Marcadores bioquímicos en la caracterización y evaluación de cultivos

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(1)tr,t¿'23. MARCADORES BIOQUIIiÍICOSEN 1A CARACTERIZACION Y EVALUACIONDE CIJLTIVOS* Hernando Ramírez y William I.. M. Roca**. INIRODUCCION. Debido a las linilaciones que presentan l-os marcadores norfológicos y/o agronónicos para .una propia dentro evaluación ale materÍa1es de una colección especialrnente cuando se trata de evaluar nateriales dentro de una misma especie, se hace necesario recurrir a 1os marcadores noleculares, 1os cuales se basan en Ia comparación electroforéque se van a tica de proteínas y/o isoenzimas de los materiales eval-uar . I¿ técnica de Ia electroforésis consiste en la separación de biomoléculas (proteínas, enzimas y/o ácidos nucléicos) en un campo eIéctrirrmatrixtt co' las cuales migran a diferentes velocidades dentro de una (gel poliacrilanida de agarosa, o almidón) debido principal-Eente a su carga eléctrica y a su tanaño (Figura 1). A diferencia y/o agronórnicos, de 1os marcadores norfológicos marcadores bioquínicos más directa representan una expresión genorna de la planta y son menos afectados por el medio ambíente.. 1os de1. Por nucho tiempo 1a comparación de los patrones elec troforéticos de protelnas provenientes totales de exLractos crudos de senillas fué de gran ayuda en Ia evaluación de materiales denlro de una colecpero este sistema tuvo sus llmitaciones ción, cuando se trataba de dife¡enciar materiales oue estuvieran muv cerca genétÍcamente.. II.. MHTODOI¡GIA PARA EL PROCESODE EI,ECTTIOFORESIS. Para el proceso de aná1isis tejido o cualquier se tona e1 tejido de 1a planta, se hace la extracción extractantes usando soluciones y dicho extracto En eI se clarifica a través de centrifugación. sobrenadante vamos a obtener las Droteínas eue son solubles en la poliasoluctón extractante. gel de proteínu" en un Estas "" ""p.i"n. Contribución Unídad de Investigación Internacional de Agricultura Tropical,. en Biotecnología, CIAT.. Centro. Respectivamente Bió1ogo, Unidad de BioLecnología y Fisió1ogo Ph.D. Jefe Unidad de BioLecnología, CIAT. A.A. 6713 Cali,Colonbia. i63.

(2) Con¡ldod & Agoroso en ect (Vo). 60-5 20- I. o.3 o.6 o.7 o.9 t.2. ,o-o.e 7-O.5 6-O.4 4-O.2. ,.5 2.O. Flg. L. p¿"o" pora .tectrolorésts. Ronoo ú sepoft€¡o'n e¡lclanre dc motéculoa llncores de DNA(rtb). 3-O.t. Act eet dc.

(3) y una vez separadas se e f e c t ú a e l p r o c e s o d e t i n c i ó n , crilanida el cual se realiza sumergiendo e1 ge1 en una solución de azúl de Coomassie. Con el. desarrollo. de 1as técnicas. de electroforésis. con isoenzimas,. este problena fué en parte solucionado. Las enzinas son catalizadores bioquímicos que intervienen en 1as diferentes vías metabólicas de los individuos, Muchas de estas enzinas pueden ser detecladas después de ser separadas por electroforésis colocando eI ge1 en una solución de tinción que contiene: el sustrato, cofac!óres y colorantes ad_ecuadospara la tinción de 1a enzima deseada (FÍgura EI patrón de bandas de una enzina (zimograma) depende de: el 2). nú¡ero de 1oci, e1 número de alelos por locus, y de Ia esEructura cuaternaria de 1a enzina. las dife¡enEes fornas noleculares de una oisna enzina reciben eI nombre de aloenzimas cuando estas gon el producto de 1a expreeión de loe dfferentes a1e1os de un simple locus y ee llaman isoenzinas cuando provienen de la expreeión de loe dlferentes aleloe de diferentee loci. Estas enzi¡oas pueden eatar conforEadas por una o nás subunidades para formar La enzina actlva, fornando MONOMEROS, DIIíEROS, TRIMEROS, TETRAMF.ROS, etc. lae sub-unidades de una enzina multimérica pueden ser iguales formando una enzima mononérica; o pueden ser diferentes formando una enzima heteronérica (Figura 3). En el caso de enzinas nultiméricas los polipéptidos codificados en un sinple locus (fornado por dos alelós) !J conbinan a\,ezax para formar Ia enzina activa. En un indÍviduo heterocllbÉb pará un deterninado locus, los segrnentos de DNA que conforman dichog alelos (A y a) se diferencian en urro o más nucieóti.¿os, cb¿if:.tando por polipéptidos que van a diferir en uno o nás a¡ninoácídos, y dependiendo del tipo de a¡qinoácidos en que difieren 1os polipéptidos, éstos tanbién pueden diferir en su conformación espacial y en su carga neta, 1o cual va a influír en su novilidad dentro del gel cuando son separados por electroforésis. los productos génicos de los a1e1os (A y a) de un individuo heterocigoto que codifican por una enzina dinérica, se combinan al azar produciendo tres formas moleculares dé Ia enzima representatia por 1os genotipos: AA, Aa y aa. Estas tres fornas noleculares están en una proporción de 1:2:1 donde Ia forna híbrida o heteromérica Aa tendrá el doble de copias que 1as formas AA y aa; por eso a1 ser separadas por electroforésis se observará un patrón de Eres bandas, donde 1a banda nás liviana (aa) escará más alejada del- origen, la banda más pesada (AA) estará más cerca del orígen y 1a banda híbrida (Aa) aparecerá en un punto intermedio presentándo el doble de intensidad que Ias bandas AA y aa. En ciertos casos ocurre que el producto de uno o anbos alelos de un locus deterninado produce polipéptidos sin actividad catalítica, cuyo fenotipo se caracteriza por 1a ausencia de bandas en el gel después de su tinción. Este tipo de alelos se denominan ALELOS NULOS. ro). ;.

(4) Í.J I do. I. Y. Exrroclo. I. sorurt,in& cttrocctón Crudo. ccn¡r¡lu,,o"tón. I. Y. SoD¡arrodonra. ( surrroro Eazlmo I cocnzlmao colocrora. I coloronr.. J,.,',-,. Atoañ2,mo. -*'-" ]. tsoca2lmo. Figuro 2 - Proceso gue sc sigue poro to tinción de isoenzimos y/o oloenzimos r66.

(5) oNA -----------+ potipe'pt ido .--------------En¿imos. Algunot Enzlmas. no. { :;tt::,i;r:; I especifi cos. Lo enzimo octivo estó formodo por uno subunidod ó potipéptitto Lo enzimo activo estc; formado pof mos de uno subunidod ri polipéptido. DIMERO. TntiiERo. TETRAINE N O. o NN,,NNN o. ñ," NNc @oo. AAoo Aooo. oooo. Figuro 3- Fundomento genético y bioquímico de los potrones eleclroforéticos de enzimos monoméricos diméricos lriméricos y letromáricos codificodos en un locus simple r67.

(6) Cuando en una población de individuos ha ocurrido más de una nutación en un misno locus, dicho locus va a tener rnás de un alelo produciendo diferentes polipéptidos que a su vez producirán nuchas fornas noleculares de una Eisna enzima (aloenzimas). Bstos diferentes aleloa dentro de un misno locus reciben eI nombre de ALEIOS MULTIPLES. Aunque la metodologla general para Ia detección de patrones electroforéticos de isoenzinas está bien desarrollada y es relativamente sencilla, la interpretación de dichos patrones requiere de ciertos conocinientos básicos Eanto de bioqulnica coEo de genétÍca y hasta del cultivo con que se está trabajando, ya que dichos patrones, e1 co¡¡¡o se nencionó anterÍornente, dependen de1 núnero de loci' por y número de alelos locus de Ia estructura cuaternaria de la enzlna . La caracterización o elininación de duplicados de una col-ecci6n ge hace con base a la presencia o ausencia de bandas de 1os narcadores isoenzináticos seleccionados; pero para estudios de segregación de un narcador o su liganiento con caracterlsticas de interés agronómico si se hace necesario del conocini-ento de la genética y la bioquínica de dichos marcadores. Con estas bases- genéticas sobre e1 coEportaEiento de las i-soenzi-nas podenos tener una visión nás clara de la aplicabilidad de esta netodologla no solamente como una herranienta para la caracterización y evaluación de materiales cono conpleEento de las evaluaciones norfológicas y agronómicas, sino Ea¡nbién en estudios bioqulnicos, genéticos y evol-utivos, fisiológicos,. III,. APLICACIONESDE T,A BI,EGIROMRBSIS. Entre laa aplicaclones generales de estas técnicas de etectroforésis de isoenzinas se pueden citar las siguientes: 1. Evaluación de la estabilidad. genétíca de:. a. -Materj.-a-les.prop¡rgados por la IUeSO Ilevacos aI camPo.. técnica. b. Materlales alnacenados ln vitro y luego llevados a1 canpo. c. l,lateriales propagados a partir. 2 . Detección de variación J.. Caracterización. de cultivo. in. vitro. por largos perlodos de tíempo de crloconservación.. somaclonal y garnetoclonal. de nateriales. y. de una colección de gernoplasma. r68.

(7) l+.. Detección ylo confirmación. de duplicados dentro de una colección. 5 . Deteccíón de híbridos en: a. Cruceelno¡males b. Cruces interespeclficos c. Fusión de protoplastos. 6 . Detección de narcadores isoenzináticos terísticas 7.. de interés. correlacionados con caracagronómi-coy/o econónico.. Utilización de narcadores de napas genéticos.. isoenzfnáticoe. para la. conetrucción. Una gran ventaja de trabajar con ieoenzinas es que el equipo y reactivos para la evaluación de materiales a travée de ésta técníca son relatÍvaoente baratos, y que e1 proceso no deatruye el Eaterial que se está evaluando ya que para e1 análisis sólo se necesita pequeñas cantidades del tejido vegetal, pernitiendo la sobrevivencia del naterial vegetal para su propagación.. IV. BIBLIOGRAHTA 1. Boulter, D., Ttrurnan, D. and Turner, B.L. 1966, The use of disc electrophoresis ,of plant proteins in systenatics. Taxon, 15:135-143. 2,. Brewer, G.J. and Sing. C.F. 1970. An introduction techiques. New York, Academic Press.. 3.. Brer¿baker, J.C., Upadhya, M.D., Makinen, y. and MacDonald, T. Isoenzyne polynorphisn in flowering plants. III. 1968. GeI electrophoretíc nethods and applications. physiol. ptaDt 2lz 93O-94O.. 4.. Cooke, R.J. 1984. The characterization crop culti-vars by electrophoresis. 59-72.. to. isozvme. and identificati.on Blectrophoresis,. of 5:. 5 . Cardy, 8.J., Stuber, C.Iü. and Goodman,M.l.{. I9BO. Techniques for Starch gel electrophoresis of enzynes fron maize (Zea Institure ggys L.). of Statistics Mimeograph SerieGl No. 1317, North Caroline State University, Raleigh, North Caroline, 3l p.. 6 . Gottlieb,. L.D. 1971. GeI electrophoresis; A new approach to the study of evolution. Bio Science, 21t 938-944.. 769.

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