Aplicación de la técnica FISH
para el diagnóstico molecular
de las enfermedades de
origen genético.
Detecta hasta 5 Mb
FISH
•Fluorescence In Situ
La hibridación in situ (ISH) es una tecnología para el examen y localización de secuencias específicas de ácidos nucleicos (< 5 mb) ya sea en células en interfase, cromosomas o tejidos. En 1969 Joe Gall and Mary Lou usaron la hibridación DNA-RNA para localizar los genes que codifican para el RNA ribosomal en los cromosomas acrocéntricos. Primer paso importante.
Que es una sonda?
Secuencia de nucleótidos marcada con
fluorocromos que se unen a un sitio del ADN, que necesitamos identificar.
Microscopio y software adecuado
Microscopio con lámpara de mercurio y un sistema de filtros que permiten pasar
diferentes longitudes de onda de la luz.
Software para el procesamiento de las imágenes captadas ( Cytovision,
Filtro barrera o de emisión Filtro de excitación Espejo dicroico Muestra 100x PlanApo
Proceso de captura de la imagen
Usando un filtro específico para cada
fluorocromo, se van capturando
imágenes crudas, que el software
Las sondas de FISH son altamente específicas para su secuencia blanco en el ADN y por tal
motivo se clasifican en:
Sondas de secuencias repetitivas del ADN.
Sondas de secuencias únicas .
Cada sonda debe ser utilizada para
cumplir objetivos diferentes
Sondas de secuencias repetitivas
Es utilizada para el marcaje de los
centrómeros, zonas teloméricas, regiones de heterocromatina constitutiva.
Es de utilidad tanto en cromosomas como en células en interfase, para la detección de aneuploidias, translocaciones,
deleciones o duplicaciones de estas regiones, que involucran la
Y
X 18
Sondas locus específicas
Son utilizadas para la identificación de las regiones dianas en el cromosoma. Cada secuencia de nucleótidos de estas sondas hibrida para un gen o grupo de genes.
Son de utilidad en la identificación de
aneuploidías, duplicaciones, deleciones y translocaciones que impliquen la región diana. Se utilizan mayormente en
Secuencia Única TTAGGG 3 a 20 kb Secuencia Subtelomérica q22.13-q22.2 21
Sondas LSI utilizadas en
onco-hematológia
Tomando en cuenta secuencias del ADN implicadas frecuentemente en eventos de ruptura-reunión (en enfermedades
malignas), se han diseñado diferentes sondas que llevan implícitas los genes cercanos a los puntos de ruptura Ej: la
Color Dual, Break-apart Normal Anormal 1R1V1A 2A inv(16)(p13q22) Normal Anormal 1R1V1A 2R2V
Sondas LSI que detectan amplificación o poliploidías de genes
Útiles en la detección de la progresión de las enfermedades malignas
Tinción completa del
cromosoma.
. Sky o M- FISH
Hibridizan el cromosoma entero, son útiles en el estudio de cromosomas marcadores, translocaciones y aneuploidias en células en metafase. No se deben usar en células en interfase, donde la cromatina esta
Y
X
Fluorocromo
Multi-FISH o SKY
Se mezclan 5 fluorocromos en proporciones diferentes, obteniéndose diferentes matices de grises, que el software le otorga
Rx- FISH
Provee una mejor resolución por set
haploide en los cromosomas humanos. Cada segmento del cromosoma se
colorea con una tonalidad diferente, lo que permite detectar aberraciones no solo
CGH
Se emplea cuando se
desconoce la secuencia diana
de ADN que está afectada y
se sospecha que esta es de
pequeño tamaño, solo es útil
Su empleo comenzó con el estudio de
células tumorales, los resultados
obtenidos pueden identificar
previamente regiones desconocidas
involucradas en la progresión del
cáncer y el estudio de genes
candidatos .
Para detectar pequeñas regiones de
ganancias o de pérdidas de ADN es utilizado un programa computarizado medidor de la
intensidad relativa de fluorescencia, detecta la variación sistemática del patrón de colores entre el rojo y el verde creando un modelo
estadístico, el cual es empleado como
La sonda PW-A
Marcaje del cromosoma 15
q 11 q 13
Centrómero
q12
Diagrama del marcador
q12 cen cen q12 INV DUP 15 q11-q13Aplicaciones del FISH
Detección de diferentes aneuploidias cromosómicas en diagnóstico prenatal o el diagnóstico preimplantación
Determinar el origen de un cromosoma marcador o en anillo.
Diagnóstico e investigaciones de enfermedades malignas.
Estudios de retraso mental asociados a regiones cripticas
