Aplicación de la técnica FISH para el diagnóstico molecular de las enfermedades de origen genético. Dr. C. Luis A. Méndez Rosado Investigador Titular

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Aplicación de la técnica FISH

para el diagnóstico molecular

de las enfermedades de

origen genético.

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Detecta hasta 5 Mb

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FISH

Fluorescence In Situ

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La hibridación in situ (ISH) es una tecnología para el examen y localización de secuencias específicas de ácidos nucleicos (< 5 mb) ya sea en células en interfase, cromosomas o tejidos. En 1969 Joe Gall and Mary Lou usaron la hibridación DNA-RNA para localizar los genes que codifican para el RNA ribosomal en los cromosomas acrocéntricos. Primer paso importante.

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Que es una sonda?

Secuencia de nucleótidos marcada con

fluorocromos que se unen a un sitio del ADN, que necesitamos identificar.

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Microscopio y software adecuado

Microscopio con lámpara de mercurio y un sistema de filtros que permiten pasar

diferentes longitudes de onda de la luz.

Software para el procesamiento de las imágenes captadas ( Cytovision,

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Filtro barrera o de emisión Filtro de excitación Espejo dicroico Muestra 100x PlanApo

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Proceso de captura de la imagen

Usando un filtro específico para cada

fluorocromo, se van capturando

imágenes crudas, que el software

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Las sondas de FISH son altamente específicas para su secuencia blanco en el ADN y por tal

motivo se clasifican en:

Sondas de secuencias repetitivas del ADN.

Sondas de secuencias únicas .

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Cada sonda debe ser utilizada para

cumplir objetivos diferentes

Sondas de secuencias repetitivas

Es utilizada para el marcaje de los

centrómeros, zonas teloméricas, regiones de heterocromatina constitutiva.

Es de utilidad tanto en cromosomas como en células en interfase, para la detección de aneuploidias, translocaciones,

deleciones o duplicaciones de estas regiones, que involucran la

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Y

X 18

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Sondas locus específicas

Son utilizadas para la identificación de las regiones dianas en el cromosoma. Cada secuencia de nucleótidos de estas sondas hibrida para un gen o grupo de genes.

Son de utilidad en la identificación de

aneuploidías, duplicaciones, deleciones y translocaciones que impliquen la región diana. Se utilizan mayormente en

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Secuencia Única TTAGGG 3 a 20 kb Secuencia Subtelomérica q22.13-q22.2 21

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Sondas LSI utilizadas en

onco-hematológia

Tomando en cuenta secuencias del ADN implicadas frecuentemente en eventos de ruptura-reunión (en enfermedades

malignas), se han diseñado diferentes sondas que llevan implícitas los genes cercanos a los puntos de ruptura Ej: la

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Color Dual, Break-apart Normal Anormal 1R1V1A 2A inv(16)(p13q22) Normal Anormal 1R1V1A 2R2V

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Sondas LSI que detectan amplificación o poliploidías de genes

Útiles en la detección de la progresión de las enfermedades malignas

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Tinción completa del

cromosoma.

. Sky o M- FISH

Hibridizan el cromosoma entero, son útiles en el estudio de cromosomas marcadores, translocaciones y aneuploidias en células en metafase. No se deben usar en células en interfase, donde la cromatina esta

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Y

X

Fluorocromo

Multi-FISH o SKY

Se mezclan 5 fluorocromos en proporciones diferentes, obteniéndose diferentes matices de grises, que el software le otorga

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Rx- FISH

Provee una mejor resolución por set

haploide en los cromosomas humanos. Cada segmento del cromosoma se

colorea con una tonalidad diferente, lo que permite detectar aberraciones no solo

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CGH

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Se emplea cuando se

desconoce la secuencia diana

de ADN que está afectada y

se sospecha que esta es de

pequeño tamaño, solo es útil

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Su empleo comenzó con el estudio de

células tumorales, los resultados

obtenidos pueden identificar

previamente regiones desconocidas

involucradas en la progresión del

cáncer y el estudio de genes

candidatos .

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Para detectar pequeñas regiones de

ganancias o de pérdidas de ADN es utilizado un programa computarizado medidor de la

intensidad relativa de fluorescencia, detecta la variación sistemática del patrón de colores entre el rojo y el verde creando un modelo

estadístico, el cual es empleado como

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La sonda PW-A

Marcaje del cromosoma 15

q 11 q 13

Centrómero

q12

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Diagrama del marcador

q12 cen cen q12 INV DUP 15 q11-q13

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Aplicaciones del FISH

Detección de diferentes aneuploidias cromosómicas en diagnóstico prenatal o el diagnóstico preimplantación

Determinar el origen de un cromosoma marcador o en anillo.

Diagnóstico e investigaciones de enfermedades malignas.

Estudios de retraso mental asociados a regiones cripticas

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CONCLUSIONES

Con la aplicación de todas estas

técnicas la citogenética ha

avanzado, no tan solo en el

diagnóstico de aberraciones

cromosómicas si no también en

el campo de las investigaciones

básicas, ampliándose mucho

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Impacto

La mayor revolución que se produce

al introducir el FISH en nuestro medio

es que da la posibilidad de realizar el

diagnóstico de la enfermedad o

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Figure

Actualización...

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