Efecto matriz en la determinación de polifenoles en vino por UPLC-MS
Ana Jiménez Cordón
M ÁSTER EN Q UÍMICA A VANZADA
Tutor: María Teresa Martínez Soria
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Curso 2010-2011
© El autor
© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2012 publicaciones.unirioja.es
E-mail: [email protected]
polifenoles en vino por UPLC-MS
ANA JIMÉNEZ CORDÓN JUNIO 2011
ÁREA DE QUÍMICA ANALÍTICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
UNIVERSIDAD DE LA RIOJA
Objetivos 1
Capítulo I: Introducción 5
1. Compuestos fenólicos del vino procedentes de la uva 7
1.1. Compuestos no flavonoides 10
1.1.1. Ácidos fenólicos 10
1.2. Compuestos flavonoides 13
1.2.1. Flavanoles o flavan-3-oles 13
1.2.2. Antocianidinas y antocianos 15
2. Reacciones experimentadas por los polifenoles más
importantes del vino 19
2.1. Reacciones de condensación de los flavan-3-oles 20
2.1.1. Polimerización por condensación directa 20
2.1.2. Polimerización por condensación indirecta en presencia
de acetaldehído 22
2.2. Combinaciones de antocianos con flavanoles 23
2.2.1. Reacción directa entre antocianos y flavanoles 23
2.2.2. Reacción entre antocianos y flavanoles con participación
del acetaldehído 25
5. Efecto matriz asociado a sistemas LC-MS 34
Capítulo II: Experimental 37
1. Materiales y reactivos 39
1.1. Reactivos para las disoluciones de la columna 39
1.2. Reactivos para el vino sintético 39
1.3. Reactivos para las disoluciones en vino sintético 40
2. Aparatos e instrumentos 41
2.1. Fraccionamiento 41
2.2. Rotavapor 42
2.3. Balanza analítica 43
2.4. UPLC MS/MS 44
3. Preparación y conservación de disoluciones 53
3.1. Disolución patrón en disolvente 53
3.2. Disolución patrón en vino sintético 55
3.3. Disolución patrón en vino real 57
4. Estudio de fraccionamiento 60
5. Métodos de análisis 63
Capítulo III: Resultados y discusión
1. Efecto Matriz 71
1.1. Obtención de las ecuaciones de regresión en el calibrado
en las diferentes matrices 71
1.1.1. Ácido Caféico. 72
1.1.2. Catequina. 75
1.1.3. Quercetina 79
1.1.4. Malvidina 83
2. Tratamiento estadístico de las pendientes obtenidas en las
regresiones de calibración. 86
2.1. Comparación entre disolvente y vino sintético. 88
2.2. Comparación entre disolvente y vino real. 89
2.3. Comparación entre vino sintético y vino real. 90
3. Conclusiones 91
OBJETIVOS
- 3 -
El trabajo realizado en este proyecto está incluido dentro del estudio de validación del método de fraccionamiento y determinación por UPLC/MS de polifenoles en vino que se ha llevado a cabo en el grupo de investigación.
Uno de los aspectos más importantes a considerar en la validación de un nuevo método de análisis es el estudio del efecto matriz que pudiera aparecer en la matriz de la muestra a estudiar.
Por este motivo el objetivo principal de este proyecto es analizar y verificar la existencia de efecto matriz para los patrones polifenólicos malvidina, ácido caféico, catequina y quercetina utilizados en la cuantificación de polifenoles en vino por UPLC/MS. Con el fin de desarrollar este objetivo principal se plantean los siguientes objetivo secundarios:
Desarrollar el método de análisis en UPLC/MS para compuestos polifenólicos de distintas familias.
Realizar la calibración por fortificación de las matrices fraccionadas de vino sintético y vino real.
Interpretación de los análisis realizados en UPLC/MS, a través de un programa de integración.
Determinar el comportamiento de los patrones en las diferentes matrices consideradas: disolvente, vino sintético y vino real.
Obtener la ecuación de regresión lineal para cada patrón polifenólico en las matrices disolventes, fracción de vino sintético y fracción de vino real.
- 4 -
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN
1. Compuestos fenólicos del vino procedentes de la uva.
2. Reacciones experimentadas por los polifenoles más importantes del vino.
3. Polifenoles destacados para el estudio del efecto matriz.
4. Estudio de polifenoles mediante UPLC.
5. Efecto matriz asociado a sistemas LC-MS
7
1. COMPUESTOS FENÓLICOS DEL VINO PROCEDENTES DE LA UVA
Los compuestos fenólicos son muy importantes en bioquímica vegetal, donde tienen funciones diversas: desde la coloración de flores y frutos hasta la impregnación de lignina de las paredes pecto-celulósicas (RIBÉREAU-GAYON y col., 2002).
El papel de los compuestos fenólicos en las variedades de uva tinta es determinante para la calidad del vino y en especial cuando su destino es la crianza en barrica.
El contenido en compuestos fenólicos del vino depende tanto de la variedad vinífera y el rendimiento de la cosecha como de las condiciones edafoclimáticas y técnicas culturales aplicadas al viñedo (CHAMKHA y col., 2003). La mayor parte de estos compuestos presentes en el vino provienen de la uva, especialmente, de sus partes sólidas, aunque algunos de ellos pueden ser también cedidos por la madera durante la estancia de los vinos en barricas.
Desde un punto de vista químico, los compuestos fenólicos constan de un anillo bencénico que contienen uno o diversos grupos hidroxilo. Según su estructura química, estos compuestos se pueden subdividir en flavonoides o no flavonoides, según sean o no derivados de la estructura básica de fluoroglucinol, caracterizada por un esqueleto C6-C3-C6, esto es un anillo bencénico unido a una cadena propánica y ésta a su vez a otro anillo bencénico tal y como se muestra en la Figura I.1.
8
Figura I.1. Esqueleto C3-C6-C3, estructura básica del fluoroglucinol.
Dependiendo del grado de saturación y patrón de sustitución de grupos funcionales en la estructura base, se da lugar a flavonoides con designaciones comunes como flavanoles, flavonas, chalconas, auronas, isoflavonoides, etc., así como a sus derivados glucosidados que portan moléculas de azúcares e incluso derivados de ácidos de azúcares. Suelen encontrarse también parcialmente polimerizados dando lugar a dímeros, trímeros, etc., hasta formar complejos multienlazados como los taninos condensados de los que se hablará en el apartado 2, donde se describen algunas de las reacciones experimentadas por estos compuestos.
Una clasificación de los compuestos fenólicos fundamentada en su estructura química se presenta en la Tabla I.1.
A continuación se describirán los compuestos fenólicos que se han usado en el estudio llevado a cabo en este trabajo de disoluciones en vino sintético.
9
Tabla I.1. Clasificación de los compuestos fenólicos.
COMPUESTOS NO FLAVONOIDES
Ácidos benzoicos ÁCIDOS FENÓLICOS
Ácidos cinámicos
ESTILBENOS Resveratrol
COMPUESTOS FLAVONOIDES
FLAVONOLES
FLAVANOLES
ANTOCIANIDINAS Y ANTOCIANOS
COOH
R2 R3 R4 R5
R2 R3 R4
R5 COOH
HO HO
CH CH OH
O+
OH OH
HO
R´5 OH R´3 O
R5 OH
HO
R4 O
OH OH
HO
R´5 OH R´3
O
10
Tabla I.2. Ácidos fenólicos de la uva y el vino.
Los ácidos fenólicos son incoloros cuando se encuentran en solución en una mezcla hidroalcohólica, pero pueden tomar un color amarillo después de la oxidación. En el plano organoléptico estos constituyentes no presentan sabor y olor particulares; pero son precursores de los fenoles
Ácidos benzoicos
R2 R3 R4 R5
Ácidos cinámicos
Ácido p-hidroxibenzoico H H OH H Ácido p-cumárico Ácido protocatéquico H OH OH H Ácido cafeico
Ácido vainíllico H OCH3 OH H Ácido ferúlico
Ácido gálico H OH OH OH
Ácido siríngico H OCH3 OH OCH3 Ácido sináptico
Ácido salicílico OH H H H
Ácido gentísico OH H H OH
COOH
R2 R3 R4 R5
R2 R3 R4
R5 COOH
11
volátiles, después de la acción de ciertos microorganismos (EDLIN y col., 1995).
Estos ácidos se encuentran mayoritariamente en la uva en forma de combinaciones tipo éter o éster, que son en parte hidrolizadas durante la vinificación, de forma que en el vino se encuentran simultáneamente formas libres y combinadas (HERMOSÍN-GUTIERREZ y col., 2005).
Varios ácidos cinámicos (C6-C3) están presentes en la uva y en el vino (Tabla I.2). Se les identifica en pequeña cantidad bajo la forma libre, pero están sobre todo esterificados, en su mayor parte con el ácido tartárico (Figura I.2) (RIBÉREAU-GAYON y col., 2002).
O
O COOH
COOH OH H
H H
H
HO R1
Figura I.2. Derivados de los ácidos cinámicos y del ácido tartárico
También pueden ser simplemente heterósidos de la glucosa (Figura I.3).
12
Figura I.3. Ácido 7-0-β-D-glucosil-p-cumárico (BLAU y col., 1996)
Los ésteres con el ácido tartárico son constituyentes del jugo de uva y son particularmente oxidables, además son la causa del ennegrecimiento del mosto blanco (CHEYNIER y col, 1989), en particular el del ácido caftárico (o ácido cafeil-tartárico).
Los productos de esterificación de la glucosa del antociano con el correspondiente ácido, sólo ha sido detectada para el ácido cafeico y cumárico, de acuerdo con lo encontrado por otros autores en uvas y vino (DANGLES y COL., 1993).
13
1.2. COMPUESTOS FLAVONOIDES
Es el grupo de flavanoides que más ampliamente está distribuido en la naturaleza. Los flavanoles son flavanoides que presentan estructuras derivadas de tres esqueletos básicos: flavan-3-ol, flavan-4-ol y flavan-3,4- diol (Figura I.4).
Figura I.4. Esqueleto básico de los flavanoles
En la naturaleza se pueden encontrar como monómeros o condensados entre sí, formando compuestos con diverso grado de polimerización.
También pueden poseer restos acilo, siendo el ácido gálico el sustituyente más frecuente. Al contrario de lo que ocurre con otros flavonoides, las combinaciones de tipo heterosídico son poco habituales.
Los flavanoles que tienen sustituida el C-4 del heterociclo son capaces de transformarse en antocianidinas por tratamiento en medio ácido mineral, por lo que se denominan también proantocianidinas.
Los flavan 3-ol monómeros se les suele designar genéricamente como
“catequinas” y según el grado de hidroxilación de su anillo B. En su
R1 R2
Flavan-3-ol OH H Flavan-4-ol H OH Flavan-3-ol OH OH
OH
HO O
R1
R2
14
OH
HO O
OH
OH
OH
HO O
OH
OH
Figura I.5a. (+)-catequina (2R,3S) Figura I.5b. (-)-epicatequina (2R,3R)
15
O+
OH OH
HO
R´5 OH R´3
1.2.2.
Los antocianos derivan de las antocianidinas, las cuales forman parte del grupo de los flavonoides. Las antocianidinas son glucósidos de derivados polihidroxi y polimetoxi del fenil-2-benzopirilio o sal de flavilio.
La estructura química de las antocianidinas encontradas en la uva se muestra en la Figura I.6.
Figura I.6. Esqueleto de las antocianidinas (aglucones antociánicos) encontradas en la uva.
Los antocianos se diferencian entre sí por el número de grupos hidroxilo presentes en la molécula, por el grado de metilación de éstos, por la naturaleza y el número de azúcares enlazados a la molécula, por la posición de enlace y por el tipo y número de ácidos alifáticos o aromáticos enlazados al azúcar presente en la molécula. Existen pequeñas variaciones de la tonalidad roja dependiendo del antociano del que se trate, pero teniendo en cuenta el predominio tan alto de los derivados de malvidina en la mayoría de los vinos, es esta antocianidina la que más va a contribuir el color.
Cada antocinanidina puede ser acetilada o glicosilada por ácidos y azúcares en diferentes posiciones. Debido a esto el número de antocianos
R1 R2
OH OH delfinidina OH H cianidina OCH3 OH petunidina OCH3 H peonidina OCH3 OCH3 malvidina
16
O+
R1
OH
R2
OH HO
O
O OH
HO OH
OH
Figura I.7. Malvidina 3-β-D-glucósido
Existen otros antocianos con una segunda posición glicosilada, pero los monoglicosilados son los más abundantes y frecuentes en la naturaleza. El segundo monoglucósido es más frecuente encontrarlo en la posición 5, hasta el momento, aunque también se ha encontrado un segundo azúcar en las posiciones 7, 3’ o 5’.
Tal y como se ha dicho anteriormente, en muchos casos el azúcar se encuentra acilado en la posición 6, por los ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico, acético, málico, succínico y pirúvico; y en menos ocasiones por
17
otros ácidos orgánicos, (KONDO y col, 1989; YOSITAMA y col, 1977.). Los más habituales son el p-cumárico, caféico y acético (DANGLES y col., 1993). La esterificación de los azúcares con ácido cafeico o p-cumárico produce una estabilización de la molécula y de su capacidad colorante debido a efectos de autocopigmentación, tal y como se explica más adelante.
En disoluciones acuosas o hidroalcohólicas, como es el vino, los antocianos existen bajo diversas formas estructurales en equilibrio condicionado por el pH (Figura I.8). Dentro de éstas, sólo los cationes flavilio, predominantes a pH muy ácido, poseen color rojo (BROUILLARDy col., 1982), por lo que al pH del vino (3,2 a 4,0) la mayor proporción de antocianos se encuentra en formas incoloras o débilmente coloreadas.
Las antocianidinas, que poseen un grupo hidroxilo en la posición 3, fijan una molécula de agua al diluirlas y dan lugar a una pseudobase, que es poco estable en disolución acuosa. A pH 3 se ve que la coloración de las antocianidinas decrece progresivamente y al cabo de un cierto tiempo la forma coloreada no se regenera al acidificar el medio.
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Figura I.8. Cambios estructurales de las antocianidinas en disolución.
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19
2. REACCIONES EXPERIMENTADAS POR ALGUNOS DE LOS POLIFENOLES PRESENTES EN VINOS
Los polifenoles presentes en el vino son los compuestos que más importantes cambios cuantitativos y cualitativos, tanto en la concentración como en la estructura, experimentan durante el envejecimiento. Estos compuestos son muy reactivos, debido al carácter ácido de sus grupos hidroxilo y de las propiedades nucleófilas de los anillos fenólicos. Sus reacciones que empiezan con la ruptura de los granos de uva (estrujado y prensado) continúan durante la fermentación y fundamentalmente durante el envejecimiento, conduciendo a una gran diversidad de productos y por lo tanto aumentando la complejidad de la composición fenólica de los vinos. Los nuevos compuestos formados presentan características organolépticas específicas, a menudo muy diferentes de las de sus precursores, por esto, el conocimiento de sus estructuras y de los mecanismos que las originan es una base indispensable para el control de la calidad de los vinos, y en especial los envejecidos.
A continuación vamos a examinar las transformaciones que estos compuestos originan, en concreto antocianos, flavanoles y ácidos hidroxicinámicos.
20
La condensación de los flavan-3-oles presentes en la uva y mosto -(+)- catequina y (-)-epicatequina- da lugar a polímeros denominados taninos.
El calentamiento en medio ácido de esos polímeros en disolución (reacción de Bate-Smith) libera carbocationes fuertemente inestables que se transforman en productos de condensación pardos y sobre todo en la antocianidina roja denominada cianidina, de allí el nombre de
“procianidina” dado a sus constituyentes; reemplaza a la antigua denominación “leucocianidina”.
Los dímeros debidos a la condensación directa de la catequina y de la epicatequina: procianidinas dímeras, se clasifican en función de la posición de los carbonos que intervienen en la unión (WEINGES y col., 1968):
(1) Tipo B, si la unión es por un enlace C4-C8 o C4-C6 (Figura I.9) (2) Tipo A si la unión interflavano además de C4-C8 o C4-C6, también
posee un enlace éter entre los carbonos C5 o C7 de la unión terminal y el carbono C2 de la otra unidad (Figura I.10).
21
Figura I.9. Estructuras de las procianidinas dímeras tipo B.
O+
OH OH
OH HO
O OH
OH O
OH HO
HO
Figura I.10. Estructuras de las procianidinas dímeras tipo A.
O+
OH OH
OH HO
H R1
R2
HO
OH
H
R4 R3
OH OH Unidad
superior
Unidad terminal
O+
OH OH
OH HO
H R1
R2
OH HO
O R4
H R3
OH OH O+
OH OH
OH HO
H R1
R2
HO
OH
H
R4 R3
OH OH Unidad
superior
Unidad terminal
O+
OH OH
OH HO
H R1
R2
HO
OH
H
R4 R3
OH OH Unidad
superior
Unidad terminal
O+
OH OH
OH HO
H R1
R2
OH HO
O R4
H R3
OH OH
22
formados por varias unidades de flavanoles (3-10).
2.1.2.
La condensación indirecta entre los flavan-3-oles, en presencia de acetaldehído mediante enlaces del tipo: CH3-CH, ha sido muy estudiada por diversos autores. Por ejemplo, LÓPEZ-TOLEDANO y col (2004) estudiaron la reacción de condensación entre la catequina y el acetaldehído en disoluciones modelo, tanto en la presencia como ausencia de levaduras, observando, cómo estas reacciones de polimerización se veían atenuadas por la presencia de estos microorganismos, ya que los intermedios de reacción eran absorbidos por sus paredes. También identificaron intermedios de reacción como dímeros, e incluso oligómeros con grado de polimerización mayor de tres mediante HPLC-MS en los 90 primeros minutos de reacción.
Tal y como demuestra ES-SAFI y col (1999) la polimerización de la catequina y epicatequina en presencia de acetaldehído tiene lugar más rápidamente que la procedente de la condensación directa. En este mismo trabajo se observó cómo los dímeros de la (-)-epicatequina unidos mediante puente etilo llevaban a cabo procesos de despolimerización y a su vez reacciones de recombinación.
23
Por otro lado, se ha comprobado que los espectros UV-Vis de los productos de condensación de los flavanoles poseen espectros de absorción similares a los de los monómeros, presentando un máximo de absorción a 280 nm (ES-SAFI y col., 1999).
2.2. COMBINACIONES ANTOCIANOS-FLAVANOLES O PROANTOCIANIDINAS
Los antocianos monómeros, que son los responsables del color morado- rojo que tienen los vinos jóvenes, son sustituídos progresivamente a lo largo del tiempo y de manera irreversible por pigmentos más estables, que son los responsables del color rojo-teja de los vinos más envejecidos.
Entre las reacciones que podrían intervenir en la formación de estos nuevos pigmentos están las reacciones de condensación entre los antocianos y flavan-3-oles, que pueden tener lugar de manera directa (VIVAR-QUINTANA y col, 1999, SALAS y col., 2004) o mediante puentes etilo en presencia de acetaldehído (ESCRIBAN-BAILÓN y col., 2001, PISSARRA y col, 2003). Además han sido descritas reacciones de cicloadición con diversos compuestos (4-vinifenol, ácido pirúvico, acetaldehído o vinilflavanoles) para dar lugar a pigmentos con un anillo pireno en la estructura inicial del antociano (FULCRAND y col., 1997).
También se han descrito los procesos de copigmentación, los cuales dan lugar a asociaciones no covalentes entre antocianos y otros compuestos como pueden ser los ácidos hidroxicinámicos (SCHWARZT y col, 2003).
2.2.1. ! "!
En ausencia de acetaldehído, mediante reacción directa entre antocianos y flavanoles, se han descrito dos mecanismos (SALAS y col, 2004) que darán lugar a dos tipos de productos, que se denotan como A-T
24
O O
H
OGl
OH
OH O
OH
OH OH OMe
OMe
O +
Figura I.10. Estructura hipotética del producto de adición del tipo A-T.
Una vez formado el dímero, la reacción de éstos con los monómeros dará lugar a oligómeros y polímeros de color rojo, formados por flavan-3- oles y antocianos.
Además, recientes estudios llevados a cabo en disoluciones en vino sintético por DUEÑAS y col. (2006) demuestran cómo las reacciones directas entre antocianos y flavanoles monómeros están directamente influenciadas por el pH debido al carácter electrofílico y nucleofílico de los antocianos y flavanoles.
25
2.2.2. Reacción entre antocianos y flavanoles con participación del acetaldehído
Este mecanismo, primero fue descrito por TIMBERLAKE y col (1976) y finalmente demostrado por FULCRAND y col. (1996b), comienza con la condensación del acetaldehído y flavanoles dando lugar a un carbocatión intermedio, que acabará reaccionando con otro flavanol o bien con la forma hidratada del antociano. La detección de dímeros de catequina enlazados mediante un puente etilo en vinos o de dímeros y trímeros de epicatequina con puentes etilo con malvidina-o-glucósido en disoluciones modelo (CHEYNIER y col., 1997) han probado la presencia de estas especies en vinos tintos (Figura I.11).
O
O CH-CH3 O
H O H
OH
O
OH OGl
R1 OH
R2
OH
OH
OH
Figura I.11. Estructura hipotética del producto de adición vía etanal.
Cuando en el medio hay suficiente acetaldehído disponible, la reacción de condensación progresa rápidamente por incorporación de nuevas unidades etil-flavanol a los condensados, hasta que estos alcanzan una masa crítica y precipitan. La velocidad y extensión de la reacción dependen de la acidez, la temperatura y de las concentraciones relativas de los sustratos. Es necesario un pH ácido para que el acetaldehído sea capaz de formar el catión necesario y la condensación tenga lugar, de este modo, la
26
2.3 REACCIONES DE LOS ÁCIDOS HIDROXICINÁMICOS
2.3.1 Recciones de los ácidos hidroxicinámicos
Los ácidos hidroxicinámicos se encuentran en las vacuolas de las células del hollejo y de la pulpa de la uva bajo la forma de ésteres tartáricos. Los principales son los ésteres de los ácidos cafeico, cumárico y ferúlico: ácido caftárico, cutárico y fertárico.
El ácido cafeico y caftárico, que son o-difenoles, en presencia de oxígeno se oxidarán para dar un radical super óxido y un radical semi-quinona (oxidaciones acopladas). Las quinonas originadas pueden condensarse con el ácido original dando lugar a especies con un mayor grado de polimerización y de color amarillo (RIVAS-GONZALO, 2002) tal y como se muestra la figura I.12.
27
OH
OH R
O
OH
R H
O
O R
OH
OH R
O
OH
H H
O HO
R R
OH
OH
H H
OH HO
R R
Figura I.12. Condensación de o-difenoles con su quinona.
28
parte acilada de la molécula interactúa con el catión flavilio confiriendo más estabilidad a la copigmentación intramolecular y evitar la hidratación del C2 en la molécula (DOUGALL y col., 1997).
Este tipo de reacciones han sido demostradas en vino, así como su especial estabilidad y resistencia a la decoloración con anhídrido sulfuroso (ROMERO y col., 1999).
O+
OH OH
OH
OH HO
O
O OH
O OH
OH
O
HO
Figura I.13. Antociano acilado (Malvidina 3-β-(6-p-cumaroil)-D-glucosa)
29
3. POLIFENOLES DESTACADOS PARA EL ESTUDIO DEL EFECTO MATRIZ
En este proyecto hemos recogido varios polifenoles para realizar nuestro estudio.
COMPUESTOS NO FLAVONÓLICOS:
Ácidos fenólicos Ácidos cinámicos Ácido caféico
Este grupo de compuestos se caracteriza por poseer en su estructura química el anillo aromático y el grupo hidroxílico comunes a los compuestos fenólicos y una función carboxílica. Los ácidos fenólicos que tienen interés terapéutico son derivados del ácido benzoico o del ácido cinámico (cafeíco, ferúlico, p-cumárico).
El ácido cafeico (Figura I.14.) es un ácido hidroxicinámico, un compuesto orgánico que ocurre naturalmente. Este sólido amarillo se compone de dos grupos fenólicos y un grupo acrílico entre los grupos funcionales de su estructura. Se encuentra en todas las plantas, ya que es un intermediario clave en la biosíntesis de la lignina , una de las principales fuentes de biomasa .
COOH
OH HO H
H COOH
OH HO H
H
Figura I.14. Ácido caféico.
30
diferentes clases de flavonoides. La capacidad de apagar el oxígeno singlete parece estar en relación con la estructura química de la catequina, con la presencia de la fracción catecol en el anillo B y la presencia de un grupo hidroxilo que activa el doble enlace en el anillo C.
Las catequinas son flavonoides que contribuyen a la construcción de varios taninos y a la percepción de la amargura en el vino. Se encuentran en mayores concentraciones en las semillas de uva, pero también se encuentran en la piel y los tallos.
Las catequinas (Figura I.15.) desempeñan un papel importante en la defensa microbiana de la uva, que se producen en concentraciones más altas cuando las vides están siendo atacadas por las enfermedades de la uva como el mildiu . Junto con los antocianos y taninos aumenta la estabilidad de mantener el color de un vino por un periodo más largo de tiempo.
31
H
H
H
H O
O
O O
O OH H
H
H
H O
O
O O
O OH
Figura I.15. Catequina.
Flavonoides Quercetina
Dentro de la categoría de flavonoides existe una sub-categoría conocida como los flavonoles , que incluye el pigmento amarillo conocido como (-)quercetina (Figura I.16.). Al igual que otros flavonoides, la concentración de flavonoides aumenta en las bayas de uva, ya que están expuestas a la luz solar.
Ejerce muchos efectos beneficiosos para la salud, incluida la mejora de la salud cardiovascular, reduciendo el riesgo de cáncer y protege contra la osteoporosis.
O
O O
O O
O O
H H
H
H
H O
O O
O O
O O
H H
H
H H
Figura I.16. Quercetina.
32
OCH3
*
OCH3
O O
O
O
OH
H
H H
OCH3
*
OCH3
O O
O
O
OH
H
H H
Figura I.17. Malvidina.
Muchos métodos de análisis han sido desarrollados para el análisis de polifenoles en matrices vegetales: cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía de gases (GC), cromatografía de alta resolución (HPLC) y cromatografía de alta resolución acoplada a espectroscopia de masas (LC- MS) son algunos de los métodos analíticos de separación más potentes.
La espectrometría de masas es la técnica analítica que mide la masa individual de átomos y moléculas. En esta técnica se determina el peso
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molecular de los compuestos mediante la ionización, separación y medida de los iones moleculares.
La cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC) es una avanzada técnica de cromatografía de líquidos (LC) en el cuál hay una estrecha columna con partículas muy pequeñas (1,7 m) y fases móviles que operan a muy altas presiones.
Las principales ventajas de UPLC son el alto rendimiento en comparación con cromatografía líquida (HPLC), la mejora de la resolución, menores tiempos de retención y una sensibilidad más alta.
La posibilidad que ofrece la técnica de UPLC para el acoplamiento de los sistemas de ionización electrospray (ESI) y de espectrometría de masas en tándem (MS/ MS), es lo que la convierte en una alternativa potente frente a la técnica HPLC-MS/MS convencional.
El sistema UPLC-MS/MS se ha aplicado en varios análisis recientes publicados en el análisis de plantas y alimentos.
Para detectar los compuestos objeto de estudio durante este trabajo se debe conocer su masa exacta. Una vez conocida la masa y utilizando patrones, se puede comprobar a qué tiempo aparecen los compuestos estudiados, pero siempre hay que tener en cuenta que estos tiempos pueden variar según las condiciones del método utilizado.
Con el método desarrollado durante este trabajo para el análisis de compuestos polifenólicos mediante UPLC-MS, las masas exactas de los patrones, así como sus tiempos de retención aparecen recogidos en la Tabla 1.3.
34
además, se ha desarrollado un método nuevo para el análisis de estos compuestos polifenólicos.
Este estudio consiste en identificar, tanto cualitativa como cuantitativamente, estos compuestos en distintas matrices para comprobar si existe o no efecto matriz.
Uno de los problemas mas típicos que se debe evaluar cuando se desarrollan métodos cuantitativos con sistemas LC-MS es el denominado Efecto Matriz (EM). El EM es un aumento o disminución no esperada de la respuesta de los analitos de interés, que se produce por la coelucion de otros componentes presentes en la matriz extraídos de la muestra. El mecanismo exacto que justifica el EM no se ha definido, sin embrago King et al. (2000) y Kebarle (2000) han mostrado tras una serie de experimentos, que el EM es el resultado de una competición entre los componentes no volátiles de la matriz y los iones de los analitos para acceder a la superficie de las gotas y pasar a estado gaseoso. Esta hipótesis justificaría porque se ha observado que el EM es un problema mas acusado en la interfase ESI que en otras interfases. Dependiendo del
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ambiente en el cual tiene lugar la ionización y el proceso de evaporación del ion, la competencia de la matriz puede disminuirla sustancialmente, denominada supresión de la señal, o aumentarla, denominado exaltación de la señal. Este efecto no es universal, ya que se han descrito métodos para su determinación de una gran variedad de matrices y no se ha encontrado el mismo grado de EM en función del analito considerado.
El EM no depende únicamente del analito ya que se han mostrado recuperaciones para un mismo analito entre el 70 y 130 % dependiendo de la matriz extraída (Jansson et al., 2004). Según estudios detallados de Matuszewski et al. (2003) se ha encontrado que la supresión o exaltación de la señal va frecuentemente acompañada de un significante deterioro de la precisión del método analítico. Por esta razón es de vital importancia ensayar, previamente a la validación de un método analítico de cuantificación por LC-MS, el EM de cada una de las matrices de interés, y para cada uno de los analitos seleccionados.
Estudiar el EM es un proceso sencillo, siempre y cuando se disponga de matriz blanco de las mismas características que las muestras que se desean analizar. La principal estrategia utilizada para determinar el grado de EM es la extracción de muestra blanco y determinación por LC- MS tras la adición del analito post-extracción. Entonces se comparan las respuestas entre una disolución del patrón de referencia en solvente y este extracto blanco fortificado con el patrón, a la misma concentración preferiblemente.
Las alternativas que generalmente se aplican para evitar el EM van por dos vías:
1. - compensación del efecto mediante el uso de patrones internos o cuantificación mediante calibrado en matriz;
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CAPÍTULO II. EXPERIMENTAL
1. Materiales y reactivos.
2. Aparatos e instrumentos.
3. Preparación y conservación de las disoluciones.
4. Estudio de fraccionamiento.
5. Métodos de análisis.
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1. MATERIALES Y REACTIVOS
A continuación, se detallan los materiales y los reactivos empleados para la realización de este trabajo.
1.1. MATERIAL Y REACTIVOS PARA EL ESTUDIO DEL FRACCIONAMIENTO
Los reactivos utilizados para la preparación de los eluyentes empleados en el fraccionamiento aparecen recogidos en la Tabla II.1.
Tabla II.1. Material y reactivos para el estudio del fraccionamiento.
Material o Reactivo Grado de pureza /
Características Casa comercial
Acetona HPLC Scharlau
Agua desionizada Grado Mili Q Millipore
Metanol HPLC Scharlau
Ácido trifluoroacético HPLC Fluka
Sílice Toyopearl TOSOH
Filtros PTFE 0,22 µm SUPELCO
1.2. REACTIVOS PARA EL VINO SINTÉTICO
EL vino sintético utilizado para la preparación de las disoluciones contenía un 12% (v/v) de etanol de calidad HPLC de la casa comercial Merck (Darmstadt, Alemania) y 6 g/L de ácido tartárico suministrado por
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La Tabla II.2. muestra los patrones de polifenoles utilizados en el estudio.
Tabla II.2. Patrones de polifenoles.
Patrones Grado de pureza Casa comercial
Malvidin-3-0-glucósido HPLC Extrasynthèse
Catequina HPLC Extrasynthèse
Ácido cafeico HPLC Sigma
Quercetina-3-O- glucopiranosido
HPLC Extrasynthese
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La Tabla II.3. muestra los disolventes necesarios para la preparación de las disoluciones.
Tabla II.3. Disolventes utilizados para la preparación de disoluciones.
Disolventes Grado de pureza Casa comercial
Acetona HPLC Scharlau
Ácido fórmico HPLC Scharlau
Acetonitrilo HPLC Scharlau
Agua desionizada Grado Milli Q Millipore
Metanol HPLC Scharlau
Etanol absoluto 99,5 % Panreac
2. APARATOS E INSTRUMENTOS 2.1. FRACCIONAMIENTO
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Figura II.1. Columna de GPC para el fraccionamiento de los vinos
2.2 ROTAVAPOR
Con el objetivo de eliminar la mayor parte del disolvente presente en las distintas fracciones de los vinos se utiliza, previo a la liofilización, un rotavapor Büchi R-200 con Büchi Heating Bath B-490 como baño calefactor (Figura II.2.). La temperatura del baño donde se lleva a cabo la evaporación es de 20ºC. Gracias al rotavapor se elimina la mayor parte de los disolventes orgánicos que acompañaban a las fracciones (etanol en la fracción 1 y acetona en la fracción 2), de tal forma que al llevarlo al liofilizador, la fracción esté prácticamente disuelta únicamente en agua.
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Figura II.2. Büchi Rotavapor R-200
2.3. BALANZA ANALÍTICA
Para pesar los patrones puros y otros reactivos se ha utilizado una balanza analítica digital Sartorius BL 120S (Figura II.3.) con una precisión de décima de miligramo.
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Sistema de vacío Analizador de
masas Electrónica
Fuente de ionización
Inserción
Sistema informático
Detector
Figura II.3. Balanza analítica digital Sartorius BL 120S
2.4. SISTEMA UPLC-MS
La espectrometría de masas es la técnica analítica que mide la masa individual de átomos y moléculas. Esta técnica determina el peso molecular de los compuestos mediante la ionización, separación y medida de los iones moleculares.
Un espectrómetro de masas consta esencialmente de los elementos representado en el siguiente esquema.
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Consta esencialmente de los siguientes elementos:
• Un sistema de inyección que transfiere la muestra a la cámara de ionización.
• Un sistema de vacío que mantiene una presión muy baja en el espectrómetro.
• Una fuente de ionización que transforma las muestras neutras en iones en fase gaseosa.
• Un analizador de masas que separa y analiza las especies iónicas en función de su relación m/z.
• Un detector que mide la abundancia relativa de las especies iónicas separadas en el analizador.
• Un sistema electrónico que controla el funcionamiento de las diferentes unidades.
• Un sistema informático que controla la electrónica del aparato, graba, procesa almacena y muestra los resultados en forma de espectros.
El UPLC empleado en este estudio ha sido el microOTOF-Q, el cual aparece representado en la Figura II.4. y la Figura II.5. incluye un esquema de las partes representativas del mismo.
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Figura II.4. UPLC microOTOF-Q
Figura II.5. Esquema UPLC.
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- IONIZACIÓN POR ELECTROSPRAY (ESI)
La ESI es una técnica de ionización a presión atmosférica (API) que se puede aplicar a un elevado número de compuestos que se encuentran presentes en matrices líquidas. La aparición de la ESI representa un gran avance en la capacidad de la espectrometría de masas (EM) para la caracterización de biomoléculas de elevada masa molecular y de sus interacciones no covalentes. Es también la interfase más utilizada para acoplar la HPLC con la EM. La gran popularidad de esta técnica en estos campos se debe a que opera de modo continuo, tolera diferentes tipos de disolventes, acepta flujos de disolventes relativamente altos y es capaz de generar iones múltiples cargados de especies bioquímicas químicamente frágiles. Con la ESI/MS se pueden analizar las masas moleculares de biopolímeros de 100 Kilodaltons con una precisión >0,01%.
El corazón de la ESI es un tubo capilar a través del cual el disolvente fluye continuamente con un flujo de entre 2 y 5 L por minuto. El disolvente consiste en una mezcla de agua y un disolvente orgánico y normalmente contiene <1% de un ácido.
En la Figura II.6. aparece representada gráficamente la ionización por electrospray.
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Figura II.6. Esquema de la ionización por electrospray
En la Figura II.7. se representa gráficamente el principal proceso de ionización por electrospray
Figura II.7. Principal proceso de ESI
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- ANALIZADOR DE TIEMPO DE VUELO (TOF)
El analizador de tiempo de vuelo (TOF) es uno de los más antiguos diseños en la historia de la EM. Su utilización ha estado restringida durante muchos años a aplicaciones especiales en espectrometría de movilidad iónica (SIMS), entre otras.
Recientemente se ha redescubierto este tipo de analizador que posee cualidades muy valiosas, tales como un rango de masas ilimitado y una detección de todos los iones formados en la fuente, lo que significa gran sensibilidad.
El analizador de tiempo de vuelo es, en cuanto a su fundamento, uno de los analizadores más simples de los que se utilizan hoy en día. Se basa en la medida del tiempo que tardan los iones generados y acelerados con igual energía en la fuente de iones, en alcanzar un electrodo colector situado a una distancia prefijada. Como los iones poseen la misma energía pero diferentes masas alcanzarán el colector a diferentes tiempos, dependiendo de su masa, carga y energía cinética.
En la práctica se introduce la muestra en la fuente iónica. Una vez producida la ionización, cosa que ocurre de modo instantáneo, se evita que los iones formados puedan salir de la fuente dispersos en el tiempo, reteniéndolos en la fuente por medio de un potencial de retardo de igual signo al de la carga de los iones. Una vez confinados los iones en el recinto de la fuente, se aplica un voltaje de extracción, con lo que se consigue que todos los iones salgan de la fuente de modo simultáneo. Pasan seguidamente por un campo electrostático acelerador con un voltaje V, adquiriendo una elevada energía cinética que les impulsa en la dirección del tubo de vuelo, o analizador, hacia el detector.
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En la Figura II.8. se representa el esquema de funcionamiento del analizador de tiempo de vuelo.
Figura II.8. Esquema del funcionamiento del analizador de tiempo de vuelo.
-DETECTOR MULTICANAL O DIODE ARRAY
Existen varios tipos de detectores que pueden incluirse en esta denominación de multicanales. Se basan en la utilización de una o dos
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capas de baterías de micromultiplicadores, seguidas de un sistema de detección más o menos eficiente y sofisticado, encargado de detectar simultáneamente todas las señales.
Este tipo de detectores reúnen la ventaja de los antiguos sistemas de fotoplacas, de ser capaces de detectar simultáneamente una amplia zona espectral, lo que aumenta enormemente el tiempo de observación de cada ion, con la mayor sensibilidad, estabilidad, capacidad de amplificación, etc de los modernos sistemas multiplicadores. Ello conduce a una sensibilidad aumentada en muchos ordenes de magnitud.
En la Figura II.9. aparece representado un detector multicanal para comprender mejor su funcionamiento.
Figura II.9. Esquema del detector multicanal.
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Figura II.10. ACQUITY UPCL BEH C18 column 2,1 x 100mm 1,7 m
La cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC) es una avanzada técnica de cromatografía de líquidos (LC) en el cuál hay una estrecha columna con partículas muy pequeñas (1,7 m) y fases móviles que operan a muy altas presiones.
Las principales ventajas de UPLC son el alto rendimiento en comparación con cromatografía líquida (HPLC), la mejora de la resolución, menores tiempos de retención y una sensibilidad más alta.
La posibilidad que ofrece la técnica de UPLC para el acoplamiento de los sistemas de ionización electrospray (ESI) y de espectrometría de masas en tándem (MS/ MS), es lo que la convierte en una alternativa potente frente a la técnica HPLC-MS/MS convencional.
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3. PREPARACIÓN DE LAS DISOLUCIONES
3.1. DISOLUCIONES PATRÓN EN DISOLVENTE.
Las disoluciones patrón se preparan en el disolvente adecuado para cada uno de los patrones utilizados: malvidina, quercetina, ácido cafeico y catequina.
Debido a los problemas que ofrecían los patrones quercetina y catequina para redisolverse en una disolución HCOOH/H2O (5/95%), se utiliza metanol como medio de disolución para las disoluciones patrón de ambos estándares.
En el caso de malvidina y ácido cafeico, las disoluciones patrón se realizaron directamente HCOOH/H2O (5/95%).
Para todos los patrones se prepararon disoluciones de 100 µg/mL y, a partir de ella con las correspondientes diluciones, se prepararon disoluciones de una concentración de 10 µg/mL, las cuales se utilizan para preparar los patrones de calibrado.
En la Tabla II.3. se presentan las concentraciones de las disoluciones de los patrones malvidina, catequina, ácido cafeico y
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Concentración en µg/mL
Malvidina Catequina Ác. Caféico Quercetina
0,5 0,5 0,5 0,25
1,0 1,0 1,0 0,5
3,0 3,0 3,0 1,0
7,0 7,0 7,0 2,5
10,0 10,0 10,0 4,0
25,0 25,0 25,0 5,5
40,0 40,0 40,0 6,0
60,0 60,0 60,0 -
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3.2. DISOLUCIONES EN VINO SINTÉTICO.
Las concentraciones a estudiar son las mismas que las representadas en la Tabla II.3., considerando en este caso que cada una de las disoluciones debe contener el mismo volumen de vino sintético.
En matraces de 5 mL se añaden los 2 mL obtenidos en el fraccionamiento del vino sintético más los correspondientes volúmenes de la disolución patrón, enrasando con disolución de ácido fórmico/H2O (5/95%) para obtener las concentraciones de calibrado.
Para añadir los volúmenes adecuados de los patrones, se emplearon las disoluciones de 100 y 10 µg/mL preparados anteriormente para todos los patrones.
En la Tabla II.4. se muestra la preparación de las disoluciones para los patrones de malvidina, catequina y ácido cafeico.
Tabla II.4. Disoluciones de calibrado en vino sintético para malvidina, catequina y ácido cafeico en µg/mL
Concentración
Calibrado (µµµµg/mL) V (mL) Vino
sintético V (mL) Disolución
Patrón Concentración
Disolución Patrón (µµµµg/mL)
60,0 2,0 3,00 100
40,0 2,0 2,00 100
25,0 2,0 1,25 100
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En la Tabla II.5. se muestra la preparación de las disoluciones de calibrado para quercetina realizada de la misma forma que para el resto de patrones, volumen final de 5 mL y enrasando con disolución de HCOOH/H2O (5/95%).
Tabla II.5. Disoluciones de calibrado en vino sintético para quercetina.
Concentración Calibrado
(µµµµg/mL)
V (mL) Vino sintético
V (mL) Disolución
Patrón
Concentración Disolución Patrón
(µµµµg/mL)
6,00 2,0 3,00 10
5,50 2,0 2,75 10
4,00 2,0 2,00 10
2,50 2,0 1,25 10
1,00 2,0 0,50 10
0,50 2,0 0,25 10
0,25 2,0 0,13 10
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3.2. DISOLUCIONES EN VINO REAL.
Las concentraciones utilizadas son las mismas que las representadas en la Tabla II.3., considerando en este caso que cada una de las disoluciones debe contener el mismo volumen de vino real.
En matraces de 5 mL se añaden los 2 mL obtenidos en el fraccionamiento del vino real más los correspondientes volúmenes de la disolución patrón, enrasando con disolución de ácido fórmico/H2O (5/95%) para obtener las concentraciones de calibrado.
Para añadir los volúmenes adecuados de los patrones, se emplearon las disoluciones de 100 y 10 µg/mL preparados anteriormente para todos los patrones.
En la Tabla II.6. se muestra la preparación de las disoluciones de vino real para los patrones de malvidina, catequina y ácido cafeico.
Tabla II.6. Disoluciones de calibrado en vino real para malvidina, catequina y ácido cafeico en µg/mL
Concentración
Calibrado (µµµµg/mL) V (mL) Vino
real V (mL) Disolución
Patrón Concentración
Disolución Patrón (µµµµg/mL)
60,0 2,0 3,00 100
40,0 2,0 2,00 100
25,0 2,0 1,25 100
10,0 2,0 0,50 100
7,0 2,0 0,35 100
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patrones, volumen final de 5 mL y enrasando con disolución de HCOOH/H2O (5/95%).
Tabla II.7. Disoluciones de calibrado en vino real para quercetina.
Concentración Calibrado
(µµµµg/mL)
V (mL) Vino real
V (mL) Disolución
Patrón
Concentración Disolución Patrón (µµµµg/mL)
6,00 2,0 3,00 10
5,50 2,0 2,75 10
4,00 2,0 2,00 10
2,50 2,0 1,25 10
1,00 2,0 0,50 10
0,50 2,0 0,25 10
0,25 2,0 0,13 10
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4. ESTUDIO DE FRACCIONAMIENTO
FRACCIONAMIENTO DE LAS MUESTRAS MEDIANTE COLUMNA DE Gel Permeation Chromatography (GPC)
Actualmente existen muchos métodos cromatográficos para la separación y cuantificación de polifenoles, sin embargo estas técnicas están limitadas para polifenoles de alto peso molecular, ya que éstos, debido a su estructura molecular, son difícilmente separables y cuantificables por estas técnicas.
Por ello, en este trabajo, se fraccionan las muestras mediante una columna de Gel Permeation Chromatography (GPC), con el fin de separar por un lado los compuestos poliméricos, de alto peso molecular que interfieren en la separación y resolución cromatografica, de los monoméricos y oligoméricos los cuales sí se pueden separar y cuantificar mediante técnicas cromatográficas. (Guadalupe y col. 2006)
El primer paso para el fraccionamiento de los vinos consiste en el empaquetamiento de la columna con sílice. Para ello se añaden pequeñas cantidades de sílice disuelta en agua destilada en la columna para que se vaya compactando la sílice a lo largo de la columna hasta llegar a los 12 centímetros de longitud.
Una vez compactada se cierra con un tapón la parte inferior de la columna de fraccionamiento con el objetivo de que la columna no pierda más agua. La columna de sílice debe estar siempre húmeda para evitar la formación de burbujas y ruptura de la columna (aparición de rajas). En
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Fase B: eluyente formado por una disolución de acetona al 60%
(v/v) en agua destilada.
El flujo de los dos eluyentes es de un 1 mililitro/minuto.
Con la fase A se eluyen los polifenoles de menor peso molecular (F1) Flavanoles (catequina) → λ = 280 nm
Flavonoles (quercetina) → λ = 365 nm
Ác. Hidroxinómicos(ácido caféico) → λ = 315-313 nm Antocianos (malvidina) → λ = 515-520 nm (color)
Con la fase B se eluyen los polifenoles de mayor peso molecular (F2), es decir, las proantocianidinas (polímeros de catequina).
Previa a la inyección de los dos mililitros de vino, es necesario purgar todo el sistema durante cinco minutos con el eluyente de la fase A y un flujo de 1 mililitro/minuto con el objetivo de eliminar todo el aire que pudiera haber en las conexiones.
Una vez inyectado el vino en la posición load con el objetivo de que todo el loop (bucle circular situado detrás del inyector) se llene de vino, se cambia a la posición inject para que el vino llegue hasta la zona de la columna impulsado por la fase A con un flujo de 1 mililitro/min. Se deja
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pasar el eluyente A durante 60 minutos, con lo cual se obtienen 60 mL de la fracción F1 con los polifenoles de menor peso molecular.
A continuación se hace pasar la fase B durante otros 60 minutos para arrastrar la fracción más pesada. Se obtiene así una segunda fracción de 60 mililitros de fracción F2 con los polifenoles de mayor peso molecular.
La columna de sílice se puede utilizar para fraccionar unos 12-15 vinos; y entre la elución de uno y otro vino no es necesario limpiar la columna. La fase B deja la columna lo suficientemente limpia para poder ser nuevamente utilizada.
Entre la inyección de un vino y otro, la columna de sílice debe acondicionarse de nuevo dejando pasar la fase A durante 5 minutos.
Recogidas las fracciones se colocan en el rotavapor a una temperatura de 20ºC durante 1 hora con el objetivo de eliminar la mayor cantidad de disolvente orgánico (etanol en Fracción I y acetona en Fracción II) que sea posible antes de ser liofilizadas. La liofilización consiste en someter la muestra, previamente congelada a –80ºC, a elevadas presiones y bajas temperaturas con el objetivo de conseguir la total evaporación del disolvente. Transcurridas 24 horas que deben permanecer las muestras en el liofilizador, se obtiene un sólido. Este sólido es necesario redisolverlo en un determinado disolvente, el cual es diferente según se trate de la Fracción I o la Fracción II. El volumen de redisolución es 2 mL.
La Fracción I se redisuelve en una disolución agua-ácido fórmico en proporción 95:5 (v/v).
La Fracción II no se utiliza en este estudio debido a que contiene los polifenoles de mayor peso molecular.
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Para la preparación de las muestras se utilizaron los siguientes materiales:
- Una jeringuilla de vidrio de la casa comercial HAMILTON empleada par filtrar las muestras antes de inyectar en el UPLC (Figura II.11)
Figura II.11. Jeringuilla HAMILTON (cristal)
- Septums precortados que facilitan la inyección de las muestras al tener mejor acceso el inyector (Figura II.12)
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Figura II.12. Septum precortados para UPLC 0073818H-8 90K37
- Filtros ISO-Disc PTFE 4-2. 4mm x 0,2µm empleados para el filtrado de las muestras antes de ser inyectadas (Figura II.13).
Figura II.13. Filtros ISO-Disc PTFE 4-2. 4mm x 0,2µm
El método UPLC fue desarrollado utilizando como base un método de HPLC ya existente en bibliografía (Avizcuri y col. 2010) y haciendo una transferencia mediante el programa Acquity UPLC columns calculator.
Este programa permite convertir un método de HPLC a las condiciones óptimas para UPLC. Posteriormente fue necesario ajustar el método respecto al teórico obtenido con dicho programa.
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En la Tabla II.8. aparecen los parámetros de análisis para este método en negativo.
Tabla II.8. Condiciones del método en negativo.
ACQUITY Binary Solvent Manager Conment:
Solvent Selection A: A1 Solvent Selection B: B1
Low Pressure Limit: 0.000 bar High Pressure Limit: 1034.200 bar
Solvent Name A: Acetonitrile + 0,1% v/v Formic Solvent Name B: Water/HFo 1%
[Gradient Table]
Time(min) Flow Rate %A %B Curve 1. Initial 0.450 1.0 99.0 2. 0.50 0.450 1.0 99.0 6 3. 1.50 0.450 8.0 92.0 6 4. 4.00 0.450 8.0 92.0 6 5. 5.00 0.450 12.0 88.0 6 6. 5.50 0.450 12.0 88.0 6
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7. 6.00 0.450 14.0 86.0 6 8. 8.00 0.450 22.0 78.0 6 9. 11.00 0.450 30.0 70.0 6 10. 12.50 0.450 100.0 0.0 6 11. 13.50 0.450 100.0 0.0 6 12. 14.00 0.450 1.0 99.0 6 13. 14.50 0.450 1.0 99.0 6 Run Events: Yes
Target Column Temperature: 40.0 C Targer Sample Temperature: 5.0 C
La Figura II.11. muestra el cromatograma obtenido en las condiciones indicadas para los patrones de quercetina, catequina y ácido cafeico. Mientras que en la Tabla II.9. aparecen los tiempos de retención y sus masas moleculares.
0 2 4 6 8 10 12
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Q-7 dis_2-b,7_02_6749.d: EIC 301.0300 -All MS cafeico 3 dis_2-c,3_02_6756.d: EIC 179.0380 -All MS cat 3.0 dis_2-a,3_02_6626.d: EIC 289.0700±0.0200 -All MS
Figura II.11. Cromatograma de ác. caféico, quercetina y catequina
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positivo debido a que este es un ión que ya esta cargado positivamente. En la Tabla II.10. se muestran las condiciones de este método.
Tabla II.10. Condiciones del método en positivo.
ACQUITY Binary Solvent Manager Conment:
Solvent Selection A: A1 Solvent Selection B: B2
Low Pressure Limit: 0.000 bar High Pressure Limit: 1034.200 bar
Solvent Name A: Acetonitrile + 1% v/v Formic Solvent Name B: Water/HFo 1%
[Gradient Table]
Time(min) Flow Rate %A %B Curve 14. Initial 0.450 5.0 95.0 15. 5.00 0.450 25.0 75.0 6 16. 6.00 0.450 95.0 5.0 6 17. 7.50 0.450 10.0 90.0 6 Run Events: Yes
Target Column Temperature: 40.0 C
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Targer Sample Temperature: 5.0 C
LC Parameters (acquisition starting conditions) Total Runtime: 7.50 min
Flow Rate: 0.450000ml/min Min. Pressure: 0 bar Max. Pressure: 1034 bar
La Figura II.12. muestra el cromatograma obtenido en las condiciones indicadas para el patrón malvidina. Mientras que en la Tabla II.11. aparecen el tiempo de retención y su masa molecular.
2.32 min 1
1 2 3 4 5 6
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Malvidina DIS 10.0 ppm_2-A,5_02_6785.d: TIC +All MS Malvidina DIS 10.0 ppm_2-A,5_02_6785.d: EIC 655.6158 +All MS
Figura II.12. Cromatograma para la malvidina.
Tabla II.11. Tiempo de detección y masa de malvidina.
Compuestos Masa Tiempo(min)
Malvidina 2-O,glucosa 655,6158 2,3
Para interpretar los datos obtenidos con el UPLC, es necesario integrar los picos cromatográficos obtenidos con el programa DataAnalyis (Bruker Daltonics).
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CAPÍTULO III.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Efecto Matriz.
2. Tratamiento estadístico de las pendientes obtenidas en las regresiones de calibración.
3. Conclusiones.
