ORQUÍDEAS
RESCATE POR GERMINACION IN
VITRO
Carmen Ruíz Bello
José Luis Moreno Martínez
Marisela Guadalupe Salgado Mora
Aída Olivera de los Santos
ORQUÍDEAS
RESCATE POR GERMINACION
IN VITRO
Carmen Ruíz Bello José Luis Moreno Martínez Marisela Guadalupe Salgado Mora
Aída Olivera de los Santos
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS
DIRECTORIO
Mtro. Carlos Eugenio Ruíz Hernández
Rector
Mtro. Hugo Armando Aguilar Aguilar
Secretario General
Mtro. Roberto Sosa Rincón
Secretario Académico
C.P. José Hugo Ruíz Santiago
Encargado de la Secretaría Administrativa Mtro. Luis Iván Camacho Morales
Secretario Auxiliar de Relaciones Interinstitucionales Dr. Lisandro Montesinos Salazar
Director General de Planeación
Dr. Lorenzo Franco Escamirosa Montalvo
Director General de Investigación y Posgrado Lic. Víctor Fabián Rumaya Farrera
Director General de Extensión Universitaria Mtra. Rocío Aguilar Sánchez
Jefa de la Unidad de Divulgación Científica de la Dirección General Investigación y Posgrado
FACULTAD DE CIENCIAS AGRICOLAS
M. C. Carlos Gumaro García Castillo
Director M. C. Miguel Antonio Ramón Castro
Secretario académico Dr. Ricardo Magallanes Cedeño
ORQUÍDEAS. RESCATE POR GERMINACIÓN IN VITRO. D.R. © 2016. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
Boulevard Belisario Domínguez Km. 1081 sin número, Colina Universitaria, Terán, C.P. 29050, Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, México.
D.R. © 2016. Carmen Ruíz Bello, José Luis Moreno Martínez, Marisela Guadalupe Salgado Mora y Aída Olivera de los Santos.
ISBN: 978-607-8459-06-3
Edición:
Dirección General de Investigación y Posgrado - Unidad de Divulgación Científica. Diseño y composición:
Bernardo Olivio Reyes de León y Ernesto de Jesús Pérez Álvarez. Diseño de forros:
Bernardo O. Reyes de León. Formación editorial:
María Beatriz Arévalo Dorry. Imagen de portada:
Carmen Ruíz Bello y José Luis Moreno Martínez.
Primera edición en español, Enero 2016. 200 ejemplares.
Impreso y hecho en México.
Título: Orquídeas. Rescate por germinación in vitro
La presente publicación ha sido evaluada y aprobada por un comité editorial constituido por integrantes de cuerpos académicos consolidados y externos a la institución. Es producto programado del proyecto aprobado a la Dra. Carmen Ruíz Bello con financiamiento UNACH-EXB-149 PROMEP/103.5/11/3666. Otorgado por la Secretaría de Educación Pública.
INDICE
Página
Presentación i
1. Introducción 1
2. Importancia 3
2.1. Importancia económica en México 5
2.2. Importancia ecológica 5
3. Usos potenciales 7
3.1. Plantas de ornato 8
3.2. Usos en la industria 8
3.3. Otros usos 10
4. Recursos forestales no maderables 12
5. Clasificación taxonómica 16
6. Descripción botánica 18
6.1. Hábitat de desarrollo 20
6.1.1. Epífitas 20
6.1.2. Terrestres 21
6.1.3. Litófitas 23
6.2. Tipos de crecimiento 23
6.2.1. Simpodial 23
6.2.2. Monopodial 23
6.2.3. Trepadoras 24
6.2.4. Rastrero 25
7. Pérdida de la biodiversidad 26
8. Propagación de orquídeas 28
8.1. Propagación asexual ó vegetativa 29
8.1.1. División de plantas 30
8.1.2. Tipos de sustratos 31
9. Propagación in vitro 37
10. Propagación in vitro de orquídeas 40
10.1. Propagación asexual ó vegetativa 41 10.2. Propagación sexual ó por semilla 42 10.2.1. Germinación de las semillas in vitro 43
10.2.1.1. Germinación simbiótica 43
10.2.1.2. Germinación asimbiótica 43
11. Cápsulas o frutos de las orquídeas 46
12. Preparación del medio de cultivo in vitro 51
12.1. Preparación de soluciones madre 55
12.2. Condiciones ambientales de los cultivos in vitro 57 12.3. Características del cuarto de crecimiento 57 13. Procedimiento para establecer el cultivo in vitro 58
13.1. Preparación del medio nutritivo 59
13.2. Siembra de las semillas y germinación de las mismas 61 13.3. Formación de protocormos y de hojas 62 13.4. Formación de raíces y crecimiento de las plántulas 63 13.5. Trasvase y separación de plántulas 65
13.6. Adaptación al medio ambiente 66
13.7. Establecimiento de plantas en maceta 69 14. Polinización manual para obtener cápsulas con semillas 70
15. Conservación de orquídeas 73
15.1. Estrategias de conservación in situ y ex situ 75
15.1.1. Conservación in situ 76
15.1.2. Conservación ex situ 76
15.2. Conservación in vitro de tejidos vegetales 79
16. Referencias Bibliográficas 81
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura Título
1 Planta y fruto de vainilla 9
2 Orquídea epífita 13
3 Dos plantas de Encyclia adenocaula en un mismo Hospedero
14
4 “Flor de la Candelaria” (Guarianthe skinneri) Orquídea Epífita
15
5 Partes que componen a una planta de orquídea 19
6 Orquídeas epifitas 21
7 Orquídeas terrestres 22
8 a) crecimiento simpodial, b)crecimiento monopodial 23 9 Vainilla (Vanilla planifolia Andrews)
24 10 Mujeres dividiendo plantas de orquídeas y
estableciéndolas en diferentes sustratos
31
11 Diferentes tipos de sustratos que se pueden utilizar para establecer los fragmentos de las plantas
32
12 Orquídea en tronco de Yaite (Gliricidia sepium) 33 13 a) Fruto de orquídea, b) Semillas de orquídea 34 14 Cápsulas (frutos) con semillas de Encyclia
adenocaula. Planta en su hospedero principal (Quercus sp) en condiciones naturales
35
15 Meristemo de la planta. (Se señala con el bisturí un meristemo de la planta)
41
17 Semillas de orquídeas vistas con microscopio 44
18 Cápsulas (frutos) de orquídeas 47
19 Cápsulas de orquídeas 48
20 Cápsulas de Encyclia adenocaula 50
21A Selección y Preparación de los medios de cultivo in vitro
59
21B Selección y Preparación de los medios de cultivo in vitro
60
22 Secuenciación de la disección de la cápsula, siembra y germinación de las semillas (in vitro)
61
23 Formación de protocormos, desarrollo de las hojas 63 24 Formación de raíces, crecimiento de plántulas 64 25 Plántulas de orquídeas, provenientes de semillas
germinadas in vitro
65
26 Trasvase de plántulas 66
27 Plántulas en proceso de adaptación en el invernadero 67 28 Plantas sembradas en macetas adaptadas al medio
ambiente (Encyclia adenocaula)
69
29 A) Ubicación del polen; B) Ubicación del gineceo 71 30 Fruto ó cápsula producto de la fecundación 72
31 Conservación in situ 78
32 Conservación ex situ 78
INDICE DE CUADRO
Cuadro Título Página
1 Medio Murashige y Skoog (1962) (MS) 54
PRESENTACIÓN
La presente publicación, es con la finalidad de informar acerca de las orquídeas: esta preciada familia de plantas monocotiledóneas. Asimismo, dar a conocer; que las semillas de las orquídeas carecen de endospermo (sustancia de reserva alimenticia para que el embrión de la semilla, continúe su división celular y origine una nueva plántula). Esto complica su germinación en la naturaleza. Las semillas deberán encontrar la asociación con un hongo micorrízico que las nutra para llevar a cabo su germinación; por este motivo miles de semillas mueren.
Las orquídeas tienen una gran importancia dentro de las plantas ornamentales, muchas de ellas se encuentran en la NOM-059-SEMARNAT en alguna categoría de riesgo, algunas ya en peligro de extinción. Por este motivo es necesario buscar estrategias para propagarlas y con ello estamos hablando de rescatarlas; conociendo las diferentes formas de propagación Asexual y Sexual podremos lograrlo. En el presente libro se notifica al respecto.
Las orquídeas pueden ser epífitas (viven sobre cortezas de los árboles), terrestres (viven sobre el suelo) y litófitas (viven sobre rocas).
Las orquídeas son más abundantes en los trópicos, pero también se les encuentra en climas templados. Su zona preferida es la franja entre los trópicos que es donde viven las orquídeas epífitas. Algunos países poseen más orquídeas que otros. En México se reportan alrededor de 1.200 especies, de las cuales el Estado de Chiapas posee alrededor de 600.
Por la belleza de sus flores, cada año cientos de orquídeas son extraídas de su hábitat natural y son vendidas de manera ilegal. Los bosques donde crecen están siendo altamente deforestados, aunado a los fenómenos naturales y a los incendios provocados. Por lo anteriormente citado; las poblaciones de orquídeas tienden a reducir su variabilidad genética con riesgos de llegar a extinguirse. Es necesario ayudar a rescatar y conservar estas maravillosas plantas.
Dra. Carmen Ruíz Bello.
Orquídeas, rescate por germinación in vitro
Por la belleza de sus flores, las orquídeas son muy preciadas en el mundo entero. Su principal uso es como plantas de ornato aunque las hay industriales. En México se reporta el empleo de varias especies en usos tan diversos como medicinales, aromatizantes de alimentos, para extracción de gomas y mucílagos utilizados como adhesivos o aglutinantes y como plantas ornamentales.
Existe un verdadero interés por las orquídeas silvestres; esto se debe primordialmente a fines comerciales y religiosos. Año con año muchos ejemplares se concentran en los mercados regionales para su venta. Por el constante saqueo de orquídeas hay especies que se encuentran amenazadas, con poblaciones reducidas o en peligro de extinción. Esto puede ocasionar la pérdida de materiales muy valiosos que aportarían germoplasma en programas de mejoramiento y propagación masiva; por lo que debe considerarse su rescate.
La propagación natural de las orquídeas se dificulta porque sus semillas son diminutas y carecen de endospermo por lo que requieren de la simbiosis con hongos micorrízicos para llevar a efecto la germinación. Por este motivo; es necesario buscar metodologías que ayuden a germinar las semillas como es el caso de la germinación in vitro y con ello contribuir al rescate y conservación de la variabilidad genética de las especies.
1
1. INTRODUCCION
1. Introducción
La familia Orchidaceae es la más evolucionada y compleja que existe, constituyendo el grupo con mayor diversidad de las plantas vasculares (Banks, 2006). La sofisticada estructura de sus flores y la alta especificidad para su polinización son características propias de este grupo. Todas las orquídeas son herbáceas y pueden ser: epífitas, terrestres y litófitas. La estructura de las plantas y en especial de las flores varía de acuerdo al grupo o género al que pertenezcan, hay la presencia o ausencia de pseudobulbos, diferentes tipos de tallos, raíces y hojas y la enorme variedad de formas de las flores siempre conservando una configuración definida: tres sépalos, son coloreados y en ocasiones similares a los pétalos, uno de los cuales recibe el nombre de labelo, que se modifica para adquirir las más extrañas formas (Cabrera, 1999). De acuerdo a Hagsáter et al., (2005) existen entre 20,000 a 30,000 especies de orquídeas y se han descubierto nuevas. En México se calcula que existen alrededor de 1,200 especies (Cabrera, 1999).
La belleza de las orquídeas y la gran diversidad de formas y colores, atraen la atención de coleccionistas alrededor del mundo, los cuales en su mayoría manifiestan una obsesión por estas plantas. Vendrame y Pinares (2009), reportan que en el Sur de la Florida hay muchos productores de orquídeas, desde los más especializados que han obtenido híbridos merecedores de premios en exhibiciones mundiales, hasta los dedicados a la producción a gran escala de millones de orquídeas de los géneros más comunes domo Phalaenopsis y Dendrobium; que el número de sociedades locales dedicadas a las orquídeas es impresionante e ilustra la pasión por estas plantas.
3
2. IMPORTANCIA
2. Importancia
Las orquídeas son sin duda, algunas de las flores más apreciadas en el mundo entero. Esto se debe a que sus flores poseen las más diversas y exóticas formas. Desde hace siglos han apasionado a reyes y nobles, así como a gente común y siguen apasionando a la humanidad. Son plantas que cuentan con un gran número de coleccionistas en el mundo, reunidos en sociedades, clubes y grupos de estudio (Bastida, 2007).
En la época de la Colonia el médico de Felipe II, Francisco Hernández vino a la Nueva España a realizar una investigación acerca de las plantas medicinales de las tierras del Nuevo Continente y junto con los sabios indígenas describió e hizo dibujar un gran conjunto de plantas desconocidas hasta entonces en Europa. Posteriormente publicó los primeros dibujos de cinco orquídeas mexicanas que fueron: una Stanhopea, una Laelia, una Encyclia, una Bletia y Vanilla planifolia. En particular, la vainilla aparece ilustrada desde 1552 con el nombre de tlixochitl en el códice de la Cruz-Badiano (Hágsater et al., 2005).
En México, como en otras partes del mundo el cultivo de las orquídeas para fines culturales constituyó la base de una creciente afición. Esto se reflejó en 1938 con la constitución de la primera asociación cívica, formada por destacados y prominentes personajes que se denominó “Amigos de las Orquídeas”. Hoy en día se le conoce como “Asociación Mexicana de Orquideología”. Esta nueva generación de orquideófilos, con verdadero espíritu de conservar nuestras joyas vegetales, aumentó en los últimos años sus actividades e investigaciones en bosques y selvas de México. Destacan los estudios realizados con fines taxonómicos de los cuales se dispone de una larga lista de especies desconocidas. Asimismo estos estudios ayudaron a resolver la problemática de su nomenclatura y el enigma existente en la clasificación de varios de sus géneros y múltiples híbridos naturales (Hartman, 1992).
5
El número de sociedades dedicadas a las orquídeas es impresionante e ilustra la pasión por estas plantas. Por citar un ejemplo, en el Sur de Florida, existen 12 sociedades que se reúnen semanalmente para discutir aspectos relacionados con el cultivo de las orquídeas, organización y programación de exhibiciones, y en ocasiones se llevan a cabo seminarios impartidos por especialistas invitados de diferentes áreas de la orquideología. Curiosamente, la mayoría de los miembros participantes de una sociedad también pertenecen a otras sociedades. Prácticamente se desarrollan actividades relacionadas con las orquídeas durante todo el año, como subastas, exhibiciones y competencias (Vendrame y Pinares, 2009).
2.1. Importancia económica en México
Se pueden señalar varias formas de uso y manejo sustentable de las orquídeas mexicanas mediante su cultivo y propagación como es el caso de las plantaciones de vainilla, el cultivo de Laelias y otras especies en traspatio y viveros (Hágsater et al., 2005).
Asimismo se dispone actualmente de varios viveros particulares que cuentan con colectas de especies de orquídeas mexicanas, algunas de las cuales están siendo propagadas, aunque muchas de ellas son de poco interés comercial.
Los principales viveros se ubican en: Tenango de las Flores y Atlixco, Puebla, en Fortín de las Flores, Veracruz, Cuernavaca, Morelos, Valle de Bravo, México y en la Ciudad de México. Además existen viveros en otras partes de México, como: Jalisco, Baja California y la Península de Yucatán, entre otros.
2.2. Importancia ecológica
La diversidad de las flores de orquídeas tiene la finalidad de atraer a los polinizadores para poder producir semillas y perpetuar su especie. Las orquídeas
se han podido establecer en casi todos los ambientes de la tierra. Algo que caracteriza a las orquídeas en conjunto es la complejidad de sus interacciones con otros seres vivos, sean estos hongos micorrízicos, polinizadores, árboles hospederos u hormigas mutualistas. Son el grupo de plantas que ha podido colonizar con más éxito las copas de los árboles como es el caso de las orquídeas epífitas (Hágsater et al., 2005). Las epífitas son plantas que crecen sobre otras plantas adheridas a los troncos y ramas de árboles y arbustos principalmente, por ello son llamadas con toda propiedad epífitas (del griego epi que significa “sobre” y phyte “planta”). El hospedero o “forofito” sobre el que crece una epifita es utilizado solo como soporte sin recibir más daño que el que pueda provocar su abundancia dentro de su ramaje, por lo tanto, una epifita difiere de una planta parásita en que esta última obtiene agua y nutrientes del hospedero. Las epífitas despliegan mecanismos muy variados y novedosos para sobrellevar no solo la sequía sino también la adquisición de nutrimentos del ambiente sin tomarlo del forofito (hospedero). Tal especialización requiere en ocasiones de interacciones mutualísticas con microorganismos artrópodos y algunos grupos de vertebrados y de características morfoanatómicas y funcionales muy especiales; este grupo incluye organismos no vasculares pterofitas y angiospermas que se relacionan ecológicamente con forofitos muy diversos que se establecen en ambientes con alta humedad atmosférica. Por ello, son responsables, en gran parte de que los bosques húmedos tropicales contengan la diversidad biótica más alta de todos los ecosistemas continentales (Granados et al., 2003). Todas las orquídeas tienen una relación obligada con los simbiontes micorrízicos durante la germinación de la semilla. Es importante entender la simbiosis micorrízica debido a que existe una especificidad con las semillas para germinar (Taylor et al., 2003; Otero et al., 2004). Resulta determinante la disponibilidad de hongos simbiontes para la distribución y diversidad de las orquídeas (Otero et al., 2002).
7
3. USOS POTENCIALES
3. Usos potenciales
3.1. Plantas de ornato
El conocimiento, uso y aprecio de las orquídeas por las culturas prehispánicas no está documentado, pero cuando los españoles llegaron a México en el siglo XVI se cultivaban algunas orquídeas como Stanhopea hernandezii y la vainilla (Vanilla planifolia) (Hágsater et al., 2005).
Existe un verdadero interés por las orquídeas silvestres; esto se debe primordialmente a fines comerciales y religiosos, como ornato se usan como flor cortada o bien plantas completas cuyos ejemplares son obtenidos de su hábitat natural de manera ilegal, año con año cientos de miles de ejemplares se concentran en los mercados regionales para su venta. El uso de las orquídeas está asociado a sus características ornamentales, ya sea su aprovechamiento como flor de corte, planta en maceta o bien en colecciones especiales (Hartman, 1992).
3.2. Usos en la industria
Sin duda alguna, la vainilla (Vanilla planifolia) es prácticamente la única orquídea que se utiliza con fines industriales y es una aportación de México para el mundo. La vainilla es una planta epífita trepadora originaria o nativa de los bosques tropicales o selvas húmedas de México, Centroamérica y posiblemente de las Antillas.
Fueron los españoles quienes le dieron el nombre de vainilla o vaina pequeña, por su similitud con los frutos de las legumbres que se denominan vainas. Al inicio del siglo XIX, llevaron plantas de vainilla de México a diferentes lugares de Europa y de ahí fue la distribución mundial, siendo los franceses quienes la
9
introdujeron a Madagascar donde actualmente se produce el mayor porcentaje de la vainilla que se consume en el mundo.
En México, la vainilla se cultiva principalmente en los estados de Veracruz, Puebla, Oaxaca, Chiapas, y existen pequeñas plantaciones en los estados de Hidalgo, San Luis Potosí, Quintana Roo, Tabasco y Michoacán (Téllez, 2011).
El extracto de la vainilla (Figura 1)es una mezcla compleja de substancias, aunque su constituyente principal es un compuesto aromático simple llamado vainillina. El extracto es utilizado como aromatizante y saborizante en repostería, elaboración de helados y refrescos embotellados y en las industrias del perfume, tabaco y aún la farmacéutica. Este producto tiene gran demanda a nivel mundial y su obtención requiere de grandes cantidades de frutos (“vainas”) que han sido sometidos a un proceso de fermentación (“curado”) para producir la fragancia de vainilla (Hágsater et al., 2005).
Figura 1. Planta y fruto de vainilla
a) Don Esteban acomodando la planta de vainilla sobre un tutor,
“El Hular”, Tuzantán, Chis. b) Fruto de la vainilla del cual se extrae la vainillina
Foto: Carmen Ruíz Bello.
a)
b)
Además de Vanilla planifolia, existen otras especies de vainilla que son utilizadas para la obtención de los principios aromáticos, aunque en una escala mucho menor debido a la calidad inferior del producto; siendo V. planifolia la más importante desde el punto de vista comercial (Lee, 2008).
3.3. Otros usos
Las orquídeas mexicanas se utilizan también en la elaboración de pegamentos, aglutinantes, aromatizantes, saborizantes, dulces, esculturas e imágenes religiosas, ritos, festividades religiosas y propiedades medicinales (Moreno y Menchaca, 2006). Desde el México prehispánico, ya se utilizaban diversas partes vegetativas de orquídeas que tenían sustancias mucilaginosas con propiedades adherentes y aglutinantes. La mayoría de estas sustancias son obtenidas de los pseudobulbos y raíces de algunas especies. Los aztecas y los mayas, las utilizaban por sus propiedades medicinales, como plantas de ornato y para extraer pegamentos (Ossenbach, 2005).
Los antiguos pueblos mesoamericanos conocían y manejaban desde antes de la conquista española, una gran variedad de productos que tenían la propiedad de ser adhesivos y aglutinantes. Utilizaban diversas partes vegetativas de orquídeas que tenían sustancias mucilaginosas con estas propiedades. Con la llegada de los españoles surgió el asombro y el interés por compilar el conocimiento indígena.
Cuando los españoles llegaron en el Siglo XVI, los frutos de la vainilla (Vanilla planifolia Andrews) se vendían en los mercados y de los cormos, seudobulbos y raíces de algunas especies se extraía un mucílago utilizado como pegamento (Hágsater et al., 2005).
De este modo, muchas de las especies de orquídeas conocidas han sido
11
aromatizantes y saborizantes. Algunas especies se usan de manera tradicional para la elaboración de dulces y para curar heridas o enfermedades pero de manera restringida (Cabrera, 1999) así como en la producción de esculturas e imágenes religiosas en ritos y festividades religiosas. Todas ellas conforman el abanico de usos diferentes que han tenido y continúan teniendo las orquídeas en algunas áreas de nuestro biodiverso y pluricultural México (Moreno y Menchaca, 2006).
4. RECURSOS FORESTALES NO MADERABLES
13
4. Recursos forestales no maderables
Las orquídeas son consideradas como recursos forestales no maderables. Un porciento de las que existen en la naturaleza, son epífitas utilizando como hospedero las cortezas de los árboles (Figura 2).
Firuga 2. Orquídea epífita
Encyclia adenocaula en su hospedero natural Quercus sp. Bosque de asociación pino-encino.
Temascaltepec, Edo. de México. Foto: Carmen Ruíz Bello
Los recursos naturales son satisfactores de necesidades humanas, que en el caso de los forestales provienen de vegetación silvestre; contra la creencia popular, no solo son árboles, sino que también hay arbustos, hierbas, hongos y animales. Las orquídeas viven sobre los árboles (Figuras 3 y 4) Los bosques se constituyen de recursos maderables y no maderables.
Figura 3. Dos plantas de Encyclia adenocaula en un mismo hospedero
Foto: Carmen Ruíz Bello
15
Figura 4. “Flor de la Candelaria” (Guarianthe skinneri) Orquídea epífita
Foto: José Luis Moreno Martínez
5. CLASIFICACION TAXONOMICA
17
5. Clasificación taxonómica
La clasificación taxonómica de la familia es compleja y cambiante. Está basada esencialmente en los caracteres de la columna y en niveles superiores en la naturaleza de la polinia. Para su clasificación no se utilizan las formas de vida, distribución o el espectro ecológico de las especies. Sin embargo, parece estar bastante correlacionada con los desarrollos evolutivos del grupo más aceptado por la mayoría de los autores. Dressler (1993), citado por Gil (2007) estableció la clasificación taxonómica más aceptada para la familia de las orquídeas:
Reino: Plantae
División: Spermatophyta Subdivisión: Angiospermae Clase: Monocotyledoneae Orden: Microspermae Familia: Orchidaceae
La familia Orchidaceae presenta cinco Subfamilias que son:
Apostasioideae, Cypripedioideae, Spiranthoideae, Orchidioideae, Epidendroideae.
6. DESCRIPCION BOTANICA
19
6. Descripción botánica
Las orquídeas son plantas monocotiledóneas, herbáceas perennes de la familia Orchidaceae. Se caracterizan porque un gran número de ellas poseen flores muy vistosas, hermafroditas (ambos sexos en la misma flor), zigomorfas (con 1 solo plano de simetría, trímeras (3 sépalos y 3 pétalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas (anteras) y femeninas (pistilo) llamada ginostemo (Figura 5).
Figura 5. Partes que componen a una planta de orquídea (Sheehan, 1994; citado por Gil, 2007).
Algunas viven en las ramas de los árboles (epifitas), otras sobre rocas (litofíticas) y algunas en el suelo (terrestres). Las raíces de las epifitas y litófitas están adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgánica, ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo.
6.1. Hábitat de desarrollo
De acuerdo al lugar donde se desarrollan se define los posibles hábitats en que se les puede encontrar y que pueden ser de los siguientes tipos:
6.1.1. Epifitas. Son plantas que se desarrollan únicamente sobre las ramas y troncos de los árboles, sus raíces no penetran el tallo de sus hospederos, sólo crecen sobre su corteza, el árbol cumple la función de soporte. La gran mayoría de las orquídeas presentan este tipo de hábitat. Su alimento lo obtienen del aire, el agua de lluvia y de algunos desechos acumulados encima de la corteza de los árboles (Figura 6).
21
6.1.2. Terrestres. En este caso las orquídeas crecen a nivel del suelo, de donde toman gran parte de los nutrientes que necesitan. Por lo general para su adaptación a este hábitat se ha modificado el pseudobulbo. Las raíces cumplen la función de estructuras de almacenamiento para épocas de sequía o para la floración, formación de cápsulas, semillas y para su reproducción (Figura 7).
Enciclya cordigera Enciclya acenocaula
Figura 6. Orquídeas epifitas.
Fotos: José Luis Moreno Martínez
Guarianthe aurantiaca
Figura 7. Orquídeas terrestres
Arundina graminifolia. Foto Carmen Ruíz Bello
Sobralia macrantha. Fotos: Carmen Ruíz Bello
23
6.1.3. Litófitas Este tipo de orquídeas crece sobre las rocas. Estas les brindan el soporte necesario para su desarrollo. Algunas de las especies terrestres se pueden adaptar a esta condición, al igual que las litófitas a hábitats terrestres.
6.2. Tipos de crecimiento
6.2.1. Simpodial. Las orquídeas con este tipo de crecimiento poseen un rizoma que crece de manera horizontal, del cual van surgiendo los retoños nuevos que tienen un crecimiento vertical y eventualmente forma pseudobulbos; en este tipo de crecimiento se presenta la posibilidad de ramificaciones (Figura 8a).
6.2.2. Monopodial. Las orquídeas con este tipo de crecimiento crecen de manera erguida, erectas con un solo tallo que no se ramifica, al cual se insertan las hojas y no presentan pseudobulbos(Figura 8b).
a) Orquídea simpodial b) Orquídea monopodial Figura 8. a) crecimiento simpodial, b)crecimiento monopodial
6.2.3. Trepadoras. Este tipo de crecimiento se presenta en orquídeas como la vainilla (género Vanilla) que va creciendo a lo largo y hacia arriba, sosteniéndose del tronco de un árbol o tutor (Figura 9).
25
6.2.4. Rastrero. Las orquídeas de este tipo crecen sobre la superficie del suelo, rocas o ramas de los árboles donde se van expandiendo horizontalmente.
7. PERDIDA DE LA BIODIVERSIDAD
27
7. Perdida de la biodiversidad
México alberga una flora que ha sido considerada de las más ricas y variadas del planeta, presentando aproximadamente el 10% de la biodiversidad terrestre, además no solamente se distingue por este atributo, sino también por su elevado índice de endemismos, es decir, especies que solamente se encuentran dentro de los límites geográficos del país (Rzedowski, 1993, Semarnap-Ine-Conabio, 1995). No obstante, de las especies de plantas vasculares, aproximadamente el 15% se consideran en peligro de extinción (Vovides, 1995). La principal causa de este problema ha sido la perturbación y la destrucción de las comunidades naturales, como producto del creciente impacto de las actividades humanas sobre ellas.
Para México, la familia Orchidaceae representa un ejemplo de la diversidad de especies y de la problemática de la extinción de ellas. Cabrera (1999), informa que en México existen alrededor de 1,200 especies, de las cuales la Norma Oficial Mexicana NOM-059-SEMARNAT-2001 reporta 180 que presentan algún riesgo de extinción. Este riesgo se acentúa debido principalmente a la conversión de terrenos forestales para usos urbanos, agrícolas o pecuarios, así como por la extracción de plantas de su hábitat para su venta en mercados nacionales e internacionales, incluyendo aquéllas especies mencionadas en la norma oficial. No existe gran información confiable respecto a la exportación ilegal de orquídeas, una aproximación se puede realizar con lo reportado por Banks (2006), quien menciona que en 1989 se exportaron a Estados Unidos 18,000 orquídeas de las cuales 8000 se encontraban amenazadas de extinción.
De acuerdo a la recomendación del Sistema Nacional de Recursos Fitogenéticos (SINAREFI) (2004), todas aquellas especies ornamentales que sean raras, que se encuentren amenazadas o en peligro de extinción deberán propagarse por técnicas o métodos adecuados para lograr la preservación de la riqueza genética en el mundo.
8. PROPAGACION DE ORQUIDEAS
29
8. Propagación de orquídeas
Las orquídeas como todas las plantas vasculares, poseen dos tipos de propagación: asexual o vegetativa y sexual o por semilla.
8.1. Propagación asexual o vegetativa
Con la propagación asexual o vegetativa, no habrá variabilidad genética en las plantas resultantes, estas serán idénticas a la planta madre de donde se separe la parte vegetativa; así que si lo que deseamos es obtener clones, este resulta ser el método adecuado. Este tipo de propagación, puede realizarse de dos formas:
Propagación manual; por división de las plantas fraccionando el número de pseudobulbos y sembrándolos en un sustrato adecuado. Algunas orquídeas (por ejemplo las del género Dendrobium y Epidendrum) producen pequeñas plantas en las axilas de sus hojas (llamadas “keikis”) que frecuentemente enraízan estando todavía en la planta madre, solo se requiere su separación para propagarlas.
No todas las orquídeas se pueden dividir de las mismas formas. Existen algunas que se pueden dividir simplemente utilizando las manos ó tijeras para cortar las raíces gruesas y sembrando cada ejemplar de orquídeas en una maceta de un tamaño apropiado para cada planta así como utilizar sustrato fresco.
Por otra parte existen plantas como Paphiopedilum a los cuales no les gusta ser divididas, en caso de dividirse es necesario dejar al menos 2 brotes antiguos y un nuevo crecimiento por división para asegurar el éxito.
8.1.1. División de plantas
Cuando una planta ha crecido lo suficiente y se quiere dividir, se recomienda los siguientes pasos:
- Primeramente se debe observar que tipo de crecimiento tiene (monopodial o simpodial).
- Para hacer el corte se debe usar navaja, tijeras o cuchillos limpios y flamearlos con un encendedor, esto evitará la transmisión de enfermedades entre las plantas.
- Después de dividir la planta, es recomendable colocar polvo de azufre en la lesión causada por el corte ó una mescla de cal común, esta medida es para evitar infecciones por hongos.
- Se puede aprovechar el trasplante para dividir la planta y obtener varios ejemplares. Para hacerlo se desmorona el sustrato con las raíces se divide con las manos hasta donde sea posible y se planta cada división en un recipiente puede ser maceta de tamaño diverso con base al tipo de orquídea, apropiado y con sustrato fresco, esta puede ser de plástico, barro, ó en cualquier otro sustrato orgánico como, madera de chipe, coco, bambu, teja, entre otros.
Si la planta que se va a dividir es de crecimiento simpodial, el corte debe hacerse dejando tres o cuatro pseudobulbos en la nueva planta, nunca se deben dejar menos, pues existen pocas posibilidades de que sobreviva, ya que existe intercambio de nutrientes entre los tallos que ayudan a los brotes nuevos a desarrollarse. Por lo contrario, si presenta crecimiento monopoidal, se deben cortar plantas que hayan crecido suficiente y que tengan raíces aéreas bien desarrolladas, así la planta separada podrá absorber agua y nutrientes por si misma.
31
8.1.2. Tipos de sustratos Los sustratos pueden ser:
Fibra de coco o corteza de pino: Que no sea nueva, por que posee sustancias dañinas para las plantas, llamadas taninos, por lo que se prefiere que ya este interperizada o vieja.
Trozos de madera: estos pueden ser de encino, Jacaranda, chalahuite (Inga sp.), gasparito (Eritrina americana), etc. Este último resulta un buen sustrato ya que proporciona fertilización natural por su alto contenido de Nitrógeno, además de ser una madera porosa que retiene la humedad. Como sustrato para comercializar las orquídeas se pueden utilizar multiples sustratos entre ellos esta el chipe, conchas de coco seco, bambu, retazos de madera, canastas de mimbre, ixtle ó alambre (Figuras 10 y 11).
Figura 10. Mujeres dividiendo plantas de orquídeas y estableciéndolas en diferentes sustratos. Foto: Aida Olivera de los Santos
Figura 11. Diferentes tipos de sustratos que se pueden utilizar para establecer los fragmentos de las plantas. Foto: Aída Olivera de los Santos
33
Figura 12. Orquídea en tronco de Yaite (Gliricidia sepium). Foto: Aída Olivera de los Santos.
Malque o Chipe. Es una costumbre muy común usar pedazos de tallo y raíces de helechos llamados comúnmente malque, maquique o Chipe, sin embargo, estos se obtienen de un helecho en peligro de extinción, por lo que no se recomienda su uso, ya que muchos otros materiales son buen sustrato para orquídeas (Figura 12) y no es justo conservar una especie afectando a otra.
Las orquídeas se pueden establecer en forma artesanal haciendo uso de plantas madres, de las cuales se extraen los hijuelos atraves de la división de plantas, y pueden establecerse en postes verdes del árbol “cocohite” ó “yaite” (Gliricidia sepium) (Figura 12).
Tierra preparada: en el caso de las orquídeas terrestres, pueden sembraras en macetas agregando una mezcla de tierra de monte húmeda con un poco de arena. Algunas inclusive pueden crecer bien directamente en el suelo.
8.2. Propagación sexual o por semillas
Las flores de las orquídeas producen frutos en forma de cápsulas en su mayoría conteniendo grandes cantidades de semillas como polvo fino (Figura 14).
Las semillas de las orquídeas, carecen de endospermo (sustancia de reserva alimenticia).
Bajo condiciones naturales (Figura 14), las semillas de orquídeas son liberadas de sus cápsulas cuando éstas maduran y son llevadas por el viento pudiendo germinar y crecer si eventualmente caen en un medio adecuado para la germinación. Sin embargo dichas semillas tienen pocas posibilidades de sobrevivir, debido a que muchas de las especies de orquídeas sólo son capaces de crecer en presencia de un hongo simbiótico como Rhizoctonia spp. (Serna, 1999).
Figura 13. a) Fruto de orquídea, b) Semillas de orquídea
35
Cada semilla posee una cubierta seminal que encierra un embrión rudimentario indiferenciado y simple, constituido por unas 100 a 200 células sin endospermo. Debido a la falta de reservas alimenticias, el proceso germinativo y el subsiguiente desarrollo de las orquídeas, se encuentran supeditados a la existencia de una simbiósis con un hongo que proporcione los elementos nutritivos necesarios para su realización. Cuando el fruto abre en forma natural y las semillas son liberadas, la Figura 14. Cápsulas (frutos) con semillas de Encyclia adenocaula. Planta en su
hospedero principal (Quercus sp) en condiciones naturales Foto: José Luis Moreno Martínez
germinación dependerá de que al caer entren en contacto con el hongo, el cual penetrará al embrión a través de una gran célula suspensora; el hongo crece en el interior de las células del embrión, éste es digerido por la orquídea que comienza a crecer rápidamente para formar un protocormo. La primera hoja se desarrolla algún tiempo después de la germinación (Mitchell, 1989).
Lee (2008) menciona que las semillas de orquídea contienen un pequeño embrión de solamente cerca de 0.1 mm de diámetro, sin ningún tejido de reserva asociado y que un método de germinación ha sido plantar semillas en suelo previamente mezclado con suelo obtenido de los alrededores de la planta madre. Sin embargo, un método más eficiente de germinación y rápido desarrollo es por cultivo in vitro de las semillas.
37
9. PROPAGACION IN VITRO
9. Propagación in vitro
La propagación por medio de cultivo in vitro; por medio de la siembra de meristemos u otra parte de la planta sembrándolos en un medio de cultivo preparado en un laboratorio.
El término cultivo in vitro, se utiliza para denominar a los cultivos asépticos de origen vegetal. El cultivo in vitro ofrece ventajas adicionales a las técnicas convencionales de propagación, como son: germinar semillas que bajo condiciones de semillero no germinan, o bien, obtener una rápida multiplicación a partir de pequeñas fracciones de la planta libres de patógenos.
Para lograr la propagación de plantas por cultivo in vitro, es posible utilizar cualquier fragmento vegetal por ejemplo; tallos, parte de la flor, secciones de hojas, meristemos, células en suspensión, entre otros; a estos materiales biológicos se les denomina explantes (Fay, 1994). Mediante el uso de explantes es factible inducir la morfogénesis, término que se utiliza para denominar al conjunto de procesos relacionados con la diferenciación y desarrollo de órganos o tejidos para dar una planta completa (Fhan, 1982).
La utilización del cultivo in vitro ha tenido un impacto en el mejoramiento de las plantas vasculares, estableciendo nuevas y mejores alternativas como son; rescate de embriones, hibridación, obtención de plantas libres de patógenos y rápida propagación clonal. La utilización de estas técnicas se justifica cuando por los métodos tradicionales, la producción de nuevos individuos es muy lenta y limitada o no se ha logrado.
Los métodos de cultivo de tejidos vegetales in vitro tienen una amplia aplicación en el conocimiento y la explotación de los recursos genéticos, como son: la propagación masiva, el intercambio de germoplasma, la inducción de la
39
ambiente natural. Mediante la germinación in vitro, se reproducen semillas en frascos de vidrio o plástico sobre un medio de agar nutritivo que contiene los azúcares y minerales necesarios para que las semillas germinen y crezcan (Mckendrick, 2000).
10. PROPAGACION IN VITRO DE ORQUIDEAS
41
10. Propagación in vitro de orquídeas
10.1. Propagación asexual ó vegetativa
Las orquídeas pueden ser propagadas asexualmente ó vegetativamente, por medio de la siembra de meristemos (Figuras 15 y 16) en medios de cultivo de tejidos in vitro preparados en un laboratorio.
Figura 15. Meristemo de la planta. (Se señala con el bisturí un meristemo de la planta) Foto: José Luis Moreno Martínez
Ventajas y desventajas
Ventajas: si logramos hacer que se propaguen plantas por este medio, de un solo meristemo podremos realizar una propagación masiva (clones) de la especie que se trate en particular.
Desventajas: los pseudobulbos de las plantas, solamente poseen dos meristemos que son sus puntos nuevos de crecimiento, los cuales si los cortamos, estamos destruyendo totalmente a la nueva planta.
10.2. Propagación sexual ó por semilla
La familia Orchidaceae requiere buscar metodologías de cultivo in vitro debido a que las plantas tienen bajas tasas de crecimiento, ciclos de vida relativamente largos aunado al problema que presenta la germinación de las semillas en forma natural ya que requieren de la asociación con el hongo simbionte.
Figura 16. Meristemo de orquídea propagado in vitro Foto: José Luis Moreno Martínez
43
10.2.1. Germinación de las semillas in vitro
Mediante la germinación in vitro, se reproducen semillas en frascos de vidrio o plástico sobre un medio de agar nutritivo que contiene los azúcares y minerales necesarios para que las semillas germinen y crezcan (Mckendrick, 2000).
Hay dos tipos básicos de germinación in vitro: simbiótica y asimbiótica:
10.2.1.1. Germinación simbiótica
En la germinación simbiótica, las semillas (Figura 17) se siembran con una pequeña porción del hongo micorrízico apropiado. El hongo crece en el medio, coloniza a las semillas en proceso de germinación y se origina una relación simbiótica que se espera alimente al protocormo hasta que este produzca hojas y se vuelva autotrófico.
10.2.1.2. Germinación asimbiótica
La germinación asimbiótica consiste en depositar semillas en un medio de agar nutritivo, el cual es más complejo que para la germinación simbiótica ya que todos los nutrientes orgánicos e inorgánicos y los azúcares deberán estar disponibles para la orquídea en una forma apropiada puesto que ya no existe la intermediación del hongo (Mckendrick, 2000).
El cultivo in vitro asimbiótico (sin la presencia del hongo micorrízico) surge en 1922, cuando Lewis Knudson encontró un medio propicio para la germinación sin la presencia del hongo (Arditti, 1990). Posteriormente Knudson C (1946) mejoró el medio de cultivo teniendo éxito en un amplio número de especies. Desde entonces, se han desarrollado medios para especies específicas como por ejemplo Vacin y Went (1949), Murashige y Skoog (1962), Ichihashi y Yamashita (1977) y Dalla Rosa y Laneri (1977), entre otros.
Por la dificultad que presentan las semillas de las orquídeas para germinar en forma natural, se han desarrollado metodologías de germinación asimbiótica bajo condiciones in vitro (Arditti y Ernst, 1993; Serna, 1999; Mckendrick, 2000; Cavalcante et al., 2001; Damon et al., 2004; Pedroza et al., 2005; Yamazaki y Kasumitzu, 2006; Pedroza y Mican, 2006; Haddix et al., 2006; Steele, 2007 entre otros). Sin embargo, cada especie de orquídea requiere diferentes nutrimentos para germinar, por lo que hay que investigar cual es el medio de germinación adecuado para cada una de ellas.
Figura 17. Semillas de orquídeas vistas con microscopio Fotos: José Luis Moreno Martínez
45
La propagación sexual o por semillas, asegura un intercambio genético y ayuda a mantener la variabilidad genética.
La madurez de las semillas al momento de la germinación in vitro es un factor importante (Damon et al., 2004). Las semillas pueden ser colectadas a partir de cápsulas verdes ó cápsulas maduras.
11. CAPSULAS O FRUTOS DE LAS ORQUIDEAS
47
11. Cápsulas ó frutos de las orquídeas
En la naturaleza las orquídeas producen pocas cápsulas (órgano de la planta que contiene las semillas las cuales son diminutas) pero se compensa por la presencia de miles de semillas por cápsula, hasta uno o dos millones en algunos casos y un máximo de cuatro millones de semillas, como en Cynoches sp. recurso de suma importancia para la conservación y cultivo sustentable de estas plantas (Arditti, 1990).
Las cápsulas (Figuras 18 y 19) de las orquídeas tardan meses para que sus semillas alcancen la madurez adecuadas para que puedan germinar in vitro.
Cápsulas de Encyclia chacaoensis Foto: Carmen Ruíz Bello
Cápsula de Encyclia adenocaula Foto: Jose Luis Moreno Martínez
Figura 18. Cápsulas (frutos) de orquídeas
George (1993), citado por Lee (2008) reporta que la germinación de la semilla inicia cuando el embrión se alarga para formar una pequeña estructura como un Cápsula de vainilla (Vanilla planifolia
Andrews) Foto: Carmen Ruíz Bello Cápsula de Guarianthe skinneri
Foto: Carmen Ruíz Bello
Figura 19. Cápsulas de orquídeas
49
radical, en polos opuestos. En la naturaleza, el protocormo se torna de color verde y acumula reservas de carbohidratos a través de la actividad fotosintética. Solamente cuando ha crecido lo suficiente, la materia orgánica almacenada da lugar a un brote y una raíz. El desarrollo normal continúa utilizando las reservas de alimento almacenadas en el protocormo.
Sin embargo, la eficiencia de este proceso de propagación a través de la germinación simbiótica de semillas de orquídea es muy baja, de únicamente el 5
% y está limitado a la existencia natural de microorganismos fúngicos para completar exitosamente la formación de una planta completa.
Cuando se lleva a efecto la germinación asimbiotica en cultivo in vitro, es mejor no permitir que las cápsulas se abran para que las semillas no se contaminen. Ruíz et al., (2008) recomienda sembrar las semillas, cuando las cápsulas tengan una coloración amarillenta .
En la Figura 20 podemos observar; que una de las tres cápsulas que se presentan en la misma planta tiene una coloración amarilla, esta es la que se considera apta para la siembra in vitro. Cuando las cápsulas abren; las semillas son expuestas a contaminarse y si se desea germinarlas in vitro habría que esterilizarlas con alcohol o cloro y esto hace que pierdan su viabilidad. Es conveniente llevar las cápsulas cerradas y esterilizar las mismas en el laboratorio para poder extraer sus semillas que en este caso estarían completamente estériles, porque no se expusieron al medio exterior para contaminarse.
El interior de las cápsulas de orquídeas se mantiene estéril si estas están intactas, por lo tanto, si se esteriliza la parte exterior de las mismas, y se abren bajo condiciones estériles, las semillas podrán mantenerse desinfectadas. La ventaja de este método es que no se requiere de la esterilización de las semillas, lo que podría provocar su deterioro (McKendrick, 2000).
Cápsulas de los géneros Cattleya y Cymbidium fueron utilizadas para la siembra de semillas in vitro por Serna (1999); Pedroza et al. (2005) estudiaron un medio de cultivo adecuado para germinar Comparettia falcata; Pedroza y Mican (2006) germinaron semillas de Odontoglossum gloriosum; Damon et al., (2004) estudiaron la germinación in vitro de tres especies de orquídeas de la región del Soconusco en Chiapas (Brassavola nodosa, Guarianthe (Cattleya) aurantiaca y Prosthechea (Encyclia) chacaoensis); Steele (2007), estudió la germinación in vitro de semillas de Cypripedium arietinum, asimismo; Ruíz et al., (2008) germinaron in
Figura 20. Cápsulas de Encyclia adenocaula Foto: José Luis Moreno Martínez
51
12. PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO IN VITRO
12. Preparación del medio de cultivo in vitro
Existen dos vías para la adquisición de medios de cultivo in vitro: La vía más fácil, es adquirir el medio ya preparado que para algunas especies en particular ya los venden en algunos laboratorios, solo se adiciona agua destilada según venga la presentación, por ejemplo si es para 1 litro, se adiciona 20 gr. de sacarosa se ajusta el pH a 5.5 y 6.5 gr. de agar bacteriológico, pero esto resulta de costo muy elevado. La otra vía es adquirir los químicos que se enlistan en la tabla 1 y se preparan soluciones madre, esto es necesario ya que las cantidades a pesar son muy pequeñas y es posible equivocarse cuando se pesa, además generalmente se prepara mas de un litro de medio. Debe utilizarse agua destilada para diluir los compuestos.
De las soluciones concentradas se tomará el volumen indicado para un litro y se mezclarán, se agregará la sacarosa ó azúcar (20 gr), se ajusta el pH a 5.7 (si no se cuenta con un potenciómetro, puede usar papel pH) y por último se adiciona el agar bacteriológico (6.5 gr). Se disuelve el agar mediante agitación manual y posteriormente se introduce un microondas por 2 minutos o a calor directo sin dejar que hierva, y repitiendo la acción hasta su total dilución. Se vacían 20 ml de medio en frascos Gerber de 100 ml, se tapan y se esterilizan por autoclave a 121˚C, 1.1 Kg/cm3 durante 15 minutos (o bien puede usar una olla Express).
Para ajustar el pH se puede usar papel indicador de pH o un potenciómetro, para ajustarlo se utilizan las soluciones 1 N ó 0.5N de ácido clorhídrico o sosa (hidróxido de potasio)
Preparación de KOH 0.5 N. Disolver 2.8 g de KOH en 80 ml de agua destilada y aforar (llevar) a 100 ml.
Preparación de KOH 1.0 N. Disolver 5.611 g en 80 ml de agua destilada y aforar a 100 ml.
53
Preparación de HCl 1N. Disolver 4 ml de HCl en agua y aforar a 50 ml. Preparación de HCl 0.5 N. Disolver 2 ml de HCl en agua y aforar a 50 ml.
Nota: causa una reacción exotérmica por lo que se debe vaciar lentamente por las paredes el ácido sobre el agua nunca el agua sobre el ácido.
Cuadro 1. Medio Murashige y Skoog (1962) (MS)
Compuesto Fórmula química Cantidad (g/l) SALES
Nitrato de amonio Nitrato de potasio Sulfato de magnesio Sulfato manganoso Sulfato de zinc Sulfato cúprico Cloruro de calcio Yoduro de potasio Cloruro de cobalto Fosfato de potasio Ácido bórico
Molibdato de sodio Na2EDTA
Sulfato ferroso
VITAMINAS MS Inositol
Ac. Nicotínico Piridoxina – HCL Tiamina – HCL Glicina
NH4NO3
KNO3
MgSO4.7H2O MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O CaCl2.2H2O
Kl CoCl2.6H2O
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O Na2C10H14N2O8.2H2O
FeSO4.7H2O
C6H12O6
C6H5NO2
C8H11NO3-HCl C12H17CIN4OS.HCl
NH2CH2COOH
1.65 1.90 0.37 0.0169 0.0086 0.000025
0.44 0.00083 0.000025
0.17 0.0062 0.00025 0.03724 0.02784
0.1 0.0005 0.0005 0.0001 0.002
55
12.1. Preparación de soluciones madre MS
Macroelementos mg/l g/l 10x-200
NH4 NO3 1650 1.61 16.5 g
KNO3 1900 1.90 19.0 g
MgSO4.7H2O 370 0.37 3.7 g
KH2 PO4 170 0.17 1.7 g
Pesar y disolver en 80 ml aprox. Llevar a 100 ml. Etiquetar macroelementos 10X- 200 ml. De esta solución se deberán tomar 20 ml por cada litro de medio.
MS
Calcio mg/l g/l 10x-100
CaCl2.2H2O 440 0.44 4.4 g
Pesar y disolver en 80 ml aprox. Aforar a 100 ml (usar agua destilada). Etiquetar Calcio 10X100 ml. De esta solución se deberán tomar 10 ml por cada litro de medio.
MS
SOL. DE FIERRO mg/l g/l 10x-100
FeSO4.7H2O 27.8 0.0278 0.278 g
Na2EDTA.2H2O 37.3 0.0373 0.373 g
Disolver el EDTA en agua destilada caliente (30 ml ), en otro vaso disolver el Fe en agua fría, en un matraz adicionar los dos y aforar a 100 ml. Etiquetar Sol. de Fe 10X-100ml. De esta solución se deberán tomar 10 ml por cada litro de medio.
MS
MICROS mg/l g/l g/20 (20X)
KI 0.83 0.00083 0.0166 g
H3BO3 6.20 0.0062 0.124 g
MnSO4.4H2O 22.3 0.0223 0.446 g
Nota: si es MnSO4.H2O pesar 0.338 g
ZnSO4.7H2O 8.6 0.0086 0.172 g
Na2MoO4.2H2O 0.25 0.00025 0.005 g
CuSO4.5H2O 0.025 0.000025 0.0005 g
CoCl2.6H2O 0.025 0.000025 0.0005 g
Pesar y disolver en 80 ml aprox. Aforar a 100 ml (usar agua destilada). Etiquetar Micros 20X-100 ml. De esta solución se deberán tomar 5 ml por cada litro de medio.
MS
VITAMINAS mg/l g/l 20x-100
Tiamina-HCl 0.1 0.0001 0.002 g
Acido nicotínico 0.5 0.0005 0.01 g
Piridoxina-HCl 0.5 0.0005 0.01 g
Pesar y disolver en 80 ml aprox. Aforar a 100 ml (usar agua destilada). Etiquetar Vitaminas 20X-100 ml. De esta solución se deberán tomar 5 ml por cada litro de medio.
MS
MYO-INOSITOL mg/l g/l g/10 (10X)
100 0.1 1.0 g
Pesar y disolver en 80 ml aprox. Aforar a 100 ml (usar agua destilada). Etiquetarar Vitaminas 20X-100 ml. De esta solución se deberán tomar 10 ml por cada litro de medio.
57
12.2. Condiciones ambientales de los cultivos in vitro
Una vez realizada la siembra, los frascos sembrados se tapan y con papel adherente se sella alrededor de las tapaderas, posteriormente deberán colocarse en un cuarto de incubación con temperaturas de 20 -25 ºC. Se pueden colocar en un sitio donde haya buena luminosidad siempre y cuando se encuentre cerca del sitio donde se desarrolle la especie que se trate.
12.3. Características del cuarto de crecimiento Ø Instalación eléctrica (110 y 220 v)
Ø Aire acondicionado para mantener una temperatura de 27 °C Ø Colocar balastras fuera del cuarto de cultivo
Ø Fotoperiodo por nivel (control automático)
Ø Lámparas (Grolux, Solar, Dro-tes o Power Grove), buscar que se cubra todo el espectro de luz
Los cultivos se deberán mantener con un fotoperíodo de 16 horas luz por 8 de oscuridad, una temperatura constante de 25oC y una intensidad lumínica de 2000 lux.
13. PROCEDIMIENTO PARA ESTABLECER EL CULTIVO IN VITRO
59
13. Procedimiento para establecer el cultivo in vitro
13.1. Preparación del medio nutritivo
En las Figuras 21A y 21B podemos observar la secuencia en la preparación del medio de cultivo de interés y por último, refrigerarlo esterilizado para cuando se requiera efectuar la siembra de semillas de alguna especie en particular.
Figura 21A. Selección y Preparación de los medios de cultivo in vitro. Fotos: Carmen Ruíz Bello
Selección de nutrientes Peso de nutrientes
Disolución de nutrientes Ajuste de PH
Se seleccionan y se pesan los nutrientes, se disuelven en agua y se mide el pH recomendado
Continúa la preparación del medio de cultivo in vitro
Añadir agar Frascos Gerber de 100 ml Depositar 20 ml en cada frasco
Frascos en autoclave Esterilizar medio 20 min
Medios esterilizados en refrigeración
Figura 21B. Selección y preparación del medio de cultivo. Fotos: Carmen Ruíz Bello
Se añade el agar al agua, el medio se deposita en frascos Gerber, se esterilizan en autoclave y se guardan en refrigerador.
61
13.2. Siembra de las semillas y germinación de las mismas
En la Figura 22 podemos observar los pasos a seguir para la siembra de las semillas en cultivo in vitro; asi como de la germinación in vitro de las mismas.
Figura 22. Secuenciación de la disección de la cápsula, siembra de semillas in vitro y germinación . Fotos: Carmen Ruíz Bello.
Pasos para la siembra de semillas en el cultivo in vitro 1. Se lava la cápsula con agua y jabón
2. Se introduce la cápsula en alcohol etílico y se flamea. Se repite el mismo procedimiento tres veces
3. Se espera que la cápsula se enfríe y se disecta para extraer las semillas
4. Se recogen las semillas con la ayuda de un bisturí para depositarlas al medio de cultivo dentro del frasco Gerber
5. Se sella el frasco Gerber con papel parafilm 6. Se ponen los frascos en un cuarto de incubación 7. Se observa si hay germinación a los días siguientes
13.3. Formación de protocormos y de hojas
En la Figura 23 podemos observar la formación de los protocormos de las semillas germinadas; y el desarrollo de las hojas de las nuevas plántulas.
63
13.4. Formación de raíces y crecimiento de las plántulas
En la Figura 24 puede apreciarse la formación de raíces y el crecimiento de las plántulas (Figura 25).
Figura 23. Formación de protocormos, desarrollo de las hojas. Fotos: José Luis Moreno Martínez
Figura 24. Formación de raíces, crecimiento de plántulas. Fotos: José Luis Moreno Martínez
65
13.5. Trasvase y separación de las plántulas
Cuando las plántulas tengan competencia alimenticia, hay que trasvasar a medios nuevos separándolas para que puedan nutrirse (Figura 26)
Figura 25. Plántulas de orquídeas, provenientes de semillas germinadas in vitro. Fotos: Carmen Ruíz Bello.
Se continúa el trasvase las veces que se considere necesario hasta que las plántulas alcancen un tamaño adecuado para adaptarlas al medio ambiente. Una vez que las plántulas alcancen un crecimiento considerable, son sacadas de los medios de cultivo in vitro y se busca sembrarlas en un sustrato adecuado
13.6. Adaptación al medio ambiente
Cuando las plantas alcancen un tamaño aproximado de cinco centímetros de altura, se procede a sacarlas de los frascos gerber para adaptarlas a condiciones de invernadero sembrándolas en un sustrato adecuado (Figura 27).
Figura 26. Trasvase de plántulas. Fotos: Carmen Ruíz Bello
67
Un sustrato adecuado puede ser una mezcla de tezontle triturado, cáscara de coco molida y corteza de encino en una proporción 1:1:1. Es importante considerar que la adaptación de las plántulas del laboratorio al invernadero deberá ser en forma paulatina; como se indica a continuación:
1. Trasladar los frascos del laboratorio al invernadero y quitar el plástico adherente 2. Aflojar las tapaderas de los frascos sin quitarlas y dejarlos un día. Se deberán ir
Figura 27. Plántulas en proceso de adaptación en el invernadero. Fotos: Carmen Ruíz Bello
