AVALIAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES INIBITÓRIA E FUNGICIDA MÍNIMA DO ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO SOBRE ASPERGILLUS FLAVUS

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(1)AVALIAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES INIBITÓRIA E FUNGICIDA MÍNIMA DO ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO SOBRE ASPERGILLUS FLAVUS. Zaira Guido 1 Zaira Guido 2 Carjone Rosa Gonçalves 3 Fernanda Macke Hellwig 4 Luiz Torres Neto 5 Adriane Lettnin Roll Feijó 6 Flávio Dias Ferreira 7. Resumo: O orégano (Origanum vulgare Lamiaceae) encontra-se entre os condimentos mais utilizados no Brasil devido sua capacidade de aumentar e acrescentar sabor aos alimentos. Ainda, apresenta propriedades antimicrobianas devido à presença dos compostos carvacrol e timol. Diante isto, o trabalho propõe avaliar o rendimento de extração, a concentração inibitória mínima e a concentração fungicida mínima do óleo essencial (OE) de Origanum vulgare frente ao Aspergillus flavus. As folhas desidratadas de orégano foram obtidas comercialmente. O óleo essencial de orégano (OEO) foi extraído por hidrodestilação. A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada pelo método da diluição em tubos em caldo adaptado do protocolo recomendado pelo CLSI, documento M38-A. A determinação da concentração fungicida mínima (CFM) foi realizada mediante a adição de uma alíquota de 100 L dos tubos, utilizados para a determinação do CIM bem como o controle positivo e negativo, em placas de DSA, sem a presença de qualquer antifúngico. A CIM foi observada na concentração de 1,0 µL/mL, enquanto que a CFM apresentou-se na concentração de 2,0 µL/mL. A eficácia da atividade antimicrobiana dos OE pode variar, pois sua composição é dependente de fatores bióticos e abióticos, sendo influenciadas pelo local de origem da planta, temperatura de secagem, processo de extração, além de outras variáveis como ciclo vegetativo, solo, clima e estação do ano. Seguindo a classificação de Aligiannis (2001) podemos considerar que o OEO é um forte inibidor frente ao Aspergillus flavus, justificando desta forma a viabilidade do uso deste OE. A atividade antifúngica do OEO pode estar relacionada à ação dos compostos majoritários carvacol e timol, pois, apresentam um grupo aromático capaz de formar ligações de hidrogênio com locais ativos de enzimas alvo, entretanto, outros autores sugerem que a eficácia dos OE completos seja maior do que a atividade de cada composto separado, apresentando um sinergismo entre os compostos majoritários e minoritários. Ainda, diversos autores descreveram que OE são capazes de causar alterações morfológicas nas espécies de Aspergillus, incluindo falta de esporulação, perda de pigmentação, desenvolvimento disforme de conidióforos e distorção das hifas. Neste sentido, relata que essas alterações morfológicas sugerem que a atividade antifúngica dos OE pode também estar relacionadas a um ataque na parede celular e retração do citoplasma nas hifas, resultando na morte do micélio. Além disso, também pode estar relacionado à interferência dos componentes do OE nas reações enzimáticas da síntese da parede celular, que afeta o crescimento fúngico e a morfogênese.O presente estudo confirmou a atividade antifúngica do OE de O. vulgare, sendo considerado um inibidor forte, com CIM e CFM de 1,0 µL/mL e 2,0 µL/mL, respectivamente. Sugere-se novos estudos para avaliação antimicotoxigênico, perfil citotóxico e genotóxico, visando obter maior embasamento para seu uso racional como uma alternativa a ser aplicada no controle biológico de espécies de Aspergillus em gêneros alimentícios..

(2) Palavras-chave: A.flavus, Origanum vulgare, óleo essencial. Modalidade de Participação: Iniciação Científica. AVALIAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES INIBITÓRIA E FUNGICIDA MÍNIMA DO ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO SOBRE ASPERGILLUS FLAVUS 1 Aluno de graduação. zairasn7930@gmail.com. Autor principal 2 Aluno de graduação. nicolez7930@gmail.com. Apresentador 3 Técnico Administrativo em Educação. carjonegoncalves@unipampa.edu.br. Co-autor 4 Técnico Administrativo em Educação. fernandahellwig@unipampa.edu.br. Co-autor 5 Aluno de graduação. torresneto1995@gmail.com. Co-autor 6 Técnico Administrativo em Educação. adrianefeijo@unipampa.edu.br. Orientador 7 Docente. flaviodiasferreira@gmail.com. Co-orientador.

(3) AVALIAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES INIBITÓRIA E FUNGICIDA MÍNIMA DO ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO SOBRE ASPERGILLUS FLAVUS 1. INTRODUÇÃO Concomitante ao crescimento populacional aumenta-se a demanda por alimentos mais saudáveis. As doenças fúngicas são fator limitante para a produção devido às perdas na produtividade e na qualidade dos produtos agrícolas. Os fungos dos gêneros Aspergillus, por exemplo, são os principais deterioradores de alimentos e possuem distribuição mundial, devido a numerosos esporos aerotransportados (HEDAYATI et al., 2007). Os fungos deste gênero apresentam como principais metabólitos secundários tóxicos as aflatoxinas, que são conhecidas por serem substâncias altamente tóxicas, mutagênicas, teratogênicas e carcinogênicas (SANTOS et al., 2014). Nesse sentido, a incidência de fungos e micotoxinas em produtos agrícolas necessitam de métodos de prevenção e controle eficazes. Entretanto, a utilização de antifúngicos sintéticos pode deixar resíduos no produto final, comprometendo a saúde dos consumidores (CAKIR et al., 2005). Portanto, o uso de extratos naturais provenientes de plantas pode fornecer uma alternativa por serem de fácil obtenção e utilização, apresentarem baixo custo e por normalmente não apresentam efeitos genotóxicos e mutagênicos a seres humanos (MARTINEZ, 2002; KHAN & AHMAD, 2011). Óleos essenciais (OE) são produtos obtidos de partes de plantas, sendo misturas complexas de substancias voláteis lipofílicas geralmente odoríferas e líquidas. Apresentam-se como alternativa potencial, pois possuem alto grau de atividade antimicrobiana, característica atribuída à ação de substâncias presentes em sua composição como os compostos fenólicos, monoterpenos e terpenóides (ANTUNNES & CAVACOB, 2010; GILLES et al., 2010). Grande parte desses compostos tem demonstrado efeito inibitório elucidando ações sobre o crescimento, morfogênese e metabolismo primário e secundário fúngico (CHAO et al., 2000; FERREIRA et al., 2013; YAMAMOTO-RIBEIRO et al., 2013; ALLAMEH et al., 2001; HELAL et al., 2007). Origanum vulgare Lamiaceae (orégano) encontra-se entre os condimentos mais utilizados no Brasil devido sua capacidade de aumentar e acrescentar sabor aos alimentos (De Morais et al., 2009). Ainda, apresenta propriedades antimicrobianas devido à presença dos compostos carvacrol e timol (NAZER et al., 2005; SILVA et al., 2005). Diante isto, o trabalho propõe avaliar o rendimento de extração, a concentração inibitória mínima e a concentração fungicida mínima do OE de Origanum vulgare frente ao Aspergillus flavus. 2. METODOLOGIA As folhas desidratadas de orégano foram obtidas comercialmente. O óleo essencial de orégano (OEO) foi extraído por hidrodestilação pelo aparato de Clevenger de acordo com a Farmacopéia Brasileira IV (1988), onde 30 g de orégano acrescidos de 250 mL de água destilada foi submetido a aquecimento brando, até.

(4) leve fervura, perdurando por duas horas, sempre ao abrigo da luz. O OEO extraído foi armazenado sob refrigeração a 4ºC. A remoção de umidade e sujidades foi realizada com adição de sulfato de sódio p.a. e centrifugação a 3000 rpm por 10 minutos. O fungo Aspergillus flavus foi obtido do banco de isolados do Laboratório de Toxicologia da Universidade Estadual de Maringá (DBS/UEM). As cepas foram mantidas em estoque de sílica e acondicionadas em refrigerador a 4 °C. A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada pelo método da diluição em tubos em caldo adaptado do protocolo recomendado pelo CLSI, documento M38-A (2002). A amostra fúngica foi cultivada em tubos contendo ágar batata dextrose (PDA) e incubadas a 28 ºC por 7 dias. As colônias fúngicas foram cobertas com 1 mL de solução salina a 0,85% esterilizada e 2 gotas de Tween 20 estéril, e a seguir homogeneizadas. Posteriormente foi realizada uma suave raspagem da superfície e a mistura de hifas e conídios foi transferida para tubos cônicos esterilizados, onde permaneceram em repouso por 5 minutos para sedimentação. O sobrenadante foi removido por aspiração, transferido para outro tubo estéril, e a densidade do inóculo foi ajustada para 80 ± 82% de transmitância em 625 nm, em espectrofotômetro para obter uma concentração final de 104 UFC/mL. Essa concentração foi FRQIHULGD SRU PHLR GR SODTXHDPHQWR GH / GR inóculo preparado em ágar PDA e realizada a contagem do número de colônias. O OEO foi testado em 14 concentrações compreendidas entre 1,5% e 0,05% (v/v). Para o ensaio, IRL DGLFLRQDGR HP WXER GH HQVDLR GH YLGUR / GR FDOGR sabouraud dextrosado (SDB) / GD GLOXLomR GR yOHR H / GR LQyFXOR aferido, e os tubos foram incubados a 28 ºC sem agitação, por 72 horas. No teste foi incluído controle positivo, representado pelo crescimento de cada isolado na ausência de OEO, e o controle negativo, que corresponde à ausência do inóculo fúngico. A menor concentração capaz de produzir inibição visual do crescimento fúngico foi considerada como a CIM do OE para esta amostra. A determinação da concentração fungicida mínima (CFM) foi realizada mediante a adição de uPD DOtTXRWD GH / dos tubos, utilizados para a determinação do CIM bem como o controle positivo e negativo, em placas de DSA, sem a presença de qualquer antifúngico. As amostras foram incubadas em BOD a 28 ºC, e a leitura efetuada após 72 e 120 horas de incubação, sendo considerado CFM a menor concentração do OEO que não apresentou visualmente crescimento fúngico na superfície do meio de cultivo após incubação (SHARMA & TRIPATHI, 2008). Todos os ensaios foram realizados em triplicata. 3. RESULTADOS e DISCUSSÃO O volume médio de OEO obtido em cada batelada de extração foi de 350 µL (±40 µL) apresentando um rendimento médio de 10,7 µL/g (±1,5 µL/g). O óleo obtido apresentou coloração amarelo-esverdeado e odor forte, característico de orégano. O rendimento obtido foi inferior ao descrito por Kawase (2013), que obteve o rendimento de 45 µL/g, porém encontra-se dentro da faixa esperada citada pela literatura, que pode variar entre 10 µL/g e 120 µL/g, de acordo com a estação de colheita e forma de secagem (RODRIGUES, 2012). A CIM foi observada na concentração de 1,0 µL/mL, enquanto que a CFM apresentou-se na concentração de 2,0 µL/mL. Outros estudos que avaliaram a ação do OEO frente ao fungo A. flavus, apresentaram inferiores de CIM de 0,6 µL/mL e CFM de 1,25 (MITCHELL, 2010), enquanto outros autores relatara valores de CIM.

(5) próximos ao encontrado neste estudo, de 0,94 µL/mL (CARMO et al., 2008) e 1,25 µL/mL (VELLUTI et al 2003); e ainda valores superiores de CIM, até 500 mg/mL (PEREIRA et al., 2006). A eficácia da atividade antimicrobiana dos OE pode variar, pois sua composição é dependente de fatores bióticos e abióticos, sendo influenciadas pelo local de origem da planta, temperatura de secagem, processo de extração, além de outras variáveis como ciclo vegetativo, solo, clima e estação do ano (MSAADA et al., 2012; SIMÕES et al., 2005). Aligiannis e et al. (2001) desenvolveram uma classificação para caracterizar a viabilidade, ou não, do extrato vegetal, considerando como forte inibidor o extrato vegetal que apresentar uma CIM até 500 µg mL/mL; inibidor moderado quando apresentar CIM entre 600 e 1500 µg mL/mL e inibidor fraco aquele que apresentar uma CIM superior a 1600 µg mL-1. Seguindo esta classificação podemos considerar que o OEO é um forte inibidor frente ao Aspergillus flavus, justificando desta forma a viabilidade do uso deste OE. A atividade antifúngica do OEO pode estar relacionada à ação dos compostos majoritários carvacol e timol, pois, apresentam um grupo aromático capaz de formar ligações de hidrogênio com locais ativos de eQ]LPDV DOYR ',0,75,-(9,û HW DO., 2007; SOUZA et al., 2007), entretanto, Milos et al. (2001) sugerem que a eficácia dos OE completos seja maior do que a atividade de cada composto separado, apresentando um sinergismos entre os compostos majoritários e minoritários. Ainda, diversos autores descreveram que OE são capazes de causar alterações morfológicas nas espécies de Aspergillus, incluindo falta de esporulação, perda de pigmentação, desenvolvimento disforme de conidióforos e distorção das hifas (RASOOLI & ABYANEH , 2004; SHARMA & TRIPATH, 2008). Neste sentido, Mitchell (2010) relata que essas alterações morfológicas sugerem que a atividade antifúngica dos OE pode também estar relacionada a um ataque na parede celular e retração do citoplasma nas hifas, resultando na morte do micélio. Além disso, também pode estar relacionado à interferência dos componentes do OE nas reações enzimáticas da síntese da parede celular, que afeta o crescimento fúngico e a morfogênese. 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS O presente estudo confirmou a atividade antifúngica do OE de O. vulgare, sendo considerado um inibidor forte, com CIM e CFM de 1,0 µL/mL e 2,0 µL/mL, respectivamente. Sugere-se novos estudos para avaliação antimicotoxigênico, perfil citotóxico e genotóxico, visando obter maior embasamento para seu uso racional como uma alternativa a ser aplicada no controle biológico de espécies de Aspergillus em gêneros alimentícios. 5. REFERÊNCIAS ALLAMEH, A. et al. Effects of neem leaf extract on production of aflatoxins and activities of fatty acid synthetase, isocitrate dehydrogenase and glutathione Stransferase in Aspergillus parasiticus. Mycopatologia, v.154, p.79-84, 2001. ALIGIANNIS N., et al., Composition and antimicrobial activity of the essential oil of two Origanum species. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40, 4168-4170, 2001..

(6) ANTUNES, M. D. C., & Cavacob, A. The use of essential oils for postharvest decay control. A review. Flavour Fragrance Journal, 25, 351-366, 2010. CAKIR, A. et al. Antifungal properties of essential oil and crude extract ofHypericum linarioides Bosse. Biochemical systematic and Ecology, v.33, p.245-256, 2005. CHAO, S.C.; YOUNG, D.G.; OBERG, C.J. Screening for inhibitory activity of essential oils on selected bacteria, fungi and viruses. Journal of Essential Oil Research, v.12, p.639-649, 2000. CARMO, E.S.; LIMA, E.O.; SOUZA, E.L. The potential of Origanum vulgare L. (Lamiaceae) essential oil in inhibiting of some foodrelated Aspergillus species. Brazilian Journal of Microbiology, 39, 362-367, 2008. DIMITRIJEVIÉ, S. I. et al. A study of the synergistic antilisterial effects of a sub-lethal dose of latic and essential oils from Thymis vulgaris L., Rosmarinus officinalis L. and Origanum vulgare L. Food chemistry, v.104, n.2, p. 774-782, 2007. FARMACOPEIA BRASILEIRA. 4.ed. São Paulo: Atheneu, 1988. FERREIRA, F.D. et al. Inhibitory effect of the essential oil of Curcuma longa L. and curcumin on aflatoxin production by Aspergillus flavus Link. Food Chemistry, v. 136, p. 789-793, 2013. GILLES, M., ZHAO, J., An, M., & AGBOOLA, S. Chemical composition and antimicrobial properties of essential oils of three Australian Eucalyptus species. Food Chemistry, 119, 731-737, 2010. HELAL, G.A. et al. Effects of Cymbopogon citratus L. essential oil on the growth, morphogenesis and aflatoxin production of Aspergillus flavus ML2-strain. Journal of Basic Microbiology, v.47, p.5-15, 2007. HEDAYATI, M. T., et al., Aspergillus flavus: human pathogen, allergen and mycotoxin producer. Microbiology, 153, 1677-1692. 2007. KHAN, M. S. A., & AHMAD, I. In vitro antifungal, anti-elastase and anti keratinase activity of essential oils of Cinnamomum-, Syzygium- and Cymbopogon-species , J.; against Aspergillus fumigatus and Trichophyton rubrum. Phytomedicine, 19, 48± 55, 2011. MARTINEZ, S.S. (Ed). O Nim ± Azadirachta indica Natureza, Usos Múltiplos, Produção. Publicado pelo IAPAR - Londrina, Abril, 2002. MILOS, M.; MASTELIC LERKIVIC, I. chermical composition and antioxidant effect of glycosidically bound volatile compounds fron oregano (origanum vulgare L. ssp. Hirtum). Food Chemistry, v. 71, n.1, p. 79-83, 2000. MITCHELL, T. C. et al . Origanum vulgare L. essential oil as inhibitor of potentially toxigenic Aspergilli. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas , v. 30, n. 3, p. 755-760, Sept. 2010 ..

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