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CONTEÚDO LIPÍDICO EMBRIONÁRIO: EFEITO DO TAMANHO FOLICULAR E MEIO DE CULTIVO

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Academic year: 2020

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(1)CONTEÚDO LIPÍDICO EMBRIONÁRIO: EFEITO DO TAMANHO FOLICULAR E MEIO DE CULTIVO. Diego Borba Müller 1 Roniele Santana Valente 2 Gabrielly de Freitas Santanna 3 Diana Pedroso Caetano 4 Jeferson Bueno Fripp 5 Mateus Jose Sudano 6. Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o conteúdo lipídico embrionário em relação ao tamanho folicular e ao meio de cultivo de embriões. No primeiro experimento foi avaliada a influência do meio de cultivo ao qual os embriões foram cultivados (na presença de SFB ou livre de SFB). No segundo experimento foi avaliado a taxa de clivagem e formação blastocistos e o acúmulo de lipídios em embriões produzidos in vitro a partir de oócitos recuperados de folículos grandes (6 mm) e pequenos ( 5 mm). As taxas de clivagem e produção de blastocisto têm sido critérios de avaliação da competência e viabilidade embrionária. Para a realização do primeiro experimento, folículos 2mm a 8mm de diâmetro, no segundo experimento foram aspirados monitoramento do volume de fluído folicular para classifica-los em dois grupos: Folículos grandes ( 6mm de diâmetro contendo 0,1mL de fluído folicular) e pequenos ( 5mm de diâmetro contendo 0,05) no conteúdo lipídico dos embriões produzidos nos meios SOFaaci com SFB (7,40 ± 0,42) e SOFaaci livre de SFB (8,33 ± 0,40). Com relação ao segundo experimento foi avaliada a taxa de clivagem, de produção de blastocistos, e conteúdo lipídico citoplasmático. A taxa de clivagem foi maior (P 0,05) apresentaram teor semelhante de lipídios citoplasmático (7,6 ± 0,5 vs 7,7 ± 0,4). No entanto, no dia 8 os blastocistos apresentaram aumento (P Palavras-chave: Embriões; lipídeos; Soro fetal bovino; criopreservação; bovinos.. Modalidade de Participação: Iniciação Científica. CONTEÚDO LIPÍDICO EMBRIONÁRIO: EFEITO DO TAMANHO FOLICULAR E MEIO DE CULTIVO 1 Aluno de graduação. diegooborbamuller@gmail.com. Autor principal 2 Aluno de pós-graduação. ronielevalente@gmail.com. Co-autor 3 Aluno de graduação. gabriellyfsantanna@gmail.com. Co-autor 4 Aluno de pós-graduação. dianapcaetano1@gmail.com. Co-autor 5 Aluno de pós-graduação. fripp.jb@gmail.com. Co-autor 6 Docente. mateussudano@unipampa.edu.br. Orientador. Anais do 9º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampa | Santana do Livramento, 21 a 23 de novembro de 2017.

(2) CONTEÚDO LIPÍDICO EMBRIONÁRIO: EFEITO DO TAMANHO FOLICULAR E MEIO DE CULTIVO 1. INTRODUÇÃO. Atualmente, o Brasil destaca-se por possuir o maior rebanho comercial do mundo com mais de 218 milhões de cabeças (IBGE, 2016) e deste modo as biotécnicas associadas a reprodução estão cada vez mais sendo utilizadas. A produção in vitro de embriões (PIV) é a biotécnica que mais cresce atualmente, visando aumentar de forma rápida o número de animais produzidos e o ganho genético alcançado. Apesar de bem consolidada, a PIV ainda possui fatores limitantes para o desenvolvimento embrionário adequado quando comparado com o desenvolvimento de seus homólogos in vivo. Um desses fatores é a quantidade lipídica aumentada em embriões PIV em relação os embriões produzidos in vivo. Esse conteúdo lipídico alterado vem sendo associado com uma reduzida sobrevivência após a criopreservação, dificultando a uma ampla aplicação comercial desta biotécnica. O uso do soro fetal bovino (SFB) em meios de desenvolvimento embrionário tem como objetivo fornecer substratos energéticos, aminoácidos, vitaminas, fatores de crescimento e quelantes de metais pesados, no entanto, a presença e a concentração desses componentes podem variar entre os lotes (MUCCI, et al, 2006). Ainda, pode levar a desvios metabólicos e acumulo de lipídios de forma excessiva (ABE, et al, 2002) e posteriormente a uma diminuição na sobrevivência do embrião após a criopreservação (RIZOS, et al 2002). Diante deste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o conteúdo lipídico embrionário em relação ao tamanho folicular e ao meio de cultivo de embriões. No primeiro experimento foi avaliada a influência do meio de cultivo ao qual os embriões foram cultivados (na presença de SFB ou livre de SFB). Deste modo tentou-se reduzir o conteúdo lipídico embrionário, visando uma melhor viabilidade desses embriões e possivelmente uma melhor criopreservação devido a redução da formação de cristais de gelo dentro das células embrionárias, pois conforme Abe, Hiroyuki et al. (2002) a formação dos cristais de gelo diminui a sobrevivência do embrião após a criopreservação. No segundo experimento foi avaliado a taxa de clivagem e formação blastocistos e o acúmulo de lipídios em embriões produzidos in vitro a partir de oócitos recuperados de folículos grandes (• mm) e pequenos (” mm). As taxas de clivagem e produção de blastocisto têm sido critérios de avaliação da competência e viabilidade embrionária (ALIKANI et al., 2002). 2. METODOLOGIA. Os ovários foram coletados em abatedouro comercial e transportados em solução fisiológica a 30ˆC até o laboratório. Para a realização do primeiro experimento, folículos 2mm a 8mm de diâmetro foram aspirados para seleção de oócitos grau I e II contendo citoplasma homogêneo e mais de duas camadas de células do cumulus. Os oócitos recuperados foram maturados por 24 horas em incubadora com 5% de CO2 em ar e umidade saturada. Após, foi realizado cocultivo dos oócitos com espermatozoides por um período de 18 horas com posterior transferência para o meio de cultivo, onde foram divididos aleatoriamente para o.

(3) meio SOFaaci com SFB ou SOFaaci livre de SFB colocados em incubadora com 5% de oxigênio, 5% CO2 e balanço de nitrogênio com umidade saturada. Considerando-se como Dia 0 o dia da fecundação, 96 horas após foi avaliado a clivagem dos embriões. Nos dias 7 e 8 de cultivo foram coletados apenas blastocistos expandidos para a avaliação lipídica com a coloração de Sudan Black B. Foram corados pelo protocolo da coloração Sudan Black B e realizado a captura das imagens e posterior análise de mensuração do conteúdo lipídico em escalas de cinza através do programa Image J. Os dados foram analisados pelo Test T do programa Graphpad Prisma. Para a realização do segundo experimento, os folículos de ovários de abatedouro foram cuidadosamente avaliados com auxílio de um paquímetro e monitoramento do volume de fluído folicular aspirado para classifica-los em dois JUXSRV )ROtFXORV JUDQGHV • 6mm de diâmetro contendo • 0,1mL de fluído folicular) H SHTXHQRV ” PP de diâmetro contendo <0,1ml de fluído folicular). Apenas os oócitos grau I e II recuperados dos folículos grande e pequenos foram submetidas a maturação in vitro, fecundação e cultivo, como descrito anteriormente. As taxas de clivagem e produção de blastocisto foram registados nos dia 3 e dia 8 após a fecundação. A coleta de blastocistos expandidos foi realizada no dia 7 ( n = 22), e os embriões que não atingiram o estádio de blastocisto expandido no dia 7, mas tornaram-se blastocistos expandidos no dia oito ( n = 23) foram coletados para ensaio semi-quantitativo sa avaliação do teor de lípidos citoplasmático utilizando a coloração Sudan Black B. O software ImageJ foi usado para converter as imagens dos blastocistos corados com Sudan Black B em escala de cinzas e para determinar o teor de lípidos expressos em intensida de cinza. Os dados foram analisados por ANOVA utilizando o PROC GLIMMIX do SAS. 3. RESULTADOS e DISCUSSÃO. Após os embriões passarem pelo processo de coloração de Sudan Black B representados nas figuras abaixo foi realizada a análise estatística do experimento.. Figura 1. A e B representação dos embriões antes de passar pelo processo de coloração. Embriões corados com a técnica de Sudan Black B, Figura C representando o grupo que o meio possui soro fetal bovino e o a Fígura D o grupo livre de soro fetal bovino no meio de cultivo..

(4) Não foi observada diferença (P>0,05) no conteúdo lipídico dos embriões produzidos nos meios SOFaaci com SFB (7,40 ± 0,42) e SOFaaci livre de SFB (8,33 ± 0,40), apesar de numericamente a intensidade de cinza do meio contendo SFB (2,5%) apresentar uma valor reduzido do conteúdo lipídico . Mesmo não havendo diferença estatística entre os dois (Figura 3) é de extrema importância a remoção do soro fetal dos meios de cultivo. Segundo Lazzari, Giovanna,et al (2002) o uso do soro fetal bovino mesmo tendo propriedades utéis pode levar os embriões a desenvolverem a síndrome da prole grande levando o animal a morte poucas horas após o parto.. Figura 2. Gráfico representativo do conteúdo lipídico citoplamático.. Com relação ao segundo experimento foi avaliada a taxa de clivagem, de produção de blastocistos, e conteúdo lipídico citoplasmático. A taxa de clivagem foi maior (P<0,05) no grupo dos folículos grandes em relação ao grupo de embriões oriundos de folículos pequenos (74,8 ± 3,6 vs 51,9 ± 4,4). Na avaliação da produção dos embriões, o grupo de folículos grandes teve produção superior (P<0,05) ao grupo de folículos pequenos (26,4 ± 9,0 vs 13,8 ± 1,7), as taxas foram avaliadas em porcentagem (%).. Fígura 3. embriões A e B representando o grupo pequeno e grande antes do processo de coloração Sudan Black e embriões C e D são os respectivos embriões corados para a avaliação do conteúdo lipidíco..

(5) Figura 4. Taxa de clivagem e produção de blastocisto dos grupos pequeno e grande;. Já com relação ao conteúdo lipídico, no dia 7 de cultivo embrionário, embriões produzidos in vitro a partir de oócitos recuperados de folículos grandes apresentaram aumentado (P <0,05) o conteúdo lipídico citoplasmático quando comparados com os blastocistos derivados de oócitos de folículos pequenos (5,3 ± 0,3 vs 4,3 ± 0,4 intensidade de cinzento, respectivamente). No dia 8, embriões produzidos in vitro a partir de oócitos recuperados de folículos grandes e pequenos (P> 0,05) apresentaram teor semelhante de lipídios citoplasmático (7,6 ± 0,5 vs 7,7 ± 0,4). No entanto, no dia 8 os blastocistos apresentaram aumento (P <0,05) no depósito de lípidos quando comparados com o dia 7 do experimento.. Figura 5. Quantificação do conteúdo lipídico citoplasmático em intensidade de cinza no dia 7 e dia 8 de cultivo embrionário..

(6) 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS. A produção com meio de cultivo livre SFB não reduziu o conteúdo lipídico embrionário em comparação ao meio com SFB. Apesar de não ter sido observado diferença no conteúdo lipídico dos embriões produzidos no presente estudo, a remoção do soro fetal bovino é essencial para o progresso da produção in vitro de embriões visando melhorar a qualidade e a viabilidade embrionária. Quanto a forma de investigação do conteúdo lipídico pelo tamanho folicular mostrou que oócitos recuperados de folículos grandes proporcionaram maiores taxas de clivagem e produção de blastocistos. Já a produção de blastocistos expandidos na coleta do dia 7 oriundos de oócitos recuperados de folículos grandes apresentaram maior conteúdo lipídico comparados com os blastocistos oriundos de oócitos recuperados de folículos pequenos, mas não houve variação de conteúdo lipídico entre os blastocistos expandidos oriundos de folículos pequenos ou grandes quando coletados no dia 8. Quanto a blastocistos com expansão retardada de blastocele (Dia 8) apresentaram maior teor lipídico em comparação com blastocistos com expansão precoce (Dia 7) como um efeito compensatório devido seu atraso no desenvolvimento e adversidades da gota. 5. REFERÊNCIAS. Abe, Hiroyuki, et al. "Accumulation of cytoplasmic lipid droplets in bovine embryos and cryotolerance of embryos developed in different culture systems using serumæfree or serumæcontaining media." Molecular reproduction and development 61.1 (2002): 57-66. Instituto Brasileiro de Geográfia e Estátistica [acesso em 22 setembro 2017]. Disponível em: https://agenciadenoticias.ibge.gov.br/2012-agencia-denoticias/noticias/16994-rebanho-de-bovinos-tem-maior-expansao-da-seriehistorica.html. Lazzari, Giovanna, et al. "Cellular and molecular deviations in bovine in vitroproduced embryos are related to the large offspring syndrome." Biology of Reproduction 67.3 (2002): 767-775. Mucci, N., et al. "Effect of estrous cow serum during bovine embryo culture on blastocyst development and cryotolerance after slow freezing or vitrification." Theriogenology 65.8 (2006): 1551-1562. Rizos, D., Ward, F., Duffy, P., Boland, MP e Lonergan, P. Conseqüências da maturação dos ovócitos bovinos, adubação ou desenvolvimento embrionário precoce in vitro versus in vivo : implicações para o rendimento do blastocisto e qualidade do blastocisto. Mol Reprod Dev . 2002 ; 61 : 234-238.

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Figure

Figura  1.  A  e  B  representação  dos  embriões  antes  de  passar  pelo  processo  de  coloração
Figura 2. Gráfico representativo do conteúdo lipídico citoplamático.
Figura 4. Taxa de clivagem e produção de blastocisto dos grupos pequeno e grande;

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