REF MOL2500 Rev. F
Prueba de RT-PCR en tiempo real para la detección cualitativa y la diferenciación del ARN viral de la gripe A y
de la gripe H1N1 2009 in vitro.
Para uso diagnóstico in vitro
INDICACIONES DE USO
La prueba Simplexa™ Influenza A H1N1 (2009) de Focus Diagnostics se ha diseñado para su uso en el termociclador Integrated Cycler de 3M para la detección cualitativa y la diferenciación in vitro del ARN del virus de la gripe A y el ARN del virus de la gripe H1N1 2009 en frotis nasofaríngeos, frotis nasales y aspirados nasofaríngeos de pacientes con signos y síntomas de infección respiratoria que presentan factores de riesgo clínicos y epidemiológicos.
Los resultados negativos no descartan una infección por el virus de la gripe y no deben utilizarse como único fundamento para tratar o tomar otras decisiones sobre el tratamiento de los pacientes.
Las características de rendimiento para la gripe A se establecieron durante la temporada gripal 2009-2010, cuando el virus de gripe A predominante era la cepa H1N1 2009. Al surgir otros virus de la gripe A, las características de rendimiento pueden variar.
Si se sospecha una infección por un nuevo virus de la gripe A de acuerdo con los actuales criterios clínicos y epidemiológicos de detección sistemática que recomiendan las autoridades de salud pública, las muestras se obtendrán siguiendo las precauciones de control de las infecciones pertinentes para los nuevos virus de la gripe y se enviarán al departamento de salud estatal o local donde serán analizadas. En estos casos, no debe intentarse cultivar el virus a menos que un laboratorio de nivel 3 de bioseguridad pueda recoger las muestras y asumir la responsabilidad del cultivo.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
La gripe está provocada por tres tipos inmunológicos de virus de ARN (A, B y C) pertenecientes a la familia Orthomyxoviridae. El virus de la gripe A también se clasifica en función de dos proteínas virales que se expresan en su superficie: la hemaglutinina y la neuraminidasa. La hemaglutinina facilita la unión del virus a las células epiteliales respiratorias, mientras que la neuraminidasa rompe esas uniones con la célula hospedadora para facilitar la liberación de los nuevos viriones. Los virus responsables de la gripe estacional contienen normalmente uno de los tres subtipos principales de hemaglutinina (H1, H2 o H3) y uno de los dos subtipos de neuraminidasa (N1 o N2). A finales de marzo de 2009 apareció en Norteamérica un nuevo virus de la gripe (gripe H1N1 2009) apareció que después se diseminóextendió por todo el mundo1. Este nuevo virus es el frutoresultado de la recombinación de componentes del virus de la gripe A humana, del virus de la gripe A aviar y de un componente de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe A que infecta a los cerdos2,3.
La gripe se manifiesta habitualmente en forma de una combinación de signos y síntomas de las vías respiratorias altas y bajas, fiebre, cefalea, mialgias y malestar general. La enfermedad puede mostrar diversos cuadros, desde signos y síntomas respiratorios aislados que se asemejan al resfriado común hasta una neumonía grave que requiere hospitalización. Las personas con mayor riesgo de hospitalización son los niños menores de 2 años, los adultos mayores de 65 años y aquellas con enfermedades concomitantes significativas. La gripe causada por el virus H1N1 2009, al igual que la gripe estacional, puede hacer que se agraven enfermedades subyacentes. La duración de la enfermedad oscila normalmente entre 2 y 5 días, pero los síntomas pueden perdurar durante una semana o más.
La naturaleza estacional de la gripe, a la que se denomina comúnmente «gripe estacional», es una característica ampliamente reconocida de este virus. La gripe debe su naturaleza recurrente a un proceso llamado «deriva antigénica»: las mutaciones puntuales de la estructura genética del virus dan lugar a la expresión de proteínas de superficie diferentes, lo que permite al virus eludir la inmunidad desarrollada en las estaciones anteriores. Un cambio más importante de las glucoproteínas de la superficie del virus se conoce como «salto antigénico». Cuanto mayor es el cambio en estos antígenos, menos probabilidad hay de que la inmunidad existente en la población confiera protección contra la nueva variante. Por esta razón, el cambio antigénico se asocia a epidemias y pandemias. Los cambios observados en el virus de la gripe H1N1 2009 son lo suficientemente importantes como para considerarse un salto antigénico2.
PRINCIPIOS DEL PROTOCOLO
La prueba consiste en una amplificación de PCR en tiempo real y un sistema de detección que utiliza un cebador-sonda fluorescente bifuncional para detectar el ARN del virus de la gripe A humana y detectar diferencialmente el ARN del virus de la gripe H1N1 2009 en frotis nasofaríngeos, frotis nasales y aspirados nasofaríngeos. La prueba consta de dos etapas principales:
1) Extracción del ARN de las muestras del paciente, 2) Empleo de un cebador-sonda fluorescente bifuncional junto con un cebador inverso para amplificar una diana específica (para cada analito y control interno). La prueba proporciona dos resultados.
Por un lado, reconoce específicamente una región bien conservada del gen de la matriz de los virus de la gripe A que permite identificar tanto el virus de la gripe humana A como el virus de la gripe H1N1 2009 en la muestra. Y, simultáneamente, reconoce una región del gen de la hemaglutinina del virus de la gripe H1N1 2009 que permite detectar de forma específica la presencia de
ARN de este subtipo viral de la gripe humana A. Por último, a fin de monitorizar el proceso de extracción y detectar la inhibición de la PCR se emplea un control interno.
MATERIALES SUMINISTRADOS
El kit SimplexaTM Influenza A H1N1 (2009) de Focus Diagnostics contiene reactivos suficientes para 100 reacciones. Tras recibirlos, guarde todos los componentes del kit a una temperatura comprendida entre -10 °C y -30 °C (no use un congelador de tipo "no-frost"). Cuando se conservan a una temperatura de -10 °C a -30 ºC, los componentes del kit permanecen estables hasta el final del mes de caducidad que se indica en el envase del kit. Tras el primer uso, almacene la mezcla de cebadores H1N1, la mezcla maestra de ARN, el control positivo de H1N1, el control interno de ARN protegido (RNA Internal Control) y el control sin molde descongelados a una temperatura comprendida entre 2 ºC y 8 ºC durante un máximo de 30 días o hasta la fecha de caducidad, lo que ocurra primero. Guarde la mezcla de RT a una temperatura comprendida entre -10 ºC y -30 ºC hasta la fecha de caducidad.
Tabla 1: Descripción del etiquetado y de los componentes del kit
Kit Etiqueta
Focus Diagnostics Simplexa™ Influenza A H1N1 (2009)
(N.º cat. MOL2500)
Español
REF
EC
SYMBOLSÍMBOLO UE
Mezcla de cebadores Simplexa™ H1N1 MOL2501 REAG AA
Mezcla maestra de ARN Simplexa™ MOL2002 REAG B
Mezcla de RT MOL9103 REAG C
Simplexa™ RNA Internal Control (Control
interno) MOL2004 CONTROL IC
Simplexa™ No Template Control (Control sin
molde Simplexa™) MOL2001 CONTROL NTC
Control positivo H1N1 Simplexa™ MOL2502 CONTROL +
Componentes Número de
tubos por kit
Código de
color Etiqueta
Simplexa™ H1N1 Primer Mix (PM) 2 Marrón REF MOL2501 Lote Caduca
Simplexa™ RNA Master Mix (RMM) 2 Verde REF MOL2002 Lote Caduca
RT Mix (RT) 1 Amarillo REF MOL9103 Lote Caduca
Simplexa™ RNA Internal Control (RNA
IC) 2 Azul REF MOL2003 Lote Caduca
Simplexa™ No Template Control (NCT) 2 Neutro REF MOL2001 Lote Caduca Simplexa™ H1N1 Positive Control (PC) 2 Rojo REF MOL2502 Lote Caduca
Tabla 2: Descripción de los componentes del kit
Componente del kit
Reaccion es por kit/vial
Volumen (µL)
por vial Descripción del componente
Primer Mix (PM) 100/50 30
Cebadores fluorescentes específicos para detección de gripe A y/o gripe H1N1 2009 y para el control interno Diana Fluoróforo
de la sonda
Excitació n (nm)
Emisión (nm)
Gen diana
FLU A
(GRIPE A) FAM 495 520 matriz
H1N1 CFR610 590 610 HC
Internal Control RNA IC
Q670 644 670 NC
RNA Master Mix (RMM) 100/50 200 ADN polimerasa, tampón y dNTPs RT Mix (RT) 100/100 50 Enzima transcriptasa inversa, tampón RNA Internal Control (RNA
IC) 100/50 250 Secuencia de ARN encapsidado
No Template Control (NCT) 8/4 800 Agua libre de nucleasas H1N1 Positive Control (PC) 8/4 800 Virus de la gripe H1N1 2009 inactivado Simplexa™ Influenza A
H1N1 (2009) Código de barras
NC NC Parámetros específicos de la prueba
MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
1. Equipo Integrated Cycler con software Integrated Cycler Studio versión 3.0 o superior 2. Discos universales para el equipo Integrated Cycler
3. Cinta de cubierta para discos universales
4. aSistema MagNA Pure LC System de Roche y elementos fungibles asociados
5. aTKit MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation (Nº de cat. de Roche No 3038505001)
6. bTMini kit QIAamp® Viral RNA (Nº de catálogo de Qiagen 52904 (50 extracciones) o 52906 (250 extracciones))
7. Micropipeta(s), de canal único, multicanal y/o de repetición, de una precisión comprendida en el rango de 1-10 µL, 10-100 µL y 100-1000 µL
8. Congelador (eliminación de escarcha manual) de -10 a -30 ºC (para guardar congelados los componentes del kit) 9. Congelador (eliminación de escarcha manual) de -10 a -30 ºC (para guardar congeladas las muestras)
10. Campana de flujo laminar para las extracciones 11. Microcentrífuga
12. Mezclador vórtex
13. Puntas de micropipeta, estériles, desechables, exentas de ARNasas/ADNasas, con protección contra aerosoles
14. Tubos para microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mL y gradillas (se recomienda usar tubos exentos de ARNasas/ADNasas, pero no es obligatorio)
15. Guantes sin polvo desechables 16. Agua exenta de nucleasas
17. Gradillas frías para los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL
a Para su uso con el método de extracción Roche MagNA Pure LC
b Para su uso con el método de extracción mini kit QIAamp Viral RNA
T Se han certificado lotes específicos del reactivo complementario del kit MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation y del mini kit QIAamp® Viral RNA para su uso con la prueba SimplexaTM Influenza A H1N1 (2009).
NOTA (clientes de los E.E.U.U.): Para garantizar el rendimiento normal de la prueba SimplexaTM Influenza A H1N1 (2009) es preciso utilizar exclusivamente lotes certificados por el fabricante del kit MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation y del mini kit QIAamp® Viral RNA. Cualquier lote que no haya sido certificado específicamente por Focus Diagnostic para su uso con la prueba SimplexaTM Influenza A H1N1 (2009) no se considera validado para esta prueba y puede generar resultados erróneos.
Se ofrece una lista de estos reactivos para extracción certificados en www.focusdx.com. Por favor, informe al fabricante de los problemas que pueda tener con los reactivos complementarios y a Focus Diagnostic de las consecuencias de dichos problemas en el rendimiento de este kit Simplexa™.
PERÍODO DE VALIDEZ Y MANIPULACIÓN
1. Conserve los reactivos a una temperatura de entre -10 ºC y -30 ºC (no use un congelador de tipo "no-frost").
2. No use los kits ni los reactivos después de la fecha de caducidad.
3. Deje que la mezcla de cebadores H1N1, la mezcla maestra de ARN, el control positivo, el control interno de ARN y el control se descongelen a temperatura ambiente antes de usarlos (aproximadamente entre 18 y 25 ºC).
4. Tras añadir la mezcla de RT, use la mezcla de reacción antes de que pase una hora.
5. Después de cada uso, vuelva a poner la mezcla de RT en el congelador (entre -10 ºC y 30 ºC) hasta la fecha de caducidad.
6. Una vez descongelados, almacene la mezcla de cebadores H1N1, la mezcla maestra de ARN, el control positivo, el control interno de ARN protegido y el control sin molde a una temperatura comprendida entre 2 ºC y 8 ºC durante un máximo de 30 días o hasta la fecha de caducidad, lo que ocurra primero.
7. No vuelva a congelar la mezcla de cebadores, la mezcla maestra de ARN, el control interno ni el control positivo.
8. No use los kits ni los reactivos después de la fecha de caducidad.
9. No combine los reactivos de distintos lotes.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Para uso diagnóstico in vitro.
2. Siga las precauciones habituales. Todas las muestras de pacientes y los controles positivos deben considerarse potencialmente infecciosos y ser manipulados como tales.
3. Los análisis de laboratorio realizados con fines diagnósticos de muestras clínicas de pacientes que pueden estar infectados por el virus de la gripe H1N1 2009 deben realizarse en un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad. Todas las manipulaciones de las muestras deben realizarse dentro de una cabina de bioseguridad. El aislamiento del virus a partir de las muestras clínicas de pacientes que pueden estar infectados por el virus de la gripe H1N1 2009 debe realizarse en un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad4.
4. Cuando manipule los reactivos del kit, use equipos de protección personal, como guantes y batas de laboratorio, entre otros.
Lávese las manos minuciosamente cuando termine de realizar la prueba.
5. No pipetee con la boca.
6. No fume, beba, coma, manipule lentes de contacto ni se aplique maquillaje en las zonas en las que se usan los reactivos del kit o muestras de origen humano.
7. Elimine los reactivos del kit que no se hayan usado y las muestras humanas según las normas locales, estatales y federales.
8. El flujo de trabajo en el laboratorio debe proceder en una sola dirección, comenzando en las zonas de preamplificación y prosiguiendo en la zona de amplificación/detección: a continuación se muestra la secuencia de acontecimientos desde la extracción de la muestra hasta la amplificación por PCR en tiempo real.
Empiece por la extracción de la muestra, siga con la configuración del equipo de PCR en tiempo real, la preparación del reactivo y finalice con la amplificación mediante PCR en tiempo real.
No use materiales fungibles ni equipos en las áreas destinadas a la extracción y preparación de muestras. No se recomienda ningún tipo de movimiento cruzado entre las diferentes áreas.
Los materiales fungibles y el equipo usado para la preparación de las muestras no debe usarse para la preparación de reactivos ni para procesar el ADN amplificado ni otras fuentes de ácido nucleico diana.
Los materiales fungibles de amplificación y los equipos correspondientes deben permanecer siempre en el área de equipos de PCR en tiempo real.
El equipo de protección personal, como las batas de laboratorio o los guantes desechables, debe ser específico de cada área.
9. La contaminación de las muestras de pacientes o de reactivos puede dar lugar a resultados erróneos. Utilice técnicas asépticas.
10. Pipetee y manipule los reactivos con cuidado para evitar que se mezclen con las muestras de los pocillos adyacentes.
11. Utilice técnicas de pipeteo adecuadas y mantenga las mismas condiciones de pipeteo durante todo el procedimiento para garantizar valores óptimos y reproducibles.
12. No sustituya los reactivos ni los mezcle con reactivos procedentes de diferentes lotes de kits o de otros fabricantes.
13. No intercambie las tapas de los tubos de reactivos. Ello puede provocar su contaminación y alterar los resultados de la prueba.
14. Use únicamente el protocolo descrito en este prospecto. Las desviaciones del protocolo o el uso de tiempos o temperaturas diferentes de las especificadas puede provocar resultados erróneos.
15. La preparación de la prueba debe realizarse a temperatura ambiente (aproximadamente en el intervalo de 18 a 25 ºC).
Cuando mezcle los reactivos, mantenga frías las enzimas mediante un bloque refrigerador.
16. No reutilice los discos universales que hayan estado expuestos a muestras de pacientes o reactivos.
17. Deseche el disco usado sin separar ni retirar la cinta de cubierta.
18. Si se preparan en el mismo disco diferentes kits o lotes de SimplexaTM, en la prueba se deberán usar los controles positivos y sin molde correspondientes a cada kit.
19. La mezcla maestra de ARN y Mezcla de RT contiene > 1% de glicerol, lo que puede causar irritación si se inhala o entra en contacto con la piel. En caso de inhalación o contacto, deben tomarse medidas de primeros auxilios.
20. No se recomienda almacenar las muestras extraídas a una temperatura de entre 2 ºC y 8 ºC de forma prolongada; no se ha establecido el rendimiento.
INSTRUCCIONES DE USO A. RECOGIDA DE MUESTRAS
Los tipos de muestra aceptables son los frotis nasofaríngeos, los frotis nasales y los aspirados nasofaríngeos. Las muestras deben recogerse según las instrucciones de uso del dispositivo de obtención y las directrices de la OMS para la obtención de muestras humanas para el diagnóstico de laboratorio de la infección por gripe aviar5. Las muestras recogidas deben colocarse en medios de transporte viral estériles que contengan estabilizadores de proteínas, antibióticos para impedir el crecimiento bacteriano y fúngico y solución tampón (por ejemplo: UTM, VCM, M4, M5, M6 y otros medios destinados a transportar clamidias, micoplasmas y virus). Si usa hisopos, use sólo los de punta sintética (es decir, dacrón, nailon o rayón) y varilla de aluminio o plástico. No use hisopos de alginato de calcio, ya que pueden contener sustancias que inhiben las pruebas de PCR.
B. ÁREA DE EXTRACCIÓN DE MUESTRAS
Realice la extracción de muestras y controles en un área destinada exclusivamente para ello.
Extracción mediante el método MagNA Pure LC de Roche
1. Los ácidos nucleicos se extraen de las muestras de los pacientes y de los controles de la prueba mediante el kit MagNA Pure Total Nucleic Acid de Roche y el equipo MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor de Roche. Consulte las instrucciones de uso del fabricante para extraer ácidos nucleicos con este kit.
2. En el menú desplegable Protocol (Protocolo) del equipo MagNA Pure LC, seleccione «Total NA» (Ácido nucleico total) y luego «Total NA Variable_elution_volume.blk» (Variable de ácido nucleico total_elución_volumen.blanco). Se cargarán los ajustes apropiados para el proceso.
3. El protocolo de la muestra debe ser «Total NA Variable_elution_volume» (Variable de ácido nucleico total_elución_volumen).
4. El volumen de la muestra debe ajustarse en 200 µL y el volumen de elución en 50 µL.
5. El volumen de dilución debe ajustarse en cero para todas las muestras.
6. Asegúrese de que el protocolo tras la elución se sitúa en None (Ninguno).
7. Una vez el material de control positivo se haya descongelado, mezcle el vial en el mezclador vórtex durante aproximadamente 2 segundos y centrifugue brevemente en una microcentrífuga.
8. Asegúrese de que las muestras y los controles ocupan la posición correcta en el cartucho de muestras.
9. En una cabina de bioseguridad, pipetee 200 µL de cada muestra y del control positivo o sin molde en la posición correspondiente del cartucho de muestras.
10. Inspeccione visualmente el nivel de las muestras y los controles en el cartucho de muestras para asegurarse de que se haya agregado la muestra (o las muestras).
11. Añada 5 µL de RNA Internal Control en cada muestra y en todos los pocillos de control. Cambie las puntas entre muestras.
12. Transfiera el cartucho de muestras con las muestras al extractor MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid e inicie el proceso de extracción.
13. Después de completar la extracción del ácido nucleico, se puede retirar el cartucho con los controles y las muestras de pacientes extraídos del MagNA Pure y sellarse. Guarde el ARN a una temperatura de entre 2 ºC y 8 ºC antes de usarlo.
No se recomienda el almacenamiento prolongado a esta temperatura de las muestras extraídas. Mantenga las muestras de ARN extraídas en un bloque refrigerador mientras carga el disco.
Extracción mediante el método de extracción mini kit QIAamp Viral RNA
El siguiente procedimiento de extracción se basa en el protocolo de centrifugación (spin protocol) del manual de QIAamp®Viral RNA (Tercera edición, diciembre de 2007). Algunos pasos se alteraron para esta prueba funcional. Siga todas las advertencias y precauciones enumeradas en el manual de QIAamp®Viral RNA. Prepare todos los tampones según el manual antes de iniciar el proceso de extracción.
1. Prepare el tampón AVL con solución de ARN portador mezclando la cantidad adecuada de tampón AVL y ARN-AVE portador en un tubo. Los volúmenes dependerán del número de muestras que se vaya a extraer. Consulte la tabla siguiente:
Nº. de muestras
Vol. tampón AVL (mL)
Vol. de ARN-AVE portador (µL)
Nº. de muestras
Vol. tampón AVL (mL)
Vol. de ARN- AVE portador
(µL)
1 0,56 5,6 13 7,28 72,8 2 1,12 11,2 14 7,84 78,4 3 1,68 16,8 15 8,40 84,0 4 2,24 22,4 16 8,96 89,6 5 2,80 28,0 17 9,52 95,2
6 3,36 33,6 18 10,08 100,8
7 3,92 39,2 19 10,64 106,4
8 4,48 44,8 20 11,20 112,0
9 5,04 50,4 21 11,76 117,6
10 5,60 56,0 22 12,32 123,2 11 6,16 61,6 23 12,88 128,8 12 6,72 67,2 24 13,44 134,4 Extracción de ARN de las muestras mediante el mini kit QIAamp®Viral RNA:
1. Añada 560 µL de tampón AVL preparado que contenga ARN portador a cada tubo.
2. Añada 140 µL de cada muestra o del control positivo o del control sin molde a un tubo de extracción de muestra.
3. Añada 5 µL de RNA Internal Control a cada tubo de muestra.
4. Mezcle mediante pulsos de vórtex durante 15 segundos y centrifugue brevemente los tubos.
5. Incube a temperatura ambiente (15 ºC-25 ºC) durante 10 minutos.
6. Añada 560 µL de etanol (96%-100%) a la muestra, mézclela mediante pulsos de vórtex durante 15 segundos y centrifugue brevemente los tubos.
7. Aplique cuidadosamente 630 µL de la mezcla de muestra y etanol del paso 6 a la columna QIAamp mini (en un tubo de recogida de 2 mL) sin mojar el borde. Cierre la tapa y centrifugue a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 minuto.
8. Coloque la columna QIAamp mini en un tubo de recogida limpio de 2 mL y deseche el tubo que contiene el filtrado.
9. Abra con cuidado la columna QIAamp mini y repita los pasos 7 y 8.
10. Abra con cuidado la columna QIAamp mini y añada 500 µL de tampón AW1. Cierre la tapa y centrifugue a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 minuto.
11. Coloque la columna QIAamp mini en un tubo de recogida limpio de 2 mL y deseche el tubo que contiene el filtrado.
12. Abra con cuidado la columna QIAamp mini y añada 500 µL de tampón AW2. Cierre la tapa y centrifugue a 20.000 x g (14.000 rpm) durante 3 minutos.
13. Coloque la columna QIAamp mini en un tubo de recogida nuevo de 2 mL y deseche el tubo que contiene el filtrado.
Centrifugue a 20.000 x g (14.000 rpm) durante 1 minuto.
14. Coloque la columna QIAamp mini en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Deseche el tubo de recogida que contiene el filtrado.
15. Abra con cuidado la columna QIAamp mini y añada 50 µL de tampón AVE. Cierre el tapón e incube a temperatura ambiente durante 1 minuto. Centrifugue a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 minuto.
16. Deseche la columna QIAamp mini. Cierre los tapones y guarde los tubos que contienen los filtrados. Guarde el ARN a una temperatura de entre 2 ºC y 8 ºC antes de usarlo. No se recomienda el almacenamiento prolongado a esta temperatura de las muestras extraídas. Mantenga las muestras de ARN extraído en un bloque refrigerador mientras carga el disco.
C. CONFIGURACIÓN DEL EQUIPO DE PCR EN TIEMPO REAL
1. Consulte el manual del operador del equipo Integrated Cycler para conocer los detalles sobre cómo configurar el software Integrated Cycler Studio para añadir definiciones de la prueba.
D. ÁREA DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Área destinada a la preparación de la mezcla de reacción de la prueba SimplexaTM Influenza A H1N1 (2009).
1. Descongele la mezcla de cebadores y la mezcla maestra de ARN a temperatura ambiente (aproximadamente a una temperatura de entre 18 ºC y 25 ºC). Cada vial del componente del kit contiene reactivos suficientes para 50 reacciones.
2. Prepare el volumen requerido de la mezcla de reacción en un tubo para microcentrífuga de polipropileno del tamaño adecuado pipeteando el volumen de cada componente como se indica en la tabla 3.
Tabla 3: volúmenes de la mezcla de reacción
Reactivo
Volumen mezcla de reacción/
1 reacción
Volumen mezcla de reacción/
10 reacciones Mezcla maestra de ARN
Simplexa™ 4,0 µL 40 µL
Mezcla de cebadores
Simplexa™ H1N1 0,5 µL 5 µL
Mezcla de RT 0,5 µL 5 µL
Volumen total 5,0 µL 50 µL
3. Mezcle suavemente la mezcla de reacción mediante inversión o pipeteo.
4. Centrifugue brevemente para arrastrar el contenido al fondo del tubo.
5. Use la mezcla de reacción antes de que pase una hora de la preparación.
6. Continúe con la preparación de la PCR.
E. ÁREA DE AMPLIFICACIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL
Realice la preparación del disco universal de 96 pocillos para la prueba Simplexa™ Influenza A H1N1 (2009) en un área habilitada exclusivamente para ello.
1. Añada 5 µL de la mezcla de reacción a cada pocillo.
2. Añada 5 µL del control positivo extraído al pocillo del disco "PC".
3. Añada 5 µL de la muestra del paciente extraída al pocillo del disco "S" correspondiente.
4. Añada 5 μL de control sin molde extraído al pocillo del disco "NTC".
5. Cubra el disco con cinta de cubierta para discos universales.
6. Cargue el disco universal sellado en el equipo Integrated Cycler e inicie el proceso.
INFORME DE LOS RESULTADOS
El informe de los resultados es un proceso de tres pasos:
1. Examen de los controles para determinar si el proceso es válido. El software Integrated Cycler Studio suprimirá la interpretación de los resultados del paciente si alguna de las muestras programadas como controles no son válidas.
2. Examen de la validez de los resultados de las muestras del paciente.
3. Interpretación de los resultados del paciente. Si los controles no son válidos, los resultados del paciente no se pueden interpretar.
1. Determine si el proceso es válido examinando el control positivo de H1N1, el control sin molde y el control interno de ARN protegido
Criterios para un control válido (simplificados)*
Control Ct H1N1 Ct gripe A Ct RNA IC
Control sin molde 0
(Si es ≤40, los resultados del paciente no se pueden informar)
0
(Si es ≤40, los resultados del paciente no se pueden informar)
≤40, ≠0
Control positivo ≤40, ≠0 ≤40, ≠0 No corresponde (NC)
*Ver notas siguientes para una descripción completa.
a. Si el control sin molde es:
i. Positivo (valor Ct ≤40, ≠0 para H1N1 o gripe A), esto indica posible contaminación de las muestras preparadas. El control no es válido y todas las muestras de pacientes deben volver a extraerse y analizarse.
ii. Negativo para el detector de H1N1 y gripe A (Ct = 0), el control es válido y aceptable.
iii. Si el RNA IC no se detecta en el control sin molde, el proceso de la prueba no es válido y todas las muestras de pacientes deben volver a analizarse.
iv. Si el RNA IC se detecta en el control sin molde, el proceso de la prueba se considera válido y aceptable.
b. Control positivo
i. Si el resultado del control positivo es Ct = 0 para H1N1 y/o gripe A, el proceso de la prueba se considera inválido e inaceptable. Todas las muestran de pacientes deben volver a extraerse y analizarse.
ii. Si los valores Ct correspondientes al H1N1 y la gripe A son ≤40, ≠0, el proceso de la prueba se considera válido y aceptable.
2. Examen de los resultados de las muestras de pacientes
El examen de los resultados de las muestras clínicas debe realizarse después de haber examinado los controles positivo y sin molde y de haber determinado si son válidos y aceptables. Los resultados de H1N1, gripe A y RNA IC deben examinarse en cada muestra de pacientes.
Criterios para una muestra de paciente válida (simplificados)*
Ct de muestra de paciente H1N1 y gripe A Gráfica de amplificación Ct RNA IC Uno de los detectores o ambos ≤40, ≠0 Muestra un aumento exponencial NC
Ambos detectores en 0 NC ≤40, ≠0
*Ver las notas siguientes para una descripción completa.
a. Se deben examinar las gráficas de amplificación de cada resultado que muestre un mensaje de "Data Quality"
(Calidad de los datos). En la pestaña Data (Datos), seleccione la curva que desee revisar y pulse Refresh (Actualizar). El software trazará las curvas seleccionadas y ajustará la escala de la gráfica. Una curva de amplificación válida presenta un aumento exponencial progresivo. Una curva de amplificación inválida puede ser no exponencial, lineal o presentar “picos” de datos en aquellos lugares donde puede cruzar el umbral. Si tras el examen la curva es válida, el valor Ct informado puede usarse para determinar si las dianas de gripe A o H1N1 son detectadas como se indica en la sección 3, más abajo. A continuación se presentan ejemplos de curvas válidas e inválidas.
Curva de amplificación válida Curva de amplificación válida Curva de amplificación inválida b. Si la curva de amplificación es válida para gripe A o H1N1, no hace falta detectar el RNA IC para informar un
resultado positivo de gripe A o H1N1.
3. Interpretación de los resultados
a. Una muestra que no contenga ningún virus de la gripe A será negativa (Ct = 0) para los detectores de gripe A y H1N1. Una muestra positiva para otro virus de la gripe A que no sea la gripe H1N1 2009, probablemente arrojará un resultado positivo (Ct ≤40, ≠0) para el detector de gripe A y negativo (Ct = 0) para el detector de H1N1. Una muestra positiva para la gripe H1N1 2009 será positiva tanto para el detector de gripe A como para el de H1N1.
b. Si sólo es positivo el detector de H1N1 pero no el detector de gripe A, el resultado se considera indeterminado.
c. Si el valor Ct de gripe A de una muestra no se detecta y el valor Ct de RNA IC cae dentro o por debajo del rango aceptable, el resultado de ARN de gripe A se notifica como «No detectado».
d. Si el valor Ct de gripe A de una muestra de paciente es ≤40, ≠0 y se observa una curva de amplificación para el pocillo, el resultado de «ARN de gripe A» se notifica como «Detectado». Si el valor Ct del pocillo es ≤40, pero no se observa ninguna curva de amplificación (en el pocillo se observa fluorescencia inespecífica), el resultado de «ARN de gripe A» se notifica como «No detectado».
e. Si el valor Ct de H1N1 de una muestra es 0 y el valor Ct de RNA IC cae dentro o por debajo del rango aceptable, el resultado de «ARN de gripe H1N1 2009» se notifica como «No detectado».
f. Si el valor Ct de H1N1 de una muestra de paciente es ≤40, ≠0 y se observa una curva de amplificación y también se detecta gripe A, el resultado de «ARN de gripe H1N1 2009» se notifica como «Detectado». SSi el valor Ct de H1N1 del pocillo es ≤40, ≠0 pero no se observa ninguna curva de amplificación en el pocillo (se observa fluorescencia inespecífica en el pocillo), el resultado de «ARN de la gripe H1N1 2009» se notifica como
«No detectado».
g. Si el valor Ct de gripe A y H1N1 de una muestra de paciente es 0 y el valor Ct de RNA IC es 0, la muestra debe volver a analizarse. Si tras repetir la prueba, la situación es la misma, el resultado del paciente debe notificarse como «Indeterminado debido a posible inhibición» con el siguiente comentario: «Tras repetir el análisis, la ausencia de amplificación del control interno sugiere la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra del paciente. Para realizar la prueba, debe enviarse una muestra adicional si se justifica clínicamente».
h. SSi tras repetir la prueba el resultado sigue siendo indeterminado para H1N1, el resultado de «ARN de gripe H1N1 2009» se notifica como «Indeterminado»..
Tabla 4: Interpretación de los resultados
Ejemplo Gripe A Valor Ct
H1N1 Valor Ct
RNA IC
Valor Ct Interpretación
1 ≤ 40 ≤ 40 NC* ARN gripe A: Detectado
ARN gripe H1N1 2009: Detectado
2 ≤ 40 0 NC ARN gripe A: Detectado
ARN gripe H1N1 2009: No detectado
3 0 ≤ 40 NC Indeterminado, repetir prueba
4 0 0 ≤ 40 ARN gripe A: No detectado
ARN gripe H1N1 2009: No detectado
5 0 0 0 Inválido, repetir prueba. Si el RNA IC sigue siendo 0 al repetirla, utilizar otra muestra si se justifica clínicamente Ct = umbral de ciclo. Detectado es un Ct ≤40. No detectado es un Ct = 0,
* La detección del RNA Internal Control (RNA IC) Simplexa™ no se requiere para obtener un resultado válido.
RANGO DE INFORME
Las muestras positivas para gripe H1N1 2009 de los estudios clínicos tienen valores Ct de gripe A comprendidos en el rango de 17,6 a 39,0 y valores Ct de H1N1 en el rango de 18,4 a 39,2. La mayoría de muestras presentan valores Ct menores de 35 para ambas dianas. En los estudios clínicos, la tasa inicial de resultados indeterminados fue 0,16%.
CONTROL DE CALIDAD
Los rangos de control de calidad se han establecido como se indica en la siguiente tabla. Si los controles no se encuentran comprendidos entre estos parámetros, los resultados de los pacientes deben considerarse inválidos y la prueba debe repetirse.
Cada laboratorio debe establecer sus propios rangos de control de calidad y la frecuencia de las pruebas de control de calidad basándose en la legislación y las normas locales aplicables y en las buenas prácticas de laboratorio.
Tabla 5: Rangos de control esperados
Tipo de control
Control positivo H1N1 Simplexa™
Valor Ct gripe A
Control positivo H1N1 Simplexa™
Valor Ct H1N1
RNA Internal Control (RNA IC) Simplexa™
Control sin molde Ct = 0 Ct = 0 Ct< 40
Control positivo Ct< 40 Ct< 40 No corresponde*
* La detección del RNA Internal Control (RNA IC) Simplexa™ no se requiere para obtener un resultado válido.
LIMITACIONES
1. Los analistas deben tener una buena formación y estar familiarizados con los procedimientos de las pruebas y la interpretación de los resultados antes de realizar la prueba.
2. La detección del ácido nucleico viral depende de la correcta obtención, manipulación, transporte, conservación y preparación de las muestras, incluida la extracción. Si no se cumplen los procedimientos correspondientes en alguno de estos pasos pueden producirse resultados incorrectos.
3. Todos los resultados de esta prueba o de cualquier otra prueba deben contrastarse con los antecedentes clínicos, los datos epidemiológicos y otros datos en poder del médico a cargo de la evaluación del paciente.
4. La prevalencia de la infección influirá en el valor diagnóstico de la prueba.
5. Como sucede con otras pruebas, los resultados negativos no descartan una infección por el virus de la gripe A ni por la cepa H1N1 2009 en particular y no deben utilizarse como único fundamento para tratar o tomar otras decisiones sobre el tratamiento de los pacientes.
6. Pueden aparecer resultados falsos negativos cuando el microorganismo causante de la infección presenta mutaciones genómicas, inserciones, deleciones, recombinaciones o si el virus migra de las vías aéreas superiores a las inferiores6. 7. Pueden aparecer resultados falsos negativos si en la muestra hay un número inadecuado de microorganismos debido a una
recogida, un transporte o una manipulación incorrectos.
8. Pueden producirse resultados falsos positivos. En determinadas circunstancias, podría estar indicada la repetición de la prueba o la realización de una prueba con un dispositivo diferente.
9. Los ácidos nucleicos virales pueden persistir in vivo independientemente de la viabilidad del virus. La detección de dianas en el analito no implica que los virus correspondientes sean infecciosos o sean la causa de los síntomas clínicos.
10. Esta prueba es de naturaleza cualitativa y no informa sobre el valor cuantitativo del microorganismo detectado.
11. El rendimiento de esta prueba se ha evaluado exclusivamente con material de muestras humanas.
12. No se ha determinado el rendimiento de esta prueba con otros tipos de muestras distintas de las que se especifican en la sección Indicaciones de uso.
13. No se ha determinado el rendimiento de esta prueba en individuos inmunodeprimidos.
14. No se ha determinado el rendimiento de esta prueba en pacientes sin síntomas de infección gripal.
15. No se ha determinado el rendimiento de esta prueba en la monitorización del tratamiento de pacientes con infección por gripe A o gripe H1N1 2009.
16. No se ha determinado el rendimiento de esta prueba en la detección sistemática del virus de la gripe A o de la gripe H1N1 2009 en sangre o hemoderivados.
17. No se ha determinado el rendimiento de esta prueba en presencia de medicamentos destinados al tratamiento del virus de la gripe o del resfriado que pudieran causar interferencias. Sólo se ha evaluado el efecto de interferencia de las sustancias mencionadas en la etiqueta. La interferencia causada por sustancias que no aparecen citadas más abajo en este documento puede generar resultados erróneos.
18. No se ha establecido el rendimiento de esta prueba en individuos que han recibido la vacuna contra la gripe.
19. AAunque se han realizado pruebas de reactividad limitadas con virus de la gripe porcina cultivados en tejidos y virus de la gripe aviar inactivado (H5N1), esta prueba no está destinada a diferenciar otras cepas de gripe aviar o gripe porcina distintas de la gripe H1N1 2009. La reactividad cruzada con microorganismos de las vías respiratorias distintos de los que se mencionan más abajo en este documento puede generar resultados erróneos.
20. Esta prueba no permite descartar enfermedades causadas por otras bacterias o virus patógenos.
CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO
SENSIBILIDAD ANALÍTICA/LÍMITE DE DETECCIÓN
El límite de detección (LDD) de la prueba de RT-PRC Simplexa™ Influenza A H1N1 (2009) se determinó mediante stocks cuantificados de seis cepas del virus de la gripe A diluidas de manera seriada en frotis o matriz de aspirado negativos. El ARN de las cepas se extrajo tanto con el kit MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation de Roche como con el mini kit QIAamp Viral RNA. El límite de detección de cada prueba quedó fijado en la concentración más pequeña que presentaba una detección ≥95%
(por lo menos 19 de 20 réplicas).
Tabla 6: Límite de detección, Simplexa™ Influenza A H1N1 (2009). GRIPE A LDD de la extracción con MagNA
Pure (TCID50/mL)
LDD de la extracción con QIAgen (TCID50/mL)
Cepa de la gripe A:
Frotis Aspirado Frotis Aspirado
A/California/ 7/2009 NYMC x-179-A 1,3x101 1,3x101 1,3x101 2,7x101
A/Swine NY/02/2009 H1N1 1x10-1 1x10-1 1x10-1 1x10-1
A/Solomon Island/03/06 H1 5x100 5x100 1x100 1x100
A/Brisbane/59/07 H1 1x100 1x100 1x100 1x100
A/Brisbane/10/07 H3 1x10-1 1x10-1 5x10-1 5x10-1
A/Wisconsin/67/05 H3 1x10-1 5x10-1 1x10-1 1x10-1
Tabla 7: Límite de detección, Simplexa™ Influenza A H1N1 (2009). H1N1 LDD de la extracción con MagNA Pure
(TCID50/mL)
LDD de la extracción con QIAgen (TCID50/mL)
Cepa de la gripe A 2009
Frotis Aspirado Frotis Aspirado
A/California/ 7/2009 NYMC x-179-A 1,3x101 2,7x101 2,7x101 2,7x101
A/Swine NY/02/2009 H1N1 1x10-1 1x10-1 1x10-1 1x10-1
Los resultados muestran que la prueba Simplexa™ Influenza A H1N1 (2009) es capaz de detectar el ARN del virus de la gripe A humana (H1N1 y H3N2) y el ARN del virus de la gripe H1N1 2009 usando ambos métodos de extracción.
REPRODUCIBILIDAD
En tres centros de investigación se evaluaron la reproducibilidad interlaboratorio y la reproducibildiad inter e intraensayo. Cada uno de los tres laboratorios evaluó dieciocho muestras, el control positivo y el control sin molde, por triplicado en cinco días diferentes. En cada centro hubo dos operadores que efectuaron la prueba una vez al día, lo que suma un total de dos procesos al día. Dos centros llevaron a cabo la extracción con el kit MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation y el tercero con el Mini kit Qiagen QIAamp Viral RNA. En las tablas siguientes se presentan los resultados combinados de todos los centros. A la hora de calcular las medias y los componentes de la varianza, a las muestras que arrojaron un resultado negativo (Ct=0) se les asignó un valor de 40,0, dado que dicho valor es más representativo de las muestras negativas que tienen valores de Ct en el límite superior del rango. Se excluyeron del análisis los resultados de muestras inválidos, incluidos los errores de pipeteo comunicados por los centros.
Tabla 8: Reproducibilidad. GRIPE A
Centro 1 Centro 2 Centro 3
Muestra
Concordan cia con los resultados esperados
Media CT
% CV
Concordan cia con los resultados esperados
Media CT
% CV
Concordan cia con los resultados esperados
Media CT
% CV
Concordan cia total con los resultados
esperados IC 95% CI
Control sin molde 30/30 40,0 0,0 29/301 40,0 0,3 30/30 40,0 0,0 89/90
(98,9%) 94% - 99,8%
Control positivo 29/292 27,9 0,3 30/30 27,3 0,5 30/30 28,9 0,9 89/89
(100%) 95,9% - 100%
Frotis Gripe H1N1 2009
negativo alto 25/293 39,8 0,6 20/30 39,5 2,0 19/30 39,6 2,0 64/89
(71,9%) 61,8% - 80,2%
Centro 1 Centro 2 Centro 3
Muestra
Concordan cia con los resultados esperados
Media CT
% CV
Concordan cia con los resultados esperados
Media CT
% CV
Concordan cia con los resultados esperados
Media CT
% CV
Concordan cia total con los resultados
esperados IC 95% CI Gripe H1N1 2009
positivo bajo 26/283 33,7 1,9 28/293 33,5 4,2 29/293 34,0 1,1 83/86
(96,5%) 90,2% - 98,8%
Gripe H1N1 2009
positivo medio 27/273 29,9 1,7 30/30 30,1 0,9 30/30 30,3 1,8 87/87
(100%) 95,8% - 100%
Gripe A (H1N1)
negativo alto 26/30 39,8 0,7 27/30 39,9 0,8 27/30 39,9 1,1 80/90
88,9% 80,7% - 93,9%
Gripe A (H1N1)
positivo bajo 25/293 33,8 2,6 27/30 33,2 7,7 29/30 33,9 3,6 81/89
(91,0%) 83,3% - 95,4%
Gripe A (H1N1)
positivo medio 29/30 29,7 2,1 30/30 28,9 0,5 30/30 30,2 0,6 89/90
(98,9%) 94% - 99,8%
Gripe A (H3N2)
negativo alto 25/283 39,8 0,7 29/30 40,0 0,0 28/30 39,9 1,0 82/88
(93,2%) 85,9% - 96,8%
Gripe A (H3N2)
positivo bajo 18/243 35,0 2,0 29/30 33,8 3,8 30/30 34,1 1,1 77/84
(91,7%) 83,8% - 95,9%
Gripe A (H3N2)
positivo medio 30/30 29,8 0,3 27/273 29,6 1,6 30/30 30,7 1,0 87/87
(100%) 95,8% - 100%
Aspirado Gripe H1N1 2009
negativo alto 25/253 40,0 0,0 29/294 40,0 0,0 29/293 40,0 0,0 83/83
(100%) 95,6% - 100%
Gripe H1N1 2009
positivo bajo 24/30 34,7 2,7 29/30 32,8 4,2 28/283 34,3 1,3 81/88
(92,0%) 84,5% - 96,1%
Gripe H1N1 2009
positivo medio 30/30 29,4 0,4 29/30 29,4 6,8 30/30 30,6 0,8 89/90
(98,9%) 94% - 99,8%
Gripe A (H1N1)
negativo alto 25/283 39,8 0,6 28/30 40,0 0,4 28/30 39,9 1,3 81/88
(92,0%) 84,5% - 96,1%
Gripe A (H1N1)
positivo bajo 26/30 34,7 2,0 29/30 33,5 3,9 29/293 34,7 1,4 84/89
(94,4%) 87,5% - 97,6%
Gripe A (H1N1)
positivo medio 29/293 30,2 0,3 27/30 30,8 9,7 28/283 31,2 0,6 84/87
(96,6%) 90,3% - 98,8%
Gripe A (H3N2)
negativo alto 30/30 40,0 0,0 26/274 40,0 0.3 28/293 39,8 3,2 84/86
(97,7%) 91,9% - 99,4%
Gripe A (H3N2)
positivo bajo 30/30 36,4 1,8 30/30 35,2 2.3 30/30 38,0 4,0 90/90
(100%) 95,9% - 100%
Gripe A (H3N2)
positivo medio 30/30 30,2 0,8 30/30 29,5 0.5 30/30 30,8 1,0 90/90
(100%) 95,9% - 100%
Concordancia total Todos
539/576 (93,6%)
563/592 (95,1%)
572/592 (96,6%)
1674/1760
(95,1%) 94% - 96%
1) La primera réplica del NTC del centro 2, día 4, proceso 1, se detectó en el canal de gripe A con un valor Ct de 39,5. Eneste pocillo se observó una curva de amplificación válida. Las otras dos réplicas fueron negativas y los datos de este proceso están incluidos en el análisis.
2) La segunda réplica del control positivo del centro 1, día 4, proceso 1 fue inválida. Las otras dos réplicas de este proceso fueron positivas y los datos del proceso están incluidos en el análisis.
3) El(los) pocillo(s) tuvieron un resultado inválido y no se usó(usaron) en el cálculo de la variabilidad de Ct.
4) Los resultados de las muestras han sido excluidos del análisis debido a errores de pipeteo comunicados por los centros de laboratorio.
Tabla 9: Reproducibilidad. H1N1
Centro 1 Centro 2 Centro 3
Muestra
Concordan cia con los resultados esperados
Media CT
% CV
Concordan cia con los resultados esperados
Media CT
% CV
Concordan cia con los resultados esperados
Media CT
% CV
Concordan cia total con los resultados
esperados IC 95% CI
Control sin molde 30/30 40,0 0,0 30/301 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 90/90
(100%) 95,9% - 100%
Control positivo 29/292 29,2 2,6 30/30 28,5 0,9 30/30 29,0 0,7 89/89
(100%) 95,9% - 100%
Frotis Gripe 2009 H1N1
negativo alto 29/293 40,0 0,0 28/30 39,9 0,7 25/30 39,6 2,2 82/89
(92,1%) 84,6% - 96,1%
Gripe H1N1 2009
positivo bajo 25/283 34,8 6,1 28/293 34,0 4,1 29/293 33,9 1,6 82/86
(95,3%) 88,6% - 98,2%
Gripe H1N1 2009
positivo medio 27/273 30,6 5,1 30/30 30,6 1,0 30/30 30,1 2,4 87/87
(100%) 95,8% - 100%
Gripe A (H1N1)
negativo alto 30/30 40,0 0,0 29/30 39,9 1,1 30/30 40,0 0,0 89/90
(98,9%) 94% - 99,8%
Gripe A (H1N1)
positivo bajo 29/293 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 89/89
(100%) 95,9% - 100%
Gripe A (H1N1)
positivo medio 30/30 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 90/90
(100%) 95,9% - 100%
Gripe A (H3N2)
negativo alto 27/283 40,0 0,7 29/30 39,9 0,8 30/30 40,0 0,0 86/88
(97,7%) 92,1% - 99,4%
Gripe A (H3N2)
positivo bajo 23/243 40,0 0,2 29/30 40,0 0,2 29/30 40,0 0,1 81/84
(96,4%) 90% - 98,8%
Gripe A (H3N2)
positivo medio 30/30 40,0 0,0 27/273 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 87/87
(100%) 95,8% - 100%
Aspirado Gripe H1N1 2009
negativo alto 25/253 40,0 0,0 29/29 40,0 0,0 29/293 40,0 0,0 83/83
(100%) 95,6% - 100%
Gripe H1N1 2009
positivo bajo 24/30 35,2 6,4 29/30 33,7 3,7 28/283 34,3 3,2 81/88
(92,0%) 84,5% - 96,1%
Gripe H1N1 2009
positivo medio 30/30 30,2 1,1 29/30 30,0 3,2 30/30 30,4 1,6 89/90
(98,9%) 94% - 99,8%
Gripe A (H1N1)
negativo alto 28/283 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 88/88
(100%) 95,8% - 100%
Gripe A (H1N1)
positivo bajo 30/30 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 29/293 40,0 0,0 89/89
(100%) 95,9% - 100%
Gripe A (H1N1)
positivo medio 29/293 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 28/283 40,0 0,0 87/87
(100%) 95,8% - 100%
Gripe A (H3N2)
negativo alto 30/30 40,0 0,0 27/274 40,0 0,0 29/293 40,0 0,0 86/86
(100%) 95,7% - 100%
Gripe A (H3N2)
positivo bajo 30/30 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 90/90
(100%) 95,9% - 100%
Gripe A (H3N2)
positivo medio 30/30 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 30/30 40,0 0,0 90/90
(100%) 95,9% - 100%
Concordancia total Todos
565/576 (98,1%)
584/592 (98,6%)
586/592 (99%)
1735/1760
(98,6%) 97,9% - 99%
1) La primera réplica del NTC del centro 2, día 4, proceso 1, se detectó en el canal de gripe A con un valor Ct de 39,5. En este pocillo se observó una curva de amplificación válida. Las otras dos réplicas fueron negativas y los datos de este proceso están incluidos en el análisis.
2) La segunda réplica del control positivo del centro 1, día 4, proceso 1 fue inválida. Las otras dos réplicas de este proceso fueron positivas y los datos del proceso están incluidos en el análisis.
3) El(los) pocillo(s) tuvieron un resultado inválido y no se usó(usaron) en cálculo de la variabilidad de Ct.
4) Los resultados de las muestras han sido excluidos del análisis debido a errores de pipeteo comunicados por los centros de laboratorio.
