INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY
CAMPUS MONTERREY DIVISIÓN DE INGENIERÍA
PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA
TECNOLÓGICO DE MONTERREY
COMPORTAMIENTO DE PARTICIÓN DE B-FICOERITRINA PRODUCIDA POR Porphyridium cruentum EN SISTEMAS
DE DOS FASES ACUOSAS TESIS
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA POR
JORGE ALEJANDRO BENAVIDES LOZANO
MONTERREY, N.L. DICIEMBRE 2003
PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA
TECNOLÓGICO DE MONTERREY
COMPORTAMIENTO DE PARTICIÓN DE B-FICOERITRINA PRODUCIDA POR Porphyridium cruentum EN SISTEMAS
DE DOS FASES ACUOSAS
TESIS
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS
ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA
POR:
JORGE ALEJANDRO BENAVIDES LOZANO
INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY CAMPUS MONTERREY
DIVISIÓN DE INGENIERÍA
PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA
Los miembros del comité de tesis recomendamos que el presente proyecto de tesis presentado por el I.Q. Jorge Alejandro Benavides Lozano sea aceptado como requisito parcial para obtener el grado académico de Maestro en Ciencias con especialidad en:
BIOTECNOLOGÍA
Comité de Tesis:
Dr. Marcó Antonio Rito Palomares ASESOR
Dra. Carmen Hernández Brenes CO-ASESORA
Dr. Sergio O. Serna Saldívar SINODAL
Dr. Federico Viramontes Brown
Director del Programa de Graduados en Ingeniería
A Dios, por permitirme llegar a este momento, estando siempre bajo su protección y cuidado.
Al Dr. Marco Antonio Rito Palomares, por su profesionalismo, su tiempo, sus consejos que me ayudaron a resolver un sin número de problemas, su honestidad y por su calidez humana; en pocas palabras, por ser un excelente asesor.
A la Dra. Carmen Hernández Brenes, por sus valiosos consejos y sus palabras de aliento en esos momentos en que parecía que las cosas no podían ir peor.
Al Dr. Sergio 0. Serna Saldívar, por su tiempo, su apoyo y sus palabras de aliento.
Al Dr. Mario Moisés Álvarez, por ser un investigador excelente que infunde mediante su ejemplo el amor hacia la investigación y la docencia.
A mis amigos y compañeros de maestría Lic. Alejandro Aguilar Jiménez, Ing. Baltasar Aguilasocho Leyva, Ing. Benito Tinoco Pérez, Biol. Helena Sánchez Tual, Q.F.B. Nidya Solís Hernández y al Ing. Osear Osorío Pérez, por su amistad, su apoyo, su honestidad, su cariño y porque gracias a ellos siempre pude encontrar alegría en los momentos de dificultad.
A la Q.B.P. Isabel García por su ayuda a todo lo largo de mi trabajo experimental en el Laboratorio de Biotecnología.
A Myriam Robledo, por su cariño, su apoyo, su alegría, por siempre estar presente cuando necesitaba hablar con alguien.
A la Sra. MaryCarmen Rodríguez por siempre estar lista para ayudarme con mis pendientes administrativos.
A mis amigos de preparatoria y licenciatura, que siempre me han mostraron su cariño y apoyo incondicional, y que me hacen recordar cada vez que hablo con ellos que hay un mundo fuera del ITESM.
A todos los profesores y colaboradores del Centro de Biotecnología y a Mayra Cisneros, por demostrarme que la calidad humana es uno de los factores más importantes para alcanzar el éxito y la excelencia.
Y por supuesto, a mi padre, Jorge César Benavides Garza, y a mi madre, Bertha Cristina Lozano Rodríguez, por su amor, su apoyo, su ayuda, por soportarme en esos días en que llegaba de mal humor a la casa por que en la escuela me habían encargado hacer algo que yo
Dedicada a
Mi padre, que siempre me ha mostrado con su
ejemplo la importancia del trabajo y del estudio, y
a mi madre, que con cariño siempre me recuerda
que no todo en la vida es trabajo y estudio.
comportamiento de partición de B-ficoeritrina producida por Porphyridium cruentum en sistemas de dos fases acuosas. Los parámetros de sistema que fueron estudiados son la concentración de los químicos que forman las fases (polímero y sal) medida como la longitud de línea de corte (LLC), el peso molecular de polímero, la relación de volúmenes (VR) y el pH del sistema.
Para llevar a cabo la evaluación del efecto de la variación de LLC y peso molecular de polímero se probaron valores de longitud de línea de corte que iban de 27% a 55% peso/peso, en sistemas PEG - Fosfatos con polímero de peso molecular 1000,1450, 3350 y 8000 g/gmol. Para el estudio del efecto de la variación de pH sobre el comportamiento de partición se seleccionó el sistema PEG - Fosfatos con los que se obtuvo mayor pureza para cada peso molecular probado durante el estudio de la influencia de LLC y peso molecular, y estos fueron construidos a pH 7, 8 y 9. Durante el estudio de VR se probaron sistemas PEG - Fosfatos con polímero de peso molecular 1000 y 1450 g/gmol cuya relación de volúmenes experimental iba de 2.4 a 0.2.
Los resultados obtenidos demuestran que la recuperación y purificación de B-ficoeritrina se ven favorecidas en sistemas de bajo peso molecular (1000 o 1450 g/gmol), con LLC elevadas, a pH 7, y a valores de VR mayores a 1, ya que los sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos con dichas características resultaron ser los que mayor pureza reportaron. Los resultados experimentales indican que el sistema PEG - Fosfatos con polímero de peso molecular 1000 g/gmol, con LLC de 40% p/p, pH 7 y una relación de volúmenes de 2.4 obtuvo la más alta pureza de B-ficoeritrina, siendo esta 3.1, partiendo de un extracto crudo "concentrado" de B-ficoeritrina con una pureza de 0.8.
El entendimiento de la influencia de los parámetros de sistema sobre el comportamiento de partición de B-ficoeritrina en sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos permite proponer una estrategia de recuperación primaria y purificación de esta proteína de alto valor comercial. Los sistemas óptimos resultantes del estudio sobre la influencia de los parámetros de sistema sobre la partición de la proteína pueden ser potencialmente útiles para su posterior integración en procesos de purificación de B-ficoeritrina.
índice General
índice General
Página Índice de Figuras i índice de Tablas iii
Capítulo 1. Antecedentes 1
1.1. Características y propiedades bioquímicas de B-f¡coeritrina. 1 1.2. Usos e importancia comercial de B-ficoeritrina. 3 1.3. Porphyridíum cruentum para la producción de B-f icoeritrina. 3 1.4. Procesos tradicionales de recuperación y purificación de B-f icoeritrina. 6
Capítulo 2. Introducción 9
2.1. Sistemas de dos fases acuosas. 9 2.1.1. Descripción y características de los sistemas de dos fases acuosas. 9 2.1.2. Parámetros de sistema y otros conceptos básicos utilizados en 12
sistemas de dos fases acuosas.
2.2. Ventajas y aplicaciones de los sistemas de dos fases acuosas. 17 2.3. Objetivo de la Investigación. 18 2.4. Hipótesis. 18
Página
Capítulo 3. Materiales y Métodos 19
3.1. Materiales. 19
3.1.1. Reactivos. 19
3.1.2. Material Biológico. 20
3.2. Técnicas analíticas. 20
3.2.1. Cuantificación de proteína total mediante el método de Bradford. 20
3.2.2. Determinación de pureza de la proteína B-ficoeritrina mediante la 21 relación A545/A280.
3.3. Fermentación de Porphyridium cruentum. 21
3.3.1. Medio de cultivo. 21
3.3.1.1. Composición del agua de mar artificial. 22
3.3.1.2. Composición del medio de cultivo. 22
3.3.1.3. Condiciones de cultivo. 23
3.4. Ruptura celular. 24
3.5. Obtención y preparación del extracto crudo "concentrado" de B- 24 ficoeritrina.
3.6. Construcción de bs sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos. 25
índice General
Página Capítulo 4. Resultados y Discusiones 31
Capítulo 5. Conclusiones y Recomendaciones 48
Bibliografía so
Anexos 55
Vita 76
índice de Figuras
Página
Figura 1.1. Estructura química del cromóforo ficoeritrobilina. 1
Figura 1.2. Estructura interna de la microalga Porphyridium cruentum. 4
Figura 1.3. Microalga Porphyridium cruentum. 5
Figura 1.4. Diagrama de proceso de purificación de B-ficoerítrína producida 7 por Porphyridium cruentum desarrollado por Bermejo et al (2002).
Figura 2.1. Fotografía de un sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos 11 probado con extracto crudo de B-ficoeritrina.
Figura 2.2. Curva binodal para los sistemas de dos fases acuosas PEG 1450 13 g/gmol - Fosfatos.
Figura 3.1. Fotografía del extracto crudo (A) y extracto crudo "concentrado" 26 (B).
Figura 4.1. Fotografía de la partición del estándar de B-ficoerítrína en sistema 32 PEG - Fosfatos.
Figura 4.2. Fotografía de la partición del extracto crudo "concentrado" de B- 34 ficoerítrína en sistemas PEG - Fosfatos.
Figura 4.3. Efecto de la longitud de línea de corte (LLC) y del peso molecular 37 de polímero sobre el porcentaje de recuperación de proteína total en los sistemas experimentales PEG - Fosfatos seleccionados.
Figura 4.4. Efecto del pH sobre el porcentaje de recuperación de proteína total 40 en los sistemas experimentales PEG - Fosfatos seleccionados.
índice de Figuras
Página
Figura 4.5. Fotografía de los sistema PEG 1450 g/gmol - Fosfatos probados 42 con extracto crudo "concentrado" de B-ficoerítrína seleccionados para evaluar la influencia de la relación de volúmenes (VR) sobre el comportamiento de partición de B-ficoeritrina.
Figura 4.6. Efecto de la relación de volúmenes (VR) sobre el porcentaje de 44 recuperación de proteína total en los sistemas experimentales
PEG - Fosfatos seleccionados.
Página
Tabla 1.1. Composición bioquímica de Porphyridium cruentum. 6
Tabla 3.1. Composición del agua de mar artificial utilizada para preparar el 22 Medio Algal para Porphyridium cruentum.
Tabla 3.2. Composición del medio de cultivo utilizado para la fermentación de 23 Porphyridium cruentum (preparado en agua de mar artificial).
Tabla 3.3. Composición de los sistemas PEG - Fosfatos utilizados en la 28 determinación de la influencia de la longitud de línea de corte (LLC), el peso molecular del polímero utilizado (PEG) y el pH sobre el comportamiento de partición de B-ficoeritrina en los sistemas de dos fases acuosas.
Tabla 3.4. Composición de los sistemas PEG - Fosfatos utilizados en la 29 determinación de la influencia de la relación de volúmenes (Vp) sobre el comportamiento de partición de B-ficoeritrina en los sistemas de dos fases acuosas.
Tabla 4.1. Pureza de B-ficoeritrina en sistemas de dos fases acuosas PEG - 36 Fosfatos seleccionados para evaluar el efecto del incremento de
la longitud de línea de corte (LLC) y peso molecular de polímero.
Tabla 4.2. Pureza de B-ficoerítrína en sistemas de dos fases acuosas PEG - 39 Fosfatos seleccionados para evaluar el efecto de la variación de
pH.
Tabla 4.3. Influencia de la relación de volúmenes (VR) sobre la pureza de B- 42 ficoeritrina en sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos.
Tabla 4.4. Efecto de un aumento de escala sobre el porcentaje de 45 recuperación de proteína total en sistemas de dos fases acuosas
índice de Tablas
Página
Tabla 4.5. Efecto de un aumento de escala sobre la pureza de B-ficoerítrína 45 en sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos.
Capítulo 1. Antecedentes.
1.1.Características y propiedades bioquímicas de B-ficoeritrina.
Las ficobiliproteinas son proteínas con grupos prostéticos tetrapirrólicos lineales (bilinas), que se encuentran unidos covalentemente a residuos dsteína específicos de las proteínas (Bermejo et al, 2002; Berns and MacColl, 1989; Ritter et al, 1999) (Figura 1.1). Las ficobiliproteinas están ensambladas dentro de una estructura célula organizada, llamada ficobilisoma. Estos complejos absorben la luz dentro de un rango amplio de longitud de onda dentro del espectro visible, y transfieren la energía de excitación resultante de la absorción de luz a los centros de reacción en las membranas fotosintéticas (tilacddes) dentro de los cloroplastos, para de esta forma generar energía química (Glazer et al, 1976; Gantt, 1980; Glazer, 1985; Glazer, 1989). Pueden ser encontradas en cianobacterias (algas verde-azules), en algas eucarióticas monocelulares biflageladas, así como en rodofitas (algas rojas).
COOH
H
Figura 1.1. Estructura química del cromóforo ficoeritrobilina. La ficoeritrobilina es una molécula tetrapirrólica de cadena abierta que se encuentra unida covalentemente mediante enlaces tioéster a una apoproteína, para dar como resultado la B-ficoeritrina, una proteína de
Capítulo 1. Antecedentes
La B-ficoeritrina obtenida de Porphyrídium cruentum (un alga microscópica unicelular de odor rojo) es un heteropdimero formado por 13 subunidades: 6 unidades a, cada una de las cuales tiene un peso mdecular de 17,500 Da; 6 unidades (3, cada una de las cuales tiene un peso mdecular de 17,500 Da; y una unidad y, con un peso mdecular entre 29,000 y 30,000 Da (MacCdl and Guard-Frár, 1987), lo cual le confiere un peso molecular total de aproximadamente 240,000 Da.
El punto isoeléctrico de B-ficoeritrina, producida por Rhodella violácea, es 4.2 (Koller et al, 1977). Los residuos de algunos de los aminoácidos que forman parte de las proteínas se prdonan y desprotonan dependiendo del pH en que se encuentran, adquiriendo de esta forma una carga electroquímica característica.
El punto isoeléctrico es aquel valor de pH en el que la carga neta electroquímica de la proteína es cero, es decir, la proteina tiene el mismo número de cargas positivas y negativas. A dicho valor de pH la proteína tiende a precipitar ya que al tener carga electroquímica nula, no existen repulsiones electroestáticas que impidan la aglomeración de las proteínas (Stryer, 1992).
En cuanto a sus características espectrofotométricas, B-ficoeritrina muestra tres picos de absorbanda en d espectro visible, a 498,545 y 563 nm, siendo su pico máximo de absorbancia el de 545 nm (Bryant, 1982). De igual forma, la B-ficoeritrina muestra 2 picos de absorbancia en el espectro ultravideta: uno a 180 nm, que corresponde al pico de absorbancia debido al los enlaces peptídicos de la proteína, y otro a 280 nm, debido a la absorbancia generada por los residuos aromáticos de los aminoácidos tirosina y triptófano.
B-ficoeritrina no sdo absorbe luz, sino que también la transmite, es decir, presenta fluorescencia, teniendo esta su pico máximo entre 575 y 578 nm aproximadamente (Bryant, 1982; MacCdl and Guard-Frair, 1978).
La B-ficoeritrina es sduble en agua, es inodora y no es tóxica. Cuando se disuelve en agua forma una sdudón de un color rosa intenso. Todas las ficobiliproteínas presentan alta sensibilidad a la luz, por lo tanto es necesario mantenerlas en la oscuridad el mayor tiempo posible para evitar su desnaturalización.
Esta proteína tiene una gran variedad de usos. Debido a que tiene un color tan característico y llamativo, es utilizada en el área de alimentos, cosméticos, fármacos y de detergentes en un afán de sustituir el uso de pigmentos sintéticos, los cuales en algunas ocasiones han demostrado ser tóxicos (Espinosa de los Monteros et al, 2000), por pigmentos de origen natural, los cuales han demostrado no ser dañinos al ser consumidos o al entrar en contacto con ellos. Debido a sus propiedades de fluorescencia, también es usada como marcador bioquímico en inmunoensayos, asi como en técnicas que requieren moléculas marcadoras fluorescentes como por ejemplo citometría de flujo, microscopía de fluorescencia, etc. (Glazer and Stryer, 1984).
Debido a que en muchas ocasiones la B-ficoeritrina es utilizada para consumo humano, o bien para técnicas que requieren alta sensibilidad y precisión, es necesario que esta proteína tenga una pureza lo más elevada posible. La pureza de B-ficoeritrina puede ser expresada como la relación:
n _ „ . . Absorboncia 54Snm ., Pureza B-ficoentnna = (Ecuación 1.1)
Absorbancia 280«m
Se tiene reportado que una relación de Absorbancia 545 / Absorbancia 280 (en lo posterior representada como A545 / A280) igual o mayor a 5.5 representa una pureza del 99 % (ZEN-U Biotechndogy Co. Ltd, 2003). Al encontrarse en un estado tan puro, dicha proteína llega a comercializarse hasta en $50 USD / mg (ProZyme Inc., 2003).
1.3. Porphyridium cruentum para la producción de B-ficoeritrina.
Las Rodofitas (o como generalmente se les llama, algas rojas) son unos de los seres eucarióticos más antiguos que se encuentran sobre la faz de la Tierra. Estas algas se caracterizan por tener un sistema fotosintético complejo, que no solo necesita clorofila a y b para su supervivencia, sino que también requiere pigmentos accesorio que le permitan captar luz de diferentes longitudes de onda. Entre dichos pigmentos accesorio se encuentran las
Capítulo 1. Antecedentes
A pesar de que la mayoría de las algas rojas son multicelulares, existen aproximadamente unos 10 géneros de algas rojas unicelulares, entre los cuales se encuentra d género Porphyridium (Lee, 1989). Dentro de este género se encuentra la especie Porphyrídium cruentum, un alga microscópica unicelular de forma esférica, cuyo color característico es indicativo de que produce B-ficoeritrina en grandes cantidades (Figura 1.2 y Figura 1.3).
mu
Figura 1.2. Estructura interna de la microalga Porphyrídium cruentum. Entre los componentes principales del alga Porphyrídium cruentum resaltan: (c) Cloroplasto, donde se encuentran los tilacoides; (g) Aparato de Golgi; (m) Mitocondria; (mu) Mucílago, capa de carbohidratos; (n) Núcleo; (p) Pirenoide; (phy) Ficobilisomas, estructuras ordenadas de constituidas de ficobiliproteinas y que se encuentran en la membrana tilacoide; (3) Almidón y (v) Vesículas. (Imagen tomada de Lee, 1989)
Figura 1.3. Microalga Porphyridium cruentum. Fotografía tomada de los cultivos de Porphyridium cruentum usando un Microscopio Cari Zeiss Estándar 25, con un lente objetivo de 40X.
Las microalgas han demostrado ser organismos de trabajo apropiados para la producción de ficobiliproteínas. Se ha reportado que Spirulina máxima (una cianobacteria), produce C- ficocianina (ficobiliproteína de alto valor comercial) en grandes cantidades (Cifferi and Tiboni, 1985; Núñez, 1999). Esta proteína representa aproximadamente el 13% del peso de la microalga en base seca.
De igual forma la especie Porphyridium cruentum ha demostrado ser eficiente en la
Capítulo 1. Antecedentes
proteínas representan el 33% del peso de Porphyridium crueníum en base seca. La B-ficoeritrina representa el 5% de la proteína total en esta microalga, mientras que R-ficocianina (otra ficobiliproteína en Porphyridium cruentum) representa solamente el 1% (Bermejo et al, 2002).
Adicionalmente es relativamente sencillo cultivarla. En la Tabla 1.1 se presenta la composición bioquímica de Porphyridium cruentum (Bermejo et al, 2002).
Tabla 1.1. Composición bioquímica de Porphyridium cruentum (Bermejo et al, 2002).
Componentes principales Proteínas
Carbohidratos Lipidos Ceniza Pigmentos:
Ficobiliproteínas Clorofilas Caroteno! des
Contenido (% peso seco) 33.00
35.80 6.70 19.70
2.00 0.65 0.10
El cultivo de Porphyridium cruentum fue hecho en un reactor tubular exterior, con una tasa de dilución de 0.049 h-1, obteniendo una productividad de 1.2 gramos por litro por día (Bermejo et al, 2002).
1.4. Procesos tradicionales de recuperación y purificación de B-ficoeritrina.
A pesar de que la producción de B-ficoeritrina (y de otras ficobiliproteínas) se lleva a cabo mediante el uso de algas rojas (como por ejemplo Porphyridium cruentum) sin mayores problemas, el uso de esta ficobiliproteína está limitado por un problema en particular: los procedimientos de recuperación y purificación reportados hasta el momento son demasiado largos y complejos, dificultando esto la obtendón de grandes cantidades de proteína purificada (Bermejo et al, 2002).
Como regla general para la recuperación y purificación de productos biotecndógicos de interés, un mayor número de etapas se traduce en un menor rendimiento y en mayores gastos de inversión y operación. Bermejo et al (2002) desarrollaron un proceso de recuperación y purificación de B-ficoeritrina producida por Porphyridium cruentum, utilizando para esto una
ficoeritrina (A545 / A280) mayor a 3, con un 45.4 % de recuperación de dicha proteina. En la Figura 1.4 se muestra un diagrama simplificado del proceso de recuperación y purificación desarrollado por Bermejo et al (2002).
Cultivo Porphyridium cruentum
Recuperación de biomasa
Ruptura celular
Centrifugación
Filtración
Precipitación con sulfato de amonio
B-ficoeritrina:
Pureza A545/A280> 3.
45.4% Recuperación.
Intercambio iónico
Centrifugación
Diálisis
Resuspensión
Figura 1.4. Diagrama de proceso de purificación de B-fícoerítrína producida por Porphyridium cruentum desarrollado por Bermejo et al (2002). Al final del proceso se obtiene B-ficoeritrina con una pureza (A545 / A280) mayor a 3, con 45.4% de recuperación de dicha proteina. Es notorio la gran cantidad de etapas con que cuenta el proceso.
Capitulo 1. Antecedentes
varias razones. El uso de técnicas como cromatografía de intercambio iónico a nivel comercial esta limitado debido a que el escalamiento de dicho procesos implica altos costos de inversión y operación (costos de resina, gasto energético implicado, etc.), e inclusive en muchas ocadones no existe infraestructura disponible que cubra las necesidades del productor. El escalamiento de dichas técnicas también representa disminución en los rendimientos de recuperación.
Debido a que la B-ficoeritrina con alto grado de pureza (A545 / A280) tiene un alto valor comercial, resulta atractivo desarrollar un proceso más eficiente que garantice altos rendimientos y genere cómo producto final proteína con una pureza (A545 / A280) superior a 3. La separación en sistemas de dos fases acuosas es una técnica que se ha empleado en la recuperación y purificación de productos de procesos biotecndógicos comerciales a escala industrial.
Capítulo 2. Introducción.
2.1. Sistemas de dos fases acuosas.
2.1.1. Descripción y características de los sistemas de dos fases acuosas.
Los primeros estudios realizados con sistemas de dos fases acuosas se remontan a los años 50, cuando Albertsson (1956) comprobó el potencial de esta técnica para separar y recuperar componentes celulares (organelos), así como pigmentos de algas y cianobacterias. Desde los trabajos de Albertsson hasta la fecha, se han hecho muchos estudios acerca del comportamiento de partición de productos de interés comercial en sistemas de dos fases acuosas, ya que estos han demostrado tener un gran potencial para recuperar y purificar productos como proteínas, pigmentos, componentes celulares, etc. (Hariri ef al, 1989; Huddleston ef al, 1991 a y b; Rito Palomares, 2002; Haraguchi ef a/, 2003; Shinomiya et al, 2003; Kepka et al, 2003, Cunha ef al, 2003; Marcos ef a/, 2002; Reh ef a/, 2002).
Los sistemas de dos fases acuosas se forman al mezclar dos o más sustancias que en ciertas concentraciones se vuelven inmiscibles en agua. Existen sistemas de dos fases acuosas polímero - polímero, los cuales están formados (como su nombre lo indica), por dos fases acuosas pdiméricas (PEG - Dextrano, PEG - Polivinil alcohol, etc.). Sin embargo, el uso de estos sistemas esta de cierta forma limitado por los altos costos que algunos polímeros.
Muchos polímeros forman sistemas de dos fases acuosas cuando son combinados con ciertas sales, dando como resultado un sistema de dos fases acuosas polímero - sal (PEG - Fosfato de potasio, PEG - Sulfato de sodio, etc.) (Huddleston ef al, 1991 a; Albertsson ef al, 1990). Debido a su bajo costo y al corto tiempo de separación, uno de los sistemas de dos fases acuosas más utilizados es el sistema polietilénglicol - solución salina (Hustedt ef al, 1985; Kula efa/, 1982).
Capítulo 2. Introducción
A pesar de que el mecanismo de formación de las fases en un sistema PEG - sal no se conoce del todo, se sabe que este está relacionado con el balance de fuerzas entálpicas y entrópicas involucradas en la hidratación de los solutos. Se cree que la separación de las fases depende del grado en el cual las asociaciones catiónicas del oxigeno en los mono-meros del polietilónglicol son capaces de sustituir las asociaciones catiónicas del agua. Los factores involucrados en este fenómeno son el largo de cada cadena de polímero (peso molecular y estructura), asi como el tamaño y la carga de los aniones asociados (Huddleston ef al, 1991 a).
Los eventos fisico-quimicos involucrados en la partición de proteínas en los sistemas de dos fases acuosas no son totalmente entendidos. La preferencia de una proteina por migrar a una fase en particular depende de varios factores, entre los cuales se encuentran: su peso molecular, su área superficial, carga electroquímica neta, punto isoeléctrico y contenido de residuos hidrofóbicos de aminoácidos. Sin embargo, no solo las características de la proteína a separar influyen en su comportamiento de partición.
Los parámetros del sistema de dos fases acuosas juegan un papel de gran importancia durante la partición de la proteína de interés hacia una fase en particular. Entre estos parámetros se encuentran: tipo, peso molecular y concentración de polímero usado para construir el sistema, naturaleza y concentración de las sales utilizadas, diferencias de concentración de los componentes en cada una de las fases, pH del sistema, adición de moléculas con afinidad bioquímica y temperatura (Albertsson ef al, 1990; Huddleston et al, 1991 a; Sarubbo et al, 2000).
En la presencia de restos celulares, los sistemas de dos fases acuosas tienden a formar una película delgada en la interfase del sistema y/o un precipitado al fondo del mismo. En la Figura 2.1 se utiliza como modelo un sistema probado con extracto crudo de B-ficoeritrina (extracto que se caracteriza por la presencia de restos celulares y polvo de vidrio utilizado durante la ruptura celular de Porphyrídium cruentum) para observar la formación de las dos fases acuosas, una fase superior (rica en polímero), una fase inferior (rica en fosfatos), y adicionalmente una película delgada en la interfase y un precipitado.
Figura 2.1. Fotografía de un sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos probado con extracto crudo de B-ficoerítrina. Sistema de dos fases acuosas PEG 1000 g/gmol - Fosfatos con longitud de línea de corte (LLC) de 28.3% p/p, con relación de volúmenes (VR) cercano a 1, con pH de 7, el cual fue probado con extracto crudo de B-ficoeritrina (sección 3.4). Puede observarse como la presencia de los restos celulares genera una película de color rosa en la interfase del sistema. De igual manera, debido a la presencia del polvo de vidrio y de restos celulares pesados se puede observar la formación de un precipitado al fondo del tubo.
Capítulo 2. Introducción
2.1.2. Parámetros de sistema y otros conceptos básicos utilizados en sistemas de dos fases acuosas.
Curva binodal de los sistemas
La formación de las fases en los sistemas de dos fases acuosas esta descrita por la curva binodal de ese sistema en particular (Figura 2.2), la bual representa la frontera entre la región monofásica y bifásica. En otras palabras, las combinaciones polímero - sal que se encuentren por debajo de la curva formarán una sda fase heterogénea, mientras que las combinaciones de polímero - sal que se encuentren por arriba de la curva binodal formarán un sistema bifásico.
Como ya se mencionó, el mecanismo mediante al cual se forman las fases esta relacionado con el balance de las fuerzas entálpicas y entrópicas involucradas en la hidratación de los solutos presentes (Huddleston et al, 1991 a).
Longitud de línea de corte (LLC)
La composición de un sistema de dos fases acuosas puede ser expresada en fundón de la concentración de los componentes en cada una de las fases del sistema a través de la longitud de la línea de corte (LLC; o bien TLL por su nombre en inglés, Tie Une Length). Tomando como ejemplo los sistemas en la curva binodal mostrada en la Figura 2.2, la línea de corte de los sistemas Xi, X2 y Xa esta representada por la línea AC. Todos los sistemas que se encuentran sobre una misma línea de corte poseen composiciones idénticas en sus fases inferiores y superiores. Sin embargo estos sistemas difieren en su relación de volúmenes (Huddleston eí al, 1991 a y b). La longitud de la línea de cate puede ser calculada usando la ecuación 2.1:
LLC 2 = (¿J>EG)2 + (AF)2 (Ecuación 2.1)
donde: LLC = Longitud de linea de corte (%peso/peso, denotado %p/p)
APEG = Diferencia de las concentraciones de PEG entre las fases (%p/p) AF = Diferencia de las concentraciones de fosfato entre las fases (%p/p)
10 15 20 25 30
% Fosfato (w/w)
Fase Superior (PEG) Fase Inferior (Fosfato)
35 40
Figura 2.2. Curva binodal para los sistemas de dos fases acuosas PEG 1450 g/gmol - Fosfatos. Todas las combinaciones de PEG 1450 g/gmol y Fosfato arriba de la curva ABC forman un sistema de dos fases acuosas, mientras que todas las combinaciones por debajo de dicha curva dan como resultado una sola fase heterogénea. Los sistemas Xi, X2 y Xa están construidos sobre la misma linea de corte (linea AC), y por lo tanto tienen la misma composición en sus fases superiores e inferiores, y dicha composición es definida por los puntos A (para la composición de la fase superior) y C (para la composición de la fase inferior). Los sistemas Xi, X2 y Xa difieren en sus relaciones de volúmenes (Vp). (Figura tomada de Núñez, 1999)
Capítulo 2. Introducción
La LLC influye en los fenómenos de partición dentro de los sistemas de dos fases acuosas (Lin et al, 2003). Se ha reportado en numerosas ocasiones que el incremento en LLC se traduce en un aumento en la partición (Grossman and Gainer, 1988; Huddleston et al, 1991 b;
Hernández, 1997; Rito-Palomares and Hernández, 1998) y explican este fenómeno en términos de variación de volumen libre de acuerdo a la teoría de Grossman y Gainer (1988), la cual explica que a medida que se aumenta la concentración de los componentes del sistema, se presenta una reducción del agua disponible para la solvatadón de los componentes en la fase inferior, mientras que la fase superior permanece constante. Esto resulta en un aumento dramático en la concentración de fosfatos en la fase inferior, mientras que la concentración de polímero en la fase superior permanece prácticamente inalterada. Esto deriva en una mayor disponibilidad de agua (volumen libre) en la fase superior, lo cual promueve el aumento de la partición hacia dicha fase.
Peso molecular del polímero
El peso molecular del polímero utilizado para construir el sistema de dos fases acuosas juega un papel importante en el comportamiento de partición de los compuestos presentes hacia una u otra fase. Una regla general respecto a este asunto dice que mientras más bajo sea el peso molecular del polímero en los sistemas de dos fases acuosas, la partición hacia la fase polimérica (superior) tenderá a aumentar (Albertsson et al, 1990).
Este comportamiento se basa en dos fenómenos que se presentan simultáneamente al incrementar el peso molecular del polímero: a) aumento de la hidrofobicidad en la fase polimérica, y b) aumento en el volumen excluido (disminución en el volumen libre) (Huddleston ef al, 1991 a). El aumento en la hidrofobicidad al usar polímeros de alto peso molecular es debido a la reducción estequiométrica de los grupos hidrofilicos terminales en las moléculas de polímero, lo cual disminuye la afinidad del polímero (y en general de la fase polimérica) por el agua (Huddleston ef al, 1991 a). La mayoría de las proteínas son solubles en agua, de tal forma que, al aumentar la hidrofobicidad de la fase, dicho compuesto tendrá menor afinidad hacia esta y tenderá a particionarse hacia la otra fase o bien, a la interfase.
Las cadenas (moléculas) de polímero Ínter accionan unas con las otras en la fase superior del sistema PEG - sá. El aumento de volumen excluido observado al aumentar el peso molecular
otras debido a su gran longitud, generándose de esta forma una red muy intrincada de moléculas de polímero (Huddieston et al, 1991 a). Mientras mayor es la interacción de las moléculas, mayor es el volumen que estas ocupan, presentándose de esta forma un volumen excluido mayor al que se presenta con cadenas más cortas (peso molecular menor) de polímero. Este volumen excluido representa un obstáculo tanto para el agua como para las demás moléculas que intentan particionarse hacia la fase superior. El hecho de que el agua se vea en cierto grado excluida genera un aumento en la hidrofobicidad de la fase polimérica.
El grado de influencia que tiene el peso molecular del polímero sobre el comportamiento de partición de las proteínas esta determinado hasta cierto punto por los pesos moleculares de dichas proteínas. Las proteínas con altos pesos moleculares se ven más influenciadas por los cambios en peso molecular de polímero que aquellas con reducido tamaño (Albertsson et al, 1990). Esto es debido a que por su tamaño, las moléculas pequeñas no se ven tan afectadas por la reducción de volumen libre. Sin embargo, dichas proteínas aun se ven afectadas por el aumento en la hidrofobicidad en la fase superior.
Relación de volúmenes entre las fases
La relación de volúmenes de un sistema de dos fases acuosas determinado esta definida simplemente como la relación del volumen de su fase superior entre el volumen de su fase inferior (Huddieston et al, 1991 a), como lo indica la ecuación 2.2. El volumen relativo de las fases es dependiente de las concentraciones de cada componente en el sistema. Retomando el ejemplo de los sistemas Xi, X? y Xs, mostrados en la Figura 2.1, aun cuando estos tres sistemas tienen la misma LLC (misma composición en sus fases superiores e inferiores) difieren en su VR.
El sistema Xi tiene un VR mayor que X2 y Xs simplemente porque la composición global del sistema tiene un porcentaje peso más alto de PEG, lo cual genera una fase superior de mayor volumen. Siguiendo el mismo principio, el sistema Xa tiene un VR más pequeño que X2 y Xi debido a que el porcentaje de fosfatos en ese sistema es mayor, lo cual genera una fase inferior de mayor volumen.
Cap/fu/o 2. Introducción
v Vs
VR = — (Ecuación 2.2)
"i
donde: VR = Relación de volúmenes.
Vs = Volumen de la fase superior.
Vi = Volumen de la fase inferior,
Se ha observado que el volumen relativo de las fases es un parámetro que influye de manera directa sobre la partición de proteínas (Rito-Palomares et al, 2001) y especialmente sobre la distribución de la biomasa y de los restos celulares en el sistema de dos fases acuosas (Hustedt ef a/, 1985; Huddleston ef al, 1991 b; Negrete, 1998; Cueto-Gómez, 1999). Sin embargo, es uno de los parámetros de los sistemas de dos fases acuosas que menos se ha estudiado.
Fuerza iónica del sistema de dos fases acuosas (pH)
El pH del sistema de dos fases acuosas tiene influencia sobre la carga electroquímica que adquieren los residuos de algunos aminoácidos en las proteínas que se intentan particionar (Chen, 1992). Se ha comprobado mediante modificaciones químicas especificas que los sistemas de dos fases acuosas poseen la capacidad de separar diferendalmente proteínas homologas que difieren en carga (Franco et al, 1996 a y b).
Algunos autores (Huddleston ef al, 1991 a; Albertsson et al, 1990) han sugerido que debido a la capacidad del polietilénglicol (PEG) de formar asociaciones iónicas mediante sus átomos de oxigeno distribuidos a todo lo largo de sus moléculas, este polímero tiene la capacidad de establecer asociaciones iónicas cuando se encuentra cargado positivamente.
En los sistemas PEG - Fosfatos, la fase superior (rica en polímero) tiene carga positiva, y por lo tanto es de esperarse que mientras más negativa sea la carga electroquímica neta de la proteína de interés, mayor será su partición hada la fase superior, debido al potencial que existe entre las moléculas de polímero (positivas) y la proteína de interés (negativa). Una proteína adopta carga negativa neta cuando se encuentra por encima de su punto isoeléctrico (pl)
funcionales de los residuos de los aminoácidos polares tienden a desprotonarse, adquiriendo carga negativa (o por lo menos neutra), de tal forma que cuando las cargas superficiales negativas rebasan en número a las cargas positivas, se dice que la proteína tiene una carga electroquímica neta negativa. Por esta razón es deseable al tratar de recuperar y purificar proteínas mediante sistemas de dos fases acuosas PEG - sal, trabajar por arriba del punto isoeléctrico de la proteína de interés.
2.2. Ventajas y aplicaciones de los sistemas de dos fases acuosas.
En años recientes el interés sobre la aplicación de los sistemas de dos fases acuosas como método de recuperación y purificación ha aumentado notablemente. Esta técnica ha demostrado ser aplicable en muchos procesos, sobre todo en el área biotecnológica.
Las principales ventajas que ofrecen los sistemas de dos fases acuosas son: a) su alta eficiencia, b) factibilidad de escalamiento, c) facilidad de manejo en cualquier escala de proceso, d) bajos costos de inversión y operación, e) pueden ser llevados a cabo en forma continua, y f) generalmente permiten la recuperación y purificación de compuestos biológicos (especialmente proteínas) en su forma nativa, lo cual es de gran valor, ya que al conservar la estructura se conserva al mismo tiempo la función especifica de las mismas.
Los sistemas de dos fases acuosas pueden ser usados en conjunto con otros procesos de separación sin afectar a las etapas previas o posteriores de recuperación (Rito-Palomares, 2002). Una de las aplicaciones más comunes de los sistemas de dos fases acuosas es la de técnica de recuperación primaria, ya que durante las etapas iniciales de separación lo que se desea es remover el mayor número de contaminantes posibles, sin que esto afecte en gran manera el porcentaje de recuperación alcanzado.
Los sistemas de dos fases acuosas han sido utilizados exitosamente en la recuperación y purificación de enzimas, proteínas virales, pigmentos de naturaleza proteica y no proteica, compuestos aromáticos, etc. A pesar de esto, la aplicación de esta técnica hasta el momento ha
Cap/fu/o 2. Introducción
2.3. Objetivo de la investigación.
El objetivo de esta investigación es la evaluación de la influencia de la variación de la longitud de la linea de corte, el peso molecular del polímero, el pH y la relación de volúmenes sobre el comportamiento de partidón de B-ficoeritrina producida por Porphyrídium cruentum en sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos.
2.4. Hipótesis.
Los parámetros de sistema influyen en el comportamiento de partidón de B-ficoeritrina en sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos y el estudio de la influencia de dichos parámetros de sistema (longitud de línea de corte, peso molecular del polímero, el pH y la relación de volúmenes) permitirá encontrar las condiciones óptimas para la recuperación primaria y purificación de B-ficoeritrina en sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos.
Capítulo 3. Materiales y Métodos.
3.1. Materiales.
3.1.1. Reactivos.
Los sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos fueron preparados con polietilénglicol de peso molecular 1000,1450,3350 y 8000 g/gmd obtenidos de SIGMA Chemical Co. y fosfato de potasio monobásico (KHzPC^) y dibásico (faHPCU) obtenidos de Productos Químicos Monterrey.
Para la construcción de los sistemas de dos fases acuosas no se utilizaron las sustancias en forma sólida, en su lugar soluciones estándar de porcentaje peso definido fueron previamente preparadas, como se describe en la sección 3.6.
La proteína de interés (B-ficoeritrina) es estable en una solución amortiguadora de sulfato de amonio 60% v/v en fosfato de potasio 50 mM (pH 7) y azida de sodio 5 mM (ProZyme, Inc.), el cual se elaboró de la siguiente manera. Para preparar 100 mi de solución amortiguadora se pesaron 0.68 gramos de fosfato de potasio monobásico y 0.032 gramos de azida de sodio, los cuales se disolvieron en 25 mi de agua bidestilada a temperatura ambiente.
El pH de la solución se ajustó a 7 con ácido ortofosfórico (85% v/v) o hidróxido de potasio (1 N) según se requirió. Una vez ajustado el pH, se agregaron 60 mi de solución saturada (a 25 °C) de sulfato de amonio. El pH de la solución resultante es muy próximo a 7. Posteriormente se agregó agua bidestilada hasta alcanzar un volumen de 97 o 98 mi, se midió el pH de la solución, y se ajustó a 7 (en caso de ser necesario) y por último se aforó a 100 mi con agua bidestilada.
El estándar de B-ficoeritrina utilizado para los estudios en sistemas de dos fases acuosas modelo (caracterizados como aquellos con la presencia de la proteina de interés únicamente) se obtuvo de ProZyme Inc. El estándar concentrado recibido fue diluido en solución amortiguadora de sulfato de amonio (60% v/v) en fosfato de potasio 50 mM (pH 7) y azida de sodio 5 mM,
Capítulo 3. Materiales y Métodos
total del estándar fue obtenida mediante el método de Bradford, mientras que la pureza del estándar fue determinada por la relación de absorbancia A545 / A280 (ver secciones 3.2.1 y 3.2.2 respectivamente).
3.1.2. Material Biológico.
Se trabajó con una cepa (no axónica) de Porphyridium cruentum obtenida del CINVESTAV (CDBB-A-001002 CINVESTAV IPN). La cepa fue propagada (a partir del vial con medio liquido recibido) y mantenida en las condiciones sugeridas por el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (ver sección 3.3).
3.2. Técnicas analíticas.
3.2.1 Cuantiflcación de proteína total mediante el método de Bradford.
El método de Bradford (Bradford, 1976) es uno de los más utilizados para determinar la concentración de proteína total debido a su gran sensibilidad y a que está validado internacionalmente. Se basa en la unión del odorante azul brillante de Coomasie G-250 a los residuos básicos (principalmente arginina) y aromáticos de las proteínas, generándose de esta forma un complejo coloreado que tiene su pico máximo de absorbancia a una longitud de onda de 595 nm. Es precisamente esta longitud de onda la que se toma para realizar las lecturas de absorbancia para determinar la concentración de proteína total.
Para la determinación de proteína total se agregaron 1.5 mi del reactivo de Bradford (SIGMA Chemical Co., Bradford reagent, B-6916) a 50 uJ de la solución "problema", agitando la mezcla por inversión en repetidas ocasiones y dejándola reposar un mínimo de 10 minutos (tiempo suficiente para que toda la proteina presente reaccione con el reactivo Bradford y se estabilice el color obtenido) y un máximo de 50 minutos (tiempo tras el cual el complejo proteína - colorante se torna inestable y como resultado de esto empieza a degradarse, causando esto una pérdida en el color), según instrucciones proporcionadas por el proveedor del producto (Sigma Chemical
espectrofotómetro Beckman DU 650 (Beckman Instruments). Las lecturas de absorbancia se tradujeron en concentraciones de proteína total mediante la ecuación de la linea de tendencia de la curva de calibración generada con este fin. La curva de calibración generó preparando soluciones de concentración conocida de proteína total (0.1 -1.2 mg/ml) a partir de una solución 5 mg/ml de Albúmina de Suero Bovino (SIGMA Chemical Co., Bovine Serum Albumin, B-4287).
3.2.2. Determinación de pureza de la proteína B-ficoeritrina mediante la relación A545 / A280.
Todas las proteínas tienen por lo menos dos regiones de absorbancia máxima en la región del espectro ultravioleta, una a 280 nm, debido a los residuos de los aminoácidos aromáticos (tirosina y triptófano) y otra a 180 nm debido a la absorbancia generada por los enlaces peptidicos de la proteína. Es debido a esto que es común expresar pureza de proteínas en forma de relaciones de absorbancia. En el caso especifico de B-ficoeritrina, se sabe que su absorbancia máxima se encuentra a 545 nm (Bermejo et al, 2002; ProZyme Inc., 2003; Bryant, 1982), por lo tanto, al obtener la relación de absorbancia A545 / A280, se puede estimar el grado de pureza de la proteína de interés. En el caso de B-ficoeritrina, una relación A545 / A280 menor a 1 significa una gran cantidad de impurezas (proteínas contaminantes presentes), mientras que una relación mayor a 5 es considerada un grado muy alto de pureza (ProZyme Inc.). Las lecturas de absorbancia a 280 nm (ultravioleta) y 545 nm (visible) fueron realizadas en un espectrofotómetro Beckman OU 650 (Beckman Instruments).
3.3. Fermentación de Porphyrídium cruentum.
3.3.1. Medio de cultivo
El medio de cultivo utilizado para la fermentación fue el Medio Algal (MA), el cual fue sugerido por el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR), preparado en agua de mar
Capítulo 3. Materiales y Métodos
3.3.1.1. Composición del agua de mar artificial.
Se siguió la especificación estándar para agua de mar artificial de la ASTM (American Sodety for Testing and Materials, ASTM Designation D1141-75,1975). El cloruro de estroncio (SrCb), el fluoruro de sodio (NaF) y los demás elementos traza, fueron omitidos. En la Tabla 3.1 se muestra la composición detallada (compuestos utilizados y cantidades de los mismos para preparar un litro) del agua de mar artificial utilizada para cultivar Porphyridium cruentum.
Tabla 3.1. Composición del agua de mar artificial utilizada para preparar el Medio Algal para Porphyridium cruentum.
Nombre del compuesto Cloruro de sodio Cloruro de magnesio
Sulfato de sodio Cloruro de calcio Cloruro de potasio Bicarbonato de sodio
Bromuro de potasio Ácido bórico
Fórmula NaCI MgCI2
Na2S04 CaCI2
KCI NaHCOa
KBr H3B03
Cantidad (por litro) 24.53 g
5.20 g 4.09 g 1.16g 0.70 g 0.20 g 0.10 g 0.03 g
Se pesó la cantidad de sales requeridas en una balanza anal ¡tica para preparar el volumen de agua de mar artificial deseado y una vez hecho esto, se agregaron al volumen de agua bidestilada necesario. Posteriormente se agitó a temperatura ambiente hasta obtener una solución homogénea.
3.3.1.2. Composición del medio de cultivo.
En la Tabla 3.2 se muestra la composición detallada (compuestos utilizados y cantidades de los mismos para preparar un litro) del medio de cultivo utilizado, conocido como Medio Algal (MA), el cual se preparó en agua de mar artificia (sección 3.3.1.1).
Poiphyridium cruentum (preparado en agua de mar artificial) (Fábregas et a/, 1984).
Nombre del compuesto Nitrato de sodio Fosfato monobásico de sodio
Cloruro de zinc Cloruro manganeso
Mdibdato de sodio Cloruro de cobalto Sulfato de cobre EDTA sal disódica
Citrato de fierro Ti amina
Biotina
Fórmula NaNOs NaH2PÜ4
ZnCI2
MnCI2
Na2Mo04 CoCI2
CuS04
Na2CioHi4N2Oa Fe3(C6Hs07)2
Ci2Hi7N4OS C10H16N203S
Cantidad (por litro) 170.00 mg
13.80mg 0.14 mg 0.20 mg 0.24 mg 0.01 mg 0.03 mg 9.90 mg 4.50 mg 35 u£ir
5u.g
Se pesaron las cantidades requeridas de sales utilizando una balanza analítica y se agregaron al agua de mar artificial (sección 3.3.1.1). Posteriormente se agitó a temperatura ambiente hasta lograr una solución homogénea. El pH del medio de cultivo (sin las vitaminas) fue ajustado a 7.6 con ácido clorhídrico (1 N) o hidróxido de sodio (1 N) según se requirió, para después ser esterilizado en una autoclave. Posteriormente en condiciones de esterilidad (campana de flujo laminar de The Baker Company, Inc. SterilchemGARD 4-TX) se agregaron las soluciones estándar de vitaminas, las cuales fueron esterilizadas previamente por filtración (filtros Millipore 0.22 UJTI).
3.3.1.3. Condiciones de cultivo
Porphyrídium cruentum fue cultivado con el medio antes descrito en una modalidad tipo lote en matraces Erlenmeyer con volumen de trabajo de 1 L, a temperatura ambiente (22 °C - 25 °C).
La aireación del cultivo fue proporcionada por una bomba para aire ELITE799, con un flujo volumétrico de aire de aproximadamente 9.63 cm3/seg. La aireación proporcionada a los matraces generaba agitación en el cultivo. El inoculo al matraz fue de aproximadamente 100 mi
Capítulo 3. Materiales y Métodos
cuales las células fueron recuperadas mediante centrifugación a 3500 rpm por 5 minutos (Centrífuga IEC HN-SII).
3.4. Ruptura celular.
Se realizó la ruptura celular utilizando mortero, el cual se mantuvo a bajas temperaturas durante todo el proceso mediante el uso de hielo. El mortero previamente enfriado fue adicionado con biomasa húmeda, y por cada gramo de biomasa utilizada, se agregaron 4.3 mi de agua bidestilada (lo cual significa un porcentaje de 23.25 % p/v, no considerando el vidrio molido) y 0.98 g de polvo de vidrio. El tiempo de maceración se estimó considerando la cantidad de biomasa utilizada, siendo este de 15 minutos por gramo. Al finalizar el tiempo estimado de maceración, se observó que la suspensión resultante adquirió una apariencia lechosa. Mediante observación al microscopio se pudo comprobar la ruptura celular, al ver como las algas habían perdido su conformación y color característicos (esféricas y rojas), para convertirse en un agregado de color gris-verdoso. A la suspensión resultante de la ruptura celular se le dio el nombre de extracto crudo (Figura 3.1 A), incluyendo el polvo de vidrio utilizado durante la ruptura.
3.5. Obtención y preparación del extracto crudo "concentrado" de B- fi coeritrina.
Durante la ruptura célula se agregó agua a la biomasa, lo cual provocó una dilución sustancial de proteína en el extracto crudo. Debido a que se deseaba realizar mediciones de concentración de proteína total en la fase superior e inferior mediante el método de Bradford, y a pesar de que esta técnica es muy sensible (0.1 mg/ml, SIGMA Chemical Co.), fue necesario incrementar la concentración de proteína, para estar dentro del rango de detección del método.
Esto se realizó mediante precipitación con sulfato de amonio (Stryer, 1992). A pesar de que esta técnica se utiliza generalmente para purificar proteínas (precipitación escalonada), en este caso solo se utilizó la precipitación con sulfato de amonio para concentrar proteínas (un solo paso de precipitación).
La metodología experimental que se siguió fue la siguiente. El suspendido obtenido de la maceradón (extracto crudo) fue centrifugado a 3500 rpm por 5 minutos (Centrifuga IEC HN-SII).
El sobrenadante fue recuperado en tubos Eppendorf, y centrifugado a 14000 rpm por 2 minutos (Centrifuga Eppendorf 5415C). El volumen total del sobrenadante obtenido fue registrado. Por cada mililitro de sobrenadante se agregaron las siguientes cantidades de sales: sulfato de amonio 0.47 gramos (que representa aproximadamente el 80% v/v a temperatura ambiente, porcentaje de sulfato de amonio al cual prácticamente todas las proteínas precipitan), fosfato de potasio monobásico 0.009 gramos y azida de sodio 0.0004 gramos. Una vez agregadas las sales se agitó en vortex (Vortex Genie 2, VWR Scientific) hasta que las sales se disolvieron totalmente.
Se centrifugó en tubos Eppendorf a 14000 rpm por 10 minutos (Centrifuga Eppendorf 5415C).
Después de la centrifugación se pudo observar la formación de un precipitado de color rosa intenso, se retiró el sobrenadante, y el precipitado se resuspendió en un reducido volumen de solución amortiguadora de sulfato de amonio (60% v/v) en fosfato de potasio 50 mM (pH 7) y azida de sodio 5 mM (ProZyme Inc.), con la finalidad de tener una alta concentración de la proteina. Al concentrado resultante se le llamó extracto crudo "concentrado* (Figura 3.1 B). Se guardó el extracto cubriéndolo con papel aluminio (para protegerlo de la luz) a baja temperatura (4 °C) evitando llegar al congelamiento, ya que el exponer a la proteina a temperaturas por debajo del congelamiento afecta las propiedades de la misma (ProZyme, Inc., 2003).
3.6. Construcción de los sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos.
Los sistemas de dos fases acuosas se construyeron utilizando soluciones estándar de polietilénglicd (PEG) y fosfato de potasio monobásico y dibásico (en una relación 7:18 respectivamente). Para preparar las soluciones estándar de polietilénglicol 50% p/p se pesaron 200 gramos del PEG del peso molecular requerido (1000, 1450, 3350 u 8000 g/gmd) y se agregaron 200 gramos de agua bidestilada, la mezcla fue mantenida en constante movimiento utilizando un agitador magnético hasta lograr una solución homogénea transparente. En el caso del PEG 1000 y PEG 1450 esto se logró después de 4 o 5 horas de agitación a temperatura ambiente, mientras que para el PEG 3350 y PEG 8000 fue necesario dejar agitando por lo
Capítulo 3. Materiales y Métodos
Figura 3.1. Fotografía del extracto crudo (A) y extracto crudo "concentrado" (B). El extracto crudo es obtenido directamente de la ruptura celular de Porphyridium cruentum; su apariencia es lechosa debido a la presencia de restos celulares y polvo de vidrio usado durante la ruptura. El extracto crudo "concentrado" es obtenido mediante la centrifugación y la precipitación con sulfato de amonio (80% v/v) del extracto crudo; tiene un intenso color rosa intenso, resultado de la alta concentración de la proteina de interés (B-ficceritrina).
Para elaborar la solución estándar de fosfatos 40% p/p se utilizó fosfato de potasio monobásico, asi como dibásico, en una proporción 7:18 respectivamente. De esta forma para preparar 400 gramos de solución fue necesario pesar 240 gramos de agua bidestilada, y posteriormente se le agregaron 115.2 gramos de fosfato de potasio dibásico, después de lo cual fue necesario dejar agitando hasta lograr la disolución total de la sal. Una vez logrado esto se añadieron 44.8 gramos de fosfato de potasio monobásico, y se utilizó agitación hasta lograr la disolución total de la sal. Como paso final se ajustó el pH de la solución, con ácido ortofosfórico (85% v/v) o hidróxido de potasio (1 N) según fue necesario. B pH del sistema de dos fases acuosas esta determinado por el pH de la solución estándar de fosfatos utilizada, de tal forma que si se desea construir un sistema de dos fases acuosas PEG - Fosfatos con pH 7, se requiere una solución estándar de fosfatos con pH 7, y de igual forma para otros valores de pH.
Los sistemas fueron construidos pesando las soluciones estándar previamente elaboradas en tubos Eppendorf 1.8 mi para los sistemas de 1 gramo o bien en tubos cónicos de 15 mi para los sistemas de 10 gramos. Posteriormente se agregó el agua bidestilada y por último el estándar de B-ficoeritrina (en el caso de sistemas modelo) o el extracto crudo "concentrado" (en el caso de sistemas complejos). Para la construcción de los sistemas blanco (llamados asi debido a que sus fases superiores e inferiores desempeñar la función de blancos espectrofotométricos durante las lecturas de absorbancia) se sustituyó el estándar o bien el extracto crudo 'concentrado* de B- ficoeritrina por solución amortiguadora de sulfato de amonio 60% v/v en fosfato de potasio 50 mM (pH 7) y azida de sodio 5 mM (ProZyme Inc.).
La composición de los sistemas PEG - Fosfatos que se construyeron para la determinación de la influencia de la LLC, peso molecular de PEG y pH sobre el comportamiento de partición de B-ficoeritrina se muestra en la Tabla 3.3 (Negrete, 1998).
Los valores de longitud de linea de corte (LLC) son calculados directamente de las curvas binodales, mediante el uso de la ecuación 2.1. La composición de los sistemas construidos para la determinación de la influencia del VR sobre el comportamiento de partición de B-ficoeritrina se muestra en la Tabla 3.4 (Nuñez, 1999; Zaslavsky, 1995).
Capítulo 3. Materiales y Métodos
Tabla 3.3. Composición de los sistemas PEG - Fosfatos utilizados en la determinación de la influencia de la longitud de línea de corte (LLC), el peso molecular del polímero utilizado (PEG) y el pH sobre el comportamiento de partición de B-ficoeritrina en los sistemas de dos fases acuosas.
Sistema 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
PEG LLC (g/gmol) (%p/p)
1000 28.3 36.1 38.0 49.4 1450 34.3
47.0 53.2 55.0 3350 33.6
39.6 45.0 48.1 8000 27.1
40.2 45.0 49.4
PEG (%p/p)
15.6 17.6 19.8 22.2 17.6 22.2 24.9 26.1 16.9 18.7 21.0 22.1 16.1 19.0 20.0 22.9
Fosfatos (%P/P)
12.6 13.6 14.8 16.0 10.9 12.1 12.6 13.0 10.1 11.2 12.9 14.0
8.1 9.1 9.5 10.3
Agua Estándar o Extracto B- (%p/p) ficoeritrina (%p/p)
61.8 58.8 55.4 51.8 61.5 55.7 52.5 50.9 63.0 60.1 56.1 53.9 65.8 61.9 60.5 56.8
10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
Los sistemas varían en función de la longitud de linea de corte (LLC), aumentando esta al aumentar el porcentaje peso de cada uno de los componentes en las fases del sistema. Todos los sistemas mostrados en la tabla tienen un VR (relación del volumen de la fase superior entre el volumen de la fase inferior) cercano a 1.
Tabla 3.4. Composición de los sistemas PEG - Fosfatos utilizados en la determinación de la influencia de la relación de volúmenes (Vp) sobre el comportamiento de partición de B- ficoerítrína en los sistemas de dos fases acuosas.
Sistema 1 II III IV V VI Vil VIII IX X
PEG(g/gmol) PEG
(%p/p) 1000 29.5
24.0 18.0 12.5 7.5 1450 29.0
23.5 17.7 12.0 7.0
Fosfatos (%p/p)
9.0 12.0 15.5 18.5 21.7 8.0 11.0 14.0 17.0 20.0
Agua Extracto crudo "concentrado"
(%p/p) B-ficoeritrina (%p/p) 51.5
54.0 56.5 59.0 60.8 53.0 55.5 58.3 61.0 63.0
10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
Los sistemas varían en función de la relación de volúmenes (VR), aumentando esta al aumentar el porcentaje peso de PEG respecto al porcentaje peso de fosfatos. Todos los sistemas mostrados en la tabla tienen una LLC (longitud de línea de corte) cercano a 40 %p/p y pH 7.
Capítulo 3. Materiales y Métodos
Una vez construidos, los sistemas de 1 gramo se agitaron en vortex (Vortex Genie 2 modelo G-560) por 30 segundos a máxima velocidad para de esta forma lograr mezclar los compuestos.
Posteriormente se centrifugaron a 1500 rpm por 2 minutos en una microcentrífuga Eppendorf, esto con la finalidad de lograr una rápida separación de las fases (Rito-Palomares et al, 2001).
Una vez retirados de la microcentrífuga se procedió a obtener el VR (relación de volumen entre la fase superior y la inferior) del sistema, calculando para esto el volumen de la fase superior e infería del mismo. Esto fue hecho con la finalidad de lograr caracterizar bajo que parámetros se llevaba a cabo la partición, y adidonalmente, el volumen de la fase superior e inferior es necesario para llevar a cabo un balance de materia (proteína) en el sistema.
En el caso de los sistemas de 10 gramos, se agitaron en rotor (Scientific Industries, Inc. Multi- purpose rotator modelo 151) por 10 minutos a velocidad media, y posteriormente se centrifugaron a 3500 rpm por 10 minutos con la fináidad de lograr una rápida separación de las fases (Rito-Palomares ef al, 2001). Al igual que en los sistemas de 1 gramo, una vez terminada la centrifugación, se procedió a estimar el VR del sistema, mediante el cálculo del volumen de la fase superior e inferior.
Posteriormente se retiró la fase superior del sistema teniendo cuidado de no tomar fase inferior para evitar contaminación. Muestras fueron tomadas de ambas fases (superior, rica en polímero e inferior, rica en fosfatos) para realizar mediciones de absorbancia a 280 nm y 545 nm, y de igual forma se realizó cuantificacion de proteína total mediante el método Bradford (ver secciones 3.2.2 y 3.2.1 respectivamente). Los resultados mostrados en el siguiente capítulo, tanto para pureza como para porcentaje de recuperación representan el promedio de 2 repeticiones hechas para cada sistema.
Capítulo 4. Resultados y Discusión.
Existe una serie de parámetros que gobiernan los fenómenos de partición de los compuestos dentro de los sistemas de fases acuosas. Debido a que cada compuesto se ve afectado de forma diferente por estos parámetros en comparación con otros que se encuentren presentes en suspensiones biológicas y/o medios de fermentación, es necesario el estudio de la influencia de dichos parámetros en el sistema experimental propuesto: la recuperación y purificación de la proteína B-ficoerítrina producida por Porphyridium cruentum.
Si bien el número de parámetros que influyen en los fenómenos de partición dentro de los sistemas de dos fases acuosas es elevado, en estudios previos del tema se ha encontrado que cuatro de estos parámetros tienen gran impacto en la partición de los compuestos involucrados (Rito-Palomares, 2002; Rito-Palomares et al, 2001; Huddleston et ai, 1991 a y b). Dichos parámetros son la longitud de línea de corte (LLC), el peso molecular del polímero, la relación de volúmenes de las fases del sistema (VR) y el pH (descritos brevemente en el capitulo de introducción).
Las pruebas realizadas en sistemas de dos fases acuosas con el estándar de B-ficoeritrina demostraron la factibilidad de recuperar esta proteína mediante dicha técnica. En la Figura 4.1 se muestra la partición del estándar de B-ficoeritrina en sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos. Como se puede observar en la Figura 4.1, la B-ficoeritrina presenta una evidente afinidad por la fase superior del sistema (rica en PEG), que se torna de color rosa, mientras que la fase inferior del sistema (rica en fosfatos de potasio) se mantiene incolora, lo cual puede indicar, al menos por observación visual, que dicha fase esta libre de B-ficoeritrina.
Este comportamiento de partición es el esperado, ya que al pH al se construyeron los sistemas (pH 7) la proteína de interés tiene una carga neta negativa (ya que su punto isoeléctrico es 4.2), mientras que el polietilénglicol en la fase superior del sistema tiene carga positiva, lo cual genera interacciones electroquímicas entre la B-ficoeritrina y el polímero (Albertsson eí al, 1990;
Huddleston et al, 1991 a). Esto se traduce en una marcada afinidad de la proteína de interés por
Capítulo 4. Resultados y Discusión
Figura 4.1. Fotografía de la partición del estándar de B-fícoeritrina en sistema PEG - Fosfatos. El sistema de peso total 1 gramo se construyó a pH 7, con una relación de volúmenes (VR) cercana a 1. Se observó una marcada afinidad de la proteína de interés por la fase superior (rica en PEG).
Efecto del incremento en la longitud de la línea de corte (LLC) y del peso molecular de polímero sobre el comportamiento de partición de B-ficoeritrina en sistemas de dos fases acuosas PEG - Fosfatos.
Una vez que se demostró la factibilidad de recuperar B-ficoeritrina mediante sistemas de dos fases acuosas usando un estándar de la proteína, se procedió a hacer estudios utilizando 16 sistemas (Tabla 3.3), usando extracto crudo "concentrado" de la proteína (sección 3.5).
De nuevo se observó una afinidad de B-ficoeritrina por la fase superior del sistema, con la única diferencia de que en esta ocasión se presentó un delgada película opaca y de color rosa en la interfase del sistema, presumiblemente debida a la presencia de restos celulares de baja densidad (los cuales no fueron removidos durante el proceso de preparación del extracto) que al ser centrifugados en presencia de PEG y solución concentrada de fosfatos tienden a acumularse en la interfase del sistema, arrastrando de esta forma parte de la proteina de interés (Figura 4.2).
En la Tabla 4.1 se muestran los resultados promedio de pureza (relación de absorbandas, A545 / A280) de B-ficoeritrina obtenidos en los 16 sistemas probados (Tabla 3.3), utilizando estándar de la proteína (sistemas modelo), y extracto crudo "concentrado" (sistemas complejos).
Las purezas de B-ficoeritrina obtenidas en los sistemas modelo son mucho más elevadas que en los sistemas complejo, lo cual es un comportamiento esperado, ya que el extracto crudo
"concentrado" tiene una mayor cantidad de contaminantes que el estándar.
Se puede observar una tendencia clara a obtener mayores purezas al utilizar polímero de pesos moleculares bajos (1000 y 1450 g/gmol) tanto en los sistemas modelo como en los sistemas complejos. Se ha reportado que el peso molecular del polímero utilizado para construir el sistema tiene gran influencia sobre el comportamiento de partición de los compuestos en el sistema (Albertsson et ai, 1990). Esto es particularmente evidente cuando se intenta recuperar compuestos de muy alto peso molecular, como por ejemplo, B-ficoeritrina (240 kDa). Las moléculas de polímero interaccionan unas con las otras de tal manera que generan un arreglo tridimensional, cuyos volúmenes libres varían dependiendo del grado de entrecruzamiento que exista, el cual depende a su vez de la longitud de la molécula de polímero (Huddleston et a/,
Capítulo 4. Resultados y Discusión
Figura 4.2. Fotografía de la partición del extracto crudo "concentrado" de B-fícoeritrína en sistemas PEG - Fosfatos. El sistema de peso total de 1 gramo se construyó a pH 7, con una relación de volúmenes (VR) cercana a 1. Se observó una marcada afinidad de la proteína de interés por la fase superior (rica en PEG).