Rev. Med. Hosp. Na!. Nll"\os 12(2): 73·78,1977
EL ENSAYO INMUNOSORBENTE ENZIMA-CONJUGADA (ELISA) EN EL DIAGNOSTICO DE ROTAVIRUS Dr. Salvador Amato* , Dr. Robert H. Yolken** Dr. Alberto Simhon*, y Dr. Leonardo Mata* INTRODUCCION
La creciente importancia que los rotaviru'& tienen en: las llamadas diarreasines~ pecíficas (3,6) ha llevado al desarrollo de diversas técnicas de laboratorio para es~ tudiar el papel de esos vírus en la etiología de la diarrea. El método clásico para el diagn6stico de rotavirus era la microscopía electrónica (7). Luego se implementaron desde la fijación del complemento hasta el radioinmunoensayo (9,2,4,14,11,12,
17,8), (Cuadro 1), Aexcepción del radioinmunoensayo, todas las técnicas mues~ tran una menor sensibilidad que la microscopíael~ctrónicaen la detección de rota· virus en muestras de heces. Elradioinmunoensayo ofrece dificultades de otra índole tales como'a necesidad de un contador de centelleot el empleo de radioisótoposy la limitada duración del reactivo marcado.
CUADRO 1
TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE ROTAVIRUS
Técnica
1) Microscopía electrónica 2) Fijación de complemento
3) Inmunofluorescencia en cultivo de tejidos 4) Inmunofluorescencia en mucosa duodenal 5) Inmunoelectroosmoforesis
6) Contrainmunoelectroosmoforesis 7) Precipitación del virus.fluorescente 8) Inmunofluorescencia en heces 9) Radioinmunoensayo 10) ELlSA Referencia Flewettet al., 1974(7) Kapikianet al., 1975 (9) Banatvalaet al., 1975 (2) Davidsonetal., 1975 (4) Tufvesson y Johnsson, 1976 (14) Middleton et al., 1976 (11) Petersonel at.. 1976 (12) Yolkenet al., 1977 (17) Kalicaet al., 1977 (8) Yolkenet al., 1977 (18)
* Instituto de Investigaciones en Salud (INISAl, Universidad de Costa Rica, Costa Rica y Ministerio de Salud, Costa Rica.
** Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Marvland, E.E.U.U.
14 REY ISTA MEDiCA DEL HOSPITAL NACIONAL DE NIKlOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA El ensayo inmunosorbente enzima-eonjugada (5) ha sido recientemente adapta· do por Yolken et al. (16) al estudio de los rotavlrus. El propósito de este informe es describir el fundamento y la técnica del ELISA y su importencia en el diagnósti· ca de rotavirus.
Fundamanto del ELISA
Las proteínas, en condiciones apropiadas de pH, se adhieren a ia superficie de polivinilo de bandejas Microtiter. Sobre la proteína adsorbida {en este caso un anticuerpo) se lleva a cabo una reacción antígeno-anticuerpoy a este complejo se agrega un conjugado de inmunoglobulina-fosfatasa alcalina. Luego se agrega un sus-trato adecuado y la hidrólisis de éste por la fosfatasa alcalina produce un color ama-rillo fácilmente apreciable.
El conjugado inmunoglobulina·fosfatasa alcalina tiene suma importancia. La reacción de con.densación se lleva a cabo sobre los grupos epsilon-amino de la Ii.ina y los grupos alfa-amino terminales de las proteínas reaetantes, a través de la forma-ción de una base de Schiff; al glutaraldehido actúa como agente condensante (1).
Dado que el conjugado debe poseer una alta actividad enzimática y una alta afini-dad del anticuerpo por su antígeno, el cociente molar debe favorecer a la enzima en proporción de 3: 1Ó4: 1.
Procedimiento
La secuencia de pasos en la técnica aparece esquematizada en la Figura 1. Los materiales y reactivos ·requeridos se encuentran resumidos en el Apéndice. Para la realización del ensayo se emplean bandejas Microtitier (Cooke) con pocillos en "U", de polivinilo flexible y descartables. En cada bandeja se pueden estudiar 33 muestras por duplicado, un testigo positivo, un testigo negativo, y un testigo .ali· no. La técnica empleada consiste en un "doble sandwich".
Primera reacción antígeno-anticuerpo. En cada uno de los pocillos de las bandejas se colocan 100 ul de suero de cabra anti·rotavirus dilu ido 1;100.000 en solución amortiguadora de carbonato a pH 9,6 (Figura 1, paso 1).La incubación de las ban· dejas de 40C durante toda la noche produce la adsorción del anticuerpo a la super-ficie de polivinilo. Después de este paso y de cada uno de los que siguen se lavan las bandejas tres veces con solución amortiguadora de fosfatos a pH 7.4, adicionada de Tween 20 al 0.050 /0 (PBS-Tweenl. Seguidamente se agregan a cada pocillo 50~I de PBS-Tween adicionado de suero normal de cabray suero fetal bovino, ambos al l%. Luego se añaden por duplicado 50~jde las suspensiones de heces al 200/0 en caldo infusión cerebro y corazón adicionado de albúmina sérica bovina al 0,50 /0 (Figura 1, paso 2). Otra incubación a 40C durante toda la noche completa la prime· ra reacción antígeno·anticuerpo.
Segunda reacci6n antígeno-anticuerpo. Se agregan 100}J1 de suero de cobayo anti-rotavirus diluído 1:800 en PBS·Tween adicionado de suero normal de cabra al 0,50 /0 y suero fetal bovino al 10/0 (Figura 1, paso 3). Las bandejas se incuban a 37°C durante una hora completándose la segunda reacción andgeno-anticuerpo. Así se obtiene el "primer sandwich". esto es, el rotavirus entre dos capas de anti· cuerpos. Si la muestra a analizar es rotavirus-negativa no se produce el sandwich y los pasos siguientes no se completan.
AMATO, S.et. al.: ELl5A EN EL DIAGNOSTICO DE ROTAVIRU$ 75
Tercera reaccián antígeno-anticuerpo. Se adicionan 100 JlI de suero de cabra anti-cobayo conjugado a la fosfatasa alcalina. El conjugado se diluye 1:400 en PBS-Tween adicionado de suero normal de cabra al 0,5% y suero fetal bovino al
,%.
Una nueva incubación de una hora a 370C completa la tercera reacciónantígeno-anticuerpo y queda constituído así el "doble sandwich" (Figura 1, paso
4), La formación del doble sandwich es una variante introducida por Yolken et al. (18) para amplificar el color resultante.
El último paso consiste en añadir 100 .&JI de sustrato p-nitrofenil fosfato en solución amortiguadora de dietanolamina a pH 9,8 (Figura 1, paso 5), Su hidró-lisis por la fosfatasa alcalina al cabo de una incubación de 30 mino a 370C genera un
1
2
suero cobro antirrotavirusl' 100000
15
horas4°C
muestra con rotav; rus15
horas4°C
45
conjugada1'400
I hora37°C
sustratopH 9.8
30min.37°C
3
6
suero•
•
desarrollo cobayo•
•
de antirrotavirus•
•
•
•
color1,800
•
•
J hora•
37°C
Figura 176 REVISTA MEDICA DEL HOSPITAL NACIONAL DE NIK.lOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA color amarillo fácilmente detectable aloJo desnudo -(Figura 1, paso
6t
Si no apare-ce color amarillo la suapare-cesión de pasos descritos no ha tenido lugar y se concluye que la muestra 'es rotavirus-negativa. Una muestra se define como positiva si al final del ensayo desarrolla un color de intensidad igualo mayor que el testigo positivo.A las muestras que aparecen dudosa~(aquellas que desarrollan un color inter· medio entre los testigos positivo y negativo) se les practica una prueba de bloqueo del antígeno, cuyo fundamento es el siguiente. Una muestra rotavirus-positiva es neutralizada por IC$ anticuerpos eSl'er.íficos del suero convaleciente de ternero in· fectado experi¡·nentalmente con rotavirus humanos. Así, los rotavírus de la muestra de heces han sido bloqueados y no hay desarrollo de color. Paralelamen-te, si la misma muestra no es bloqueada por suero fetal bovino, el cual carece de anticuerpos anti-rotavirus, el antígeno se une al primer anticuerpo, yal completar-se el ensayo, la muestra desarrolla color. Concompletar-secuentemente, una muestra dudosa se considera positiva si desarrolla color con el suero fetal bovino y a la vet es blo-queada po: el suero convaleciente.
Comentario
El ELlSA ha abierto grandes posibilidades en el campo de la virología. En el caso particular de las diarreas debidas a rotavirus se cuenta ahora con un ElISA sencillo, práctico y sensible. Su realización no requiere de aparatos costosos ni de tecnología complicada. Las muestras a analizar no necesitan de ninguna manipula· ción e!'p'.!r:ial. Su costo es sumamente bajo ya que cada muestra cuesta aproximada-mente dos colones con sesenta céntimos (US$O.331. El ELlSA presenta además la posibilidad de estudiar un gran número de muestras con gran econom ía de tiempo. En una !emana se pueden procesar mil muestras utilizando los servicios de un asis-tente de laboratorio y la supervisión de un profesional univ6:rsitario. Sin embargo: la mayor ventaja de la técnica reside en su sensibilidad, la cual es similar a la del radioinmunoensayo.
En el INISA se ha realizado un estudio de pacientes diarréicos del Hospital Nacional de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera" (10), admitidos en el periodo com· prendido entre enero de 1976 y marzo de 1978. Como derivado de ese estudio se ha hecho la comparación entre la microscopía electrónica y el ELlSA en el diagnós-tico de los rotavirus. El ELlSA permitió descubrir rotavirus en las heces de 5,70/0
niños que previamente habían resultado negativos por microscopía electrónica, siendo la diferencia estadísticamente significativa. La mayor eficiencia del ELISA en una comparación ciega con la microscopía electrónica, fue demostrada a lo lar-go de un año y medio de observación prospectiva (13).
AMATO. S.et.al,: EL.ISA EN El. DIAGNOSTICO DE ROTAVIRUS 71 Apéndice. Conjugado inmunoglobulina-fosfatasa alcalina, sueros y testigos.
a. Conjugado inmunoglobulina·fosfatasa alcalina. Su preparación se basóesencial~ mente en el método de Voller atal. (15).
b. Suero de cabra antí·rotavirus y suero de cobayo anti-rotavirus: preparado por R.H. Yolkan, NIA/O, NIH, Bethesda, Maryland, E.E.U.U.
c. Testigo positivo: "Pool" de 15 extractos fecales positivos por rotavirus por mi-croscopía electrónica y ELISA. Se determinó una dilución de trabajoaprapia~ da diluyendo al 20 /0en caldo infusión cerebro y corazón adicionado de albú-mina bovina al 0,50 /0.
ch. Testigo negativo: "pool" de 15 extractos fecales negativos por rotavirus por mi· eroscopia electrónica y ELISA. Se diluyó de igual forma que el testigo positIvo. d. Otro, reactivo" según Voller et.al, (15).
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