Cadenas Ligeras Libres
y
Proteínas de Bence Jones
L. Massaro, R. Scaringi
New Scientific Company - Cormano (Milano)
1ª Revisión
- en ocasión deI Reunión sobre “Catene Leggere Libere e Proteine di Bence Jones”
Forlì, 28 mayo 1993
2ª Revisión
- en ocasión deXIV Curso de Bioquímica Clínica - Hospital de la Sta. Creu i Sant Pau
Barcelona, 23 - 26 noviembre 1994
3ª Revisión
- en ocasión deV Reunión sobre “Catene Leggere Libere e Proteine di Bence Jones”
Forlì, 26 mayo 1995
4ª Revisión
- en ocasión deEncuentro “Proteine Urinarie - Clinica e Diagnostica”
Pesaro, 23 junio 1999
5ª Revisión
- en ocasión deCurso CEFAR “ Le Proteine: dal Laboratorio alla Clinica”
Desenzano, 13 – 15 octubre 1999
© New Scientific Company S.r.l.
Via Dante Alighieri, 35 - I - 20032 Cormano (MI) (ITALIA) Tel. +39 02 61 52 021 - Fax +39 02 61 52 154
www.newscientific.com [email protected]
New Scientific Company España, S.r.l.
c/ Valencia, 558 - 08026 Barcelona (ESPAÑA) Tel. +34 93 244 82 94 - Fax +34 93 244 82 95 [email protected]
** trad-SP - rev. 07.06.01 **
Prefacio
La primera edición de este escrito se preparó en ocasión de la primera reunión organizada con el Dr. Palloti, en Forlì, el 28 de mayo de 1993; reunión que, como respuesta a las solicitudes recibidas de distintas partes, tuvo características atípicas; intentando ser un momento de agrupación para expresar libremente dudas, problemas, opiniones, sensaciones, resultados y cualquier otra cuestión relacionada con el tema propuesto.
Se han efectuado nueve reuniones, hasta la última del pasado 18 de junio, y la “comisión” que se constituyó expontaneamente ha trabajado en la evaluación de los métodos para la determinación de las Cadenas Ligeras Libres (CLL) y de las Proteínas de Bence Jones (BJP) en orina.
Los primeros resultados concretos fueron publicados en Biochimica Clinica en 1995, vol. 19, n. 5, en la rúbrica "L'angolo dell'Elettroforesi" de F. Aguzzi con el título "Valutazione Multicentrica di metodi e protocolli per le Catene Leggere Libere e Proteine di Bence Jones in urine - Primi risultati".
En 1997 las Secciones de Liguria de la SIBioC – AIPAC – SIMEL decidieron emprender conjuntamente una iniciativa análoga también coordinada organizativamente por NSC.
Desde entonces la Comisión Liguria ha celebrado tres reuniones, la última el 1 de julio de 1999.
Las comisiones continuan su trabajo con los siguientes objetivos: definición de muestras de control para las Proteínas de Bence Jones, evaluación epidemiológica, evaluación de las correlaciones clínicas, estandarización de la estrategia para la comunicación del resultado (informe).
Predispuse la segunda revisión en ocasión de la reunión organizada en Barcelona por el Dr. Cortés al que agradezco, así como también a los asistentes, el haberme dado la posibilidad de discutir sobre las BJP y las CLL aportando los resultados y experiencias italianas.
Sobre el argumento específico de las CLL y las BJP y, más genericamente en proteinología, la experiencia y las competencias de nuestros Laboratorios de base se colocan, en nuestra opinión, en la vanguardia internacional.
La tercera edición fué en ocasión de la reunión de Forlì del 26 mayo de 1995.
La cuarta edición fué en ocasión de la reunión de Pesaro del 23 de junio de 1999 "Proteine urinarie - Clinica e Diagnostica" y agradezco al Dr. Acetoso la oportunidad que nos quiso brindar.
Esta quinta edición se efectuó en ocasión del Curso CEFAR “Le proteine: dal Laboratorio alla Clinica” VIII edición; agradezco a Francesco Aguzzi el haber posibilitado nuestra participación.
Indice de los temas
Prefacio... 1
Indice de los temas ... 1
Indice de las figuras y tablas... 2
Abreviaturas ... 2
Capítulo I Introducción - Historia - Terminología
3
Introducción... 3Historia ... 3
Terminología... 4
Capítulo II Inmunoglobulinas y Cadenas Ligeras
7
Introducción... 7Estructura... 7
Multiplicidad y Heterogeneidad ... 8
Antisueros... 9
Capítulo III Cadenas Ligeras Libres: Metabolismo y Fisiopatología
13
Introducción... 13Metabolismo de las CLL... 13
Síntesis de las Cadenas Ligeras Libres ... 15
Eliminación de las CLL ... 15
Concentración de CLL en el sujeto normal ... 16
Producción diaria de Ig y CLL... 16
Hemivida de Ig y CLL... 16
Alteraciones del metabolismo de las CLL ... 16
Capítulo IV Cadenas Ligeras Libres: Patologías relacionadas
19
Introducción... 19CLL Monoclonales o Proteínas de Bence Jones... 19
Cadenas Ligeras Libres Policlonales ... 19
Contraindicaciones al uso de medios de contraste... 19
Capítulo V Introducción al Estudio de las Proteínas
21
Introducción ...21
Metodología de Estudio de las Proteínas...21
Variabilidad y Anormalidades de las Proteínas - Técnicas de rutina ...21
Técnicas de Estudio de las Proteínas - Generalidades...22
Capítulo VI Técnicas y Protocolos de Estudio de las CLL
25
Introducción ...25Procedimiento lógico de selección de métodos y protocolos ...25
Selección de Métodos y Protocolos a la luz de las peculiaridades de las CLL: Composición, Distribución, Concentración ...26
Termo-Test - Tiras - Proteínas Totales...28
Electroforesis zonal (EF)...28
InmunoFijación (IFE)...30
InmunoPrecipitación en fase líquida (IPL) Indirecta, con antisueros anti Cadenas Ligeras Totales Nefelometría y Turbidimetría...31
InmunoPrecipitación en fase líquida (IPL) Directa, con antisueros anti Cadenas Ligeras Libres Nefelometría y Turbidimetría...33
Capítulo VII Contrastografías y BJP
35
Introducción ...35Bibliografía: análisis y reflexiones...35
Las Circulares Ministeriales...36
Folletos ilustrativos de las especialidades medicinales ...36
Protocolo PreContrastográfico ...36
Hallazgos accessorios...37
Referencias Bibliográficas... 39
Resumen de Bibliografía ... 41
Indice de las figuras y tablas
Figura 1 - Esquema Estructura Inmunoglobulina ... 7Figura 2 - Multiplicidad y Heterogeneidad de las Inmunoglobulinas... 8
Figura 3 - Esquema de IFE en orina de muestras con CM IgG-k + k libre (BJP-k) ... 10, 31 Figura 4 - Antisueros anti Cadenas Ligeras – esquema de reacción... 11
Figura 5 - Metabolismo de las CLL y sus alteraciones... 14
Figura 6 - Anomalías cuali y cuantitativas de las CLL en orina Resultado analítico e Interpretación ... 15
Figura 7 - Cadenas Ligeras Libres y Patologias relacionadas... 20
Figura 8 - Esquema de la Reacción de InmunoPrecipitación... 23
Figura 9 - Comparación de técnicas para el estudio de las BJP (y CLL) ... 27
Figura 10 - De Monoclonal a Policlonal - Simulación por Ordenador ... 28
Abreviaturas
Las abreviaturas se relacionan en orden alfabético; muchas de ellas son "no estandard". Ab = Anticuerpo
Ag = Antígeno As = Antisuero
BJP = Proteínas de Bence Jones BM = Banda Monoclonal
CL = Cadenas Ligeras en general CLL = Cadenas Ligeras Libres
CLLM = Cadenas Ligeras Libres monoclonales CLLBM = Cadenas Ligeras Libres Banda Multiple CLLP = Cadenas Ligeras Libres policlonales CLLT = Cadenas Ligeras Totales, Libres y Ligadas CM = Componente Monoclonal
EF = Electroforesis (zonal) IEP = Inmunoelectroforesis
IFE = Inmunofijación
Ig = Inmunoglobulinas en general IPL = Inmunoprecipitación en Fase Líquida IPS = Inmunoprecipitación sobre Soporte IR = Insuficiencia Renal
IRA = Insuficiencia Renal Aguda IRC = Insuficiencia Renal Crónica IN = Inmunonefelometria IT = Inmunoturbidimetria LCR = Líquido Céfalo Raquídeo MdC = Medio de Contraste UC = Orinas Concentradas UNC = Orinas No Concentradas
Capítulo I
Introducción – Historia - Terminología
Introducción
Muchos laboratorios en Italia y algunos en España efectúan en rutina, desde 1988, la determinación "directa" de las Cadenas Ligeras Libres (CLL) por Inmunoturbidimetría o Inmunonefelometría.
Son, sin embargo, Tillyer et al. [1], de Londres, que en junio de 1991 publican, en la prestigiosa revista "Journal of Clinical Pathology", la propuesta del método inmunoturbidimétrico "directo" para la determinación de las CLL y de las Proteínas de Bence Jones (BJP) y su cuantificación.
La necesidad de este debate nace de la incertidumbre y de las dudas que la determinación cotidiana de las CLL y las BJP ha hecho surgir en los últimos años, desde que se dispone en rutina de métodos electroforéticos e inmunológicos mucho más sensibles y específicos que el clásico "Termo-Test".
A continuación intento relacionar dichas dudas: a) Fase preanalítica - tipo de muestra:
· orina de 24 horas
· orina de la primera o segunda micción de la mañana · orina extemporánea
b) Unidades de medida
· mg/dl (o g/l, o mg/l) - concentración absoluta en la muestra examinada · mg/24 horas - concentración x diuresis
· mg/creatinina urinaria, etc.
c) Valores de referencia normales para las CLL policlonales (CLLP) d) Definición de un estandard de referencia
e) Sensibilidad necesaria f) Anomalías:
· cualitativas: monoclonales, oligoclonales · cuantitativas
· sus correlaciones clínicas
g) Técnicas y Protocolos de búsqueda h) Modelos Organizativos
Este escrito es un intento de formalizar mis reflexiones sobre el tema de las CLL y las BJP.
El escrito se complementa con una "Relación Bibliográfica", citas y Abstracts de artículos al respecto.
Historia: desde Henry Bence Jones hasta hoy
<< Saturday, Nov. 1, 1845 >> << Dear Dr. Jones, >>
<< The tube contains urine of very high specific gravity. >> << When boiled, it becomes slightly opaque. >>
<< On addition of nitric acid, it effervesces assumes a reddish hue, and becomes quite clear, but as it cool, assumes >> << the consistency and appearance which you see. Heat reliquifies it. What is it ? [2, 3] >>
El uno de noviembre de 1845 el Dr. Henry Bence Jones, notable "Patólogo" de Londres (el mismo osaba definirse "The best 'Chemical Doctor' in London" [4]), recibía del Dr. Thomas Watson primero y poco después del Dr. William MacIntyre, ambos notables "Clínicos", una muestra de orina de un paciente (un importante y rico comerciante de Londres) afectado por "Mollities Ossium".
La muestra le fue enviada porque en los test químico-físicos de la época había mostrado un comportamiento desconocido.
La autopsia del paciente evidenció las típicas lesiones del Mieloma Múltiple [5].
La carta que el Dr. Watson envió al Dr. Jones junto a la muestra de orina no tiene únicamente un valor histórico sino que, sobre todo, evidencia cual era el nivel de colaboración entre clínico y patólogo y de qué importancia pueden llegar a ser los resultados de dicha colaboración.
En 1847 H.B. Jones describía las particulares características químico-físicas de la muestra, hipotetizaba que fuesen debidas a la presencia de una proteína anómala, un "Deutosido Hidrato de Albúmina", y, intuición genial, sugería buscar tal proteína en los pacientes con sospecha clínica de "Mollities Ossium" [2, 3].
Jones había descubierto el primer marcador tumoral
En 1955 experimentos In Vitro con células plasmáticas demostraron que aminoácidos marcados con isótopos radioactivos eran incorporados en las BJP y las proteínas mielomatosas.
En 1962 Edelman y Gally demostraron que las CL obtenidas de las proteínas del suero de un mieloma IgG y las BJP del mismo paciente tenían idénticas características químico-físicas. Edelman formuló la teoría de que las BJP y las CL eran la misma cosa.
En 1963 Porter proponía para la IgG el modelo estructural de cuatro cadenas; dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras.
En 1966 y 1967 Putnam et al. publicaban la secuencia aminoacídica completa de una BJP.
Hoy están demostrados los siguientes puntos fundamentales:
a) En el sujeto normal hay presentes CLL en la sangre, la orina y el líquido cefalorraquídeo y es posible determinarlas cuantitativamente con métodos oportunos.
b) Las CLL del sujeto normal (por simplicidad CLL) y las BJP son sintetizadas "de novo" y no se trata de productos de degradación de las Inmunoglobulinas.
c) Las BJP, las CLL y las Cadenas Ligeras de las Inmunoglobulinas son la misma individualidad molecular en todos los líquidos biológicos.
d) Las BJP y las CLL existen en forma de monómeros, dímeros y polímeros de mayor peso molecular en todos los líquidos biológicos.
e) Las BJP, las CLL y las CL de las Ig, al igual que las Ig enteras y las Cadenas Pesadas, constituyen un “pool” extremadamente heterogéneo debido a las variaciones estructurales que todas estas proteínas presentan tanto en el sujeto normal, ligadas a tipo, alotipo e idiotipo, como, con mayor razón, en el caso de patologías de la producción, que determinan, en el ámbito de una substancial homogeneidad:
· variaciones del punto isoeléctrico y por tanto de la movilidad electroforética.
· variaciones de algunos determinantes antigénicos y por ello de su reactividad en las técnicas inmunológicas. · variaciones del metabolismo y de la función.
La heterogeneidad de su homogeneidad es el hilo conductor del estudio y la clave del análisis de las Ig y de las CL.
Más de 100 años han transcurrido entre la individualización de una proteína anómala y su caracterización estructural, metabólica y fisiopatológica.
La historia de las BJP es un ejemplo de como la metodología de estudio típica de una ciencia o de uno de sus sectores puede ser desviada por una intuición accidental.
Hoy, después de 150 años de su identificación, estamos todavía ocupados en discutir sobre las BJP (y las CLL) y veremos que hay todavía elementos no definidos, empezando por su metodología de estudio en la práctica cotidiana. Hay además otros interrogantes que esperan respuesta:
¿porqué existen dos tipos de Cadenas Ligeras?
¿porqué producimos y catabolizamos 170 mg/día de CLL? [6] ¿cuál es la función de las CLL?
A la genial intuición de H.B. Jones es de imputar, al menos en parte, el haber relegado el estudio de las CLL únicamente al ámbito del "Mollities Ossium".
Terminología
Tanto en la bibliografía como en el uso corriente hay confusión; los términos "Proteínas de Bence Jones", "Cadenas Ligeras" y "Cadenas Ligeras Libres" son incorrectamente usados de manera intercambiable, casi como si fuesen sinónimos, incluso en el ámbito de un mismo artículo.
Dada la complejidad del argumento es necesario definir una terminología clara y unívoca.
Terminológía de uso corriente y empleada en este escrito
A continuación probaremos a definir los términos de uso corriente que utilizaremos en este escrito.
Banda Monoclonal (BM) o Componente Monoclonal (CM):
Banda electroforética estrecha que reacciona con un sólo tipo de antisuero anti Cadena Pesada y/o un sólo tipo de antisuero anti Cadena Ligera.
Las BM pueden estar constituidas por Inmunoglobulinas Enteras, por sólo las Cadenas Pesadas, por sólo las Cadenas Ligeras (Cadenas Ligeras Libres) o por una combinación de ellas.
Ejemplos:
BM o CM IgG-κ = Banda electroforética estrecha que reacciona exclusivamente con los As anti γ y anti κ. BM o CM CLL-λ = Banda electroforética estrecha que reacciona exclusivamente con el As anti CLL-λ. Excepciones: una CM puede estar constituida por dos Ig o por una Ig y una CLL. Ejemplo: BM IgG-λ + CLL-κ. En una muestra pueden estar presentes dos y hasta excepcionalmente tres CM del mismo tipo o de tipos distintos. Advertencia: la monoclonalidad no se expresa necesariamente con la típica "banda estrecha"; un Clon maligno de células-B puede producir una banda larga que, eso si, reacciona sólo con el antisuero de una de las dos clases de cadenas ligeras [7].
Proteínas de Bence Jones (BJP) o Cadenas Ligeras Libres Monoclonales (CLLM):
Banda electroforética estrecha que reacciona exclusivamente con un tipo de antisuero anti Cadena Ligera Libre o, por vía indirecta, que reacciona con un sólo tipo de antisuero anti Cadena Ligera Libre y Ligada (Antisuero anti Cadenas Ligeras Totales - CLT) y no reacciona con ninguno de los antisueros anti Cadena Pesada.
En una muestra pueden estar presentes dos o más Bandas de BJP, en general del mismo tipo.
Cadenas Ligeras Libres Policlonales (CLLP):
Banda electroforética larga que reacciona con ambos antisueros anti CLL. Las CLLP pueden coexistir con las BJP.
Cadenas Ligeras Libres Bandas Múltiples (CLLBM) y “Ladders”:
Múltiples Bandas electroforéticas estrechas que reaccionan con uno o ambos tipos de As anti CLL; pueden tomar un aspecto característico llamado "ladder" (escalera de peldaños) [4, 8]. Pueden coexistir con una BJP.
La opinión personal
Hoy en día está determinada la estructura, incluso como secuencia aminoacídica, el metabolismo, la fisiología de las CLL y de las Ig, y es también conocida y sistematizada una amplia patología y mecanismos patogenéticos ligados a estas proteínas; están disponibles y son utilizados, incluso en rutina, métodos y procedimientos de estudio enormemente más sofisticados que el "Termo Test" de Bence Jones y sucesivas modificaciones.
Por ello, en mi opinión, sin con eso pretender quitar ningún mérito a la genial intuición de H.B. Jones, pero tomando nota de la evolución de los conocimientos adquiridos en los siguientes 150 años, el término "Proteínas de Bence Jones" debería ser substituido por el de "Cadenas Ligeras Libres" seguido, si es necesario, por el atributo "monoclonales", "oligoclonales" y "policlonales" según su aspecto después de la separación electroforética.
A propósito de estos atributos espero que me sea permitida una reflexión.
La ciencia médica raramente permite procedimientos experimentales rigurosos, positivos y prospectivos, típicos de las "ciencias exactas" (por ejemplo, no podremos someter a una inyección de medios de contraste a un número estadísticamente suficiente de pacientes afectados por mieloma, con el objeto de establecer con certeza si el mieloma es un factor de riesgo para las contrastografías), sino que permite sólo la asociación lógica de observaciones que inducen deducciones probables.
El laboratorio no puede asegurar la relación entre el aspecto electroforético de las Ig y la "clonalidad" de su producción; por ello sería prudente limitarse a describir aquello que se ve, substituyendo los términos "banda monoclonal" o "componente monoclonal" por el de "banda anómala estrecha" y el término "policlonal" por el de "mancha difusa", u otros términos análogos.
Debe considerarse que, como se ha señalado, la monoclonalidad no se expresa necesariamente con la típica "banda estrecha"; un clon maligno de células-B puede producir una banda larga que, sin embargo, reacciona con sólo el antisuero de una de las dos clases de Cadenas Ligeras [7].
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Capítulo II
Inmunoglobulinas y Cadenas Ligeras
Introducción – Estructura – Multiplicidad y Heterogeneidad - Antisueros
Introducción
Las Inmunoglobulinas difieren de las demás proteínas por un conjunto de características peculiares sintetizables en: multiplicidad: Clases, Tipos, Subtipos.
heterogeneidad: en el ámbito de una misma Clase, Tipo y Subtipo. especificidad anticorpal.
En efecto, una ciencia entera, la Inmunoquímica, se ha desarrollado sobre las interacciones entre antígeno y anticuerpo, sobre el mecanismo de la biosíntesis de los anticuerpos, sobre la naturaleza de la especificidad del anticuerpo y sobre la identificación y cuantificación de proteínas y otras substancias, tanto de alto como de bajo peso molecular, con métodos inmunológicos.
Las Inmunoglobulinas (Ig) se definen como proteínas de origen animal con reconocida actividad anticorpal; en el término de Ig se incluyen también algunas proteínas relacionadas con los anticuerpos por su estructura química y especificidad antigénica, entre las cuales tienen una particular dignidad las Cadenas Ligeras Libres (CLL).
Todas estas proteínas son producidas por el sistema de las Células Linfoides de los vertebrados y circulan normalmente por su sangre, pero se encuentran también en muchos otros líquidos biológicos.
Las Ig migran electroforéticamente en zona γ hasta la zona β. Su característica química más importante es la heterogeneidad.
Las Ig del plasma normal y la mayor parte de los anticuerpos purificados muestran características heterogéneas para los distintos parámetros testados: físico-químicos, biológicos y estructurales.
Una heterogeneidad tan exagerada habría hecho muy difícil el estudio de las Ig; los progresos reales de los conocimientos sobre las Ig y las CLL se han basado en el estudio y el análisis de las BJP y de las Ig mielomatosas, aprovechando su relativa homogeneidad.
Podemos decir que los pacientes mielomatosos, un desafortunado experimento de la naturaleza, han permitido el
progreso de los conocimientos sobre la estructura y las demás características de las Ig.
Recomendando el estudio de la bibliografía para una profundización, es necesario subrayar, y continuaremos haciéndolo en este escrito, la multiplicidad y la heterogeneidad de las Ig y sus componentes.
Basta pensar que Putnam, entre las muchas BJP e Ig monoclonales estudiadas, no ha encontrado nunca dos estructuras idénticas.
Estructura
La unidad estructural monomérica de las
Inmunoglobulinas está compuesta por:
Figura: 1 Esquema Estructura Inmunoglobulina
dos Cadenas Pesadas (Cad. H = Heavy) (CP)idénticas, del mismo tipo.
dos Cadenas Ligeras (Cadena L = Light) (CL) idénticas, del mismo tipo.
Son conocidos cinco tipos de Cadenas Pesadas (CP), convencionalmente denominadas: γ, α, µ, δ, ε, y algunos Subtipos. Dichas Cadenas Pesadas caracterizan las cinco Clases de Inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE.
Son conocidos dos tipos de Cadenas Ligeras (CL) convencionalmente denominadas: κ y λ. Dichas Cadenas Ligeras caracterizan los dos Tipos de Inmunoglobulinas: Ig-κ e Ig-λ.
Las IgG son típicamente monómeros.
Las IgA están presentes como monómeros, dímeros o polímeros de mayor coeficiente de sedimentación.
Las IgM están presentes como pentámeros o polímeros de mayor coeficiente de sedimentación.
Las Cadenas Ligeras Ligadas a las Cadenas Pesadas formando la Inmunoglobulina, tienen algunos determinantes antigénicos "ocultos" ("hidden"), es decir determinantes que no son capaces de reaccionar con el antisuero, porque están esterificadamente enmascarados.
Las Cadenas Ligeras Libres (CLL) tienen "expuestos", es decir capaces de reaccionar con el antisuero, incluso aquellos determinantes que están "ocultos" cuando están ligadas a la Cadena Pesada.
Esta característica permite obtener antisueros que reaccionan sólo con los determinantes "ocultos" ("hidden") de las Cadenas Ligeras y por lo tanto evidencian directa y específicamente las Cadenas Ligeras Libres.
Multiplicidad y Heterogeneidad
La multiplicidad y heterogeneidad de las Inmunoglobulinas se puede formalizar como sigue:
A) Clase, Subclase y Tipo
Los tipos y subtipos de las Cadenas Pesadas caracterizan la Clase y Subclase de la Inmunoglobulina, mientras que las Cadenas Ligeras caracterizan su Tipo.
Por ejemplo con "IgG1-κ" entendemos una Ig que monta Cadenas Pesadas Tipo "γ", Subtipo "γ1" y Cadenas Ligeras Tipo "κ".
B) Isotipo
Con este término se entienden aquellos determinantes antigénicos que caracterizan los tipos y subtipos de las Cadenas Pesadas y de las Cadenas Ligeras y que son comunes a todos los individuos de la misma especie y específicos y exclusivos de ella.
Los determinantes isotípicos permiten obtener los antisueros comerciales utilizados en las técnicas inmunológicas de rutina para el estudio cualitativo y cuantitativo de las Ig y de las CL.
C) Alotipo
Las Cadenas Pesadas y las Cadenas Ligeras de los individuos de una misma especie tienen, además de grupos antigénicos comunes, también grupos antigénicos que no son comunes a toda la especie sino sólo a un grupo de individuos de la misma.
D) Ideotipo
Las Inmunoglobulinas de la misma Clase y Tipo del mismo individuo tienen, además de los grupos antigénicos comunes a todos los individuos de la misma especie y los grupos antigénicos comunes a los individuos con idéntico alotipo, también grupos antigénicos específicos del "Sito Combinatorio Anticorpal".
El Sito Combinatorio está constituido por la parte terminal de la Cadena Pesada y de la Cadena Ligera acopladas. La especificidad anticorpal está determinada por la variabilidad de la estructura de esta parte terminal de la Inmunoglobulina.
Un Clon plasmacelular es capaz de producir Inmunoglobulinas con una sóla especificidad anticorpal y, por lo tanto, con el sito combinatorio idéntico.
Si es cierto que la característica principal, bajo cualquier punto de vista, de las Ig es su heterogeneidad resulta obvio que la alteración de tal característica, la presencia de Ig homogéneas, se corresponde a una situación anómala, patológica.
Figura: 2
Multiplicidad y Heterogeneidad de las Inmunoglobulinas - Putnam, Vol. III, pag. 36
Efectos de la Heterogeneidad
Los efectos de la heterogeneidad de las Inmunoglobulinas son múltiples y complejos, pero aquí nos interesa resaltar dos:
posibilidad de obtener antisueros específicos a diversos niveles, de los cuales los mas utilizados lo son a nivel de Isotipo.
efectos sobre las técnicas de laboratorio.
A continuación ampliaremos este segundo punto mientras que de los antisueros se hablará más adelante en un próximo capítulo.
Efectos sobre las técnicas de laboratorio
Electroforesis Zonal (EF)
La típica mancha difusa que caracteriza la "zona gamma" de la EF de las proteínas séricas del sujeto normal es la expresión de la heterogeneidad de las Inmunoglobulinas y más precisamente expresa:
Clase, Subclase y Tipo Ideotipo.
Puesto que tal heterogeneidad expresa la multiplicidad de los clones plasmacelulares, las Inmunoglobulinas que constituyen la zona gamma de una EF normal son llamadas "Inmunoglobulinas Policlonales", término que se contrapone al de "Inmunoglobulinas Monoclonales", es decir Ig con una reducida heterogeneidad, producidas por un solo clon, cuya expresión electroforética recibe la denominación de "Banda Monoclonal" (BM) o Componente Monoclonal" (CM).
La Banda Monoclonal, característica peculiar pero no exclusiva de los Mielomas y de la Macroglobulinemia de Waldenström, es la expresión electroforética de la prevalencia de un clon respecto a los demás.
La EF y las técnicas basadas en ella, como la IFE, son las únicas disponibles en rutina para valorar la heterogeneidad de las Inmunoglobulinas; por otra parte suministran una información sólo semicuantitativa y su sensibilidad decrece desde una distribución monoclonal a una policlonal (como se detalla más adelante).
Inmunoprecipitación en fase líquida (IPL) - nefelometría y turbidimetría
Estas técnicas que en un primer análisis podrían considerarse "precisas" y "exactas" no proporcionan ninguna información sobre la heterogeneidad de las Ig o dan una información sólo indirecta, por ejemplo en el caso de un importante aumento cuantitativo de una Ig contemporáneo a una disminución de las demás.
Sin embargo, en el caso de una reducida heterogeneidad de las Ig, pueden resultar inexactas por la falta de paralelismo entre la heterogeneidad de composición de la muestra y la del calibrador.
Antisueros
La posibilidad de obtener antisueros contra las distintas Clases y Subclases de Ig y de CL está ligada a los determinantes antigénicos isotípicos de las Cadenas Pesadas, de las Cadenas Ligeras y de los fragmentos de Ig: Fc, Fab, etc.
Los animales más utilizados son la cabra, la oveja y el conejo.
Los antisueros están disponibles comercialmente en varias "preparaciones"; las más comunes son: Antisuero Estándar o Total: es el suero entero, sólo deslipemizado, del animal inmunizado.
Antisuero Fracción Ig o IgG: es la fracción Ig o IgG obtenida del suero del animal inmunizado; por ejemplo, Antisuero IgG de cabra anti IgG humanas.
Estos antisueros, por estar constituidos por sólo la fracción Ig o IgG del suero animal, dan un “fondo” inferior respecto a los antisueros Totales, ventaja evidente sobre todo en las técnicas de inmunoprecipitación en gel seguidas de coloración: IFE, etc.
Antisueros anti Inmunoglobulinas
Los antisueros anti clases y subclases de las Inmunoglobulinas se obtienen inmunizando al animal con la Cadena Pesada de las Ig humanas. Por lo tanto un antisuero anti IgG se obtiene inmunizando con la Cadena Pesada γ humana y reaccionará con todas las IgG tanto κ como λ.
Además de los antisueros específicos para las distintas clases y subclases de Ig hay disponibles antisueros polivalentes: trivalente para las tres clases principales de Ig: IgA+IgG+IgM
pentavalente para las cinco clases de Ig: IgA+IgG+IgM+IgD+IgE.
Antisueros anti Cadenas Ligeras
La posibilidad de obtener antisueros contra los dos Tipos de Cadenas Ligeras humanas está ligada a sus determinantes antigénicos isotípicos. Con los procedimientos oportunos son realizables dos tipos de antisuero anti Cadenas Ligeras: Antisuero anti Cadenas Ligeras Libres y Ligadas o Cadenas Ligeras Totales (CLT) - κ y λ
Antisuero anti Cadenas Ligeras Libres (CLL) - κ y λ. Veámoslo más detalladamente con la ayuda de la Figura: 4.
Antisuero anti Cadenas Ligeras Libres y Ligadas o Cadenas Ligeras Totales (CLT)
Son dos antisueros, anti κ y anti λ, que se obtienen inmunizando al animal con las CLL humanas κ y λ respectivamente. El animal producirá anticuerpos contra todos los determinantes antigénicos de las CLL, tanto aquellos "ocultos" como aquellos "no ocultos".
Estos antisueros reaccionan indiferentemente con:
las Ig enteras, puesto que reaccionan con los sitos antigénicos "no ocultos" de las CL que las constituyen las CLL, puesto que reaccionan con todos sus determinantes "no ocultos" y "ocultos".
Antisuero anti Cadenas Ligeras Libres
Se obtiene eliminando de los antisueros anti CLT los anticuerpos dirigidos contra los sitos antigénicos "no ocultos" de la CL; para ello se hace reaccionar el As anti CLT con Ig enteras y se recuperan los anticuerpos que no han reaccionado; estos anticuerpos están evidentemente dirigidos únicamente contra los sitos antigénicos "ocultos" de la CL.
Un antisuero así obtenido reacciona con las CL sólo si están Libres (CLL) puesto que sólo en este caso están expuestos los determinantes "ocultos".
Comparación entre As anti CLT y As anti CLL
Para el estudio inmunológico de las CLL a menudo se prefieren utilizar As anti CLT y procedimientos indirectos en lugar de usar As anti CLL y procedimientos directos.
Las críticas a los antisueros anti CLL son: baja reactividad
reactividad inespecífica con las CL de las Ig coste más elevado respecto a los As anti CLT
Por lo que respecta a los dos primeros puntos desde hace ya algunos años hay más de un productor capaz de suministrar antisueros anti CLL que, utilizados para la IEF y la IFE, tienen una reactividad muy buena y no evidencian ninguna reacción inespecífica con las CL de las Ig.
Excepcionalmente sucede que tales antisueros, en la IFE, dan reacciones tenues (aunque visibles) debido al hecho de que una BJP puede tener un número muy pequeño de epítopes reconocidos por el antisuero.
Para la inmunoprecipitación en fase líquida (IPL), turbidimetría y nefelometría, son necesarios algunos ajustes para obtener resultados satisfactorios con los As anti CLL, tanto en términos de especificidad como en términos de reactividad.
En relación al coste, veremos también más adelante que, si no se considera únicamente el "Ahorro de Caja", es decir el coste por ml de antisuero, sino el "Ahorro de Gestión", es decir el coste conjunto de la determinación de las CLL o de las BJP, la conveniencia del uso de los As anti CLT respecto a los As anti CLL puede resultar a favor de estos últimos, sin contar con que su resultado es más fiable.
Anticipando lo que se dirá mejor a continuación, no podemos compartir la opinión de que, para la búsqueda de las BJP en la orina con la IFE, sea suficiente el uso de los As anti CLT.
Esta opinión se apoya sobre la hipótesis de que, en el caso no infrecuente de eliminación urinaria tanto de la Ig monoclonal como de la CLL monoclonal (BJP), la BJP migre de manera distinta respecto a la Ig y por lo tanto resulte evidente como una banda separada, autónoma, que reacciona sólo con el As anti CLT, bien diferenciada de la banda que reacciona tanto con el As anti CLT como con el As anti Cadena Pesada.
Contrariamente, sucede frecuentemente que la BJP está perfectamente superpuesta a la Ig monoclonal y por ello no es distinguible con el As antiCLT mientras queda claramente evidenciada con el As anti CLL (Figura: 3).
En la Figura 4 se esquematiza la reacción de los dos tipos de antisueros anti CL.
Figura: 3
Esquema de IFE urinaria de muestra con CM IgG-k + k libre (BJP k)
-Ref IgG IgA IgM CLT-κ CLT-λ Ref Ig CLT-κ CLT-λ CLL-κ CLL-λ
Izquierda Derecha
Informe: CM IgG-k - BJP ausente Informe: CM IgG-k + BJP-k
IFE con A s anti Ig (polivalente Cadenas Pesadas) y A s anti CLT y CLL.
IFE "tipo suero" con A s anti CLT, sin A s anti CLL.
Las BJP presentes en la muestra tienen la misma velocidad de migración que la Ig entera y por lo tanto no se evidencian si no es con el uso de As anti Cadenas Ligeras Libres.
Figura: 4
Antisueros anti Cadenas Ligeras – Esquema de reacción
Se esquematiza la distinta reacción de los dos tipos de antisuero anti Cadenas Ligeras: As anti Cadenas Ligeras Totales y As anti Cadenas Ligeras Libres.
Capítulo III
Cadenas Ligeras Libres: Metabolismo y FisioPatología
Introducción
La referencia bibliográfica fundamental para este capítulo es la revisión de Sölling [6].
La concentración de las CLL (y de cualquier otro metabolito) en los distintos líquidos biológicos, o compartimentos, es la resultante de:
volumen del compartimento
cantidad del elemento en entrada en el compartimento: · por producción en elementos estructurales del compartimento · por entrada desde otro compartimento
cantidad del elemento en salida del compartimento: · por el paso a otro compartimento
· por transformación en otro elemento dentro del mismo compartimento.
La contemporánea "normalidad" de la concentración en los distintos compartimentos depende de la "normalidad" de los flujos, que a su vez son función de la "normalidad" de:
estructuras
mecanismos funcionales interferencias
compensaciones.
Por lo tanto si, por simplicidad, en general medimos la concentración de un analito, esta, por su propia estaticidad, no puede ser una expresión exhaustiva del complejo mecanismo dinámico que la determina y para una mejor interpretación será necesario tener presentes los elementos detallados.
Concretamente, para interpretar la concentración y la calidad: mono, oligo o policlonal de las CLL en la orina (y en los otros líquidos biológicos: sangre, LCR, etc.) deberemos tener presente:
las estructuras y los mecanismos de síntesis y entrada en círculo las estructuras y los mecanismos de eliminación en la orina los tiempos: expresados por la hemivida
los volúmenes: volemia y diuresis las interferencias y las compensaciones.
En las páginas siguientes se describen esquemáticamente las estructuras y los mecanismos implicados para determinar la concentración de las CLL en la sangre y la orina.
Metabolismo de las Cadenas Ligeras Libres
Las Cadenas Ligeras Libres (CLL), al igual que las Inmunoglobulinas (Ig), son producidas e inmersas en círculo por las células plasmáticas.
La producción de CLL (kappa+lambda), es decir de Cadenas Ligeras no incorporadas en las Inmunoglobulinas completas, es de alrededor de 170mg/24h y constituye el 10-20% de la producción diaria total de Cadenas Ligeras (CL)[6].
El catabolismo de las CLL se realiza casi enteramente en el riñón.
La concentración de CLL en la sangre del sujeto normal es muy baja (≈2mg/dl) [6] aún siendo importante la cantidad inmersa en círculo puesto que, por su bajo peso molecular (22.000 para el monómero), pasan rápidamente al Filtrado Glomerular (FG).
Igualmente baja es la concentración en la orina (≈5mg/24h) [6] dado que las CLL presentes en el FG son reabsorbidas y catabolizadas por el Túbulo Proximal.
Desde el punto de vista renal el comportamiento de las CLL es análogo al de las demás Microglobulinas: β2-micro, α1-micro, etc. [6].
En el sujeto con Filtrado Glomerular normal, la hemivida de las CLL está valorada entre 30 y 60 minutos [6], si se excluye su estacionamiento en la vejiga.
Las CLL en la orina expresan el equilibrio entre la síntesis en las Células-B y el catabolismo renal (filtración glomerular y reabsorción tubular) en el período entre la última micción y la actual, o en el período de la toma de muestra [9].
Un aumento de la concentración de CLL en la orina, tal que sea evidenciable con los métodos de rutina de los Laboratorios, puede estar determinado por:
aumento de la producción de CLL al que sigue un aumento de su concentración en el Filtrado Glomerular y superación de la capacidad específica actual de reabsorción tubular.
reducción de la capacidad específica actual de reabsorción tubular. concurrencia de las dos situaciones precedentes.
Las CLL en la orina serán policlonales (CLLP) o monoclonales (CLLM - Proteínas de Bence Jones - BJP) o las dos contemporáneamente según la calidad de la producción de las Células-B.
Algunas técnicas electroforéticas caracterizadas por una alta resolución y sensibilidad muestran las CLLP distribuidas en lugar que en la tradicional mancha difusa, en bandas estrechas y homogéneas, de 3 a 7, organizadas en un esquema característico denominado "ladder" ("escalera de peldaños") [4, 8].
Este fenómeno no tiene por ahora una explicación segura, pero ciertamente crea algunos problemas a la hora de la interpretación diferencial de las CLLP y las BJP, empeorados por la posibilidad de superposición de ambas situaciones [4, 8].
En la Figura 5 se esquematiza el metabolismo de las CLL y sus alteraciones y en la Figura 6 el resultado cuali/cuantitativo de la búsqueda de las CLL en orinas patológicas y sus relativas interpretaciones.
Figura: 5
Metabolismo de las CLL y sus alteraciones
Figura: 6
Anomalias cuali/cuantitativas de las CLL en Orina – Resultado analítico e Interpretación
Resultado analítico Interpretación
Inmunoglobulinas y Cadenas Ligeras Libres en Orina
Cadenas Ligeras Libres Monoclonales Cadenas Ligeras Libres "Oligoclonales"
otras situaciones de significado incierto: ej. "Ladders" o "Pseudo-Oligoclonales" Cadenas Ligeras Libres Policlonales Enferm. Hiperinmunes
Función Tubular Alterada
otras informaciones
Inmunoglobulinas Monoclonales Ig Monoclonal en el suero con Función Glomerular Alterada Inmunoglobulinas Policlonales Función Glomerular Alterada Combinaciones de los casos precedentes
Bence Jones - Inmunoproliferativas Bence Jones - Inmunoproliferativas
Síntesis de las Cadenas Ligeras Libres
La célula plasmática sintetiza separadamente las Cadenas Ligeras Libres y las Cadenas Pesadas de las Inmunoglobulinas.
El ensamblaje en la unidad estructural monomérica se realiza después de su liberación en las cisternas del retículo endoplasmático.
Aunque la síntesis de Cadenas Ligeras y Cadenas Pesadas es un proceso muy bien balanceado, la presencia de Cadenas Ligeras Libres en la sangre del sujeto normal induce a suponer que las Cadenas Ligeras son producidas en ligero exceso respecto a las Cadenas Pesadas.
No está claro si este ligero desequilibrio es una característica de todos o sólo de algunos clones plasmacelulares. Las anomalías de la síntesis de las CLL son un reflejo de las anomalías de la síntesis de las Ig, a las que hay que añadir el Mieloma Micromolecular que tiene su equivalente en la “Enfermedad de Cadenas Pesadas”. Dichas anomalías se pueden agrupar como sigue:
reducción de la síntesis: hipo y agammaglobulinemia. aumento de la síntesis:
· monoclonal: en las enfermedades inmunoproliferativas. · policlonal: en las enfermedades hiperinmunes.
Eliminación de las Cadenas Ligeras Libres
Las CLL monoméricas tienen un peso molecular de alrededor de 22.000, 44.000 los dímeros y 88.000 los tetrámeros. Por lo tanto, análogamente a como sucede con otras proteínas de bajo peso molecular: beta2-microglobulina, alfa1-microglobulina, etc., las CLL filtran fácilmente a través del glomérulo renal y son reabsorbidas por el túbulo proximal donde son catabolizadas a aminoácidos, los cuales son reinmersos en círculo.
No parece existir un mecanismo de transporte del túbulo a la sangre.
Es necesario recordar que las células y más en general las estructuras, tienen una capacidad de trabajo característica en calidad y cantidad.
En el caso de las CLL la célula del túbulo proximal realiza dos operaciones: reabsorve las CLL presentes en el Filtrado Glomerular (FG).
cataboliza las CLL reabsorvidas.
Reabsorción Tubular
La primera fase de la reabsorción tubular de las CLL (y de las otras proteínas presentes en el filtrado glomerular) es el enlace que se formaría entre los grupos amínicos y guanídicos libres de la proteína (positivos) y los "sitos" negativos de la superficie de la Célula Tubular.
Este mecanismo está confirmado por la observación de que la inyección endovenosa de Arginina en un sujeto normal determina el inmediato (al cabo de 2 minutos desde el inicio del suministro) y dosis-dependiente incremento de la excreción urinaria de albúmina, beta2-microglobulina y CLL.
La excreción se normaliza al cabo de unos 20-40 minutos después de finalizar el suministro.
Experimentos similares realizados con una serie de otras substancias confirman la hipótesis expuesta.
Catabolismo Tubular
Las CLL reabsorbidas son catabolizadas por las células tubulares.
El aumento de la carga en CLL y el consiguiente aumento de su reabsorción pueden determinar la saturación de la capacidad catabólica y el acúmulo de CLL en la célula tubular y por ello sufrimiento celular.
La distinta nefrotoxicidad de las CLL podría incidir a este nivel.
Concentración de CLL en el sujeto normal
La concentración de CLL en la sangre del sujeto normal es muy baja (≈2mg/dl) incluso siendo importante la cantidad inmersa en círculo (≈170mg/24h) dado que, por su bajo peso molecular, pasan rápidamente al Filtrado Glomerular (hemivida de 30-60 minutos excluyendo el almacenamiento en la vejiga [9]).
Igualmente baja es su concentración en la orina (≈5mg/24h) dado que las CLL presentes en el FG son reabsorvidas y catabolizadas por el túbulo proximal.
Puede concluirse que tanto en la sangre como en la orina del sujeto normal: las CLL estan presentes en cantidades "mínimas".
las CLL presentes son “policlonales”.
Producción diaria de Ig y de CLL
El hecho de que las CLL esten presentes en poca cantidad en el suero y en la orina no significa que la cantidad producida por las células plasmáticas sea igualmente pequeña.
El metabolismo de las Ig es de 2-3 g/24 h para la IgG, 0,6-2 g/24 h para la IgA y 0,4 g/24 h para la IgM; esto significa que en 24 h se metaboliza un total de Ig de alrededor de 3-5,4 g.
Dado que las CL constituyen alrededor del 30% de las Ig se puede calcular que en 24h se incorporan en las Ig 0,9-1,6 g de CL.
Se ha calculado que la cantidad de CLL filtrada por el glomérulo es de alrededor de 170 mg/24h: 110 mg/24h para las κ y 60 mg/24h para las λ.
Esto quiere decir que el 10-20% de las CL producidas no es incorporado en las Ig.
Esta cantidad no es obviamente despreciable ni en términos absolutos ni en términos relativos e induce a reflexionar sobre cual puede ser la función real de las CLL.
Hemivida de Ig y de CLL
La hemivida de las IgG es de 21 días para las IgG1, IgG2 e IgG4, y de 7-9 días para las IgG3; la hemivida de las IgA es de 6 días y la de las IgM es de 5 días, mientras la hemivida de las CLL es de alrededor de 1 hora.
De ello deriva que las Ig del suero son la expresión de la producción plasmacelular de varios días, digamos unos 15. Las CLL en la orina del sujeto normal (o con filtrado glomerular normal) son la expresión de la producción plasmacelular ocurrida durante el período de estacionamiento en vejiga de la orina o durante el período de la toma de muestra.
Parece demostrado que sólo pocos clones están contemporáneamente activos produciendo Ig (y CLL) y por lo tanto en el sujeto normal la "producción instantánea" de Ig (y de CLL) sería "oligoclonal".
Si es cierta esta hipótesis, dada la hemivida de Ig y de CLL, las Ig resultan policlonales en la EF del suero (y de la orina) porque son la expresión de la producción de clones de alrededor de 15 días, mientras que las CLL pueden resultar oligoclonales en la EF de la orina porque son la expresión de la producción realizada durante la recogida.
Alteraciones del metabolismo de las CLL
Una vez definida la estructura e individualizado el lugar y mecanismo de producción y de eliminación de las CLL, podemos esquematizar que sucede en el caso de un incremento de producción o disminución del catabolismo.
Aumento de producción
causa: aumento del número de células productoras efecto:
· aumento de la cantidad de CLL inmersas en círculo
tal incremento no determina un aumento de la concentración hemática de CLL hasta que el Filtrado Glomerular no se reduce hasta los 30ml/min. Puesto que las CLL pasan libremente el Filtro Glomerular.
· incremento de la cantidad de CLL en el Filtrado Glomerular · incremento de la cantidad de CLL reabsorvidas por el Túbulo
· si la cantidad de CLL en el filtrado glomerular supera la capacidad actual de reabsorción del túbulo las CLL no reabsorvidas seran eliminadas en la orina definitiva.
· si la cantidad de CLL reabsorvidas por la Célula Tubular supera la capacidad catabolica actual de la Célula Tubular se tendrá un acúmulo de CLL en la célula y consiguientemente sufrimiento celular.
El déficit tubular secundario a la sobrecarga determina el cierre del círculo vicioso.
La nefrotoxicidad de las CLL parece estar más ligada a la calidad que a la cantidad; hay pacientes que eliminan pequeñas cantidades de BJP y evidencian un rápido e irreversible compromiso renal, mientras otros eliminan una importante cantidad de BJP durante años sin evidenciar daños renales.
En síntesis, el proceso puede esquematizarse como sigue: incremento de la cantidad de CLL en círculo
sobrecarga tubular y consiguiente proteinuria daño tubular.
Disminución del catabolismo
causa: deficit de la reabsorción tubular de las CLL por: · insuficiencia tubular primaria
· insuficiencia tubular secundaria por sobrecarga de CLL o o de otras substancias: aminoácidos, fármacos, etc. efecto:
· cantidad normal de CLL en círculo y por lo tanto en el Filtrado Glomerular
· reducción de la cantidad de CLL reabsorvidas por el Túbulo y eliminación en la orina de las CLL no reabsorvidas.
Aumento de las CLL en la Sangre
Para que se pueda verificar un aumento de la concentración hemática de CLL es necesario que haya una filtración glomerular insuficiente para la carga actual de CLL.
Así, tomemos en examen algunas hipótesis:
si aumenta la síntesis de CLL, a menos que tal aumento non sea imponente, la concentración hemática no sufrirá variaciones apreciables mientras que el filtrado glomerular sea suficiente.
como incluso en el sujeto normal hay una pequeña cantidad de CLL inmersas en círculo, una reducción del filtrado glomerular determinará un aumento de la concentración de CLL en la sangre.
En efecto, en pacientes con Filtrado Glomerular inferior a 5-10 ml/min. y sin presumible aumento de la síntesis de CLL, la concentración de CLL en la sangre resulta entre 5 y 8 veces aumentada respecto a la del sujeto normal [6].
Contrariamente, pacientes con Mieloma Micromolecular y BJP enorme, superior a 400 mg/dl (y 4600 mg/día), pueden presentar una concentración sérica de CLL normal [6].
Aumento de las CLL en la Orina
Las causas que determinan el aumento de concentración de las CLL en la orina son esquematicamente:
aumento de la síntesis y consiguiente aumento en el filtrado glomerular suficiente para superar la capacidad de reabsorción del túbulo proximal:
· si el aumento de síntesis es monoclonal u oligoclonal tendremos en la orina respectivamente CLL monoclonales u oligoclonales.
· si el aumento de síntesis es policlonal tendremos en la orina CLL policlonales. reducción de la reabsorción específica del túbulo proximal por:
· interferencia y competición de otras substancias presentes en el filtrado glomerular; por ejemplo: aminoácidos tipo arginina, lisina, etc., fármacos, etc.
· funcionalidad reducida debida a daño tubular.
En ambos casos las CLL en la orina reflejarán el tipo de producción. combinación de ambas situaciones precedentes.
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Capítulo IV
Cadenas Ligeras Libres – Patologías Relacionadas
Introducción
Para profundizar sobre este argumento aconsejamos estudiar el óptimo tratado de Fang [10], que se esquematiza en la Figura 7.
En la práctica de Laboratorio la determinación de las CLL asume una validez distinta según se trate de BJP o de CLLP, mientras que tiene un significado completamente aparte en el ámbito de los protocolos precontratográficos.
A la importancia, abajo sintetizada, de la investigación entorno a las BJP y a las CLL, no parece, por el momento, corresponderle una adecuada estandarización de métodos, protocolos, referencias, controles y de la expresión del informe, todas ellas exigencias insistente y justamente reclamadas por los operadores.
De hecho seria deseable que una muestra resultase, por lo menos, "BJP-positiva" o "BJP-negativa" en todos los Laboratorios.
CLL Monoclonales o Proteínas de Bence Jones (BJP)
Las Proteínas de Bence Jones (BJP), es decir las CLLM en orina, en el curso de enfermedades linfoproliferativas, debidas al aumento de producción de las plasmacélulas de un clon, a la que sigue y se añade la nefropatía tubular secundaria a la sobrecarga, son históricamente el primer marker tumoral identificado y, después de más de 150 años desde la genial intuición de Henry Bence Jones [2, 3], conservan intacto su valor de significado diagnóstico a veces único, precoz y de hallazgo accidental e inesperado; esto no es todo, sino que han adquirido también valor en el diagnóstico diferencial, en la prognosis y en el seguimiento de la evolución de la enfermedad.
Las BJP están presentes en el 60-80% de los pacientes con Mieloma Múltiple y, en el 15-20% de los Mielomas son el único producto secretado por el clon maligno (Mieloma Micromolecular).
BJP se encuentran en el curso de muchas otras neoplasias de las Células-B: Macroglobulinemia de Waldenström, Leucemia Linfoide Crónica, Enfermedad de Cadenas Pesadas µ y otras neoplasias linfoproliferativas.
Las BJP, causa de la enfermedad, están presentes en un alto porcentaje de pacientes con Amiloidosis AL y, más raramente, en pacientes con Enfermedad de Depósito de Cadenas Ligeras.
Pequeñas cantidades de BJP se encuentran en la orina de pacientes con Componente Monoclonal en el suero no asociada a enfermedad (MGUS).
Por otra parte, una cantidad incluso importante de BJP puede estar presente en pacientes que no presentan ninguna enfermedad sistémica: Proteinuria de Bence Jones Idiopática [11], aunque casi siempre en estos casos el seguimiento a largo plazo ha evidenciado la evolución a Mieloma Múltiple o Amiloidosis [12].
Por ello, con raras excepciones, las BJP no sólo indican un proceso maligno, sino que son ellas mismas una “entidad
maligna” (el Mieloma Micromolecular no es de per se “más maligno” que otros mielomas) que produce efectos patológicos principalmente sobre el riñón[13].
Cadenas Ligeras Libres Policlonales
Un exceso de CLLP en la orina puede ser consecuencia de un aumento de la producción policlonal o de una alteración de la función tubular.
Aumento de la producción policlonal
El exceso de CLLP en orina es frecuente en enfermedades inflamatorias agudas y crónicas como la Sarcoidosis, la Tuberculosis Pulmonar, el Lupus Eritematoso, la Artritis Reumatoide, etc.
Alteración de la función tubular
Las CLL policlonales (CLLP) en orina son un índice sensible, al igual que las demás microglobulinas, de insuficiencia de la reabsorción tubular específica.
Su hallazgo en el paciente diabético, tanto adulto [14], como niño [15], parece ser signo predictivo de nefropatía incluso en ausencia de albuminuria.
La insuficiencia tubular y la consiguiente presencia de CLLP en la orina puede ser transitoria, ligada, por ejemplo, a carga en aminoácidos tipo lisina o arginina o a la toma de algunos fármacos.
Contraindicaciones al uso de medios de contraste
Un significado aparte tiene la búsqueda de las BJP en el ámbito de las contraindicaciones en el uso de medios de contraste órganoiodados por vía inyectable (y también por Os [16]).
Para el surgimiento de la Insuficiencia Renal Aguda, el nexo originario entre Mieloma y Medio de Contraste [17, 18] se ha ido substituyendo por el nexo entre BJP, otras causas concurrentes y Medio de Contraste [10,16,19].
Los medios de contraste "no iónicos" y aquellos con "baja osmolaridad" parecen menos nefrotóxicos respecto a los clásicos de "alta osmolaridad" en sujetos con alteración de la función renal, mientras que en el sujeto normal no serían evidenciables diferencias [20, 21]. Por lo tanto la relación coste/beneficio no parece por el momento justificar el uso indiscriminado de los medios "no iónicos" y de "baja osmolaridad", más costosos que los tradicionales [22, 23]. Aunque sea teóricamente hipotetizable que en los pacientes con BJP el uso de medios de contraste "no iónicos" pueda reducir el riesgo de Insuficiencia Renal, no hay, por ahora, datos clínicos que lo confirmen[19].
Figura: 7 –
Cadenas Ligeras Libres y Patologías Relacionadas
Patologías
Proteínas de Bence Jones (BJP)
Mieloma Múltiple (de los que 15-20% Mieloma Micromolecular)
Macroglobulinemia de Waldenström
Leucemia Linfoide Crónica
Enfermedad de Cadenas Pesadas µ
otras neoplasias linfoproliferativas
Amiloidosis
AL
Enfermedad de Depósito de Cadenas Ligeras
CM en suero no asociada a enfermedad (MGUS)
Proteinuria de Bence Jones Idiopática
Las BJP no sólo son índice de un proceso maligno, sino que son ellas
mismas una “entidad maligna” (el mieloma micromolecular no es de por
si “más maligno” que los otros mielomas) que produce efectos
patológicos sobretodo en el riñón.
Cadenas Ligeras Libres Policlonales
Aumento de la Producción Policlonal
Sarcoidosis, Tubercolosis Pulmonar, Lupus Erythematosus, Artritis
Reumatoide
Alteración de la Función Tubular
Síndrome de Fanconi, nefropatía diabética, carga de aminoácidos
tipo lisina o arginina, toma de fármacos
Capítulo V
Introducción al Estudio de las Proteínas
Introducción
El estudio de las proteínas en el Laboratorio práctico ha tenido en los últimos 20 años un gran impulso y hoy se dispone de técnicas electroforéticas e inmunológicas sofisticadas y frecuentemente automatizadas.
El uso rutinario de tales técnicas tiene: efectos inmediatos:
· proporcionar a la clínica importantes elementos en el ámbito diagnóstico, pronóstico y terapeutico. · proporcionar datos epidemiológicos.
efectos a medio plazo:
· posibilita el continuo progreso en los conocimientos fisiopatológicos · posibilita y estimula la continua mejora de las propias técnicas.
Así se cierra el círculo, puesto que progresos en fisiopatología paralelos a la mejora de las técnicas disponibles en rutina ofrecen nuevos elementos para la clínica y la epidemiología.
El objetivo de este capítulo es la reflexión sobre las ventajas, desventajas y límites de las técnicas individuales más usadas en proteinología y de los protocolos, es decir del conjunto articulado de técnicas que, formalizados o no, se derivan de la exigencia de superar las limitaciones de una técnica en particular.
Metodología de Estudio de las Proteínas
Para el estudio de las proteínas los pasos metodológicos en su secuencia lógica pueden esquematizarse como sigue: Identificación: Puede ser fruto de estudios sistemáticos de laboratorio o de la "colaboración" entre clínico y analista
como en el caso de las BJP.
Aislamiento: Es el paso fundamental para poder producir un antisuero específico. Caracterización químico-física.
Definición de la estructura y análisis de la secuencia aminoacídica. Definición de la función.
Definición de las relaciones y correlaciones entre función y estructura. Definición del metabolismo.
Definición de las relaciones entre función, estructura y metabolismo.
Definición de las variaciones de estructura, función y metabolismo, o sea de las variaciones cualitativas y/o cuantitativas, y relaciones entre tales variaciones y enfermedades.
Este procedimiento ideal frecuentemente sufre un vuelco. Un ejemplo perfectamente representativo es el "descubrimiento" de las BJP.
Variaciones y Anormalidades de las Proteínas – Técnicas de Rutina
Las técnicas de rutina disponibles en el Laboratorio permiten afirmar algunas de las posibles variantes y anomalías de las proteínas; para el análisis es útil formalizar tres elementos:
Calidad Concentración Función
Calidad
En el estudio de las variantes y anomalías de las proteínas y en particular de las Inmunoglobulinas, es necesario analizar dos elementos característicos:
individualidad antigénica o composición movilidad electroforética o distribución Así las proteínas pueden tener:
idéntica individualidad antigénica pero distinta movilidad electroforética idéntica movilidad electroforética pero distinta individualidad antigénica. Deriva de ello que:
una técnica sólo separativa, por ej. la EF, puede evidenciar si las fracciones de la muestra en examen son similares por "distribución" a las de la correspondiente muestra "normal", pero no puede evidenciar cuales son las proteínas contenidas en las fracciones, es decir, no es capaz de evidenciar si la "composición" de las fracciones es similar a la de la correspondiente muestra "normal".
una técnica sólo inmunológica, por ej. la IPL, puede evidenciar si una proteína o un grupo de proteínas está presente en la muestra en examen y en que concentración, es decir, es capaz de evidenciar la individualidad antigénica
buscada en la muestra y su cantidad, pero no es capaz de preveer la "distribución" de la proteína o grupo de proteínas sometido a una técnica separativa.
la valoración exaustiva de variantes y anomalías de las proteínas debe preveer el uso combinado de técnicas separativas y técnicas inmunológicas.
Concentración
Las consideraciones son en cierta medida analogas a las relativas a la "Calidad":
con una técnica separativa, por ej. la EF, podremos valorar exclusivamente la concentración de las "proteínas totales" presentes en las fracciones particulares.
con una técnica inmunológica, por ej. la IPL, podremos valorar exclusivamente la concentración en la muestra de una única proteína, es decir de una individualidad antigénica.
para valorar la concentración de las proteínas particulares presentes en una fracción deberemos preveer el uso combinado de técnicas separativas y de técnicas inmunológicas.
Función
Muchas proteínas pueden presentar concentración y movilidad normales pero función alterada; por ejemplo las proteínas de la coagulación, las fracciones del Complemento, etc.
En el caso de las CLL todavía no se conoce su función y por lo tanto, por el momento, no tenemos este problema.
Técnicas de Estudio de las Proteínas - Generalidades
Las técnicas de estudio de las proteínas pueden dividirse en dos grandes categorías: técnicas separativas
técnicas inmunológicas
Técnicas Separativas
Estas técnicas aprovechan las características químico-físicas de las proteínas para separar un grupo o una molécula en particular de las demás presentes en el líquido en examen, por ejemplo el suero.
Las técnicas separativas permiten, entre otras cosas, "aislar" y "purificar" las proteínas que nos servirán para inmunizar al animal y así obtener los antisueros específicos a utilizar en las técnicas inmunológicas.
Las técnicas más utilizadas son:
Técnicas separativas con recuperación de las fracciones: · Cromatografía de intercambio iónico
· Cromatografía por filtración en gel · Ultracentrifugación
· Electroforesis separativa sobre diversos soportes y en diversas variantes
Estos métodos permiten la recuperación de las fracciones separadas que podrán contener o una única proteína o un conjunto de proteínas con características análogas respecto al método de separación empleado.
La fracción separada puede ser objeto de ulteriores análisis:
· determinación de las proteínas totales: absorvancia a 280 nm, reactivo de Folin, etc. · ulteriores separaciones con o sin recuperación
· técnicas inmunológicas
· técnicas químico-físicas para la caracterización estructural Técnicas separativas sin recuperacióin de las fracciones:
· Electroforesis zonal sobre acetato de celulosa o sobre agarosa · Electroforesis sobre Gel de Poliacrilamida
· Isoelectrofocusing sobre diversos soportes.
Estas técnicas emplean cantidades mínimas de muestra y no permiten la recuperación de las fracciones aisladas pero permiten sin embargo valorar algunas características estructurales, químico-físicas, funcionales e inmunológicas de las fracciones individuales; por ejemplo:
· determinación de los componentes protéicos, glicídicos, lipídicos · determinación de la actividad enzimática: Isoenzimas
· caracterización inmunológica: con la Inmunofijación directa o después de “blotting”, la Inmunosubstracción, etc. De dichas técnicas las empleadas en rutina son la Electroforesis Zonal (EF) y la Inmunofijación (IFE).
Técnicas Inmunológicas
Las técnicas inmunológicas aprovechan la individualidad antigénica de las proteínas que permite obtener antisueros específicos para realizar la reacción antígeno-anticuerpo.
La unión In Vitro de un antígeno (Ag) al anticuerpo (Ab) da lugar a un producto de reacción llamado Inmunocomplejo. La reacción inmune se divide a efectos didácticos y descriptivos en dos estadios:
primer estadio – se actua: · rapidísimamente
· con variaciones de energía
· sin alteraciones visibles del medio de reacción
· cualquiera que sea la valencia del antígeno y por ello incluso con Ag monovalentes o con As que "vean" al Ag como monovalente (As monoclonales).
· con cualquier relación Ag/Ab · con cualquier salinidad del medio
Ejemplos de técnicas que emplean el primer estadio son: · Técnicas Inmunoenzimáticas
· Técnicas Radioinmunológicas segundo estadio – se actua:
· lentamente
· con pequeñísimas variaciones de energía
· con alteraciones visibles del medio de reacción: Inmunoprecipitación (IP), Inmunoaglutinación
· sólo con Ag polivalentes y con As que vean al Ag como polivalente; por lo tanto no se actua con As monoclonales en sentido estricto.
· sólo para determinadas relaciones Ag/Ab según la "curva de precipitación" · sólo en medio salino
Ejemplos de técnicas que emplean el segundo estadios son: · Inmunoprecipitación sobre Soporte (IPS): IFE, RID, etc.
· Inmunoprecipitación en Fase Líquida (IPL): Inmunoturbidimetría (IT), Inmunonefelometría (IN)
De entre estas, Inmunofijación (IFE), Inmunoturbidimetría (IT) e Inmunonefelometría (IN) son las más utilizadas actualmente en la rutina proteinológica.
La Figura 8 ilustra el clásico esquema de Reacción de Inmunoprecipitación: de Clerici-Villa, Inmunología General, III Edición
