ENDOTOXEMIA
Julieta Ronchi 1 ([email protected]), Gabriela Olea 1 ([email protected]), Luis Huespe2 ([email protected]), Maria Victoria Aguirre 1 ([email protected]),
Tania Romina Stoyanoff 1 ([email protected]).
Lugar de Trabajo: 1. Departamento de Bioquimica- ´´Laboratorio de Investigaciones Bioquímicas´´ (LIBIM)- Facultad de Medicina) 2. Hospital Escuela ´´Gral. Josè Francisco de San Martín´´ Centro de Investigaciones
Clínicas
RESUMEN
La sepsis se define como una disfunción orgánica potencialmente mortal, causada por la respuesta desregu- lada del huésped a la infección. Constituye una de las principales causas de morbimortalidad. Un órgano crucial en la defensa frente a patógenos es el hígado, pero a su vez, es blanco de lesiones secundarias responsables de injuria hepática aguda (IHA). La dexmedetomidina (DEX), es un fármaco utilizado como anestésico en la te- rapia intensiva y se habrían identificado acciones benéficas en pacientes sépticos. Sin embargo, restan dilucidar los efectos protectivos y mecanismos subyacentes asociados a la DEX. Los objetivos del trabajo fueron evaluar los efectos protectivos de la DEX sobre el tejido hepático en un modelo séptico agudo. Ratones machos, cepa Balb-C fueron divididos en cuatro grupos experimentales (n=3/grupo): Grupo control,inyectados con Sol.Salina ip.;Grupo LPS, inyectados con lipopolisacárido (LPS O157:B7; 8 mg/kg, ip.); Grupo DEX , inyectados con DEX 50 µg/kg con 1 dosis i.p.; Grupo LPS + DEX, inyectados con DEX media hora antes del LPS. A las 24 horas post LPS se determinaron parámetros bioquímicos de función hepática, alteraciones histopatológicas del tejido hepá- tico (H/E, Tricrómica y PAS) y expresión de Bax y Bcl-xL mediante inmunohistoquímica. El grupo LPS + DEX mostró una mejora significativa tanto en la lesión hepática (p<0,01), como en la severidad de los cambios histo- patológicos en relación al grupo LPS. Asimismo, se observó una disminución marcada de la relación Bax/Bcl-xl.
Estos resultados preliminares indican que DEX posee efectos protectivos frente a la IHA y la sitúan como un po- tencial agente terapéutico.
Palabras claves: Dexmedetomidina, LPS, Injuria Hepática Aguda, Apoptosis
SUMMARY
Sepsis constitutes a life-threatening organ dysfunction caused by a dysregulated host response to an infec- tion. According to statistics, this illness is the main cause of mortality and worst outcome in the intensive care unit (ICU). The liver is crucial on immune response to pathogens, yet can undergo secondary damage leading to acu- te liver injury (ALI). Dexmedetomidine (DEX) is a common drug used as a short-term anesthetic on ICU and re- cent studies have demonstrated DEX protective effects on septic patients. However, remains to be elucidated its potential protective effects and the underlying molecular mechanism of action. In this sense, this study aimed to evaluate the protective effects of DEX on liver tissue on an acute model of sepsis. Male inbred Balb/c mice were divided into four experimental groups: I) Control; II ) LPS ( 8 mg / kg , ip) , III ) DEX ( 50µg/ kg , ip ) and IV ) DEX+LPS. After 24 hours post LPS administration, biochemical parameters, liver histopathology alterations (H/E, Trichrome, PAS), and the expression of Bax and Bcl-xL were assed. LPS + DEX group showed a significant im- provement not only on liver injury (p <0,01) but also on the severity of histopathological alterations to that of the LPS group. Furthermore, Dex markedly decreased the Bax/Bcl-xL ratio. These preliminary results highlight DEX protective effects on ALI and place it as a potential therapeutic option on septic patients.
Key words: Dexmedetomidine, LPS, Acute liver injury, Apoptosis
INTRODUCCIÓN
De acuerdo al último consenso realizado en 2016, la sepsis está definida como ´´una disfunción orgánica potencialmente mortal causada por una respuesta desregulada del huésped a la infección(1). Clínicamente, la patología suele acompañarse de marcada hipotensión, inadecuada perfusión tisular, estado pro-trombótico lo que demarca la gravedad del cuadro. Constituye una de las principales cau- sas de muerte en todo el mundo, resultando a menudo en una discapacidad significativa en los so- brevivientes y está aumentando a nivel mundial (2). En Argentina, se han informado tasas de mortali- dad por shock séptico que oscila entre el 45,6% y el 51% (3). En cuanto a la fisiopatología de la sep- sis, se propone que el huésped sufre la exacerbación simultánea de las respuestas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias a raíz del cuadro infeccioso; la intensidad de ambas dependerá de factores del
huésped (genética y comorbilidades) como del patógeno (carga y virulencia) (4). En este sentido, es menester recordar el papel central del hígado en la defensa inmune frente a diversos microorganis- mos, lo cual lo sitúa como esencial en un cuadro séptico pero a la vez, susceptible de marcado daño debido al stress oxidativo, apoptosis e hipoxia originando una injuria hepática aguda (IHA) (5). A pesar de haberse logrado avances significativos en la comprensión de esta patología esto no se tradujo de forma similar en progresos terapéuticos. La dexmedetomidina (DEX) es un agonista de los recepto- res alfa 2 adrenérgicos, ampliamente utilizada como analgésico y anestésico de corta duración en la Unidad de Terapia Intensiva (UTI) (6). En los últimos años, se ha señalado que la DEX presentaría efectos benéficos en pacientes sépticos que son pre-tratados con la droga respecto aquellos que re- ciben otro sedativo, más aún, existen reportes que sugieren efectos anti-inflamatorios y anti- apoptóticos en diversos modelos experimentales (7,8). Sin embargo, aún restan dilucidar los potencia- les efectos benéficos de la DEX así como también los mecanismos subyacentes asociados a estas acciones no clásicas.
El objetivo es evaluar los efectos protectivos de la Dexmedetomidina sobre el tejido hepático en un modelo pre-clínico de sepsis inducido por endotoxemia.
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales y diseño experimental: Se usaron ratones machos adultos isogénicos de la cepa Balb-C (26-28g) del Bioterio de la Facultad de Medicina de la UNNE, mantenidos con dieta estándar y agua a libre demanda. Los procedimientos fueron aprobados ante el CICUAL de la Facultad de Medicina- UNNE. Los ratones fueron divididos al azar en cuatro grupos experimentales (n=3 animales por gru- po). Grupo control: se suministró una única inyección de solución fisiológica (NaCl 0,9 %) ip. Grupo LPS: inyección de LPS (8mg/kg) vía ip en concordancia con estudios previos del laboratorio (9). Gru- po DEX: se suministró la DEX (50 ɥg/kg) en una dosis por vía intraperitoneal (ip).Grupo LPS + DEX:
se suministró 50 ɥg/kg de DEX (ip.) en una dosis, media hora antes LPS (8 mg/kg). A las 24 hs post LPS, se observaron manifestaciones clínicas y los animales fueron anestesiados para la obtención de muestras sanguíneas por punción cardíaca. Luego de eutanizados por dislocación cervical, se procedió a la extirpación del órgano (hígado) en condiciones estériles para los análisis posteriores.
Evaluación de función hepática a través de la determinación de parámetros bioquímicos (GOT, GPT, FAL): Se analizaron los niveles de GOT (transaminasa glutámico oxalacética), GPT (transami- nasa glutámico pirúvica) y FAL (Fosfatasa alcalina) utilizando métodos colorimétricos estándares (Wiener Lab) con autoanalizador Synchron CX7 Analyzer (Beckman, CA) en los distintos grupos ex- perimentales.
Examen histológico de muestras hepáticas: Brevemente, los hígados fueron fijados con formol bufferado (pH 7.4) durante 18hs, deshidratados en alcoholes de graduación creciente e incluidos en parafina. Seguidamente, se obtuvieron los cortes (5 µm), desparafinizados, rehidratados, y se some- tieron a las técnicas histológicas de rutina: Hematoxilina/Eosina (H/E), PAS (Periodic Acid-Schiff) y Tricrómica de Masson para posterior evaluación por microscopía óptica (Olympus BX40, Tokio, Japan).
Inmunohistoquímica (IHQ): Las muestras de tejido hepático se trataron como se describió previa- mente hasta obtener cortes rehidratados y desparafinizados. Luego, se efectuó el desenmascara- miento antigénico con Triton X-100. Posteriormente, se incubaron con H2O2 al 0.3% en PBS, para bloqueo de la peroxidasa endógena, y luego con solución bloqueante comercial (suero). Los cortes se incubaron con anticuerpos primarios (en dilución a determinar dependiendo del caso) en buffer PBS durante 1 hora a 37°C. Finalmente, la inmunorevelación se realizó usando el kit DAKO LSAB + /HRP kit (Dako Cytomation) seguido del Kit DAB/H2O2 (DakoCytomation) utilizado como cromógeno.
La tinción con hematoxilina se utilizó como colorante de contraste nuclear. La intensidad de la inmu- nofijación se valoró usando un microscopio óptico (Olympus BX40, Tokio, Japan).
Imágenes y análisis estadístico: Los resultados se analizaron utilizando el Software INSTAT 3.0 y PRISM versión 4.0 (GraphPad Software, U.S.A.) y se expresaron como la media ± S.E.M., conside- rando significativo un P< 0.05. Las imágenes digitalizadas serán procesadas con Adobe Photoshop 8.
RESULTADOS
Efectos de la DEX sobre el estado general: Los animales sometidos a endotoxemia exhibieron clásicos signos de sepsis que incluyeron, piloerección, taquipnea, diarrea, exudado periorbital y le- targia desde las primeras horas post inyección de LPS.
DEX mejora la funcionalidad hepática tras la administración de LPS 8mg/kg: Como se puede observar en la figura 1, a las 24hs de la administración del LPS se pone de manifiesto un incremento significativo GPT y GOT y en menor medida un aumento de FAL evidenciando una marcada injuria hepática. Sin embargo, el tratamiento con DEX atenúa en forma significativa dichos parámetros.
Figura 1. Efecto de la administración de DEX sobre la funcionalidad hepática en la sepsis inducida por LPS (8 mg/kg). Los resultados son expresados como la media ± DS de tres experiencias diferentes. ANOVA y Test de Bonferroni. *p<0,05;
** p<0,01 diferencias grupo LPS vs control. # p<0,05; ### p< 0,001 diferencias gru- po LPS vs LPS + DEX. Las imágenes representan los valores plasmáticos de GOT, GPT y FAL.
Dex atenúa las alteraciones histopatológicas hepáticas tras endotoxemia: Con el objetivo de confirmar los efectos hepatoprotectivos, se analizaron los cambios morfológicos en dicho órgano mediante tres tinciones: hematoxilina-eosina (H/E), Ácido periódico-Schiff (PAS) y Tricrómica de Masson. Como se puede observar en la figura 2, los tejidos controles se presentaron con estructuras lobulillares conservadas, a diferencia del grupo LPS 24hs, en donde se evidenció un aumento del in- filtrado leucocitario con marcada degeneración vacuolar (flecha). Sin embargo, estas alteraciones fueron atenuadas de forma marcada en el grupo LPS + DEX. Estos resultados son congruentes con lo advertido por la bioquímica hepática.
Figura 2. Efecto protector de DEX en IHA séptica inducida por LPS (8 mg/kg).
A) Muestras histológicas representativas de los diferentes grupos experimentales.
B) Score histopatológico semi-cuantitativo del tejido hepático. Las secciones his- topatológicas fueron sometidas a tres tinciones: H/E, PAS, y Tricrómica de Masson y en las imágenes se observa una visión panorámica del preparado (100x) y a mayores aumentos (400x y 1000x). Barras de escala 100 µm, 40 µm y 20 µm.
Scores histológicos de daño. Media ± SD. *** p<0.001 Control vs LPS; # p<0,05 diferencias grupo LPS vs LPS + DEX
A TRI PAS HIE
Control
LPS 24 hs.
LPS + DEX
B
Evaluación de la expresión de proteínas participantes de la apoptosis (Bax, Bcl-xL) en los di- ferentes grupos experimentales: Como se puede ver en la figura 3, se evaluaron los niveles de dos proteínas pertenecientes a la familia Bcl-2 con propiedades antiapoptoticas (Bcl-xL) y pro-apoptóticas (Bax). A diferencia de lo observado en el grupo control, la administración de LPS incremento en for- ma marcada la expresión de Bax y disminuyó los niveles de Bcl-xL. Interesantemente, el tratamiento con dexmedetomidina provocó una disminución en los niveles de Bax junto a un aumento en la ex- presión de Bcl-xL.
Figura 3. Evaluación de la expresión de Bax y Bcl-xL luego de la administra- ción de LPS (8 mg/kg) A) Expresión de Bax y Bcl-xL en los diferentes grupos ex- perimentales. En las imágenes se observa una visión panorámica del preparado (400x). Barra de escala 40 µm.
HÌGADO
CONTROL LPS LPS + DEX
BAX
BCL-XL
DISCUSIÓN
La sepsis es una patología de interés creciente, cuya complejidad y elevada tasa de mortalidad la han convertido en un verdadero desafío en el ámbito médico. A pesar de haberse logrado compren- der diversos aspectos en la fisiopatología; la terapéutica permanece sin respuestas. El hígado, cum- ple un rol fundamental en la respuesta inmunitaria y en los procesos de coagulación, sin embargo, se ha visto que frente a respuestas desreguladas como ocurren en los cuadros sépticos, puede sufrir le- siones secundarias llevándolo a IHA.
En el presente trabajo nos enfocamos en el estudio del hígado en el contexto de un cuadro sépti- co agudo inducido luego de la administración del LPS. En principio, evaluamos el grado de injuria ti- sular mediante la determinación de enzimas hepáticas (GOT, GPT y FAL) acompañado de un análi- sis histopatológico. En la práctica habitual se utiliza la determinación de las aminotransferesas (GOT y GPT) como indicativos de lesión hepatocelular. No obstante, GPT es más específica de daño hepá- tico que GOT, ya que la primera se localiza casi en forma exclusiva en el citosol del hepatocito y la segunda además de citosol y mitocondria, se encuentra en el corazón, musculo esquelético, riñones, cerebro, páncreas, pulmón, eritrocitos y leucocitos. La fosfatasa alcalina (FAL), está presente en el epitelio de los conductos biliares y participa en la formación de la bilis, motivo por el cual aumenta en forma marcada durante la colestasis. En el presente estudio se observó que respecto al control, la administración de LPS provocó un aumento significativo de GPT y GPT, con niveles ligeramente au- mentados de FAL, lo cual pone en evidencia una clara lesión a nivel de los hepatocitos, posiblemente debido al cuadro isquémico e inflamatorio subyacente. El subsiguiente pre-tratamiento con DEX revir- tió los valores enzimáticos similares al control. Estos hallazgos fueron concordantes con las altera- ciones histopatológicas, donde el grupo LPS presento severa injuria respecto al control, mientras que la DEX revirtió estas alteraciones en forma marcada. Estos resultados son similares a los reportados en otros estudios (10).
A partir de los resultados anteriores, decidimos investigar la expresión de Bax y Bcl-xL en el pa- rénquima hepático. Nuestros hallazgos evidencian que luego de la administración de LPS hubo un claro aumento en la expresión de Bax acompañado de bajos niveles de Bcl-xL lo cual sería sugestivo de un fenómeno apoptótico en el parénquima hepático. Sin embargo, DEX logró atenuar en forma marcada lo antes citado. Estos hallazgos son coincidentes con los reportados por otros autores (11).
En resumen, el presente estudio logró recrear las características típicas asociadas a un cuadro séptico temprano, y evidenciar los efectos hepatoprotectivos que presenta la DEX. Más aún, nues- tros hallazgos sugieren efectos anti-apóptóticos asociados a la DEX, que explicarían, al menos en parte, uno de los mecanismos de acción no clásicos del que se beneficiarían aquellos pacientes que sufran de IHA.
CONCLUSIÓN
El presente estudio pone en evidencia que la administración de DEX posee efectos protectivos frente a la IHA en modelos sépticos murinos, situándola como un potencial agente terapéutico. A su vez, este estudio preliminar provee nuevas perspectivas para nuestras futuras investigaciones ten- dientes a profundizar los mecanismos protectivos de la DEX frente a un cuadro séptico temprano
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11. Sha J, Zhang H, Zhao Y, Feng X, Hu X, Wang C, et al. Dexmedetomidine attenuates lipopolysaccharide-induced liver oxida- tive stress and cell apoptosis in rats by increasing GSK- 3β/MKP-1/Nrf2 pathway activity via the α2 adrenergic receptor. To- xicol Appl Pharmacol [en línea]. 2019 [acceso septiembre 2020):144–52. Disponible en:
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