Estudio de la producción de biomasa en un cultivo de Bacilus thuringiensis subesp kurstaki por medio de una metodología de alimentación FED-BATCH continua

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(1)ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA EN UN CULTIVO DE Bacillus thuringiensis subesp kurstaki POR MEDIO DE UNA METODOLOGÍA DE ALIMENTACIÓN FED-BATCH CONTINUA. MERY ANGÉLICA SOTO DURÁN. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTÁ D.C. 2004.

(2) IQ-2003-2-24. ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA EN UN CULTIVO DE Bacillus thuringiensis subesp kurstaki POR MEDIO DE UNA METODOLOGÍA DE ALIMENTACIÓN FED-BATCH CONTINUA. MERY ANGÉLICA SOTO DURÁN. Proyecto de Grado para optar al título de Ingeniera Química.. Director CARLOS ANDRÉS GARNICA VALENZUELA Ingeniero Químico. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTÁ D.C. 2004. 2.

(3) IQ-2003-2-24. A mis Padres, Por su apoyo durante estos 5 años. 3.

(4) IQ-2003-2-24. AGRADECIMIENTOS. A José Maria Robles, por su gran colaboración en el CITEC. A Luz Myriam Echeverri, profesora del Departamento de Matemáticas. A Carlos Andrés Garnica, profesor del Departamento de Ingeniería Química. A Andrés Fernando González, profesor del Departamento de Ingeniería Química. A mis padres y a mis hermanas por apoyarme y colaborarme siempre.. A Magnolia, Angela, Giovanna, Diana, Camilo y todos mis demás amigos de la universidad por estar a mi lado siempre.. 4.

(5) IQ-2003-2-24. TABLA DE CONTENIDO. INTRODUCCIÓN OBJETIVOS 1. ANTECEDENTES 2. CINÉTICA DE CRECIMIENTO 2.1. CURVA DE CRECIMIENTO 2.2. ECUACIONES DE CRECIMIENTO 3. MODELO DE SIMULACIÓN 3.1. MODELO MATEMÁTICO 3.2. SIMULACIÓN 4. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 4.1. FERMENTACIONES BATCH 4.2. FERMENTACIONES FED-BATCH 5. PARÁMETROS DE EVALUACIÓN 6. RESULTADOS 6.1. FERMENTACIÓN BATCH 6.2. SIMULACIÓN 6.2.1. SIMULACIÓN No. 1 6.2.2. SIMULACIÓN No. 2 6.2.3. SIMULACIÓN No. 3 6.3. FERMENTACIÓN FED-BATCH 6.3.1. PRIMER PATRÓN DE ALIMENTACIÓN 6.3.2. SEGUNDO PATRÓN DE ALIMENTACIÓN 6.4. ELECTROFORESIS 7. ANÁLISIS DE RESULTADOS 7.1. FERMENTACIÓN BATCH 7.2. SIMULACIÓN 7.3. FERMENTACIÓN FED-BATCH 7.3.1. PRIMER PATRÓN DE ALIMENTACIÓN 7.3.2. SEGUNDO PATRÓN DE ALIMENTACIÓN 8. CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA ANEXOS. 5. 10 12 13 15 15 17 20 20 21 24 24 26 29 31 31 34 35 37 39 41 41 44 47 48 48 49 51 52 55 57 60 62.

(6) IQ-2003-2-24. LISTA DE FIGURAS. Figura 1.. Curva de crecimiento microbiano. 16. Figura 2.. Algoritmo global simulación. 23. Figura 3.. Preparación del Inóculo. 25. Figura 4.. Diagrama de flujo para fermentaciones Batch. 26. Figura 5.. Montaje fermentaciones Fed-Batch. 27. Figura 6.. Gráfica de producción de biomasa en fermentaciones Batch. 33. Figura 7.. Gráfica de consumo de glucosa en fermentaciones Batch. 33. Figura 8.. Gráfica de consumo de DO en fermentaciones Batch. 34. Figura 9.. Gráfica cambio en el volumen durante la simulación No.1. 35. Figura 10. Gráfica de crecimiento de biomasa durante la simulación No.1. 35. Figura 11. Gráfica de consumo de glucosa durante la simulación No.1. 36. Figura 12. Gráfica de comportamiento microbiano durante la simulación No.1. 36. Figura 13. Gráfica cambio en el volumen durante la simulación No.2. 37. Figura 14. Gráfica de crecimiento de biomasa durante la simulación No.2. 37. Figura 15. Gráfica de consumo de glucosa durante la simulación No.2. 38. Figura 16. Gráfica de comportamiento microbiano durante la simulación No.2. 38. Figura 17. Gráfica cambio en el volumen durante la simulación No.3. 39. Figura 18. Gráfica de crecimiento de biomasa durante la simulación No.3. 39. Figura 19. Gráfica de consumo de glucosa durante la simulación No.3. 40. Figura 20. Gráfica de comportamiento microbiano durante la simulación No.3. 40. Figura 21. Gráfica producción de biomasa fermentaciones Fed-Batch 1, 2 y 3. 42. Figura 22. Gráfica consumo de glucosa en fermentaciones Fed-Batch 1, 2 y 3. 43. Figura 23. Gráfica de consumo de DO en fermentaciones Fed-Batch 1, 2 y 3. 43. Figura 24. Gráfica producción de biomasa en fermentaciones Fed-Batch 4 y 5. 45. Figura 25. Gráfica consumo de glucosa en fermentaciones Fed-Batch 4 y 5. 46. Figura 26. Gráfica de consumo de DO en fermentaciones Fed-Batch 4 y 5. 46. 6.

(7) IQ-2003-2-24. Figura 27. Resultados de electroforesis. 27. Figura 28. Curva de calibración DNS. 66. Figura 29. Balanza analítica. 72. Figura 30. Centrífuga. 72. Figura 31. Horno. 72. Figura 32. Desecador. 72. Figura 33. Autoclave. 73. Figura 34. Plancha de calentamiento. 73. Figura 35. Espectrofotómetro. 73. 7.

(8) IQ-2003-2-24. LISTA DE TABLAS. Tabla 1.. Patrones de alimentación fermentaciones Fed-Batch. 28. Tabla 2.. Parámetros y técnicas de evaluación. 30. Tabla 3.. Condiciones de operación Fermentación Batch. 31. Tabla 4.. Parámetros cinéticos a partir de fermentaciones Batch. 31. Tabla 5.. Variables de crecimiento celular para fermentaciones Batch. 32. Tabla 6.. Resultados del comportamiento microbiano fermentaciones Batch. 32. Tabla 7.. Flujos de alimentación utilizados en las simulaciones. 34. Tabla 8.. Condiciones de operación primer patrón de alimentación Fed-Batch. 41. Tabla 9.. Variables de crecimiento celular para Fed-Batch 1,2 y 3. 41. Tabla 10. Resultados del comportamiento microbiano para Fed-Batch 1, 2 y 3. 42. Tabla 11. Condiciones de operación segundo patrón de alimentación Fed-Batch. 44. Tabla 12. Variables de crecimiento celular para Fed-Batch 4 y 5. 44. Tabla 13. Resultados del comportamiento microbiano para Fed-Batch 4 y 5. 45. Tabla 14. Datos curva de calibración DNS. 65. Tabla 15. Resultados producción biomasa fermentación Batch 1. 78. Tabla 16. Resultados producción biomasa fermentación Batch 2. 79. Tabla 17. Resultados consumo de sustrato Batch 1. 79. Tabla 18. Resultados consumo de sustrato Batch 2. 80. Tabla 19. Resultados producción biomasa Fed-Batch 1. 81. Tabla 20. Resultados producción biomasa Fed-Batch 2. 82. Tabla 21. Resultados producción biomasa Fed-Batch 3. 83. Tabla 22 Resultados producción biomasa Fed-Batch 4. 84. Tabla 23 Resultados producción biomasa Fed-Batch 5. 85. Tabla 24. Resultados consumo de sustrato Fed-Batch 1. 86. Tabla 25. Resultados consumo de sustrato Fed-Batch 2. 86. Tabla 26. Resultados consumo de sustrato Fed-Batch 3. 87. 8.

(9) IQ-2003-2-24. LISTA DE ANEXOS. Anexo A.. Composición Medio de Cultivo. 62. Anexo B.. Descripción Métodos de Análisis. 63. Anexo C.. Archivos Simulación. 69. Anexo D.. Equipos Utilizados. 72. Anexo E.. Resultados Simulaciones realizadas en MatLab. 74. Anexo F.. Datos Fermentaciones Batch. 78. Anexo G.. Datos Fermentaciones Fed-Batch. 81. 9.

(10) IQ-2003-2-24. INTRODUCCIÓN. En el campo de la industria agrícola, se presenta una continua búsqueda por nuevas técnicas que permitan el control y eliminación de plagas en distintos cultivos. En la búsqueda de estas técnicas, se pretende encontrar soluciones que no afecten dichos cultivos ni tengan un impacto ambiental negativo ya que hasta el momento los pesticidas químicos presentan grandes desventajas en cuanto acumulación, especificidad y problemas relacionados con la salud tanto de los productores como de los consumidores y demás especies que se vean involucradas. De aquí que día a día se esté incrementando el uso de biopesticidas para la eliminación y en general para el control de dichas plagas.. Dentro del campo de la producción de biopesticidas se encuentra ampliamente desarrollado el uso de Bacillus thuringiensis.. Este microorganismo durante el. proceso fermentativo produce ciertas sustancias que son tóxicas para las plagas que afectan los cultivos, de aquí que surja la necesidad de estudiar e implementar nuevos métodos que permitan mejorar la producción de dichas toxinas para obtener un alto grado de competitividad en el mercado.. Estas toxinas actúan como agentes tóxicos en diferentes tipos de plagas siendo esta una ventaja importante del uso de pesticidas biológicos.. En el caso. específico de la subespecie kurstaki, las toxinas que se producen en el proceso fermentativo actúan directamente sobre insectos del orden lepidóptera.. 10.

(11) IQ-2003-2-24. Debido a la continua búsqueda de tecnologías que hagan posible la producción de Bacillus thuringiensis, se considera relevante la investigación de métodos alternos a los existentes, de manera que se logren mejorar los procesos y obtener así un mayor rendimiento en la consecución de este tipo de pesticidas, con el fin de reducir los problemas existentes con los agentes químicos para obtener un mayor grado de competitividad de el producto.. En este trabajo se realiza un estudio con respecto a la producción de biomasa de un cultivo de Bacillus thuringiensis utilizando herramientas computacionales y nuevas tecnologías de alimentación, evaluando las variables significativas del proceso con el fin de predecir el comportamiento del microorganismo en cuanto al aumento de densidad celular y consumo de sustrato, para llegar a determinar metodologías que permitan aumentar la producción en el campo industrial.. Para llevar a cabo el estudio, fue desarrollado un modelo de simulación de crecimiento microbiano y una serie de fermentaciones en laboratorio con el fin de validar los resultados obtenidos, observando el comportamiento de crecimiento del microorganismo frente a variables del sistema omitidas en la implementación del modelo.. Para el proceso de fermentación de Bacillus thuringiensis se implementó un sistema de producción utilizando una alimentación Fed-Batch continua adecuando el bioreactor para este propósito con una entrada de alimentación controlada por una de las bombas peristálticas del equipo.. 11.

(12) IQ-2003-2-24. OBJETIVOS. Objetivo General •. Implementar y validar un método de simulación que permita determinar el comportamiento microbiano de un sistema de crecimiento Fed-Batch continuo de Bacillus thuringiensis.. Objetivos Específicos •. Plantear el modelo matemático necesario para la implementación de la simulación.. •. Implementar un método de simulación utilizando como herramienta MatLab con el fin de conocer el comportamiento del sistema frente a diferentes señales de alimentación.. •. Realizar fermentaciones evaluando el comportamiento de las variables que afectan el proceso tales como: consumo de sustrato, crecimiento de biomasa y producción de esporas.. •. Evaluar el comportamiento del sistema, en cuanto al crecimiento de biomasa controlando los parámetros de alimentación con el fin de reducir la demanda de oxígeno dentro del reactor.. 12.

(13) IQ-2003-2-24. 1.. ANTECEDENTES. Los biopesticidas son productos que contienen un microorganismo como ingrediente activo o bien se extraen de un ser vivo mediante procedimientos que no alteran su composición química.. (De Liñan, 2001).. Dentro de estos. microorganismos encontramos Bacillus thuringiensis el cual a sido ampliamente estudiado en el campo de los biopesticidas por la producción de toxinas especificas (δ-endotoxinas) para diferentes ordenes de insectos (Realpe y col., 1995). En la actualidad la producción industrial de Bacillus thuringiensis se realiza por medio de fermentaciones tipo Batch, sin embargo, a nivel de planta piloto se están desarrollando metodologías de alimentación Fed-Batch continua (CFBC). o. discontinua (IFBC) con el fin de mejorar el crecimiento de biomasa, el consumo de sustrato y la producción de esporas y toxicidad de las mismas, reduciendo así los tiempos de operación y por consiguientes los costos de producción. (Kang y col. , 1992). El proceso tipo Batch consiste en realizar una alimentación inicial de todos los nutrientes necesarios por el microorganismo dentro del reactor para que este se reproduzca en forma exponencial hasta el momento en que se agote el sustrato, posteriormente la fermentación llega a fase estacionaria donde se inicia el proceso de esporulación y por ende formación del cristal paraesporal.. 13.

(14) IQ-2003-2-24. En contraste, la metodología Fed-Batch consiste en suministrar los nutrientes al microorganismo durante el proceso fermentativo sin la eliminación del medio agotado,. esta corriente de alimentación puede ser suministrada de forma. continua, con flujos variables o constantes, o de forma discontinua en forma de pulsos. Cuando se trabaja con la metodología Fed-Batch continua, se mantiene una alimentación constante al fermentador con el fin de mantener la concentración de sustrato limitante permanente para lograr realizar un control mas ordenado del crecimiento celular.. Al manejar una concentración baja, pero constante, del sustrato, se consigue tener un metabolismo de crecimiento mas ordenado lo que favorece el aumento de la densidad celular y la disminución de la demanda de oxígeno.. En estudios anteriores, se desarrollo un sistema Fed-Batch continuo con un incremento lineal de flujo de sustrato utilizando Bacillus thuringiensis subesp israelensis, permitiendo una mayor adaptación del patrón de flujo al crecimiento del microorganismo (Ming Yang y col., 1998). Por otro lado, se ha venido implantando la utilización de herramientas computaciones para realizar simulaciones de bioprocesos con el fin de optimizarlos. 1. Bertalan. De esta forma tenemos los estudios realizados por B. Sevela y G.. en los cuales se desarrollan simulaciones de procesos biológicos. utilizando como herramienta de simulación MatLab donde es posible resolver sistemas de ecuaciones diferenciales ordinarias, manipulación de distintos tipos de datos y utilización de ambientes gráficos que representan los comportamientos descritos por los modelos.. 1. [9]. 14.

(15) IQ-2003-2-24. 2.. 2.1.. CINÉTICA DE CRECIMIENTO. CURVA DE CRECIMIENTO2. La cinética de crecimiento esta relacionada con los factores ambientales que favorecen el desarrollo del microorganismo, de esta forma se deben garantizar las condiciones óptimas de operación para obtener una alta concentración celular. (Shuler, 1992). La curva de crecimiento microbiano incluye las fases por las cuales pasa el microorganismo a través del tiempo (Figura 1).. •. Fase de Latencia “Lag Phase”: Esta fase es un periodo de adaptación de las células al medio en el que se encuentran, el crecimiento celular es mínimo y es recomendable utilizar inóculos grandes de aproximadamente 5 al 10% del volumen total del reactor con el fin de reducir el tiempo de latencia.. •. Fase de Crecimiento Exponencial “Log Phase”: Durante este periodo, las células ya se encuentran adaptadas al medio y comienzan una etapa de. 2. Shuler, pag. 147-158. 15.

(16) IQ-2003-2-24. crecimiento acelerado en el cual la densidad celular incrementa exponencialmente con el tiempo. •. Fase de desaceleración:. En este periodo se presenta una. desaceleración en la tasa de crecimiento del microorganismo debido a la acumulación de productos tóxicos que actúan como inhibidores o por la disminución de los nutrientes en el medio. •. Fase Estacionaria:. Comienza al finalizar la etapa de desaceleración,. durante este periodo de tiempo la tasa de crecimiento es nula o es igual a la tasa de muerte, la densidad celular se mantiene constante, sin embargo el número de células vivas empieza a decrecer ya que los nutrientes disminuyen y las células deben gastar energía en su propio mantenimiento. Durante esta etapa se generan metabolitos secundarios no relacionados con el crecimiento celular. •. Fase de Muerte “Death Phase”: Durante esta etapa, las células mueren a causa de la falta de nutrientes y la acumulación de sub-productos tóxicos.. 16.

(17) IQ-2003-2-24. 2.2.. ECUACIONES DE CRECIMIENTO. El crecimiento microbiano es proporcional a la concentración celular, de aquí se define la tasa de crecimiento específico:. µ=. 1 dX X dt. µ:. Tasa de crecimiento específico [h-1]. X:. Concentración celular. t:. Tiempo. [g/L]. [h]. Separando variables e integrando la ecuación de X0 en t0 y X en t, tenemos:. X. 1 ∫X X dX = µ 0. Ln. t. ∫ dt. t0. X = µt X0. Ln X - Ln X0 = µt Ln X(t) = µt + Ln X0. Para obtener el valor experimental de la tasa de crecimiento específico, se grafica el logaritmo natural de la concentración de biomasa vs. tiempo y se realiza una regresión lineal donde la pendiente representa el valor de µ.. 17.

(18) IQ-2003-2-24. Otro parámetro a tener en cuenta en el crecimiento de microorganismos corresponde al tiempo de duplicación el cual se define como el tiempo en el cual la masa celular es el doble del valor inicial X0, de esta forma el tiempo de duplicación esta representado por τd:. Ln. 2X 0 = µt X 0. τd =. Ln 2. µ. La concentración del sustrato limitante es fundamental en la determinación de los parámetros cinéticos que se ven involucrados en la cinética de crecimiento microbiano, de esta forma, esta cinética puede ser descrita por la ecuación de Monod:. µ=. µ max S Ks + S. Donde µmáx. y Ks representan la tasa máxima de crecimiento y la constante de saturación respectivamente.. Para la determinación de estos parámetros cinéticos, se grafican los valores de biomasa contra concentración de sustrato y se realiza una regresión lineal en la. 18.

(19) IQ-2003-2-24. cual la pendiente corresponde a µmáx. y el punto de corte sobre el eje X es el valor de la constante de saturación Ks. Finalmente se definen dos parámetros estequiométricos relacionados con el crecimiento del microorganismo, el coeficiente de rendimiento y el coeficiente de mantenimiento, los cuales representan la relación de producción de biomasa con respecto al consumo de sustrato y la tasa de consumo de sustrato para mantenimiento celular respectivamente.. Coeficiente de Rendimiento:. Yx / s =. Biomasa Formada Sustrato Consumido. Yx / s =. X − X0 S0 − S. Coeficiente de Mantenimiento:. m=. Sustrato consumido para mantenimiento Biomasa. m=. [dS dt ]. m. X. 19.

(20) IQ-2003-2-24. 3.. 3.1.. MODELO DE SIMULACIÓN. MODELO MATEMÁTICO. Para la implementación del modelo de simulación, fueron escogidas las ecuaciones de crecimiento microbiano en un sistema continuo teniendo en cuenta que en el la metodología de alimentación Fed-Batch continua se tiene un volumen variable a través del tiempo, de esta manera, el sistema de ecuaciones diferenciales que modelan el crecimiento de microorganismos está representado por las ecuaciones (1), (2) y (3) (Cuhna, 1998). dV = DV dT dX (2) = (µ − D )X dT µ dS ( 3) = D (S f − S ) − X dT Yx / s (1). Para complementar el modelo se utilizan las ecuaciones (4), (5) y (6) que manejan la variable de control definida como la tasa de dilución ‘D’ y los parámetros cinéticos de crecimiento específicos para el microorganismo.. 20.

(21) IQ-2003-2-24. F V ⎛ µ ∗S ⎞ (5)µ = ⎜⎜ max ⎟⎟ ⎝ ks + S ⎠ (4)D =. (6)Yx / s =. (X − X0 ) (S0 − S ). D:. Tasa de dilución (1/h). V:. Volumen (L). F:. Flujo de alimentación (L/h). µ:. Tasa de crecimiento específica (1/h). X:. Concentración de biomasa (g/L). S:. Concentración de sustrato (g/L). Sf:. Concentración de sustrato en la alimentación (g/L). Yx/s:. Coeficiente de rendimiento. µmáx., Ks: Parámetros cinéticos (Monod). 3.2.. SIMULACIÓN. Para la implementación de la simulación, se utilizaron las ecuaciones (1), (2) y (3) como un sistema de ecuaciones diferenciales las cuales fueron resueltas en MatLab utilizando como herramienta la rutina ODE45 por la cual es posible evaluar un sistema de estas características ingresando como parámetros de entrada un vector tiempo y un vector con los valores iniciales (V0, X0, S0) (Anexo C).. 21.

(22) IQ-2003-2-24. El modelo de simulación implementado, se compone de dos archivos relacionados entre ellos por la rutina ODE45, en los cuales se definen los valores iniciales y los parámetros cinéticos necesarios para la resolución del sistema y obtener de esta forma los perfiles de comportamiento microbiano.. A continuación se presenta una breve descripción de los dos archivos que hacen parte de la simulación.. •. Archivo No. 1: “Prueba”. o Se realiza la definición de los valores iniciales V0, X0, S0 y el vector tiempo. o Se pregunta al usuario por el valor del flujo de alimentación o Se determinan los tiempos de inicio y finalización de la alimentación. o Se llama al archivo que contiene la definición del sistema de ecuaciones ingresando como variables de entrada el vector tiempo y el vector de condiciones iniciales. o Se grafican los vectores generados en la solución.. •. Archivo No. 2: “Solución”. o Se realiza la definición de las ecuaciones (4) y (5) ingresando como valores constantes µmáx., Ks, Sf y Yx/s o Se define el sistema de ecuaciones diferenciales. o Este retorna al archivo “Prueba” los tres vectores solución que corresponden a los valores de volumen, biomasa y sustrato en cada intervalo de tiempo.. 22.

(23) IQ-2003-2-24. El algoritmo general del modelo se presenta en la figura 2.. Inicio programa “Prueba”. Definición valores iniciales V0, X0, S0 Definición vector tiempo y determinación de tiempos de inicio y finalización de la alimentación Preguntar al usuario por el flujo de alimentación: variable global. Definición valores constantes µ máx., Ks, Sf y Yx/s. Definición sistema de ecuaciones diferenciales. Variables de entrada programa “Solución” [Tiempo], [ V0, X0, S0] Inicio programa “Solución”. Ejecución rutina ODE45 Variable de salida: vector solución [Vt,Xt,St]. Graficar vector solución vs. tiempo. Figura 2. Algoritmo global simulación. Para cada una de las simulaciones con uno, dos y tres escalones en el flujo de alimentación, se tiene un archivo “Prueba” en donde se especifican los tiempos de inicio y finalización del flujo.. Por cada valor de flujo diferente se resuelve el. sistema de ecuaciones tomando como valores iniciales, los valores finales del proceso del flujo anterior. El archivo “Solución” se utiliza cada vez que se ejecuta la rutina ODE45, se necesita de un archivo diferente para cada etapa de la fermentación durante las 33 horas de fermentación (Anexo C.).. 23.

(24) IQ-2003-2-24. 4.. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL. Para la realización del proyecto se utilizó una solución de esporas de la cepa de Bacillus thuringiensis subesp.. kurstaki proporcionada por el Centro de. Investigaciones en Ingeniería Química (CIIQ) CITEC.. El procedimiento experimental llevado a cabo se dividió en dos partes, en primer lugar, se realizaron dos fermentaciones Batch con el fin de conocer el comportamiento microbiano y obtener los parámetros de la cinética de crecimiento de Bacillus thuringiensis, posteriormente, se efectuaron 5 fermentaciones FedBatch. aplicando. dos. métodos. distintos. de. alimentación.. Para. estos. procedimientos se utilizó el bioreactor marca New Brunswick, referencia Bioflo 3000.. 4.1.. FERMENTACIONES BATCH. La metodología utilizada tanto para las fermentaciones Batch como para FedBatch consistió inicialmente en la preparación del inóculo,. para las. fermentaciones Batch se utilizó un volumen de control de 3 litros, para lo cual el inóculo corresponde a 300 mL el cual es equivalente al 10% del volumen total. Para esto se preparó el medio de cultivo del inóculo en un erlenmeyer de 500 mL (Anexo A),. teniendo en cuenta que para realizar el proceso de autoclave es 24.

(25) IQ-2003-2-24. necesario separar la glucosa y el sulfato de magnesio cada uno en un 10 % del volumen y los demás componentes en el 80 % restante, esto con el fin de evitar precipitaciones del extracto de levadura por las temperaturas elevadas que se alcanzan en el proceso de esterilización, posteriormente se agregó 1mL de solución de esporas al medio, y se dejó en el shaker durante 14 horas a 30 °C y agitación continua (Figura 3 ).. Figura 3. Preparación del Inóculo. Simultáneamente fue preparado el medio de cultivo del reactor, teniendo en cuenta las mismas consideraciones con respecto a la glucosa y el sulfato de magnesio para el proceso de autoclave.. Pasadas las 14 horas, se agregó el inóculo al reactor en condiciones asépticas para evitar contaminación y se inició el proceso fermentativo durante 33 horas tomando muestras durante las primeras 7 horas para realizarle los análisis de concentración de sustrato (glucosa) y concentración de biomasa producida (Anexo B) con el fin de obtener los parámetros cinéticos. fermentación se presenta en la figura 4.. 25. El procedimiento global de.

(26) IQ-2003-2-24. Preparar el medio de cultivo del inóculo 10% del volumen total. Preparar el medio de cultivo del reactor. Realizar el procedimiento de autoclave. Realizar el procedimiento de autoclave. Agregar la solución de esporas al medio de cultivo y dejarlo en el shaker durante 14 horas. Añadir el inóculo al reactor e iniciar el proceso fermentativo durante 33 horas, tomando muestras durante las primeras horas de fermentación. Figura 4. Diagrama de flujo para fermentaciones Batch. 4.2.. FERMENTACIONES FED-BATCH. Para las fermentaciones Fed-Batch se realizó el mismo procedimiento descrito para las fermentaciones Batch, en el cual es preparado el inóculo y esterilizado el medio del cultivo del bioreactor, además de esto se realizó el procedimiento de autoclave para la alimentación que fue añadida durante la fermentación. (Figura 5).. 26.

(27) IQ-2003-2-24. Figura 5. Montaje fermentaciones Fed-Batch. Para el procedimiento Fed-Batch continuo se utilizaron dos patrones de alimentación distintos, Fed-Batch 1, Fed-Batch 2 y Fed-Batch 3 corresponden al primer patrón de alimentación y Fed-Batch 4 y Fed-Batch 5 corresponden al segundo.. La primera estrategia de alimentación se dividió en tres etapas, operación Batch durante las 5 primeras horas seguida por la operación Fed-Batch continua a una tasa de alimentación de 0.07 L/h con una concentración de glucosa de 16 g/L durante las siguientes 15 horas y nuevamente operación Batch durante las últimas 13 horas.. 27.

(28) IQ-2003-2-24. Para la segunda estrategia se utilizaron cuatro etapas en las cuales las primeras 5 horas corresponden a operación Batch, seguida por 19 horas de operación FedBatch continua con un flujo de 0.035 L/h con concentración de glucosa de 32 g/L, posteriormente el flujo de alimentación se aumento el doble durante las siguientes 5 horas y las últimas 4 horas corresponden nuevamente a operación Batch.. El flujo de alimentación suministrado en las fermentaciones estaba compuesto por glucosa y extracto de levadura cada una en un 50% volumen con concentraciones iguales. La glucosa fue el sustrato limitante durante el proceso.. Los patrones de alimentación utilizados en las fermentaciones Fed-Batch con los respectivos tiempos y parámetros iniciales se muestran en la tabla 1.. Vo (L) Va (L) Sf (g/L) Primer Patrón. Segundo. F (L/h). Ta (h) Hora Inicio Hora Final. Fed-Batch 1. 3. 1. 16. F = 0,07. 15. 5. 20. Fed-Batch 2. 3. 1. 16. F = 0,07. 15. 5. 20. Fed-Batch 3. 3. 1. 16. F = 0,07. 15. 5. 20. Fed-Batch 4. 2. 1. 32. F1=0,035. 19. 5. 24. F2 = 0,07. 5. 24. 29. F1=0,035. 19. 5. 24. F2 = 0,07. 5. 24. 29. Patrón Fed-Batch 5. 2. 1. 32. Tabla 1. Patrones de alimentación fermentaciones Fed-Batch. Vo:. Volumen inicial en el reactor. Va:. Volumen total alimentado. Sf:. Concentración de glucosa en la alimentación. F:. Flujo de alimentación. Ta:. Tiempo total de alimentación. 28.

(29) IQ-2003-2-24. 5. PARÁMETROS DE EVALUACIÓN. Para evaluar el comportamiento celular, se analizó la cantidad de biomasa producida y la glucosa consumida a través del tiempo utilizando como métodos de análisis el peso seco y DNS respectivamente. (Anexo B). Durante la realización de la parte experimental, para cada fermentación se tomaron muestras durante las primeras 7 horas de fermentación, luego una muestra a las 24 horas y otra al finalizar la fermentación a las 33 horas. A cada una de las muestras se les realizaron los análisis nombrados anteriormente. Para garantizar la confiabilidad de los resultados, la metodología de peso seco se realizó por duplicado para cada muestra.. Por otro lado, en el momento de tomar cada una de las muestras se leían los valores de oxígeno disuelto, temperatura, pH y flujo de aire reportados por el equipo en el tablero digital, esto con el fin de controlar las condiciones óptimas de operación y la variación del oxígeno dentro del reactor al pasar del tiempo.. Además de estas pruebas, de cada una de las muestras al finalizar las fermentaciones (33 horas), se tomó 1 mL y se llevó a una temperatura por debajo de los 0 °C con el fin de conservarlas para realizar finalmente una electroforesis en gel de poliacrilamida con el fin de observar la presencia y cantidad de proteína toxica en cada fermentación, SDS-PAGE (Anexo B). 29.

(30) IQ-2003-2-24. De esta forma los parámetros evaluados y controlados durante las fermentaciones se resumen en la tabla 2.. PARÁMETRO EVALUADO. TÉCNICA. Concentración de biomasa. Peso seco. Consumo de glucosa. DNS. Presencia de proteína tóxica. SDS-PAGE. Oxígeno disuelto Flujo de aire. Observación tablero digital. Temperatura pH. Tabla 2. Parámetros y técnicas de evaluación. 30.

(31) IQ-2003-2-24. 6. RESULTADOS. 6.1.. FERMENTACIÓN BATCH. El tiempo total de fermentación para Batch 1 y Batch 2 fue de 33 horas a partir de la inoculación en el bioreactor, la agitación se mantuvo en 300 rpm.. Temperatura. pH. °C. DO. Flujo de Aire. %. L/min. Batch 1. 30. 6.48. 88. 3.2. Batch 2. 29.8. 6.51. 87.4. 3.4. Tabla 3. Condiciones de operación Fermentación Batch. Las fermentaciones Batch fueron llevadas a cabo con el fin de obtener los parámetros cinéticos necesarios para la implementación del modelo de simulación. De esta forma se obtuvieron los siguientes resultados (Tabla 4).. Parámetros Cinéticos Batch1. Batch 2. Promedio. Desviación. µmáx.. 0.3850. 0.3405. 0.3627. 0.0315. Ks. 9.7568. 8.4731. 9.1150. 0.9077. Tabla 4. Parámetros cinéticos a partir de fermentaciones Batch. 31.

(32) IQ-2003-2-24. Las variables de crecimiento celular obtenidas para las fermentaciones Batch se reportan en la tabla 5.. µ. Yx/s. Fermentaciones. [h-1]. [%]. τd. Batch 1. 0,2228. 42,69. 3,11. Batch 2. 0,3347. 55,11. 2,07. Promedio. 0.2787. 48.90. 2.59. Desviación. 0.0559. 6.214. 0.52. Tabla 5. Variables de crecimiento celular para fermentaciones Batch. Biomasa Final. Sustrato Final. [g/L]. [g/L]. Batch 1. 3.8. 0.855. Batch 2. 3.6. 2.012. Promedio. 3.7. 1.433. Desviación. 0.1. 0.578. Tabla 6. Resultados del comportamiento microbiano fermentaciones Batch. A continuación se presentan las gráficas que muestran el comportamiento microbiano.. 32.

(33) IQ-2003-2-24. Producción Biomasa. 4. [Biomasa] (g/L). 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. 35. Tiempo (h) Batch 1. Batch 2. Figura 6. Gráfica de producción de biomasa en fermentaciones Batch. Consumo Glucosa 9. [Glucos a] (g/L). 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. 35. Tiem po (h) Batch 1. Batch 2. Figura 7. Gráfica de consumo de glucosa en fermentaciones Batch. 33.

(34) IQ-2003-2-24. Consumo de DO 100 90 80. DO(%). 70 60 50 40 30 20 10 0 0,3. 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5,3. 6,3. Tiempo. Batch 1. Batch 2. Figura 8. Gráfica de consumo de DO en fermentaciones Batch. 6.2.. SIMULACIÓN. Fueron. realizadas. tres. simulaciones. con. uno,. dos. y. tres. escalones. respectivamente con diferentes flujos de alimentación.. Ta (h) Simulación 1 Simulación 2. Simulación 3. F (L/h). Hora Inicio. Hora Final. 15. F = 0.07. 5. 20. 19. F1 = 0.035. 5. 24. 5. F2 = 0.07. 24. 29. 6. F1 = 0.0175. 5. 11. 8. F2 = 0.035. 11. 19. 9. F3 = 0.07. 19. 28. Tabla 7. Flujos de alimentación utilizados en las simulaciones. 34.

(35) IQ-2003-2-24. 6.2.1. SIMULACIÓN No. 1. Alimentación:. 0.07 L/h durante 15 horas (inicio: hora 5). Cambio en el Volumen 3.9 3.8 3.7. Volumen(L). 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3. 0. 5. 10. 15 20 Tiempo(h). 25. 30. 35. Figura 9. Gráfica cambio en el volumen durante la simulación No.1. Crecimiento de Biomasa 5 4.5 4. Biomasa (g/L). 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0. 0. 5. 10. 15 20 Tiempo(h). 25. 30. 35. Figura 10. Gráfica de crecimiento de biomasa durante la simulación No.1. 35.

(36) IQ-2003-2-24. Consumo de Sustrato 8 7. Sustrato (g/L). 6 5 4 3 2 1 0. 0. 5. 10. 15 20 Tiempo(h). 25. 30. 35. Figura 11. Gráfica de consumo de glucosa durante la simulación No.1. Comportamiento microbial 8 7. Producción-Consumo (g/L). 6 5 4 3 2 1 0. 0. 5. 10. 15 20 Tiempo(h). 25. 30. 35. Figura 12. Gráfica de comportamiento microbiano durante la simulación No.1. 36.

(37) IQ-2003-2-24. 6.2.2. SIMULACIÓN No. 2. Alimentación:. 0.035 L/h durante 19 horas (inicio: hora 5) 0.07 L/h durante 5 horas (inicio: hora 25). 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2. 0. 5. 10. 15. 20. 37. 25. 30. 35.

(38) IQ-2003-2-24. Consumo de Sustrato 8 7. Sustrato (g/L). 6 5 4 3 2 1 0. 0. 5. 10. 15 20 Tiempo(h). 25. 30. 35. Figura 15. Gráfica de consumo de glucosa durante la simulación No.2. Comportamiento microbial 8 7. Producción-Consumo (g/L). 6 5 4 3 2 1 0 0. 5. 10. 15 20 Tiempo(h). 25. 30. 35. Figura 16. Gráfica de comportamiento microbiano durante la simulación No.2. 38.

(39) IQ-2003-2-24. 6.2.3. SIMULACIÓN No. 3. Alimentación:. 0.0175 L/h durante 6 horas (inicio: hora 5) 0.035 L/h durante 8 horas (inicio: hora 11) 0.07 L/h durante 9 horas (inicio: hora 19). Cambio en el Volumen 2.9 2.8 2.7. Volumen(L). 2.6 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2. 0. 5. 10. 15 20 Tiempo(h). 25. 30. 35. Figura 17. Gráfica cambio en el volumen durante la simulación No.3. Crecimiento de Biomasa 6. 5. Biomasa (g/L). 4. 3. 2. 1. 0. 0. 5. 10. 15 20 Tiempo(h). 25. 30. 35. Figura 18. Gráfica de crecimiento de biomasa durante la simulación No.3 39.

(40) IQ-2003-2-24. Consumo de Sustrato 8 7. Sustrato (g/L). 6 5 4 3 2 1 0. 0. 5. 10. 15 20 Tiempo(h). 25. 30. 35. Figura 19. Gráfica de consumo de glucosa durante la simulación No.3. Comportamiento microbial 8 7. Producción-Consumo (g/L). 6 5 4 3 2 1 0 0. 5. 10. 15 20 Tiempo(h). 25. 30. 35. Figura 20. Gráfica de comportamiento microbiano durante la simulación No.3. 40.

(41) IQ-2003-2-24. 6.3.. FERMENTACIÓN FED-BATCH. 6.3.1. PRIMER PATRÓN DE ALIMENTACIÓN. El tiempo total de fermentación para Fed-Batch 1 y Fed-Batch 2 fue de 33 horas y para Fed-Batch 3 fue de 48 horas a partir de la inoculación en el bioreactor, la agitación se mantuvo en 300 rpm.. Temperatura. pH. °C. DO. Flujo de Aire. %. L/min. Fed-Batch 1. 30.2. 6.3. 88. 3.5. Fed-Batch 2. 30.1. 6.4. 93. 7.1. Fed-Batch 3. 30. 6.5. 80. 3.4. Tabla 8. Condiciones de operación primer patrón de alimentación Fed-Batch. Las variables de crecimiento celular obtenidas para el primer patrón de alimentación Fed-Batch se reportan en la tabla 9.. µ. Yx/s. [h-1]. [%]. Fed-Batch 1. 0,1326. 43,16. 5,23. Fed-Batch 2. 0,2561. 71,07. 2,71. Fed-Batch 3. 0,1559. 32,29. 4,45. Promedio. 0.1815. 48.84. 4.13. Desviación. 0.0536. 16.33. 1.05. Fermentaciones. τd. Tabla 9. Variables de crecimiento celular para Fed-Batch 1,2 y 3. 41.

(42) IQ-2003-2-24. Biomasa Final. Sustrato Final. [g/L]. [g/L]. Fed-Batch 1. 4,65. 2,11. Fed-Batch 2. 7,8. 0.044. Fed-Batch 3. 4,7. 2.12. Promedio. 5.71. 1.42. Desviación. 1.47. 0.97. Tabla 10. Resultados del comportamiento microbiano para Fed-Batch 1, 2 y 3. A continuación se presentan las gráficas que muestran el comportamiento microbiano.. Producción Biomasa 9. [Biomasa] (g/L). 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. Tiempo (h). Fed-Batch 1. Fed-Batch 2. Fed-Batch 3. Figura 21. Gráfica producción de biomasa fermentaciones Fed-Batch 1, 2 y 3. 42.

(43) IQ-2003-2-24. Consumo Glucosa 8 7. [Glucosa] (g/L). 6 5 4 3 2 1 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. Tiempo (h) Fed-Batch 1. Fed-Batch 2. Fed-Batch 3. Figura 22. Gráfica consumo de glucosa en fermentaciones Fed-Batch 1, 2 y 3. Consumo de DO 100 90 80. DO (%). 70 60 50 40 30 20 10 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. 35. 40. 45. 50. 55. Tiem po Fed-Batch 1. Fed-Batch 2. Fed-Batch 3. Figura 23. Gráfica de consumo de DO en fermentaciones Fed-Batch 1, 2 y 3. 43.

(44) IQ-2003-2-24. 6.3.2. SEGUNDO PATRÓN DE ALIMENTACIÓN. El tiempo de fermentación para Fed-Batch 4 y 5 fue de 33 horas.. Temperatura. pH. °C. DO. Flujo de Aire. %. L/min. Fed-Batch 4. 30. 6.5. 96.4. 3.3. Fed-Batch 5. 30. 6.5. 90.4. 3.4. Tabla 11. Condiciones de operación segundo patrón de alimentación Fed-Batch. En la tabla 12 se reportan las variables de crecimiento celular para las fermentaciones realizadas con el segundo patrón de alimentación.. Fermentaciones. µ. Yx/s. -1. τd. [h ]. [%]. Fed-Batch 4. 0,2116. 57,697. 3,27. Fed-Batch 5. 0,2105. 67,076. 3,29. Promedio. 0.2110. 62.386. 3.28. Desviación. 0.0005. 4.6895. 0.01. Tabla 12. Variables de crecimiento celular para Fed-Batch 4 y 5. 44.

(45) IQ-2003-2-24. Biomasa Final. Sustrato Final. [g/L]. [g/L]. Fed-Batch 4. 7,1. 1,87. Fed-Batch 5. 7. 2,05. Promedio. 7.05. 1.96. Desviación. 0.05. 0.09. Tabla 13. Resultados del comportamiento microbiano para Fed-Batch 4 y 5. A continuación se presentan las gráficas que muestran el comportamiento microbiano durante las fermentaciones Fed-Batch continuo con el segundo patrón de alimentación.. 45.

(46) IQ-2003-2-24. Consumo Glucosa 9 8. [Glucosa] (g/L). 7 6 5 4 3 2 1 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. 35. Tiempo (h). Fed-Batch 4. Fed-Batch 5. Figura 25. Gráfica consumo de glucosa en fermentaciones Fed-Batch 4 y 5. Consumo de DO 120 100. DO (%). 80 60 40 20 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. 35. Tiempo. Fed-Batch 4. Fed-Batch 5. Figura 26. Gráfica de consumo de DO en fermentaciones Fed-Batch 4 y 5. 46.

(47) IQ-2003-2-24. 6.4.. ELECTROFORESIS. Se realizaron dos corridas en gel de poliacrilamida con el fin de observar y cuantificar la proteína tóxica característica de Bacillus thuringiensis los resultados se presentan en la figura 27.. Figura 27. Resultados de electroforesis. 47.

(48) IQ-2003-2-24. 7. ANÁLISIS DE RESULTADOS. 7.1.. FERMENTACIÓN BATCH. Se realizaron dos fermentaciones Batch manteniendo las condiciones de operación iguales, con el fin de determinar los parámetros cinéticos de crecimiento de Bacillus thuringiensis donde se obtuvieron los valores promedio de velocidad de crecimiento específico µmax 0.3627 h-1 con una desviación estándar de 0.0315 y constante de saturación Ks de 9.1150 con desviación de 0.9077.. La velocidad de crecimiento específico (µ) promedio obtenida de las dos fermentaciones Batch fue de 0.2787 h-1 (0.0559). con un coeficiente de. rendimiento (Yx/s) promedio de 48.9 % y un tiempo de duplicación (τd) de 2.59 h.. Finalmente, se obtuvo una concentración de biomasa total de 3.7 g/L. En las gráficas de crecimiento de biomasa y consumo de sustrato para la operación Batch (figuras 6 y 7) se observa el comportamiento microbiano, en el cual durante las primeras 3 horas se presenta una fase de latencia donde el crecimiento es mínimo y a partir de la 4ª hora, comienza un proceso de crecimiento exponencial hasta la hora 7, posteriormente el microorganismo entra en la fase estacionaria hasta finalizar la fermentación.. 48.

(49) IQ-2003-2-24. Con respecto a la gráfica (figura 8) de consumo de oxígeno disuelto dentro del fermentador, se ve claramente la rápida disminución del porcentaje de DO durante las primeras 6 horas de fermentación, alcanzando niveles por debajo del 10 %, de aquí, que el microorganismo no haya logrado esporular debido a las condiciones de operación.. 7.2.. SIMULACIÓN. Luego de realizar las fermentaciones Batch y obtener los parámetros cinéticos para la ecuación de Monod, se llevó a cabo la implementación del modelo de simulación utilizando el sistema de ecuaciones diferenciales descrito en el capitulo 3, luego de ejecutar cada simulación se obtienen como resultado 4 graficas que representan las variables de crecimiento celular. (Figuras 9 a 20). Aunque el modelo implementado, utilizando como herramienta MatLab, se encuentra restringido frente a. diferentes variables involucradas en el proceso. fermentativo tales como el consumo de oxígeno y el flujo de aire, los resultados en cuanto a los perfiles son coherentes con los resultados obtenidos en los experimentos realizados.. Para la primera simulación, en la figura 10, se observan tres colores distintos a lo largo del crecimiento de biomasa, estos colores representan las tres etapas que se tienen en cuenta en la simulación donde la primera (color azul) y la tercera (color rojo) fase corresponden a los periodos de fermentación Batch, mientras que la segunda etapa (color verde) corresponde al tiempo durante el cual se realiza la 49.

(50) IQ-2003-2-24. alimentación continua al reactor. Para esta primera simulación se obtiene un valor final de biomasa de 4.8026 g/L.. De igual forma que en la figura 10 se presentan distintos colores, en las figuras 9,11 y 12, los colores representan las diferentes etapas de fermentación. En la gráfica 9, se observa el volumen constante durante el periodo de crecimiento Batch y el aumento del volumen dentro del fermentador durante el periodo de alimentación continua.. Para la segunda simulación, se presenta el mismo comportamiento microbiano observado en la primera simulación, donde las diferentes etapas de fermentación se representan por los cambio de color de la curva a través del tiempo.. En la figura 15 donde se muestra el consumo de glucosa dentro del reactor, se observa un grado de saturación durante el periodo de alimentación del segundo flujo (0.07L/h) manifestado en el cambio de la pendiente de la curva (color rojo) sin embargo al finalizar la alimentación y continuar con fermentación Batch, la pendiente cambia y toma un valor negativo.. Para esta simulación se presenta un valor final de concentración de biomasa de 5.3994 g/L.. Nuevamente para la tercera simulación,. en la que se manejan 3 flujos de. alimentación, se presenta el mismo comportamiento en las diferentes curvas obtenidas (figuras 17, 18, 19 y 20), sin embargo el valor final de concentración de. 50.

(51) IQ-2003-2-24. biomasa disminuye a 5.3503 g/L comparada con el resultado obtenido durante la simulación 2 en la que solo se utilizan dos flujos distintos de alimentación.. De acuerdo a la grafica del comportamiento microbiano (figura 20), se observa que durante el periodo de tiempo de la última alimentación se presenta un aumento en la concentración de sustrato dentro del medio, la pendiente de la curva de crecimiento durante este mismo periodo disminuye comparada con las curvas de los periodos que se encuentran antes y después de esta alimentación,. esto. posiblemente debido a la inhibición por altos niveles de sustrato que se presenta en Bacillus thuringiensis. (Kuppusamy & Balaraman, 1991). 7.3.. FERMENTACIÓN FED-BATCH. Para la determinación de los patrones de alimentación, se utilizó como referencia el estudio realizado por Kang, Lee & Chang3 en el cual utilizan un flujo de alimentación constante de 0.07 L/h. De aquí se estableció el flujo para el primer patrón de alimentación y con ayuda de los resultados de las simulaciones se establecieron los flujos de alimentación para el segundo patrón.. En cuanto al comportamiento global de los parámetros de evaluación (producción de biomasa y consumo de sustrato), se pudo observar la misma tendencia en todas las pruebas realizadas,. obteniéndose perfiles de comportamiento. microbiano similares a los presentados tanto en las fermentaciones Batch como en las simulaciones.. 3. [6]. 51.

(52) IQ-2003-2-24. 7.3.1. PRIMER PATRÓN DE ALIMENTACIÓN. Durante el desarrollo de las primeras tres fermentaciones Fed-Batch, se manejó el mismo valor de flujo de alimentación manteniéndose en 0.07 L/h, sin embargo hubo variaciones entre ellas para observar el comportamiento frente a las variables que no son tenidas en cuenta en el modelo de simulación como lo son el flujo de aire y el oxígeno disuelto.. En la fermentación Fed-Batch 1 se manejo un flujo de aire de 3.5 L/min y tiempo total de fermentación de 33 horas, obteniéndose como resultado de la tasa de crecimiento específico un valor de 0.1326 h-1 , tiempo de duplicación igual a 5.23 horas y un coeficiente de rendimiento de 43.16%.. Llegando finalmente a. obtenerse un valor de 4.65 g/L de biomasa, observándose un aumento del 25.67%. 52.

(53) IQ-2003-2-24. El valor final de la biomasa producida fue de 7.8 g/L donde se puede ver que también aumentó un 67.74% comparado con lo obtenido en la fermentación FedBatch 1 y 110.8% comparado con las fermentaciones Batch. A partir de estos resultados, se puede observar como la variación del valor de flujo de aire, afecta directamente al crecimiento del microorganismo y a su comportamiento en general.. Para la fermentación Fed-Batch 3 se utilizaron nuevamente las condiciones de operación empleadas en la primera fermentación Fed-Batch, manejándose un flujo de aire dentro del reactor de 3.4 L/min, sin embargo, la fermentación se llevó hasta las 48 horas con el fin de observar el comportamiento del oxígeno disuelto dentro del reactor.. Los valores de crecimiento celular para esta fermentación fueron similares a los de la primera corrida Fed-Batch como era de esperarse por las condiciones de operación que se manejaron, de esta forma tenemos un valor de 0.1559 h-1 para la tasa de crecimiento específico, 4.45 horas para el tiempo de duplicación y coeficiente de rendimiento de 32.29%. El valor de biomasa total obtenido durante esta fermentación fue de 4.7 g/L a las 48 horas, lo que representa un incremento del 27 % sobre las fermentaciones Batch.. Con respecto al comportamiento de consumo de oxígeno disuelto (Figura 23) se puede apreciar en la curva que representa la fermentación Fed-Batch 1, una disminución durante las primeras 5 horas de fermentación, sin embargo en el momento en el cual es iniciada la alimentación continua, presenta un cambio en la pendiente y aumenta durante las siguientes 5 horas donde nuevamente decrece el 53.

(54) IQ-2003-2-24. porcentaje, no obstante, durante las ultimas 3 horas de fermentación tiende a subir nuevamente este valor. Este comportamiento es atribuido al crecimiento del microorganismo, en el cual, durante las primeras 10 horas, inicia un proceso de metabolismo rápido con una tasa de consumo de glucosa alta, periodo durante el cual el requerimiento de oxígeno aumenta, sin embargo, en la hora 5 donde se inicia la alimentación, el consumo de oxígeno se ve reducido por la adición de nutrientes al medio, donde el metabolismo de crecimiento del microorganismo se presenta en forma mas ordenada de manera que el requerimiento de OD es menor. Al finalizar la fermentación, el valor de oxígeno aumenta, lo que nos indica que el microorganismo se encuentra en la fase estacionaria. Por otro lado, el comportamiento en cuanto al consumo de oxígeno durante FedBatch 2 fue diferente y se mantuvo en valores muy bajos, durante las primeras 5 horas, la disminución fue rápida hasta llegar a los valores de 0.1% donde se mantuvo durante las siguientes 5 horas, de aquí el consumo empezó a aumentar hasta la hora 33 llegando a un valor máximo de 26.2%, siendo este un valor muy bajo para los requerimientos de crecimiento del microorganismo. A partir de este comportamiento, podemos observar la influencia que tiene la variación del flujo de aire dentro del reactor afectando las variables de crecimiento del microorganismo.. En Fed-Batch 3 el comportamiento presenta cierta tendencia a aumentar durante las primeras 5 horas de alimentación sin alcanzarse valores tan altos como los observados durante la primera fermentación,. además, durante el periodo de. tiempo final, de la hora 33 a la hora 48, se observa el aumento en el valor de este parámetro, confirmándonos así que el microorganismo entra en la fase estacionaria después de la hora 30.. 54.

(55) IQ-2003-2-24. 7.3.2. SEGUNDO PATRÓN DE ALIMENTACIÓN. Para el segundo patrón de alimentación, se manejaron las mismas condiciones de operación para Fed-Batch 4 y Fed-Batch 5, con un flujo de aire entre 3.3 y 3.4 L/min durante 33 horas.. Durante estas fermentaciones se mantuvo un buen grado de confianza entre los dos experimentos donde se obtuvo como resultado de biomasa final promedio de 7.05 g/L con desviación estándar de 0.05 y concentración de sustrato final de 1.96 g/L con desviación de 0.09.. Las variables de crecimiento celular fueron de 0.211 h-1 con desviación de 0.0005 para la tasa de crecimiento especifico, tiempo de duplicación en 3.28 horas y coeficiente global de rendimiento de 62.07%.(Tabla 12). En cuanto al comportamiento de consumo de oxígeno disuelto, durante estas pruebas se manifestó un comportamiento similar entre las dos réplicas, en el cual durante las primeras 5 horas de fermentación el valor disminuyó y desde la hora 5 a la 10, periodo en el cual se realizó la alimentación, este valor aumentó, además, a partir de la hora 24 donde se inició la segunda alimentación, el porcentaje de oxígeno tendió a aumentar para el caso de la fermentación Fed-Batch 5.. Comparando los resultados obtenidos en las fermentaciones y en las simulaciones se puede observar que los perfiles de comportamiento microbiano son similares cualitativamente, sin embargo los resultados numéricos reportados por el modelo 55.

(56) IQ-2003-2-24. son menores a los obtenidos realmente durante las pruebas experimentales. Esto se debe muy posiblemente a las variables externas al modelo que afectan directamente el comportamiento de crecimiento del microorganismo como se pudo ver con la fermentación Fed-Batch 2 y la variación del flujo de aire.. Otros factores importantes y que no son considerados en el modelo matemático tales como el porcentaje de oxígeno disuelto dentro del fermentador, el pH, y la temperatura. de. operación, influyen. directamente. en. el. crecimiento. del. microorganismo, independientemente de la metodología de alimentación.. Finalmente, con respecto a los resultados obtenidos en la electroforesis se puede determinar que el microorganismo no produjo esporas durante el proceso fermentativo, ya que no se logro identificar la presencia de proteína tóxica en ninguna de las muestras.. En la figura 27 se observa la tinción de pesos. moleculares para los tres patrones analizados únicamente, los demás pozos de siembra de muestra para la corrida están en blanco, lo que nos indica que no hay presencia de ninguna proteína.. 56.

(57) IQ-2003-2-24. 8. CONCLUSIONES. Inicialmente, se pretendía implementar una estrategia de alimentación Fed-Batch continua de manera que la producción de biomasa aumentara con un consumo mínimo de oxígeno dentro del bioreactor, con el fin de reducir los costos de operación en la producción de Bacillus thuringiensis, buscando finalmente no comprometer la producción de esporas y la síntesis de la proteína tóxica. Sin embargo,. con los resultados obtenidos en las simulaciones no fue posible. determinar la estrategia de alimentación óptima, ya que inicialmente se esperaba un aumento de biomasa con el aumento de escalones en el flujo, no obstante, al realizar la simulación 3 este valor disminuyó.. Además se debe tener en cuenta la influencia de las demás variables involucradas en el crecimiento microbiano que no fueron consideradas en el modelo de simulación.. Pese a los inconvenientes presentados en el desarrollo de la simulación,. se. puede observar en los resultados obtenidos que el modelo cualitativamente es acertado con el comportamiento microbiano, sin embargo, como se puede ver, los resultados numéricos de cantidad de biomasa son menores a los obtenidos en las fermentaciones. Esto se debe a que el modelo está restringido en cuanto a variables externas que afectan directamente el crecimiento del microorganismo, tales como la velocidad de agitación, control de espuma en el fermentador, pH,. 57.

(58) IQ-2003-2-24. flujo de aire y oxígeno disuelto, las cuales son controladas en la experimentación pero no son tenidas en cuenta en el modelo.. De estas variables es importante considerar el papel que juega el flujo de aire y el oxígeno disuelto dentro del fermentador, ya que si este valor se encuentra por debajo del 40% del volumen total, las condiciones no son apropiadas para el proceso de esporulación.. Con la metodología de alimentación Fed-Batch continua fue posible reducir el consumo de oxígeno dentro del fermentador comparado con los valores obtenidos en las fermentaciones Batch, sin embargo este valor sigue estando por debajo de los límites recomendados para favorecer la esporulación.. Con respecto a los resultados obtenidos en la electroforesis, la proteína no fue sintetizada en el proceso fermentativo, por lo cual se asume que el microorganismo no produjo esporas muy posiblemente por la deficiencia de oxígeno dentro del reactor.. La simulación es una herramienta útil en la determinación del comportamiento global del microorganismo, sin embargo se recomienda un diseño de experimentos que permita validar de manera mas acertada los resultados obtenidos por las simulaciones y complementar el modelo de simulación tratando de involucrar las variables mas significativas en el porceso de crecimiento microbiano.. 58.

(59) IQ-2003-2-24. El diseño de experimentos recomendado, sería realizar una serie de fermentación evaluando el comportamiento tanto de oxigeno como la influencia del flujo de aire, para determinar qué tanto afecta la variación de estos parámetros en el crecimiento celular y de esta forma determinarlos flujos de alimentación continua que favorezcan mas la producción. Por otro lado,. la simulación podría ser modificada utilizando modelos de. crecimiento celular mas complejos que el modelo de Monod,. tales como la. implementación del modelo de Hump como lo proponen Cunha y Souto4 donde se realiza la simulación utilizando simultáneamente los dos modelos.. 4. [1]. 59.

(60) IQ-2003-2-24. BIBLIOGRAFIA. [1] Cuhna C.C.F. , Souto Maior A.M., Souza M.B., Simulation investigations towards the development of a Bacterial Biopesticide Fed-Batch Reactor, Brazilian J. of Chem Eng., 15, No.1, 39 (1998). [2] Cuhna C.C.F. , Souza M.B. , Comparison of Biomass Estimation Thechniques for a Bacillus thuringiensis Fed-Batch Culture, Brazilian J. of Chem Eng., 18, No. 1, 35 (2001). [3]. Delgado M.A. , Produccion de Bacillus thuringiensis subesp kurstaki por la. metodología en Fed-Batch discontinuo con membrana de flujo tangencial, Proyecto de Grado, Universidad de los Andes, 2002.. [4]. DE LIÑÁN, C. 2001. Vademécum de productos fitosanitarios y nutricionales.. Ediciones Agrotécnicas S.L., Madrid. 670 pp.. http://www.futureco.net/img-. ct/publicacions/Phytoma%20n%BA141-2002-BIOPESTICIDAS.pdf. [5] Gonzalez A., Restrepo A., Orduz S., Producción de Bacillus thuringiensis cap. V, ed. Phytoma, Universidad Pública de Navarra, España, (2001). [6]. Kang B.C., Lee S.Y., Chang H.N., Enhanced Spore Production of Bacillus. thuringiensis by Fed-Batch Culture, Biotech. Lett., 14, No. 8, 721 (1992). 60.

(61) IQ-2003-2-24. [7] Kuppusamy M. , Balaraman K. , Fed-Batch Fermentation studies with Bacillus thuringiensis H-14 synthesising delta endotoxin, Indian J. of Exper. Biology, 29, 1031, (1991). [8]. REALPE, M., MONTOYA D., ORDUZ, S. 1998. Bacillus thuringiensis: legado. para el siglo XXI.Revista Colombiana de Biotecnología, 1: 11-27. [9]. Sevella B. , Bertalan G. , Development of a MATLAB based bioprocess. simulation tool, Bioprocess Eng. 23, 621, (2000). [10] Shuler M., Bioprocess Engineering Basic Concepts, cap. 6, 9, Prentice Hall, New Jersey, 1992. [11]. Vallejo F., Gonzalez A., Posada a., Restrepo A., Orduz S., Production of. Bacillus thuringiensis by Batch and Fed-Batch Culture, Biotechnol. Lett 13, 279, (1999). [12]. Yang X.M. , Wang S.S. , Development of Bacillus thuringiensis fermentation. process control from a practical perspective, Biotechnol. Appl. Biochem.,28, 95, (1998). 61.

(62) IQ-2003-2-24. ANEXOS. Anexo A. Composición Medio de Cultivo. El medio de cultivo para las fermentaciones realizadas está compuesto por:. Glucosa anhidra. 8 g/L. Extracto de levadura. 8 g/L. Fosfato monobásico de potasio. 3 g/L. Fosfato bibásico de potasio. 3 g/L. Sulfato de amonio. 1 g/L. Cloruro de calcio. 0.41 g/L. Sulfato de magnesio. 4 g/L. Para el procedimiento de autoclave es necesario separar los componentes en las siguientes proporciones:. Volumen Total % Glucosa anhidra. 10. Sulfato de magnesio. 10. Otros. 80. 62.

(63) IQ-2003-2-24. Anexo B. Descripción Métodos de Análisis. Determinación de Biomasa. Para la determinación de biomasa se utilizo el procedimiento de peso seco el cual se describe a continuación:. 1. Se llevan al horno 2 eppendorfs por cada muestra durante 4 horas a 121 °C, posteriormente se llevan al desecador para que lleguen a la temperatura ambiente. 2. Con guantes de látex se pesa cada uno de los recipientes en la balanza analítica y se anota el peso de cada uno de ellos. 3. Se toma 1 mL de cada muestra previamente agitada en cada recipiente y se centrifuga durante 10 minutes a 10000 rpm. 4. Se confirma que el sobrenadante se encuentre separado de la biomasa (botton), de lo contrario centrifugar de nuevo. 5. Descartar el sobrenadante del botton. 6. Resuspender el botton con 1mL de agua destilada y centrifugar bajo las mismas condiciones. 7. Repetir el paso anterior y luego descartar el sobrenadante. 8. Llevar al horno los recipientes con el botton durante 2 horas a 121°C 9. Llevar al desecador hasta que alcance temperatura ambiente aprx. 2 horas 10. Pesar nuevamente en balanza analítica con guantes de látex 11. Obtener la diferencia entre el peso final y el inicial siendo este el valor de biomasa presente en la muestra en g/mL. 63.

(64) IQ-2003-2-24. Determinación de Azucares. En el caso de la glucosa (sustrato) la determinación en las muestra se realizó por el método DNS basado en la colorimetría del ácido Di-nitro-salicílico, el cual en presencia de azucares reductores (glucosa) se reduce en 3-amino, 5-nitrosalicílico que presenta un color naranja oscuro. La intensidad del color obtenido es proporcional a la cantidad de glucosa en la solución, por lo tanto se utiliza un espectrofotómetro para medir la absorbancia de cada muestra y con una debida curva de calibración, se obtiene la cantidad de azúcar presente en ella.. • Preparación de la solución estándar de DNS. 1. Se mezclan y disuelven los siguientes componentes: · Agua destilada:1416 mL · Ácido Di-nitro-salicílico: 3,510.6 g · NaOH :19.8 gr. 2. Se agrega: · Tartato de sodio y potasio (sal de Rochelle): 306 g · Fenol: 7.6 mL · Metabisulfito de sodio:8.3 g. Se almacena la anterior solución a temperatura ambiente por una semana antes de su uso. Para usar la solución DNS, adicionar 210 µL de una solución de glucosa 0.1 M, para 100 mL de DNS el día que se va a usar.. 64.

(65) IQ-2003-2-24. •. Procedimiento DNS. 1. Se toma 0.25 mL del sobrenadante de cada muestra en un tubo de ensayo. 2. Se lleva a 10 mL con agua destilada. 3. De la solución anterior se toman 2 mL y se añaden 5 mL de solución DNS, además se prepara una muestra blanco con 2 mL de agua destilada. 4. Se llevan los tubos a ebullición en baño maría durante 15 minutos. 5. Se deja enfriar 6. Se realiza la lectura de absorbancia en espectrofotómetro a 600 nm. •. Curva de Calibración. Para la realización de la curva de calibración, se llevo a cabo el procedimiento descrito anteriormente con soluciones conocidas de glucosa.. Concentración Muestra. [µg/mL]. Absorbancia. 1. 0. 0,0857. 2. 45. 0,0814. 3. 90. 0,0893. 4. 135. 0,1187. 5. 180. 0,1757. 6. 225. 0,275. 7. 270. 0,3437. 8. 450. 0,4761. 9. 630. 1,1071. 10. 900. 1,4817. Tabla 14. Datos curva de calibración DNS. 65.

(66) IQ-2003-2-24. CURVA DE CALIBRACIÓN 2. Absorbancia. 1,5. Abs = 0.00154*Con 1. R2 = 0.9563. 0,5. 0 0. 200. 400. 600. 800. 1000. Concentración [mg/ml]. Figura 28. Curva de calibración DNS. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Procedimiento:. 1. Preparación del gel 10% para mL del gel: · Agua bidestilada: 2 mL · Tris-HCl 1.5 M pH 8.8: 1.25 mL · SDS 10% (w/v): 50 µL. 2. Solución Acrilamida/Bisacrilamida al 30%: · Persulfato de Amonio al 10%: 1.6666 mL · Temed: 10 µL Se coloca en las laminas de vidrio. 66.

(67) IQ-2003-2-24. 3. Stakin Gel al 4% para un volumen de 2.5 mL: · Agua bidestilada: 1.6 mL · Tris –HCl 0.5 M, pH 6.8: 625 µL · SDS 10% (w/v) : 25 µL · Acrilamida (30 gr) + Bisacrilamida (1.6 gr) :375 µL · Persulfato de amonio 10% : 21µL · Temed : 28 µL. Se coloca encima del gel anterior, con la peineta para formar los pozos, esperar 30 minutos hasta que el gel endurezca.. 4. Buffer de la muestra: · Agua deshionizada: 3.8 mL · Tris de HCl 0.5 M, pH 6.5: 10 mL · Glycérol :0.8 mL · SDS 10% (w/v) : 1.6 mL · 2 mercaptoetanol : 0.4 mL · Azul de bromo fenol 1% (w/v):0.4 mLs. Diluir la muestra 1:4 con el buffer de la muestra y calentar a 95ºC por 4 minutos. 6. Buffer de corrida · Glicina: 14.4 g · Trizma base: 3.03 g · SDS al 20%: 5mLs · Se completa con agua deshionizada: hasta 1000 mL. 67.

(68) IQ-2003-2-24. Aplicar en los pozos las muestras y los patrones y el buffer de corrida, tapar la cámara y colocar los electrodos en 18 mA constantes hasta que el buffer llegue a l parte inferior de la lámina. 7. Fijación de las proteínas. Una vez terminada la electroforesis, se sumerge los vidrios con el gel durante 5 minutos en la solución de fijado. · Metano: 25 mL · Agua: 75 mL · Ácido acético: 7 mL. Luego con la ayuda de una micro espátula se despega el gel y se deja en la tinción una hora.. 8. Tinción de las proteínas con Azul de comassie al 0.2%. Después de la fijación, se sumerge el gel en la solución de azul de comassie de 0.2% durante ½ hora. · Azul de comassie: 0.2 gr. · Metanol: 50 mL · Ácido acético glacial 5 mL · Se completa con agua hasta 1000 mL.. 9. Decoloración del Gel. Se sumerge el gel en solución de ácido acético al 10% y 30% de metanol. Cambiar la solución 3 o 4 veces hasta obtener una buena coloración.. 10. Patrones estándares utilizados en la electroforesis: Bio-rad. Broad Range, Catalog 161-0.318, control 81623. 68.

(69) IQ-2003-2-24. Anexo C. Archivos Simulación. Archivo “Prueba”: %Descripción Variables Globales% global F global Flu global Flu1 global Flu2 global y global Y global y1 %Pregunta al usuario por los valores del flujo de alimentación y se le asignan a las variables Flu,Flu1 y Flu2% Flu=input('Ingrese el valor del Flujo de Alimentacion en L/h:\n'); Flu1=input('Ingrese el valor del Flujo2 de Alimentacion en L/h:\n'); Flu2=input('Ingrese el valor del Flujo3 de Alimentacion en L/h:\n'); %Definición del vector Flujo% F(1:5)=0; F(6:12)=Flu; F(13:21)=Flu1; F(22:31)=Flu2; F(32:34)=0; %Definición vector valores iniciales% y0(1)=2; y0(2)=0.01; y0(3)=8; y0=y0'; %Definición vector tiempo para flujo =0 (hora 0-5) % t1=[0:0.25:5]; %Primera resolución sistema de ecuaciones% [T1,y]=ode45('ode1tres',t1,y0); %Asignación a variables a,b y c de los valores finales de la solución del sistema de ecuaciones% a=y(21); b=y(42); c=y(63); y1=y; %Definición del nuevo vector de valores iniciales% y0=[a,b,c]; %Definición del nuevo vector tiempo para flujo = Flu (hora 5-11)% t2=[5:0.25:11]; %Segunda resolución sistema de ecuaciones% [T2,y]=ode45('ode2tres',t2,y0); %A continuación se realiza la misma asignación de valores y tiempos para cada uno de los flujos y tiempos correspondientes% a=y(25); b=y(50);. 69.

(70) IQ-2003-2-24. c=y(75); y2=y; y0=[a,b,c]; t3=[11:0.25:19]; [T3,y]=ode45('ode3tres',t3,y0); a=y(33); b=y(66); c=y(99); y3=y; y0=[a,b,c]; t4=[19:0.25:27.75]; [T4,y]=ode45('ode4tres',t4,y0); a=y(36);. 70.

(71) IQ-2003-2-24. Archivo “Solución”: %Nombre de la función% function ydot = ode1(t1,y0) global F global Flu global y %Definición de constantes% mumax=0.36275; ks=9.115; sf=0; yxs=0.485692; %Definición de ecuaciones% mu=(mumax*y0(3))/(ks+y(3)); D=F(1)/y0(1); %Definición sistema de ecuaciones diferenciales% ydot(1)= D*y(1); ydot(2)= (mu-D)*y(2); ydot(3)= (D*(sf-y(3)))-((mu/yxs)*y(2)); ydot=ydot';. 71.

(72) IQ-2003-2-24. Anexo D. Equipos Utilizados. Figura 31. Horno. Figura 29. Balanza analítica. Figura 32. Desecador. Figura 30. Centrífuga. 72.

(73) IQ-2003-2-24. Figura 33. Autoclave. Figura 34. Plancha de calentamiento. Figura 35. Espectrofotómetro. 73.

(74) IQ-2003-2-24. Anexo E.. Resultados Simulaciones Realizadas en MatLab. Las unidades manejadas en las tablas que se presentan a continuación son las siguientes:. Volumen:. [L]. Biomasa:. [g/L]. Sustrato:. [g/L]. 74.

(75) IQ-2003-2-24. Simulación No. 1 Volumen 3 3 3. [Biomasa] 0,01 0,22035781 0,41932714. [Sustrato] 8 7,56689052 7,15722898. Volumen 3,39411255 3,40954542 3,42490876. [Biomasa] 3,41458918 3,44129874 3,46763791. 75. [Sustrato] 1,88660569 1,86671367 1,84742607. Volumen 3,87104637 3,87104637 3,87104637. [Biomasa] 4,43391703 4,45312238 4,47145765. [Sustrato] 0,87263884 0,83309658 0,79534577.

(76) IQ-2003-2-24. Simulación No.2 Volumen [Biomasa] [Sustrato] 2 0,01 8 2 0,17799029 7,65412176 2 0,33871756 7,32319749 2 0,49249583 7,00658065 2 0,63962551 6,7036527 2 0,78039409 6,41382174 2 0,91507656 6,13652158 2 1,04393607 5,87121041 2 1,16722436 5,61736994 2 1,28518232 5,37450418 2 1,39804038 5,14213869 2 1,50601906 4,91981944 2 1,60932929 4,70711214 2 1,70817294 4,50360118 2 1,80274309 4,30888899 2 1,89322454 4,12259511 2 1,97979403 3,94435563 2 2,06262071 3,77382228 2 2,1418664 3,61066191 2 2,21768592 3,45455572 2 2,29022739 3,30519879 Inicio Alimentación No.1: 0,035L/h 2,00873094 2,32955932 3,26735786 2,0174241 2,3685241 3,2300862 2,02607996 2,40712493 3,19337956 2,03469899 2,44536508 3,15723359 2,04328167 2,48324787 3,12164375 2,05182845 2,52077667 3,08660536 2,06033978 2,5579549 3,0521136 2,06881609 2,594786 3,01816352 2,07725781 2,63127344 2,9847501 2,08566536 2,66742075 2,95186817 2,09403916 2,70323146 2,91951248 2,1023796 2,73870915 2,88767765 2,11068709 2,77385743 2,85635819 2,11896201 2,80867997 2,8255485 2,12720474 2,84318039 2,79524295 2,13541565 2,87736236 2,76543587 2,14359511 2,91122954 2,73612151 2,15174348 2,94478562 2,70729405 2,15986111 2,97803429 2,67894762 2,16794834 3,01097927 2,65107628 2,17600551 3,04362429 2,62367403 2,18403297 3,07597309 2,59673481 2,2 3,13979682 2,54422139. Volumen 2,20794022 2,21585198 2,2237356 2,23159136 2,23941957 2,24722051 2,25499446 2,2627417 2,27046251 2,27815715 2,28582589 2,29346899 2,3010867 2,30867928 2,31624696 2,32379001 2,33130865 2,33880311 2,34627364 2,35372046 2,36114379 2,36854386 2,37592087 2,38327506 2,39060662 2,39791576 2,40520269 2,41246762 2,41971073 2,42693222 2,43413229 2,44131112 2,44846891 2,45560583 2,46272207 2,46981781 2,47689322 2,48394847 2,49098374 2,4979992 2,50499501 2,51197134 2,51892834 2,52586619 2,53968502. [Biomasa] 3,17127917 3,2024801 3,23340331 3,26405251 3,29443138 3,32454361 3,35439281 3,38398262 3,41331663 3,44239844 3,47123163 3,49981975 3,52816636 3,55627494 3,58414895 3,61179184 3,63920701 3,66639785 3,69336773 3,72011999 3,74665794 3,77298483 3,79910386 3,82501823 3,85073109 3,87624556 3,90156475 3,92669172 3,95162949 3,97638101 4,00094921 4,025337 4,04954722 4,07358273 4,0974463 4,12114071 4,14466864 4,16803277 4,19123572 4,21428007 4,23716838 4,25990318 4,28248696 4,30492215 4,34935633. 76. [Sustrato] 2,51863509 2,4934876 2,46877283 2,44448462 2,42061683 2,3971633 2,37411797 2,35147474 2,32922756 2,30737035 2,28589706 2,26480164 2,24407805 2,22372033 2,20372259 2,18407894 2,16478356 2,14583062 2,12721434 2,10892896 2,09096879 2,07332823 2,05600173 2,0389838 2,02226897 2,00585184 1,98972703 1,97388924 1,95833323 1,94305387 1,92804608 1,91330484 1,89882518 1,88460217 1,87063095 1,85690672 1,8434248 1,83018056 1,81716946 1,80438698 1,7918287 1,77949022 1,76736721 1,75545544 1,73224909. Volumen [Biomasa] [Sustrato] 2,54656632 4,37135999 1,72094641 2,55342907 4,39322442 1,70983877 2,56027342 4,41495187 1,69892224 2,56709953 4,43654458 1,68819299 2,57390754 4,45800472 1,67764723 2,58069758 4,47933442 1,66728128 Inicio Alimentación No.2: 0,07L/h 2,59422435 4,49417597 1,70332122 2,60768096 4,50958849 1,73784012 2,62106848 4,52554668 1,77089541 2,63438797 4,54202646 1,80254182 2,64764046 4,55900492 1,83283161 2,66082694 4,57646022 1,86181465 2,67394839 4,59437154 1,88953864 2,68700577 4,61271899 1,91604919 2,7 4,63148361 1,94138994 2,71293199 4,65064726 1,9656027 2,72580263 4,67019259 1,98872755 2,73861279 4,69010301 2,01080289 2,7513633 4,71036264 2,03186561 2,76405499 4,73095626 2,05195109 2,77668868 4,75186929 2,07109333 2,78926514 4,77308774 2,08932501 2,80178515 4,79459819 2,10667753 2,81424946 4,81638778 2,12318113 2,82665881 4,83844412 2,13886488 Fin Alimentación 2,82665881 4,88238287 2,04839859 2,82665881 4,92479227 1,96108113 2,82665881 4,96570259 1,87685013 2,82665881 5,00514499 1,79564146 2,82665881 5,04315138 1,71738942 2,82665881 5,07975435 1,6420269 2,82665881 5,11498709 1,56948559 2,82665881 5,14888325 1,49969617 2,82665881 5,18147692 1,43258848 2,82665881 5,21280246 1,36809176 2,82665881 5,24289447 1,30613477 2,82665881 5,27178769 1,24664601 2,82665881 5,29951687 1,18955389 2,82665881 5,32611677 1,13478689 2,82665881 5,351622 1,08227372 2,82665881 5,376067 1,03194347 2,82665881 5,39948595 0,98372576.