BlOMEDlCA
Vol. 4, No. 2 - 1984
UTILIZACION DE LOS HIDRATOS DE CARBONO
EN LA IDENTIFICACION DE MYCOBACTERIA DE
CRECIMIENTO RAPIDO
MAYE BERNAL R., * LUIS CARLOS OROZCO V. **
Se realizó un estudio para evaluar la prueba de los hidratos de carbono en la identificación de microorganismos del genero Mycobacterium de crecimiento rápido. Se encontró que este tipo de pruebas puede ser fhcilmente utilizable estandarizando el procedimiento mediante el cultivo sobre el medio de Tsukamura adicionado I del hidrato de
carbono correspondiente usando como indicador de pH, el indicador de Andrade, una temperatura de incubación de 37OC y un inóculo de 0 2
ml de una suspensión de aproximadamente 1 g de masa bacilar por ml.
INTRODUCCION Medios de Cultivo:
Lautilizacidn de los hidratos de carbono
y l a formación d e ácido a p a r t i r d e los mismos ha sido extensamente usada en la identificación d e microorganismos, particularmente e n aquellos d e r á p i d o crecimiento, como las enterobacterias (1).
Sin embargo, e s t e tipo d e p r u e b a s no ha
sido evaluado suficientemente e n e l diagnóstico d e los microorganismos d e l género Mycobacteriurn. El presente trabajo fue realizado con e l objeto d e e x p l o r a r l a utilización d e e s t a s p r u e b a s e n n u e s t r o medio, normalizar una técnica reproducible
y e v a l u a r un a d e c u a d o medio d e cultivo p a r a microorganismos d e l género
Mycobacteriurn de crecimiento rápido. MATERIALES Y METODOS
Cepas:
Se seleccionaron q u i n c e c e p a s d e Mycobacteriurn de crecimiento rápido, del c e p a r i o del Grupo d e M i c o b a c t e r i a s d e l Instituto Nacional de Salud.
Se seleccionó e l medio básico d e Tsukamura (2) y se utilizaron dos tipos de i n d i c a d o r e s : el a z u l d e bromotimol, recomendado por T s u k a m u r a y e l d e Andrade recomendado por nosotros.
Hidratos de Carbono:
Se utilizaron doce h i d r a t o s d e c a r b o n o (arabinosa, dulcitol, fructosa, galactosa, glucosa, inositol, manitol, ramnosa, sorbitol, s u c r o s a , t r e a l o s a y xilosa), obtenidos comercialmente (Difco, BBL, Merck y Sigma).
C a d a u n a d e l a s c e p a s d e l estudio s e cultivb e n medio d e Lowenstein Tensen; después de una incubación de 8 días, la cepa se emulsionó en solución salina fisiológica y
s e dió a l a suspensión u n a t u r b i d e z i g u a l al tubo No. 3 de la escala de McFarland. De c a d a u n a d e e s t a s suspensiones s e tomó con pipeta u n a c a n t i d a d d e 0,2 m1 y s e depositó sobre la superficie inclinada del medio que contenía el hidrato de carbono.
*
Bacterióloga, Grupo de Micobacterias, Instituto Nacional de Salud.. . .
UTlLlZAClON D E LOS HIDRATOS DE CARBONO EN LA IDENTlFlCAClON DE MYCOBACTERIAEste medio e s t á c o n s ituído según utilizándose d e c a d a u n a d e e l l a s v a r i a s formulación de Tsukamura
!
2) así: c e p a s p a r a d e t e r m i n a r si el p a t r ó n de utilización de los hidratos de carbono. . . .
(NH4) 2 SO4 2,65 g era reproducible. Para precisar si la
densidad del inóculo influía en la utili-
KH2 PO4 . . . 0,s g zación del hidrato de carbono se hicieron experimentos utilizando e n unos u n a
MgS04 7 H 2 0 . . . 0,s g concentración de 1 g de masa bacilar
por m1 que corresponde al patrón No. 3 de
. . . . .
Extracto de levadura
M c F a r l a n d y e n otros u n a c o n c e n t r a c i ó n
Agar . . . 2 0 g de 10 g que corresponde al tubo No. 10.
A ~ u l de bromotimol 0,2 o / o (p/v) Igualmente, s e utilizó incubación a
en NaOH 0,02M . . . 2 0 m1 d i f e r e n t e s t e m p e r a t u r a s con e l fin d e
determinar la temperatura óptima; algunos
Agua destilada . . . 9 8 0 ni1 experimentos fueron i n c u b a d o s a 3 0 ° C y
otros a 37°C: también se utilizaron dos t i ~ o s Para algunos experimentos se utilizó, en
vez de azul de bromotimol, el indicador de Andrade en la misma forma que se utiliza en el estudio de las enterobacterias, según lo recomendado por Ewing (3).
P a r a p r e p a r a r e l medio s e mezclaron todos los componentes, a j u s t a n d o s u s cantidades al número de litros requeridos, se disolvieron por calentamiento teniendo cuidado de agitar constantemente. El pH fue ajustado a 7,O con NaOH 1N y luego se distribuyó en fiolas en cantidades de 200 ml, l a s c u a l e s s e esterilizaron a 1 5 l i b r a s d e presión por 30 minutos, manteniéndose posteriormente en baño maría a 8OoC, para adicionarles el h i d r a t o d e c a r b o n o correspondiente, a una concentración final d e 0,5°/o ( p / v ) ; el pH fue nuevamente ajustado a 7 , O con NaOH 1N. Finalmente, se distribuyó en tubos de ensayo de tapa-rosca d e 1 3 X 100, en c a n t i d a d e s d e 6 m1 y s e esterilizó nuevamente a 10 libras de presión por 10 minutos, luego de lo cual se colocaron
de indicadores en unos se utilizó el indicador de Andrade y en otros se utilizó el azul de bromotimol. Las lecturas se realizaron a los 15 y 20 días de incubación.
RESULTADOS
Cada u n a d e l a s especies e s t u d i a d a s mostró un patrón de producción de ácido a partir de los hidratos de carbono específico y reproducible, lo cual permite su identifi- cación. En l a t a b l a No. 1 s e m u e s t r a un ejemplo de dos de las cepas patrbn incluídas en este estudio: estos datos son coincidentes - - - - con los hallazgos d e o t r o s a u t o r e s , como puede verse en la tabla No. 2 (2, 4-9). No se observó ninguna diferencia cuando s e utilizó un inóculo de 1 g o de 10 g de masa bacilar por ml. No se observó tampoco diferencia consistente cuando se incubó a 30°C 6 37°C. La tabla No. 3 muestra claramente que la reproducibilidad del t e s t e s mayor con e l indicador de Andrade (indicador 1) que con el azul de bromotimol (indicador 2).
e n posición inclinada p a r a d e j a r l o s
solidificar. El medio a s í p r e p a r a d o fue El análisis global del resultado del estudio conservado a 4 ° C hasta su utilización. demuestra que se debe utilizar un inóculo aue c o r r e s ~ o n d a a 1 n de masa bacilar Dor Con el objeto de buscar las condiciones ml, Una temperatura
&!
incubación de3i0c
d e e s t a n d a r i z a c i ó n , s e s e l e c c i o n a r o n l a s por facilidad práctica y como indicador de siguientes especies de Mycobacteria: pH, el indicador de Andrade.M chelonei DISCUSION
M diernhoferi
M fortuitum Los estudios de fisiología bacteriana han
id phlei demostrado que las micobacterias pueden
MAYE BERNAL R., LUIS CARLOS OROZCO V .
TABLA No l . PRUEBAS DE H l DRATOS DE CARBONO EN L A IDENTI F l CACION DE M I
-
COBACTERI A S . 1-
M:
p u,
2 - M. vaccae1'
TABLA No 2 . Identificación de Mycobacteria por pruebas de Hidratos de Carbono.
1 2 3 4 5 6 7 8
+
lndica que el 100 o/o de las cepas probadas producen ácido. V lndica que el 50 o/o de las cepas probadas producen ácido. - lndica que el 100 o/o de las cepas probadas no producen ácido.Los números indican el porcentaje de cepas probadas que producen ácido. Arabi-
noca
1 2
t t
t t
t t -
-t t -
-t -t t t t t Dulci- tol 1 2
- -
- - ' t t
t t -
-- --
- -
- - Fruc tosa 1 2 t t t t t t t t t t t t t t Galac- tosa 1 2 f t t t t t t t t t t t t t t + GIg cosa 1 2 t t t t t t t t t t t t t t t t Inosi- tol 1 2 - t t- +
- +
- t - t - t - t 1 2 t t + t t + t t t t t t t t t t Ramnq sa 1 2 - t - t - t - t- +
- t- +
- +
Sorbi- tol 1 2 t t t t + t t t t t t t t t t tS u c r ~ sa 1 2 - t - t
- +
- +
- +
- t - t - t Trea- losa 1 2 + t t t t t t t t t t t+ +
t t Xilosa 1 2 t t t t t t t t t t t t t t t t m(UTlLlZAClON D E LOS HIDRATOS D E CARBONO E N LA IDENTlFlCAClON DE MYCOBACTERIA
.
..
. .
TABLA N2 3 Porcentaje de reproducibilidod de los pruebas de Hidro- tos de Carbono en las cepos estudiadas.
I lndicodor de Andrade 2 lndlcodar de Azul de Bromollmol
carbono a t r a v é s de un complejo equipo enzimático y metabolizarlos, h a s t a un metabolito intermediario: el p i ruvato.
Sin embargo, la manera como los azúcares son transportados del exterior al interior de l a s micobacterias, no e s t á c l a r a m e n t e establecido y no existe mucha información al respecto. El sistema de traslocación para la toma de los a z ú c a r e s q u e involucran un sistema de fosf oenol-p i ruvato dependiente de la fosforilación del hidrato de carbono ha sido ciertamente demostrado en algunos procariotes pero este proceso no ocurre en
M. srnegrnatis y probablemente tampoco en o t r a s micobacterias (10). Esto se debe probablemente a que el sistema fosfoenol- pi ruvato dependiente está confinado a los anaerobios facultativos y a los anaerobios estrictos, los cuales poseen un sistema glicolítico anaeróbico (11). Estos investiga- dores han demostrado que el M. srnegrnatis posee un sistema constitutivo para la toma de la glucosa y puede s e r inhibido por e l dinitrofenol y la azida. Para la toma de la fructosa, el microorganismo posee un sistema inducible o adautativo, e n o t r a s
pueden utilizar numerosos hexoles y
hexosas. El M. srnegmatis crece más rápida- mente sobre fructosa, manosa y manitol que sobre glucosa (12). La micobacteriología en la actualidad busca obtener la identificación exacta de l a s especies del género p a r a lo cual es necesario utilizar una g r a n variedad de p r u e b a s de tipo bioquímico. Las p r u e b a s de hidratos d e carbono han sido usadas desde los inicios de la bacteriología, habiendo tenido su máxima utilidad en el estudio de las enterobacterias
( l ) , en donde ha permitido la c l a r a
definición de l a s distintas especies q u e integran la familia Enterobacteriaceae.
En el estudio de la micobacteriología en nuestro medio, estas pruebas no han sido lo suficientemente evaluadas y normalizadas como p a r a introducirlas d e rutina. Los resultados del trabajo preliminar a q u í presentados, nos permiten predecir q u e adecuadamente e s t a n d a r i z a d a s , pueden tener gran utilidad en la identificación de especies. El medio recomendado por Tsukamura (2) que empleamos como medio básico, permite un buen desarrollo de las especies estudiadas; el indicador de Andrade por su gran sensibilidad, permite una fácil lectura (Fig. No. 1); a d e m á s de que detecta más rápidamente el cambio de pH, no permite su reversión y e s menos costoso (3); es por lo tanto, el indicador que recomenklamos utilizar. La lectura de las
palabras, un sistema que se aumenta cuando
se cultiva el microorganismo sobre fructosa, Figura No. 1. Muestra una prueba de utilización de
hidratos de carbono. La prueba superior utilizando
Además de utilizar un g r a n núme,$o de azul de bromotimol y la inferior utilizando el indicador
M A Y E BERNAL R.. LUIS CARLOS OROZCO V.
pruebas en el día 20 p e r m i t e d e f i n i r a q u e l l a s
l e c t u r a s q u e f u e r o n débiles e n la l e c t u r a
i n i c i a l , hecha a l o s 15 días de i n c u b a c i ó n . D u r a n t e la r e a l i z a c i ó n de los e x p e r i m e n t o s
se e n c o n t r ó q u e es i m p o r t a n t e q u e la
suspensión del m i c r o o r g a n i s m o en e s t u d i o
sea hecha en una s o l u c i ó n s a l i n a b u f f e r de pH 7,O y a q u e si este p H n o es controlado
p u e d e f a l s e a r los resultados. Sería
c o n v e n i e n t e , p a r t i e n d o de la e s t a n d a r i z a c i ó n
aquí p r o p u e s t a , r e a l i z a r un estudio posterior
c o n un número e x t e n s o de cepas p a r a d e f i n i r
el p o r c e n t a j e de p o s i t i v i d a d o n e g a t i v i d a d
de p r o d u c c i ó n de Bcido a p a r t i r del hidrato
de carbono p o r p a r t e de cada una de ellas.
SUMMARY
A n e s p e r i m e n t a l s t u d y t o evalute the
c a r b o - h y d r a t e test in the i d e n t i f i c a t i o n of rapid g r o w i n g m i c r o o r g a n i m s f r o m g e n u s M y c o b a c t e r i u m was p e r f o m e d . It was f o u n d
t h a t this k i n d o f tests a r e v e r y u s e f u l s t a n d a r i z i n g t h e p r o c e d u r e b y c u l t u r i n g
the m i c r o o r g a n i m s o n T s u k a m u r a medium
a d d i n g t o this the r e s p e c t i v e c a r b o - h y d r a t e ;
a s p H i n d i c a t o r A n d r a d e ' s i n d i c a t o r w a s
f o u n d as the m o s t c o n v e n i e n t ; the o p t i m a l i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e w a s 3 7 " C , the
r e a d i n g of the tests was best p e r f o m e d o n
the 2 0 t h d a y o f i n c u b a t i o n g i v e n a s h a r p
r e s u l t ; i t also w a s f o u n d t h a t 1 g / m l o f b a c i l a r y m a s s was optimal i n o c u l u m .
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