n i t r a t o c â l c i c o a n h i d r o .
Se h a n c a l e n t a d o v a r i o s g r a m o s de ( N O ^ )^ C a .4 H g O en e s t u f a , a 1 5 0 ° C, d u r a n t e s e i s h o r a s , h a s t a c o m p r o b a r , p o r e s p e c t r o s c o p î a i n f r a r r o j a la p é r d i d a de l a g u a d e c r i s tal i z a c i ôn . El e s p e c t r o resultain te c o i n c i d e c o n el p u b l i c a d o en la 1 i t e r a t u r a ( 21 ) .
3.7.3. 2 . - O b t e n c i ô n de l p o l i - L - q l u t a m a t o c ô l c i c o N - d e u t e r a d o .
Se ha s e g u i d o el m é t o d o i n d i c a d o en la l i t e r a t u r e (2 2). (2 3), (24). A u n a s o l u t i o n de 10 ml de a g u a p e s a d a c o n t e n i e n d o 1 00 m g de po 1 i - L - g l u t a m a t o de s o d i o d e u t e r a d o se h a n a h a d i d o 5 ml de o t r a s o l u t i o n en a g u a p e s a d a c o n t e n i e n d o 0 , 0 5 4 2 g de ( N O ^ ) 2 ^ 3 a n h i d r o . La s o l u t i o n r é s u l t a n t e se ha c a l e n t a d o a 6 0 ° C d u r a n t e do s h o r a s en un reci pi en te c e r r a d o . El p r e c i pi t a d o o b t e n i d o se ha f i l t r a d o y s e c a d o en un deseca.
d o r a v a c î o en p r e s e n c i a de P g O g . Su e s p e c t r o i n f r a r r o j o c o i n c i d e c o n el p u b l i c a d o en la l i t e r a t u r a ( 2 3 ). La p r e p a r a c i ô n de e s t e p r o d u c t o N - d e u t e r a d o se ha r e a l i z a d o en c a j a de g u a n t e s .
3 . 7 . 4 . - A p a t i t a s d e u t e r a d a s .
P a r a la o b t e n c i ô n de e s t o s p r o d u c t o s se ha p r o c e d i d o p r e v i a m e n t e a p r e p a r a r P O ^ D N a g .
j ^ ^ j P r e p a r a c i ô n de P O ^ D N a g .
Se h a n c a l e n t a d o a 8 0 - 8 5 “ C, d u r a n t e t r è s h o r a s , 0 . 5 g de P O ^ N a g .2 H g O . Se ha o b t e n i d o e n t o n c e s P O ^ H N a g a n h i d r o . A c o n t i n u a c i ô n , se d i s u e i v e en v a r i o s m i l i l i t r o s de D g O s e c â n d o i o a v a c f o en p r e s e n c i a d e P g O g . Se afiaden n u e v a m e n t e u n o s m i l i l i t r o s de 0 ^ 0 y se s e c a la so l u c i ô n , o p e r a c i o n e s q u e se r e p i t e n v a r i a s v e c e s en la c a j a de g u a n t e s h a s t a c o m p r o b a r , p o r e s p e c t r o s c o p î a i n f r a r r o j a , la t o t a l d e u t e r a c i ô n del p r o d u c t o . Su e s p e c t r o i n f r a r r o j o r e s u l t ô c o i n c i d i r c o n el d e la b i b l i o g r a f î a ( 26 ) .
3 . 7 . 4 . 2 . - P r e p a r a c i ô n de a p a t i t a s d e u t e r a d a s .
Se h a n d i s u e l t o 0 . 1 2 0 g de P O ^ D N a g en 5 ml de D gO . I g u a l m e n t e se h a n d i s u e l t o 0 . 2 9 5 m g de ( N O ^ )g C a a n h i d r o (ô c a n t i d a d é q u i v a l e n t e de ( N 0 j ) 2 S r Ô ( N02)28a) en 5 ml d e C ^ O . L o s pD d e a m b a s d i s o l u d o n e s se h a n a j u s t a d o a 10 c o n N a O D O . I N . P o s t e r i o r m e n t e , se a ô a d e la prime^
ra s o l u c i ô n g o t a a g o t a s o b r e la s e g u n d a , p r o c u r a n d o m a n t e n e r a 10 el pD del m e d i o d u r a n t e la a d i c i ô n . El p r e c i pi t a d o r é s u l t a n t e se f i l t r a y se l a v a c o n u n o s m i l i l i t r o s de 0 ^ 0 , s e c S n d o l o a v a c î o en p r e s e r c i a d e F ^ O g .
3 . 8 . - D e t e r m i n a c i ô n d e 1 os p a r â m e t r o s de la r e d de la h i d r o x i 1 -apati ta n o e s t e q u i o m é t r i c a .
Al s e r la h i d r o x i l - a p a t i t a de 1 os c â l c u l o s un c o m p u e s t o no
g r a d o de d e f l c l e n d a . En t o d o s 1 os c a s o s , la h i d r o x i 1 - a p a t i ta c ri st alj _ za e n el s i s t e m a h e x a g o n a l , p o r 1 o q u e su s p a r â m e t r o s c r i s t a l o g r â f i c o s s o n a = b / c .
C o n la a y u d a d e la d i f r a c c i d n de R a y o s X y la e s p e c t r o s c o p f a de a b s o r c i ô n i n f r a r r o j a , se h a n cal cul a d o las d i m e n s i o n e s d e la c e l d i l l a u n i d a d d e la s a p a t i t as c â l d c a s s i n t e t i z a d a s p o r n o s o t r o s s i g u i e n d o el m é t o d o d é s a r r o i 1 a d o p o r P .F . G o n z â l e z - D f a z y M . S a n t o s ( 1 2 ) , ( 2 7 ) .
3 . 9 . - Nucleacifln de cri s t a l e s de h i d r o x i 1 - a p a t i t a no e s t e q u i o m é t r i c a . 3 . 9 . 1 • - M a t e r i al e s .
3. 9 . 1 . 1 . - P r e p a r a c i ô n d e l a s d i s o l u d o n e s de c l o r u r o c â l c i c o y f o s f a t o d i s ô d i c o .
a) C l o r u r o c â l c i c o .- Se p e s a r o n 3 4 0 m g de C l g C a . Z ^ g O s o b r e 1 os q u e se a n a d i ô a g u a d e s t i l a d a h a s t a un v o l u m e n f i n a l d e 50 m l , a j u £ t a n d o l u e g o el pH a 10 c o n h i d r ô x i d o a m ô n i c o .
b) F o s f a t o d i s ô d i c o .- Se p e s a r o n 2 3 2 m g de P O ^ H N a ^ . E H g O y se a ô a d i ô a g u a d e s t i l a d a h a s t a un v o l u m e n de 50 ml . El pH d e la di s o l u d ôn r é s u l t a n t e se a j u s t ô a 10 c o n h i d r ô x i d o a m ô n i c o .
3 . 9 . 1 . 2 . - P r e p a r a c i ô n de l a s di s o l u c i o n e s de l as m o l é c u l e s m o d e 1o . a) A c i d o L - g l u t â m i c o .- Se p e s a r o n 1 9 . 4 7 mg de â c i d o L - g l u t â - m i c o y se l l e v a r o n a un v a s o de p r e c i pi t a d o s s o b r e el q u e se a fia di ero n 7 ml de a g u a d e s t i l a d a . El pH de la d i s o l u c i ô n se a j u s t ô a 7 . 5 c o n hi^
d r ô x i d o s ô d i c o . El v o l u m e n f i n a l se l l e v ô a 10 ml en un m a t r a z a f o r a d o .
b ) A c i d o pol i - L - g l utâiiilco. - Se p e s a r o n 20 tng d e e s t a s u s t a n c i a y s e a fi ad i er o n 7 ml de a g u a d e s t i l a d a . El pH de la di sol u c i ô n se a j u s t ô a 7 . 5 c o n h i d r ô x i d o s ô d i c o , c o m p l e t a n d o el v o l u m e n f i n a l d e la m i s m a a 10 ml , c o n a g u a d e s t i l a d a , en un m a t r a z a f o r a d o .
c) A c i d o p o l i a c r i l i c o .- E s t e p r o d u c t o se ha o b t e n i d o p a r t i e ^ d o del â c i d o a c r i l i c o c o m e r c i al d e la f i r m a M e r c k p u r i f i c a d o m e d i a n t e d e s t i 1 a c i ô n a v a c i o en a t m ô s f e r a d e ni t r ô g e n o . Se p o l i m e r i z a r o n r a d i cal m e n t e u n o s 2 0 ml de l m o n ô m e r o en un m a t r a z c o n 0 . 6 g d e p e r s u l f a t o s ô d i c o , 0 . 1 8 g d e s u l f i t o s ô d i c o y 3 0 0 ml d e a g u a d e s t i l a d a . La m e z c l a , se c a l e n t ô d u r a n t e 4 h o r a s a 6 0 “ C . El di sol v e n t e s e e x t r a jo des tilaji d o a v a c i o ; el p o l f m e r o se d i s o l v i ô en 1 l i t r o de m e t a n o l , p r e c i p i t â j i d o l o a c o n t i n u a c i ô n c o n é t e r e t i l i c o en la p r o p o r c i ô n 1 : 1 0 . E s t a o p e r a c i ô n se r e p i t i ô v a r i a s v e c e s . El m e t a n o l r e s i d u a l del p r e c i pi t a d o , se e l i m i n ô s e c â n d o i o a v a c i o . L a i d e n t i d a d se v e r i f i e d m e d i a n t e su e s p e £ t r o de a b s o r c i ôn IR (24 ).
La di s o l u c i ô n del â c i d o p o l i a c r i l i c o se p r e p a r ô del s igui e n t e m o d o : la m u e s tr a o b t e n i d a p o r n o s o t r o s e x i s t e i ni ci al m e n t e en f o r m a â c i d a . De é s t a , se p e s a r o n 2 3 . 8 5 m g . q u e se i n t r o d u j e r o n en u n v a s o de p r e c i p i t a d o y se afi adi ero n 20 ml de a g u a d e s t i l a d a . El pH d e la di solj^
c i ô n se a j u s t ô a 7 . 5 y se e n r a s ô a 25 ml en un m a t r a z a f o r a d o .
r
3 . 9 . 2 . - P r e c i p i t a c i ô n de la h i d r o x i 1 - a p a t i t a
H e m o s p r e c i pi t a d o h i d r o x i 1 - a p a t i t a no e s t e q u i orné tri c a , p a r - t i e n d o de di f e r e n t e s c o n c e n t r a c i o n e s d e r e a c t i v o .
a) S e t o m a r o n 2 ml de la di s o l u c i ôn de cal c i o y o t r o s 2 ml
u n a d 1 s o l u c i ô n d e h i d r ô x i d o a m ô n i c o a pH 10. Se v i r t i ô la d i s o l u c l ô n de f o s f a t o s o b r e la d e c a l c l o y t r a s un m i n u t o de a g i t a c i ô n se m i d i ô la t r a n s m i t a n c i a a 5 5 0 n m . u t i l i z a n d o c u b e t a s d e v i d r i o de 1 c m de ca m i n o ô p t i c o . E s t a m e d i d a se r e a l i z ô C a d a m i n u t o d u r a n t e m e d i a h o r a .
T r a s la m e z c l a d e l a s d i s o l u d o n e s r e a c t i v a s , la cpn c e n t r a c i ôn de c l o r u r o c â l c i c o f u é 0 . 0 9 2 m M , y la d e f o s f a t o d i s ô d i c o 0 . 0 5 2 mM. P o r e s p e c t r o s c o p î a IR se v e r i f i e d q u e el p r e c i pi t a d o o b t e n i d o c o r r e s p o n d e a h i d r o x i 1 - a p a t i t a no e s t e q u i o m é t r i c a .
b) Se r e a l i zô e s t a m i s m a p r e c i pi t a c i ô n , s e g û n el m é t o d o q u e se a c a b a d e d e s c r i b i r , p e r o p a r t i e n d o de 4 ml d e c a d a s o l u c i ô n d e c i o r u r o c â l c i c o y f o s f a t o d i s ô d i c o , y c o m p l e t a n d o c a d a u n o de e s t o s volû^
m e n e s h a s t a 25 ml c o n la d i s o l u c l ô n de h i d r ô x i d o a m ô n i c o ( p H = 1 0 ) .
c) F i n a l m e n t e , se r e a l i z a r o n p r e c i p i t a c i o n e s d e a p a t i t a p a r t i e n d o d e l a s c o n c e n t r a c i o n e s d e c a l c i o y f o s f a t o i n d i c a d a s en 1 os a p a r t a d o s a) y b ) , p e r o a f i a d i e n d o a la d i s o l u c l ô n d e f o s f a t o 2 ml d e la dj^
s o l u c i ô n d e 1 os â c i d o s L - g l u t â m i c o , p o l i - L - g l u t â m i c o o p o l i a c r f l i co y c o m p l e t a n d o , c o m o s i e m p r e h a s t a un v o l u m e n de 25 ml c o n la d i s o l u c l ô n de N H ^ O H ( p H * 1 0 ) . D e s p u é s de m e z c l a r l as d i s o l u d o n e s r e a c t i v a s , las c o n c e n t r a c i o n e s de e s t a s s u s t a n c i as o r g â n i c a s f u e r o n de 5 . 3 : 1 0 ”^N.
La r e p r o d u c i b i 1 i d a d d e e s t a s p r e c i pi t a c i o n e s f u é del 0 . 3 % de t r a n s m i t a n c i a
d) A s i m i s m o , se r e a l i zô un e x p e r i m e n t o de p r e c i p i t a c i ô n , par^
t i e n d o d e l as c o n c e n t r a c i o n e s I n d i c a d a s en el a p a r t a d o a ) , I n c l u y e n d o en la d i s o l u c l ô n r e a c t i v a de f o s f a t o d i s ô d i c o , l y 2 ml d e d i s o l u c l ô n d e a c i d o p o l i - L - g l u t I m i c o . A m b a s p r e c i p i t a c i o n e s s e h a n r e a l i z a d o c o n o b j e t o de d e t e r m i n e r m e d i a n t e el C o u l t e r C o u n t e r ( S e c c i ô n 3 . 1 1 . 8 . - ) la d i s t r i b u c i ô n m e d i a de 1 os d i â m e t r o s de la s p a r t i c u l as de a p a t i t a p r e c i pi t a d a y la d e p e n d e n c i a de é s t o s c o n la c o n c e n t r a c i ô n d e â c i d o p o l i - L - g l u t â m i c o .
3 . 9 . 3 . - N u c l e a c i ô n d e cri s t a l e s de b r u s h i t a .
C o m o t é r m i n o d e c o m p a r e d ô n , h e m o s p r e c i pi t a d o b r u s h i t a , P O ^ H C a .2H2O , p a r a d e t e r m i n e r la di f e r e n c i a de c o m p o r t a m i e n t o e n t r e las m o l é c u l e s m o d e l 0 c o n s i d e r a d a s al p a s a r d e u n a e s t r u c t u r a cri s t a l 1 ne a o t r a c u y a s di s t a n c i as i n t e r c a 1 1ô n i c a s f u e r a n di f e r e n t e s .
3 . 9 . 3 . 1 . - P r e p a r a c i ô n d e las d i s o l u d o n e s de c l o r u r o c â l c i c o y f o s f a t o di s ôdi c o .
a) C l o r u r o c â l c i c o .- Se p e s a r o n 2 . 0 4 0 m g de C l g C a .2H2O s o b r e 1 os q u e se a n a d i ô a g u a d e s t i l a d a h a s t a un v o l u m e n f i n a l de 50 m l , a j u ^ t a n d o l u e g o el pH a 5 . 8 c o n Cl H 0 . 1 N.
b) F o s f a t o d i s ô d i c o .- Se p e s a r o n 1 . 3 9 2 g de P 0 ^ H N a 2 .2H2O y se a n a d i ô a g u a d e s t i l a d a h a s t a un v o l u m e n f i n a l de 5 0 ml. El pH d e la d1_
s o l u c i ô n r é s u l t a n t e se a j u s t ô a 6 . 0 c o n C I H 0 . 1 N.
3 . 9 . 3 .2 . - P r e p a r a c i ô n de las d i s o l u d o n e s de mol é c u 1 as m o d e l 0.
P a r a la n u c l e a c i ô n d e b r u s h i t a h e m o s u t i l i z a d o , c o m o m o l é c u 1 as m o d e l o , las d i s o l u c i o n e s p r e p a r a d a s e n la s e c c i ô n 3 . 9 . 1 . 2 .
a) S e t o m a r o n 6 ml d e la d i s o l u c l ô n d e c a l c i o y o t r o s 6 ml d e la d e f o s f a t o ; y c a d a u n o d e e s t o s v o l û m e n e s se e n r a s ô a 25 ml c o n u n a d i s o l u c l ô n a c u o s a d e Cl H a pH 5 . 5 . Se v i r t i ô la d i s o l u c l ô n d e f o s f a t o s o b r e la de c a l c i o y t r a s u n m i n u t o de a g i t a c i ô n se m i d i ô la t r a n s m i t a n c i a a 5 5 0 m y , d e a c u e r d o c o n el m é t o d o i n d i c a d o en la s e c c i ô n
T r a s la m e z c l a d e la s di s o l u c i o n e s r e a c t i v a s , la c o n c e n t r a c i ô n de c l o r u r o c â l c i c o f u e 0 . 5 5 2 m M y la d e f o s f a t o d i s ô d i c o 0 . 3 1 2 m M
P o r e s p e c t r o s c o p î a IR se v e r i f i e d q u e el p r e c i pi t a d o obteni_
d o c o r r e s p o n d e a b r u s h i t a .
b) Se r e a l i zô e s t a m i s m a p r e c i p i t a c i ô n s e g û n el m é t o d o q u e se a c a b a d e d e s c r i b i r , p e r o a ü a d i e n d o en c a d a c a s o 2 ml d e c a d a u n a d e las d i s o l u d o n e s de m o l é c u l a s m o d e l o , a la di s o l u c i ô n d e f o s f a t o d i s ô d i c o .
3 . 1 0 . - A d s o r c i ô n d e m o l é c u l a s m o d e l o .
C o n el f i n d e e s t u d i a r la i n t e r a c c i ô n de la f r a c c i ô n orgâni_
ca de 1 os c â l c u l o s r e n a l e s c o n la h i d r o x i l - a p a t i t a no e s t e q u i o m é t r j ^ ca se h a n e l e g id o u n a s e r i e de m o l é c u l a s m o d e l o r e l a c i o n a d a s c o n 1 os p r i n c i p a l e s c o m p o n e n tes d e d i c h a s f r a c e i o n e s o r g â n i c a s .
C u a n d o la a d s o r c i ô n de m o l é c u l a s se e s t u d i a en la i n t e r f a s e 1 î q u i d o - s ô l i d o , p u e d e n a p a r e c e r d o s p r o b l e m a s . En p r i n c i p i o , y p u e £
to q u e l a s m o l é c u l a s e s t u d i a d a s e n e s t o s s l s t e m a s s o n m a y o r e s q u e las de c u a l q u l e r I n t e r f a s e g a s - s 6 1 1 d o , p u e d e p r o d u c i r s e un f e n d m e n o de c a p a s m u l t i p l e s c u a n d o se t r a b a j a c o n a l t a s c o n c e n t r a c i o n e s d e a ^ s o r b a t o . En t a l e s c a s o s , no se p o d r î a d i s t i n g u i r la p r i m e r a c a p a , q u e es la q u e i n t e r a c c i o n a c o n el s u s t r a t o , en e s t e c a s o la a p a t i t a , de la s si gui e n t e s . P o r o t r o l a d o , la a d s o r c i ô n d el di sol v e n t e p o d r f a c o m p e t i r c o n el a d s o r b a t o ; si e s t o o c u r r i e r a , h a b r T a q u e e x c l u i r a q u e l l a s r é g i o n e s del e s p e c t r o en la s c u a l e s la a b s o r c i ô n del d 1 s o % v e n t e f u e r a i n t e n s a .
En el p r é s e n t e t r a b a j o , se ha p r o c u r a d o q u e la p r o p o r c i ô n de m o l é c u l a s a d s o r b i d a s r e s p e c t e al s u s t r a t o f u e r a tal q u e q u e d a r a t o d ^ v f a l e j o s d e c o m p l é t e r u n a m o n o c a p a . A d e m é s , no ha h a b i d o n i n g û n p r o b l e m a c o n la r e t e n d ô n de 1 os di sol v e n t e s e m p l e a d o s , p o r el s ô l i d o .
3 . 1 0 . 1 . - A d s o r c i ô n d e N - m e t i l a c e t a m i d a .
D e b i d o al p o r c e n t a j e r eal m e n t e i m p o r t a n t e d e p r o t e i n a s q u e a p a r e c e n en las f r a c c i o n e s o r g é n i c a s d e 1 os c â l c u l o s r e n a l e s , p a r e c e i n t e r e s a n t e c o m e n z a r e s t u d i a n d o si el e n l a c e p e p t î d i c o , - C O - N H - , j u e ga a l g û n p a p e l e n la i n t e r a c c i ô n d e e s t a s f r a c c i o n e s o r g â n i c a s c o n el f o s f a t o c â l c i c o a p a t î t i c o .
C o m o m o d e l o se ha e l eg i do la N - m e t i l a c e t a m i d a , C H j - C O - N H - C H j , q u e es la m o l é c u l a m â s s e n d 11 a q u e c o n t i e n e un e n l a c e p e p t î d i c o , p u d i e n d o s e c o n s i d e r a r c o m o u n i d a d e s t r u c t u r a l de u n a c a d e n a p ol i p e g t î d i c a .
t i c o s a 1 os q u e a p a r e c e n e n la 1 1 t e r a t u r a ( 24 ) .
La e x p e r 1 e n c 1 a d e a d s o r c i ô n d e e s t a s u s t a n c i a s o b r e la h i - )
d r o x i 1 - a p a t i t a se ha r e a l i z a d o c o m o s i g u e : En u n a c a j a d e g u a n t e s , se m u e l e n e n u n m o r t e r o d e â g a t a u n o s 30 m g d e h i d r o x i 1 - a p a t i t a no e s t e q u i o m ê t r i c a d e u t e r a d a , a la q u e p o s t e r l o r m e n t e se a ü a d e 0 . 5 ml de
se di se ca el
3.
O g O . E s t a s u s p e n s i ô n s e d i s p e r s a d e s p u é s e n el m o r t e r o d u r a n t e u n o s j u n d o s . A c o n t i n u a c i ô n , se c o g e n c o n u n a p i p e t a v a r i a s g o t a s de :ha s u s p e n s i ô n y se d e p o s i t a n s o b r e un c r i s t a l d e F g C a q u e ha de
"v ir d e v e n t a n a p a r a u n a c é l u l a d e i n f r a r r o j o . El c r i s t a l se c o l £ s o b r e un d e s e c a d o r q u e c o n t i e n e P g O g y se r e a l i za p os t e r i o r m e n t e v a c î o .
En la c é l u l a e s p e c i a l q u e s e d e s c r i b e m a s a d e l a n t e ( S e c c i ô n ll.l.) se i n t r o d u c e 1 ml d e N - m e t i l a c e t a m i da N - d e u t e r a d a y se re^
g i s t r a el e s p e c t r o i n f r a r r o j o c a d a h o r a .
3 . 1 0 . 2 . - A d s o r c i ô n de a m i n o â c i d o s .
P a r a e s t u d i a r la i n t e r a c c i ô n e n t r e la h i d r o x i 1 - a p a t i t a y 1 os a m i n o â c i d o s , se h a n e l e g i d o c o m o m o d e l o s el â c i d o L - a s p â r t i c o :
C 0 0 - - C H , - C H - C 0 0 ’
^ iu* NHj (2)
y el â c i d o L - g l u t â m i c o :
C 0 0 ' - C H , - C H , - C H - C 0 0 "
= : (3)
p o r s e r 1 os m i s a b o n d a n t e s e n l a s f r a c c l o n e s o r g l n i c a s e s t u d i a d a s . T a m b U n se ha c o n s 1 d e r a d o la L - a r g 1 n 1 n a , q u e , c o m o se s a b e p o s e e u n g r u p o f u n c l o n a l b i s 1 c o :
En los t r e s c a s o s se h a r e a l i z a d o la e x p e r l e n c l a d e la slgulen^
te f o r m a : se p r e p a r a n 3 0 0 ml d e u n a d i s o l u c l d n a c u o s a q u e c o n t i e n e 10 m i l i m o l e s d e a m i n o l c l d o y 4 5 m i H m o l e s de C l g C a s o b r e la q u e se a h a - d e n g o t a a g o t a 1 0 0 ml de o t r a d i s o l u c i Ôi, y u e c o n t i e n e 3 8 m 1 1 I m o l e s d e P O ^ H N a g . El pH d e l as d o s d i s o l u d o n e s se a j u s t a , d u r a n t e t o d o el p r o c e s o , a un v a l o r c e r c a n o a 8 c o n N H ^ O H . L a s u s p e n s i ô n as f f o r m a d a , se f i l t r a a v a c i o , ( s e l a v a c o n 1 0 0 ml d e a g u a h i r v i e n d o p a r a e ) i m i - n a r el N H ^ ) y se s e c a e n e s t u f a a 6 0 “ C.
La t e m p e r a t u r a a la c u a l se r e a l i z a la p r e c i p i t a c i ô n es de 3 7 ° C . Se ha e l e g i d o e s t a t e m p e r a t u r a c o n o b j e t o de a p r o x i m a r s e i la del c u e r p o h u m a n o . A s i m i s m o , el pH se ha e l e g i d o c o n el f i n d e que l o s g r u p o s c a r b o x f 1 i c o s de lo s a m i n o i c i d o s e s t é n en f o r m a d i s o c r a d a q u e es c o m o se e n c u e n t r a n en un m e d i o f i s i o l ô g i c o .
L a s i s o t e r m a s d e a d s o r c i ô n d e l os t r e s a m i n o â c i d o s se hin ob t e n i d o c o l o c a n d o d i s t i n t a s m u e s t r a s p e s a d a s d e h i d r o x i 1 - a p a t i ta ( 1 0 0 a 4 0 0 m g ) e n t u b o s c o n 2 ml d e d i s o l u c l ô n de los a m i n o â c i d o s en a g u a ( p H = 1 0 ) a d i s t i n t a s c o n c e n t r a c i o n e s ( 0 . 1 0 - 4 . 5 y m / m l ). L o s tub os se h a n m a n t e n i d o d u r a n t e u n a h o r a d e n t r o d e un b a ô o a 37 ^ 0 . 5 ° C , agi t a n d o c a d a c i n c o m i n u t o s . A c o n t i n u a c i ô n , se h an c e n t r i f u g a d o a 4 0 0 0 r p m d u r a n t e 10 m i n u t e s , t o m a n d o p a r t e s a l I c u o t a s de los soirena^
L a s c a n t i d a d e s a d s o r b i d a s se h a n o b t e n i d o c o m o di f e r e n c i a e n t r e l a s c o n c e n t r a c i o n e s ini ci al y f i n a l de ami n o â c i d o . La presen^
t a c i ô n d e la c a n t i d a d a d s o r b i d a p o r g r a m o de a p a t i t a , g, f r e n t e a la s c o n c e n t r a c i o n e s f i n a l e s d e a d s o r b a t o , Ç , c o n s t i t u y e 1 a i s o t e r m a d e a d s o r c i ô n del c o m p u e s t o e n c u e s t i o n .
3 . 1 0 . 3 . - A d s o r c i ô n d e p ë p t i d o s .
A p a r t i r d e l o s r e s u i t a d o s o b t e n i d o s c o n lo s a m i n o â c i d o s , se ha e s tu di cj do la i n t e r a c c i ô n d e la h i d r o x i 1 - a p a t i t a d é f i c i e n t e c o n t r e s h o m o p é p t i d o s c o m e r c i a l e s : p o l 1 - g l i c i n a , â c i d o p o l i - L - a s p â r t i c o y â c i d o p o l i - L - g l u t â m i c o .
3 . 1 0 . 3 . 1 . - P o l i - q l i c i n a
i L a a d s o r c i ô n se h a l l e v a d o a c a b o a n a d i e n d o 5 m g d e h i d r o x i l - [ a p a t i t a no e s t e q u i o m ê t r i c a a u n a d i s o l u c l ô n de 2 mg de p o l i - g l i c i _ na d i s u e l t a en 5 ml de u n a d i s o l u c l ô n s a t u r a d a de B r L i . La s u s p e n s i ô n ij se s o m e t e a u l t r a s o n i d o y al c a b o d e 24 h o r a s se d e c a n t a , 1 a v â n d o l a } r e p e t i d a s v e c e s c o n v o l û m e n e s de a g u a d e s t i l a d a de 5 ml . A c o n t i n u ^ j c i ô n s e f i l t r a y s e s e c a .
3 . 1 0 . 3 . 2 . - A c i d o P o l i - L - a s p â r t i c o .
L a a d s o r c i ô n se ha l l e v a d o a c a b o de la s i g u i e n t e f o r m a :
Se p r é p a r a u n a s u s p e n s i ô n d e 10 m g de a p a t i t a en 5 ml de a g u a , a j u s t a n d o el pH a 8 c o n N H ^ O H , y s o m e t i e n d o l a a u l t r a s o n i d o d u r a n t e m e d i a h o r a . A c o n t i n u a c i ô n se a h a d e n 0 . 5 ml d e u n a d i s o l u c l ô n al 2 ^
en p e s o del p o l T m e r o en a g u a c u y o pH se ha l l e v a d o t a m b i é n a un v a l o r c e r c a n o a 8 c o n N H ^ O H . L a s u s p e n s 16 n se m a n t i e n e a 3 7 “ C d u r a n t e 24 h o r a s , se f i l t r a y se s e c a .
3 . 1 0 . 3 . 3 . - A c i d o P o l i - L - q l u t â m i c o .
En un t u b o d e v i d r i o d e 0 . 3 x 7 c m , se h a n i n t r o d u c i d o 10 mg d e a p a t i t a c â l c i c a d e u t e r a d a y , a c o n t i n u a c i ô n , 0 . 3 ml de s o l u c i ô n de a g u a p e s a d a c o n t e n i e n d o 15 m g d e p o l i - L - g l u t a m a t o s ô d i c o d e u t e r a d o . E s t a o p e r a c i ô n se ha r e a l i z a d o e n u n a b o i s a d e g u a n t e s q u e p r e v i a m e n ^ te h a b i a s i d o p r e p a r a d a h a c i e n d o el v a c f o e i n t r o d u c i e n d o a r g o n a l t e £ n at i v a m e n t e c i n c o v e c e s . U n a v e z p r e p a r a d a la s u s p e n s i Ôn en el t u b o , se i n t r o d u c e Ô s t e en u n a c a j a d e g u a n t e s y se a g i t a d e v e z en c u a n d o d u r a n t e c i n c o h o r a s . Se d e j a d e c a n t a r y la s o l u c i ô n r e s t a n t e d e p o H m e r o se s é p a r a c o n la a y u d a d e u n a p i p e t a . L a m u e s t r a d e a p a t i t a se s e c a al v a c i o e n p r e s e n c i a d e P g O g . A c o n t i n u a c i ô n se m u e l e la apatj^
ta e n un m o r t e r o de â g a t a , d e n t r o d e la b o i s a de g u a n t e s , y se le a h ^ d e n v a r i a s g o t a s d e D g O . S e g u i d a m e n t e , y c o n a y u d a d e u n a p i p e t a , se c o l o c a n u n a s g o t a s de la s u s p e n s i ô n r é s u l t a n t e s o b r e un c r i s t a l de f l u o r u r o c â l c i c o q u e e s t â s i t u a d o en un p e s a s u s t a n c i a s c e r r a d o . E s t e se i n t r o d u c e d e s p u é s en un d e s e c a d o r c o l o c a d o en u n a c a j a d e g u a n t e s , h a c i e n d o el v a c f o en p r e s e n c i a d e P g O g . El c r i s t a l , u n a v e z s e c o , se c o l o c a en la c é l u l a e s p e c i a l , i n d i c a d a e n la s e c c i ô n 3.11.1. , c o n el f i n de r e g i s t r a r el e s p e c t r o i n f r a r r o j o .
E s t a e x p e r i e n c i a de a d s o r c i ô n se ha r e a l i z a d o d o s v e c e s , utj_
l i z a n d o en la u l t i m a u n a s o l u c i ô n de p o l f m e r o c u y a c o n c e n t r a c i ô n e ra la m i t a d de la c i t a d a m â s a r r i b a . En l o s d o s c a s o s se h a n o b t e n i d o b a n d a s d e a b s o r c i ôn i n f r a r r o j a a p r e c i a b l e s .
3 . 1 0 . 4 . - C r e c i m l e n t o d e c r i s t a l es de h 1 d r o x i 1 - a p a t i t a no e s t e q u i o m ë - t r i c a .
Se h a n i n t r o d u c i d o e n v a s o s de p r e c i pi t a d o d e 1 0 0 m i , 36 1 mg d e C l N a , 2 m g de h i d r o x i i - a p a t i t a no e s t e q u i o m ê t r i c a y p o s t e r i o r m e n . te 1 . 3 7 . 1 0 * ^ m o l e s d e di f e r e n t e s m o l é c u l a s m o d e l o 1 . 3 7 . 1 0 ' ® e q u i v ^ l e n t e s en el c a s o de l a s m a c r o m o l é c u l a s u t i 1 i z a d a s ) y 4 . 1 8 . 1 0 ’ ® m £ l e s de P O ^ H N a g d i s u e l t o s e n 2 5 . 5 ml d e a g u a . El pH d e la s d i s o l u c i o n é s se a j u s t é p r e v i a m e n t e a 9 c o n N a O H 0 . 1 N. A c o n t i n u a c i ô n se a h ^ d i e r o n 2 4 . 5 ml de u n a s o l u c l ô n d e c l o r u r o c â l c i c o c o n t e n i e n d o 8 . 4 5 .
-c '
1 0 ’ m o l e s . L a s s o l u c i o n e s r é s u l t a n t e s se a g i t a r o n c a d a h o r a , s e p ^ r a n d o 5 ml d e s o b r e n a d a n t e a n t e s d e c a d a a g i t a c i ô n . L o s v o l û m e n e s as i o b t e n i d o s se fi 1 t r a r o n y se s o m e t i e r o n a d e t e r m l n a c i ô n c u a n t i t ^ t i v a d e C a * * p o r e s p e c t r o s c o p î a de a b s o r c i ôn a t ô m i c a .
L a s m o l é c u l a s m o d e l o e n s a y a d a s h a n s i d o : â c i d o L - a s p â r t i c o , â c i d o L - g l u t â m i c o , L - a r g i n i n a , N - m e t i l a c e t a m i d a , â c i d o p o l i - L - g l u ^ t â m i c o y â c i d o p o l i a c r î l i c o .
El c r e c i m i e n t o de c ri s t a l e s de b r u s h i t a se ha r e a l i z a d o raez^
c l a n d o p o r un l a d o , 2 m i s d e u n a d i s o l u c l ô n de P O ^ H N a g 2 . 6 . 1 0 ^ M ( p H = 6 ) c o n 2 m g d e b r u s h i t a , q u e se e n r a s a n a 25 ml c o n u na disolu^
c i ô n de â c t d o c l o r h î d r i c o a j u s t a d a a pH 6. P a r a e n s a y a r l as moléc^^
las m o d e l o , se a ü a d e n 1 . 3 7 . 1 0 ’ ® é q u i v a l e n t e s de e s t a s s u s t a n c i a s a £ t es de e n r a s a r a 25 ml. P o r o t r a p a r t e se p r e p a r ô o t r a d i s o l u c l ô n r e a c t i v a q u e c o n t i e n e 5 . 5 . 1 0 ’ ^ m o l e s de C l g C a en 25 ml de s o l u c i ô n c l o r h î d r i c a a j u s t a d a a pH 6.
