EFECTE DEL FRAGMENT H
CDE LA TOXINA TETÀNICA SOBRE MECANISMES IMPLICATS EN L'ACCIÓ DEL
RECEPTOR p75
NTRRoger Cubí Piqué
Tesi Doctoral
Bellaterra, 2011
Institut de Neurociències
Departament de Bioquímica i Biología Molecular
Unitat de Bioquímica, Facultat de MedicinaEFECTE DEL FRAGMENT H
CDE LA TOXINA TETÀNICA SOBRE MECANISMES IMPLICATS EN L'ACCIÓ DEL RECEPTOR p75
NTRMemòria de la tesi doctoral presentada per Roger Cubí Piqué per a optar al
grau de Doctor en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina, per la Universitat Autònoma de Barcelona.
Treball realitzat a la Unitat de Bioquímica i Biologia Molecular de la facultat de Medicina, del Departament de Bioquímica i Biologia Molecular i al Institut de Neurociències, de la Universitat Autònoma de Barcelona, sota la
direcció del Dr. José Aguilera Ávila i del Dr. Carles Gil Giró.
Doctorant
Bellaterra, 10 de Gener del 2011 Directors de tesi
Dr.José Aguilera Ávila Dr. Carles Gil Giró
Roger Cubí Piqué
Aquest estudi ha estat realitzat gràcies al següents projectes:
“Caracterització de l’acció neurotròfica del fragment C-terminal de la toxina tetànica.
Avaluació de la capacitat terapèutica en el tractament de malalties neurodegeneratives”.
Ministerio de Educación y Ciencia (MEC), ref. SAF2006-15184
“Demostrar l'acció neurotròpic del fragment no tòxic C terminal de la toxina tetànica i la seva capacitat terapèutica en la malaltia de Parkinson i en altres malalties neurodegeneratives”
. Ministerio de Educación y Ciencia (MEC), ref. SAF2009-13626
Estados de ánimo A veces me siento como un águila en el aire ...
(A propósito de una canción de de Pablo Milanés) Unas veces me siento
como pobre colina, y otras como montaña de cumbres repetidas, unas veces me siento como un acantilado, y en otras como un cielo azul pero lejano, a veces uno es manantial entre rocas, y otras veces un árbol con las últimas hojas, pero hoy me siento apenas como laguna insomne, con un embarcadero ya sin embarcaciones, una laguna verde inmóvil y paciente conforme con sus algas sus musgos y sus peces,
sereno en mi confianza confiando en que una tarde, te acerques y te mires..
te mires al mirarme.
Mario Benedetti
AGRAÏMENTS
Primer de tot, voldria agrair als meus directors de tesi Dr. Carles Gil i Dr. José Aguilera, haver-me permès realitzar la tesi doctoral al seu laboratori, així com al Dr. Arturo Ortega per haver-me acollit al seu laboratori en la meva estada a Mèxic.
També voldria agrair als Drs. Enrique Claro i Albert Gubern per ajudar-me en els primers passos en el món dels lípids.
Com no, també agrair als meus companys de grup, Mireia, Ana i Daniel, per els bons moments passats, i en especial a la Naty, amb qui vaig iniciar aquest viatge en el que hem passat moments bons i dolents, espero que no perdem el contacte compi!
Com no, agrair a “las ovejitas”, Tània, Greti, Arantza, Judit i Tati, els centenars de cerveses que hem pres a la vila ( i la de refredats que hagués agafat sense vosaltres...) ;-).
Tampoc em puc deixar a tots els que heu compartit amb mi aquests anys de tesi, alguns ja fa temps que vàreu marxar, altres just acabeu d’arribar, però tots en major o menor mesura m’heu ajudat a ser millor científic, i el més important, ser millor persona.
Finalment, agrair a la família el suport donat en tots aquests anys.
Moltes gràcies a tots.
11
1 ÍNDEX
1 ÍNDEX ... 11
2 ABREVIATURES ... 17
3 RESUM ... 23
4 INTRODUCCIÓ ... 27
4.1 La toxina tetànica ... 27
4.2 El fragment Hc de la toxina tetànica ... 30
4.3 Accions de la TeTx i del fragment Hc- TeTx. ... 32
4.4 La membrana cel·lular ... 33
4.4.1 Els lípids de les membranes cel·lulars ... 33
4.4.2 Els lipid rafts ... 36
4.4.3 Els esfingolípids ... 37
4.4.4 Metabolisme dels esfingolípids ... 38
4.4.5 Les SMases ... 40
4.4.6 Compartimentació i regulació dels esfingolípids bioactius ... 44
4.4.7 Senyalització dels esfingolípids bioactius ... 45
4.5 Les neurotrofines ... 49
4.5.1 Estructura de les neurotrofines... 49
4.5.2 Els receptors de les neurotrofines ... 51
5 OBJECTIUS ... 75
6 MATERIALS I MÈTODES ... 79
6.1 Preparació de la fracció enriquida en sinaptosomes de rata (P2) ... 79
6.1.1 Animals utilitzats ... 79
6.1.2 Solucions i reactius ... 79
6.1.3 Metodologia ... 79
6.2 Cultius primaris de neurones... 81
6.2.1 Animals utilitzats ... 81
6.2.2 Reactius generals... 81
6.2.3 Preparació dels cultius primaris ... 83
6.3 Manteniment i subcultiu de la linea cel·lular PC12... 85
12
6.3.4 Diferenciació de les PC12 ... 86
6.4 Purificació del fragment recombinant Hc-TeTx ... 87
6.4.1 Solucions i reactius ... 87
6.4.2 Metodologia ... 87
6.5 Marcatge del Hc recombinant amb el fluorocrom Alexa Fluor 488 ... 89
6.5.1 Material ... 90
6.5.2 Metodologia ... 90
6.6 Immunocitoquímica ... 91
6.6.1 Reactius ... 91
6.6.2 Anticossos ... 92
6.6.3 Metodologia ... 92
6.7 Extracció de lipid rafts ... 93
6.7.1 Extracció a partir de sinaptosomes de cervell de rata. ... 93
6.7.2 Extracció a partir de neurones granulars de cerebel de rata ... 94
6.8 Determinació de proteïnes per el mètode de BCA ... 94
6.9 Determinació de colesterol ... 95
6.10 Visualització de les membranes cel·lulars mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (TEM) ... 95
6.10.1 Reactius ... 95
6.10.2 Metodologia ... 96
6.11 Western-blot ... 96
6.11.1 Solucions i reactius ... 96
6.11.2 Preparació del gel d’acrilamida (SDS-PAGE)... 96
6.11.3 Anticossos ... 98
6.11.4 Metodologia ... 99
6.12 Immunoprecipitació de fosfo-tirosines ... 100
6.12.1 Reactius ... 100
6.12.2 Metodologia ... 100
6.13 Determinació de l’activitat SMasa ... 101
6.13.1 Solucions i reactius ... 101
6.13.2 Metodologia ... 101
13
6.14 Cromatografia de capa fina ... 102
6.14.1 Reactius ... 102
6.14.2 Metodologia ... 102
6.15 Determinació de la viabilitat cel·lular per MTT ... 103
6.16 Determinació dels nivells de Glutatió (GSH) ... 104
6.16.1 Reactius ... 104
6.16.2 Metodologia ... 105
7 RESULTATS ... 109
7.1 Caracterització de l’aïllament de lipid rafts amb detergents no iònics. ... 109
7.1.1 Determinació de nivells de proteïna i colesterol ... 109
7.1.2 Distribució de les proteïnes marcadores de diferents dominis de membrana . 111 7.1.3 Efecte de la depleció de colesterol sobre les DRM ... 112
7.1.4 Determinació de l’estructura dels rafts aïllats amb els detergents Tritó X-100 i Brij 98 mitjançant microscòpia electrònica. ... 114
7.1.5 Efecte del citoesquelet en el manteniment de l’estructura dels rafts aïllats amb tritó X-100 ... 114
7.1.6 Efecte de la temperatura en la purificació dels rafts ... 116
7.2 Caracterització de la distribució dels receptors de neurotrofines en microdominis de membrana ... 117
7.3 Caracterització del shedding de p75 ... 118
7.4 Distribució de les proteases TACE i Presenilina en microdominis de membrana ... 120
7.5 Caracterització de la purificació dels rafts en granulars de cerebel de rata 121 7.6 Efecte del fragment Hc en el shedding i la localització de p75
NTRen els rafts .. ... 123
7.7 Efecte del Hc sobre el procés de shedding de p75
NTRen els rafts ... 123
7.8
Efecte del Hc sobre la localització dels receptors de neurotrofines en els
rafts ... 1247.9 Efecte del Hc sobre la diferenciació de la línia cel·lular PC12 ... 126
7.10 Efecte del Hc sobre la producció de ceramida ... 128
7.10.1 El fragment Hc augmenta la relació ceramida/esfingomielina. ... 128
7.10.2 Determinació de l’activitat nSMasa ... 130
7.10.3 Determinació dels nivells de ceramida mitjançant microscòpia confocal ... 131
14
7.13 Efecte del Hc enfront a la pèrdua de viabilitat cel·lular induïda per retirada
de sèrum... 139
7.14 Efecte del Hc enfront l’estrès oxidatiu ... 140
8 DISCUSSIÓ ... 145
9 CONCLUSIONS ... 165
10 BIBLIOGRAFIA ... 171
15
ABREVIATURES
16
17
2 ABREVIATURES
ADAM: A desintegrin and metallopreoteinase
AP2: Proteïna activadora 2
aph-1: Anterior pharynx-defective 1
APP: Proteïna precursora amiloide
ARMS: Ankyrin-rich membrane spanning protein
BCL-2: B-cell lymphoma 2
BDNF: Brain-derived neurotrophic factor
Cadena H: Cadena pesada de la toxina tetànica
Cadena L: Cadena lleugera de la toxina tetànica
CARD: Caspase recruitment domain
CCN: Cultured Cortical Neuron
CDases: Ceramidases
Cer: Ceramida
Cer-1P: ceramida-1P
Cer1PP: Ceramida 1 fosfat fosfatasa
CerK: Ceramida cinasa
CGN: Cerebelar Granule Neuron
TEM: Microscopia electrònica de transmissió
CHO: Chinese hamster ovary
CNT: Neurotoxines Clostridials
cPLA2: fosfolipasa A2 citoplasmàtica
CRD: Cysteine rich domain
DNA: Àcid desoxiribonucleic
DRM: Detergent-resistant membranes
EGF: Factor de creixement epidèrmic
ErbB4: v-erb-a erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4
ERK: Extracellular signal-regulated kinase
FAP-1: Proteïna fosfatasa de tirosines
GDP: Difosfat de guanosina
GPI: Glycosylphosphatidylinositol
GTP: Trifosfat de guanosina
Hc: Fragment C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetànica
HN: Fragment N-terminal de la cadena pesada de la toxina tetànica
ICDs: Dominis intracel·lulars dels receptors
IKK: IkB kinase
IRAK: IL-1 receptor associated kinase
JNK: C-jun N-terminal Cinasa
18 LD50: Dosi letal 50
Lingo 1: Leucine rich repeat and Ig domain containing 1
MAG: Myelin-associated glycoprotein
MAGE: Melanoma antigen gene
MAPK :Mitogen-Activated Protein Kinase
MCDX: Methyl-β-cyclodextrin
MHD: MAGE homology domain
MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide
NADE: p75-associated cell death executor
NES: Senyal d’export nuclear rica en leucines
NF-KB: Nuclear Factor-KappaB
NGF: Nerve Growth Factor
Nogo: Neurite outgrowth inhibitor
NRAGE: Neurotrophin receptor-interacting MAGE homolog
NRH: Neurotrophin receptor homologue
NRIF: Neurotrophin receptor interacting factor
NT-3: Neurotrofina-3
NT-4/5:Neurotrofina 4/5
glycoprotein
p75-ICD: p75-Intracellular domain
p75NTR: Receptor de neurotrofines p75
PC12NGF: PC12 diferenciades amb NGF
pen-2: Presenilin enhancer 2
PEST: Seqüència potencial amino terminal
PI3-K: Fosfatidilinositol 3-kinase
PKB: Proteïna cinasa B
PKC: Proteïna cinasa C
PLC-: Fosfolipasa C-
PR: Domini regulador positiu
PrP: Proteïna priònica
PS1: Presenilina 1
PS2: Presenilina 2
PTB: Phosphotyrosine binding
Ras: RAt Sarcoma
RhoA: Ras homolog gene family, member A
RIP: Regulated intramembrane proteolysis
RIP-2: Receptor-interacting protein 2
RNA: Àcid ribonucleic
RNS: Reactive nitrogen species
ROS: Reactive oxigen species
SC-1: Schwann cell factor 1
19 SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate-
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis SH2: Src homology 2
SM: Esfingomielina
SMasa: Esfingomielinasa
SNAP 25: Synaptosomal-associated protein 25
SNARE: Soluble NSF Attachment protein Receptor
SNC: Sistema nerviós central
Sp1: Proteïna estimuladora 1
Sph: Esfingosina
Sph-1P: esfingosina-1P
SPV: C-terminal Ser-Pro-Val
Src: Sarcoma
TACE: Tumor necrosis factor-α-converting enzyme
TeTx: Toxina tetànica
TfR: Receptor de Transferrina
TK: Tirosina cinasa
TNFR: Receptor del Factor de Necrosi Tumeral
TPA: 12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetat
TRAF: Tumor necrosis receptor-associated factor
Trks (TrkA, TrkB i TrkC): Tropomyosine Receptor Kinase
TX100: Tritó X-100
VAMP2: Vesicle-associated membrane protein 2
Vps10p: Vacuolar protein sorting 10 protein
20
21
RESUM
22
23
3 RESUM
Les malalties neurodegeneratives tenen una alta incidència en la societat actual. Degut a això s’han invertit grans quantitats de diners i d’esforç en investigació per tal d’alleujar-ne els símptomes o intentar curar-les. Dins d’aquests esforços globals, en el nostre grup estudiem l’efecte en neurones del fragment Hc de la toxina tetànica (Hc), domini encarregat de la unió de la toxina tetànica a les neurones, però sense l’acció patogènica de la toxina sencera. Així, s’ha vist que el fragment Hc genera una acció neuroprotectora en situacions d’estrès cel·lular i en models animals de malalties neurodegeneratives. Malgrat aquest efecte neuroprotector, no es coneix en detall el mecanisme a través del qual genera el mencionat efecte. En anteriors treballs del grup a on s’ha realitzat aquesta tesi es va descriure l’activació per Hc de vies de senyalització típiques de neurotrofines, indicant així el mecanisme de senyalització bàsic mitjançant el qual es genera l’efecte neuroprotector. Per altra banda, experiments previs d’entrecreuament químic també mostraven interacció del fragment Hc amb el receptor de neurotrofines p75. Basant-nos en aquestes dades, vàrem partir de la hipòtesi que l’Hc inicia la seva senyalització promotora de supervivència modificant l’acció del receptor p75 i alterant la senyalització intracel·lular que porta a terme. Hem pogut observar, com a resultats principals, que el fragment Hc indueix la mobilització del p75 cap als microdominis de membrana de tipus Lipid Rafts, indueix la fosforilació del p75 en tirosines i estimula l’activitat enzimàtica esfingomielinasa (SMasa), donant lloc a la formació de ceramida i de microdominis de membrana rics en aquest esfingolípid. Hem observat, però, que la formació de plataformes de ceramida no està implicada en la internalització del Hc, com s’ha demostrat per altres agents patògens, tot i que sí sembla estar implicada en senyalització induïda per Hc. Així doncs, els resultats obtinguts en el present treball donen suport al paper del receptor p75 com a mediador de l’acció del fragment Hc i aporten nova informació sobre el seu sistema d’actuació a nivell molecular.
24
25
INTRODUCCIÓ
26
27
Figura 1. Simptomatologia de la malaltia del tètanus. Dibuix de Charles Bell (1774-1842) de l’any 1809 on es mostra un home amb símptomes generalitzats de la malaltia del tètanus. (Original en el Royal College of Surgeons of Edinburgh, Escocia).
4 INTRODUCCIÓ
4.1 La toxina tetànica
La toxina tetànica (TeTx) és una de les substàncies més tòxiques que es coneixen i és responsable de la malaltia del tètanus, caracteritzada per contraccions musculars i espasmes recurrents (Mallick and Winslet, 2005). Forma part de la família de les neurotoxines clostridials (CNTs), que són holoproteïnes sintetitzades per diferents espècies de bactèries del gènere Clostridium. El gènere Clostridium el conformen bacils Gram-positius, anaerobis estrictes, formadors d’espores i àmpliament distribuïts en la natura.
La TeTx és sintetitzada pel Clostridium tetani en forma d’una única cadena polipeptídica de 150 kDa. La forma activa o exotòxica es produeix per la hidròlisi d’un enllaç peptídic mitjançant una proteasa clostridial, o bé una endoproteasa de l’hoste amb característiques similars a la tripsina (Neubauer and Helting, 1979). D’aquesta forma, la hidròlisi genera dos fragments que resten units per un pont disulfur. La reducció del pont disulfur dóna lloc a la cadena lleugera (cadena L) de 50 kDa i la cadena pesada (cadena H) de 100kDa; la cadena L és la responsable de l’activitat toxigènica, mentre que la cadena H és la responsable de la unió de la toxina al teixit nerviós i de la internalització dins les neurones.
Alhora, la cadena H pot patir un tall per la papaïna generant 2 fragments, el N-terminal (HN) i el C-terminal (Hc) (Craven and Dawson, 1973; Helting and Zwisler, 1977; Helting et al., 1977).
L’estructura de la toxina tetànica presenta tres dominis funcionals diferents, la cadena L, i els extrems HN i Hc de la cadena H (figura 2). Aquesta organització en dominis de la toxina, està
28
1) unió a la membrana, 2) internalització en vesícules endocítiques, 3) translocació al citosol i 4) acció catalítica(per revisió veure (Lalli et al., 2003)
La dosi letal 50 (LD50) de la toxina tetànica està al voltant de 1 ng/kg, fet que la converteix, juntament amb les toxines botulíniques, en les proteïnes amb potència letal més gran conegudes actualment. S’ha suggerit que aquesta gran potència és deguda a la seva gran especificitat i afinitat pel teixit nerviós, especialment per als terminals nerviosos perifèrics.
S´ha comprovat que aquesta unió especifica al teixit nerviós té lloc en els rafts (Herreros et al., 2001), on hi intervenen tant els gangliòsids, concretament els que contenen 2 o més residus d’àcid siàlic, com ara els gangliòsids GD1b i GT1b (Helting et al., 1977) com un component proteic encara per identificar (Herreros et al., 2000). S’ha proposat un model d’unió a les membranes, on primer actuaria un component lipídic o proteic lligat a oligosacàrids que realitzaria una funció de captura de la toxina tetànica, i seguidament, actuarien grups de receptors presents en un mateix domini de membrana que acabarien d’atrapar la toxina i iniciarien l´endocitosi (figura 3) (Montecucco et al., 2004).
Figura 2. Estructura de la toxina botulínica B, representativa de totes les neurotoxines clostridials, entre elles la Toxina tetànica. De color lila està representat el Fragment Hc de la cadena pesada, responsable de la unió específica a les neurones i de la conseqüent internalització., de color taronja està representat el fragment Hn, responsable de la translocació de la cadena lleugera al citoplasma de la neurona i en verd la cadena lleugera, on l’esfera rosa representa l’àtom de zinc del centre catalític responsable de la proteòlisi de la proteïna diana. Imatge adaptada de http://www.wikidoc.org/index.php/Botulinum_toxin.
29
Després de la unió al terminal nerviós, la TeTx és internalitzada per un procés d’endocitosi on estarien involucrades vesícules recobertes de clatrina (Roux et al., 2005), que posteriorment viatjarien dins la motoneurona mitjançant el transport retroaxonal (figura 4).
Aquestes vesícules, en les que s’ha vist que colocalitzen el p75NTR amb la toxina tetànica, no contenen els marcadors de la via clàssica d’endocitosi i a més no són acidificades durant el transport retroaxonal (Lalli and Schiavo, 2002), condició necessària per a mantenir la TeTx dins la vacuola i així assegurar que arribi a les neurones intercalars inhibidores de la medul·la espinal. Finalment, per produir l’efecte catalític sobre la sinaptobrevina 2, s’ha d’alliberar la cadena L de la vesícula. Per facilitar aquest procés, es creu que hi intervé una bomba de protons ATPasa de tipus V que produeix una acidificació de l’interior vesicular, la qual promouria una conformació de la TeTx en forma de canal, per on la cadena L seria “injectada”
cap a l’exterior de la vesícula endocítica (Boquet and Duflot, 1982; Gambale and Montal, 1988;
Figura 3. Unió i endocitosi de la TeTx. a) S’ha suggerit que la TeTx s’uneix a la membrana presinàptica mitjançant una primera interacció amb un gangliòsid, que és un oligosacàrid unit a un lípid. Aquesta primera interacció es creu que és ràpida i de baixa afinitat. b) i c) Aquesta unió permetria al gangliòsid mitjançant moviments laterals de presentar la TeTx a un grup de proteïnes amb les que la TeTx també interaccionaria, resultant irreversible la unió amb la membrana presinàptica. Dins dels grup de proteïnes estarien presents receptors amb la capacitat d’activar les vies de senyalització necessàries per que es pugui produir la internalització i el següent transport retroaxonal per tal de que la TeTx viatgi de la motoneurona fins a la medul·la espinal. Adaptat de (Montecucco et al., 2004).
30
Figura 4. Transport de la TeTx. Vista esquemàtica d’una motoneurona de mamífer amb una interneurona espinal inhibitòria on es mostra la entrada dins la motoneurona de la TeTx amb el conseqüent viatge retroaxonal a través de l’axó de la motoneurona fins a arribar al soma on es produeix el salt transinàptic cap a la interneurona espinal inhibitòria. Adaptat de (Lalli et al., 2003).
sinaptobrevina 2, proteïna implicada en la fusió sinàptica, impedint així la secreció vesicular (Link et al., 1992).
4.2 El fragment Hc de la toxina tetànica
El fragment carboxi-terminal de la cadena H de la toxina tetànica (Hc) és el domini responsable de la unió específica a membranes neuronals i del procés d´internalització aparentment mitjançant la fulla beta de la regió C-terminal (Sinha et al., 2000). A més, aquest domini conserva la capacitat de viatjar retroaxonalment sense causar els símptomes clínics de la malaltia del tètanus.
El fet de que el fragment Hc pugui viatjar retroaxonalment i s’acumuli en el sistema nerviós central (SNC) va portar a provar la utilització d’aquest fragment com a transportador
31
de molècules dins del SNC (Covey et al., 1985; Jiang et al., 2005; Carlton et al., 2008; Ciriza et al., 2008). L'estructura cristal·logràfica per rajos x mostra que el fragment Hc està compost per dos subdominis d'aproximadament la mateixa grandària (25 KDa): HcC i HcN (figura 5).
L'extrem amino-terminal certa similitud amb el domini d'unió a carbohidrats present en lectines (jelly-rolle lectin like fold) i és una regió altament conservada entre les toxines clostridials (Emsley et al., 2000). Encara que no es coneix amb certesa la funció d'aquesta regió, s'ha demostrat que és incapaç d'unir-se a la membrana plasmàtica neuronal (Figueiredo et al., 1995). També es postula que sigui necessària per dirigir la TeTx cap a una ruta determinada en l'última fase d'intoxicació, en la qual la TeTx experimenta la transcitosi cap a les interneurones inhibitòries (Lalli et al., 2003). L'extrem carboxi-terminal, HcC, adopta una conformació, anomenada ß-trefoil, que presenta 4 llocs d'unió a carbohidrats, dos d'ells funcionals i dos sense funció aparent. La “butxaca” de reconeixement més conservada d'unió a oligosacàrids juga un paper primordial en la interacció amb receptors superficials que contenen àcid siàlic, com els polisialogangliòsids, i possiblement amb glicoproteïnes neuronals, com així ho demostra un estudi en el qual, a conseqüència de la seva mutació, es perd la interacció amb la membrana neuronal. D'altra banda, aquest domini d'unió de carbohidrats interacciona amb un derivat soluble del gangliòsid GT1b. També s'ha demostrat que per aconseguir una unió altament específica a la membrana neuronal és necessària la presència d'una segona butxaca d'unió a carbohidrats capaç d'ancorar àcid siàlic. De fet, la depleció de part d'aquesta regió provoca la pèrdua d'unió de la TeTx a les motoneurones inhibint-se així el seu transport retrògrad in vivo (Sinha et al., 2000).
Figura 5. Estructura del fragment Hc de la TeTx. Fragment responsable de la unió i internalització de la TeTx a les neurones, que produeix efectes en la senyalització similars als que produeix la TeTx sencera però sense la activitat catalítica causant de la malaltia del tètanus. Aquest, està present en la cadena lleugera de la TeTx. Imatge extreta del portal d’informació d’estructures biològiques macromoleculars PDB http://www.pdb.org/pdb/explore/explore.do
?structureId=1DLL
32
A part de produir la malaltia del tètanus i del seu possible ús com a molècula transportadora a sistema nerviós, tant el Fragment Hc de la toxina tetànica com la toxina sencera, en el procés d’unió, internalització i transport retroaxonal també generen una sèrie de canvis en la senyalització de la neurona que no tenen a veure, al menys directament, amb el procés patològic.
Inicialment es va veure que la toxina tetànica incrementa els nivells de serotonina en regions del SNC riques en terminals serotonèrgics (Aguilera et al., 1987; 1991), a l’hora que produïa una translocació de PKC, de la forma inactiva present al citoplasma a la forma activa en membrana (Aguilera et al., 1990). Aquesta translocació estava relacionada temporalment amb els increments de serotonina (Aguilera et al., 1990). Finalment es va descriure que la TeTx i el fragment Hc de la TeTx inhibien l’alliberament i la recaptació de serotonina (Inserte et al., 1999; Najib et al., 1999), concretament per la fosforilació a través de PKC del transportador de serotonina (Najib et al., 2000; Pelliccioni et al., 2001) (figura 6).
Alhora que es caracteritzaven els efectes de la TeTx i de l’Hc sobre el transportador de serotonina també es van caracteritzar els efectes dels gangliòsids sobre l’activitat PKC (Aguilera et al., 1993) així com els efectes de la TeTx sobre les diferents isoformes de PKC, observant activació en les isoformes i , lleugers canvis en les isoformes i , mentre que no es va observar cap canvi en la forma atípica (Gil et al., 2000).
Els efectes que causava sobre les diferents isoformes clàssiques i noves de la PKC, van ser explicats al demostrar-se que la TeTx i el Hc indueixen la fosforilació de la PLC amb la conseqüent hidròlisi de fosfoinositols, ja que la producció de DAG i l’alliberació de Ca2+ a través del receptor de IP3 acaben provocant l’activació de les PKC (Gil et al., 1998; Gil et al., 2000).
Així, també l’activació de la PLC es va veure que es devia a l’activació dels receptors Trk, ja que al tractar amb la TeTx o amb el fragment Hc es produïa la fosforilació d’aquest. Aquesta fosforilació dels receptors Trk també es va veure que activava les vies de senyalització de les p21ras/MAPK i de la PI3K/AKT associades amb la supervivència cel·lular (Gil et al., 2000; Gil et al., 2003; Chaib-Oukadour et al., 2004) (figura 6).
33
Finalment, s’ha vist que el fragment Hc protegeix el sistema dopaminèrgic, millorant la resposta motora en rates amb lesió en el estriat per MPP+, model animal ampliament emprat que emula els efectes de la malaltia del Parkinson. (Mendieta et al., 2009).
En resultats no publicats del nostre grup s’ha vist, mitjançant assaigs de cross-linking, la unió del fragment Hc de la toxina tetànica al receptor de neurotrofines de baixa afinitat p75NTR. Aquest ha estat el punt de partida d’aquest treball.
4.4 La membrana cel·lular
4.4.1 Els lípids de les membranes cel·lulars
La majoria de les propietats dels essers vius (moviment, reproducció, metabolisme, comunicació, etc) depenen directa o indirectament de les propietats de les membranes. Les
p p p p
p
Shc
GRB SOS Ras
Via de les MAPK
Creixement PLC
PKC PI3K
AKT
Supervivència
Y490
Y674/675
Y785 Y751
Trk
5-HT
SERT
p
GT1b
Hc-TeTx
Figura 6. Vies de senyalització activades per el fragment Hc de la toxina tetànica. Esquema basat en els resultats publicats per el grup. A l’apartat de discussió presentarem un nou esquema on resaltarem el paper de p75 en la senyalització i neuroprotecció.
34
tipus de lípids que formen l’estructura central de la bicapa. Les principals classes de lípids que conformen la bicapa lipídica són (figura 7): Els fosfolípids (fosfoglicèrids i esfingomielines), que representen la família més gran de lípids de membrana, en els quals les regions hidrofòbiques estan formades per dos cadenes d’àcids grassos unides covalentment al glicerol; els glicolípids (esfingolípids i glicerofosfolipids), essent els més representatius els esfingolípids, els quals com els glicerofosfolípids, tenen un cap polar i dues cadenes apolars però difereixen en que aquests no contenen glicerol, sinó esfingosina. Finalment els esterols, que es caracteritzen per presentar un sistema rígid de quatre anells el principal representant dels quals és el colesterol.
Figura 7. Classificació estructural dels lípids de membrana: Classificació dels lípids de membrana segons la seva estructura. (Esquema extret de: Structure-based classification of membrane lipids. Expert Reviews in Molecular Medicine. Cambridge University Press 2002).
35
Les propietats físiques de les membranes estan determinades en part pel grau d’insaturació i la longitud de les cadenes hidrocarbonades dels lípids que les conformen.
D’aquesta manera, una membrana amb lípids amb cadenes hidrocarbonades llargues sense presencia de dobles enllaços, tindrà més rigidesa que si les cadenes fossin més curtes o presentessin un o més dobles enllaços, ja que en les cadenes llargues saturades es produiran interaccions de Van der Waals, obtenint així un empaquetament més gran; en canvi, la presència de dobles enllaços, provoca colzes en les cadenes hidrocarbonades disminuint molt la possibilitat de formar interaccions dèbils amb altres cues, obtenint un empaquetament més fluid (figura 8).
Segons les classes de lípids, i segons els àcids grassos que els esterifiquen, en una membrana es poden trobar diferents estats a temperatures fisiològiques (36oC). Lípids amb cadenes d’àcid gras llargues i saturades estaran presents en la membrana en fase gel (Lβ) mentre que lípids amb presència de dobles enllaços (en els àcids grassos insaturats) estaran en fase cristall-líquid (Lc) (London, 2005b). D’aquesta manera, a temperatura fisiològica els microdominis de membrana rics en esfingolípids (que amb freqüència estan esterificats per àcids grassos saturats) estaran en fase Lβ i els formats per glicerofosfolípids (que amb freqüència estan esterificats en el carboni-2 del glicerol per àcids grassos insaturats) estaran en fase Lc. Aquestes característiques físiques dels lípids són el que els permet la ordenació en diferents dominis generant regions de membrana amb diferent grau de fluïdesa, d’aquesta manera poden existir els lipid rafts.
B)
Figura 8. L’empaquetament dels àcids grassos. A) El grau d’empaquetament depèn de l’estat de saturació.
Els àcids grassos saturats formen empaquetaments més rígids gràcies a l’estabilització per interaccions hidrofòbiques. Els àcids grassos insaturats impossibiliten empaquetaments rígids, ja que un o més enllaços dobles en posició cis interfereixen en l’empaquetament i formen agregats menys estables o més fluids.
Esquema modificat del llibre de bioquímica Lehninger 4ª ed. 2005. B) Existeixen tres tipus de fases principals en que es poden trobar les membranes biològiques: Liquid desordenat (Ld), Gel sòlid (So) i Liquid ordenat (Lo), cadascuna amb parametres d’ordre dels grups acil (S) i coeficients de difusió (DT) diferents. Extret de (van Meer et al., 2008).
A)
36
L’any 1972 Singer i Nicolson van proposar el model de membrana del mosaic fluid, que ha proporcionat les bases fonamentals per a l’enteniment de l’estructura i organització de les membranes biològiques. El model proposa que la membrana es una capa lipídica molecular (la bicapa lipídica) i funciona, segons aquest model antic, com un solvent neutre bidimensional que té poca influència en les funcions de les membranes i on els lípids i les proteïnes tenen lliure mobilitat i autonomia en les dos dimensions de la membrana (Singer and Nicolson, 1972). Aquest model va ser molt útil per explicar l’estructura de la membrana, però avui en dia es coneix que la llibertat de moviment de les proteïnes i els lípids està lluny de ser aleatòria i sense restriccions. No ens sorprèn ara saber que la composició i la proporció de lípids i de proteïnes varien considerablement entre els tipus cel·lulars, entre els diferents orgànuls de la cèl·lula, i fins i tot, en diferents regions de la mateixa membrana. Una de les evidències de la distribució no aleatòria de les proteïnes va ser el descobriment de l’existència de grups complexos de proteïnes i de diferents tipus de dominis de membrana (Vereb et al., 2004).
També ho va ser la demostració del potencial dels glicoesfingolípids per a formar dominis (Dietrich et al., 2001; Holthuis et al., 2001; Wiśniewska et al., 2003), fets que modifiquen el model inicial proposat per Singer i Nicolson. D’aquesta manera, des que es va postular l’existència de microdominis de similar composició lipídica, es va anar perfilant una altra hipòtesi per tal d’explicar l’organització de la membrana (Meer and Simons, 1988). A partir d’aquí es va començar a parlar de la hipòtesi dels Lipid rafts, també anomenats Membrane rafts o simplement Rafts, com a microdominis de membrana rics en esfingolípids i colesterol (figura 9). Aquesta hipòtesi proposa que certs lípids s’agreguen naturalment en el pla de la membrana per diferents interaccions intermoleculars, incloent-hi múltiples enllaços de Van der Waals entre les llargues i saturades cadenes de esfingomielines i glicoesfingolípids, així com ponts d’hidrogen entre els residus glicosil dels glicoesfingolípids veïns (Dietrich et al., 2001). Més recentment s’han descrit també la existència de rafts rics en ceramida (Megha and London, 2004). Aquests microdominis estarien involucrats en funcions cel·lulars molt diferents com la transducció de senyals, el transport de membrana, l’ordenament de proteïnes, així com a lloc d’interacció de toxines bacterianes i de virus entre moltes altres funcions vitals per la cèl·lula (Brown and London, 1998a; Herreros et al., 2001; van der Goot and Harder, 2001;
Simons and Ehehalt, 2002; Chini and Parenti, 2004; Shingo et al., 2004; Pike, 2005; Urano et al., 2005; Marquez et al., 2006).
37 4.4.3 Els esfingolípids
Els esfingolípids són lípids que es troben de forma ubiqua en les membranes dels organismes eucariotes. Van ser descoberts l’any 1876 per J. L. W. Thudichum, i durant molt de temps es va considerar que la seva funció era bàsicament estructural en la formació de membranes. Diferents estudis sobre el metabolisme i la seva funció, varen permetre descobrir
A)
B)
Figura 9. Estructura dels membrane rafts. A) Esquema representatiu dels rafts, on es mostren els rafts com a regions riques en esfingolípids, colesterol i proteïnes involucrades en la transducció de senyals (esquema adaptat de (Jacobson and Dietrich, 1999). B) Visualització de rafts en cèl·lules vives mitjançant microscòpia de doble fotó i marcatge amb laurdan. El compost laurdan es distribueix de manera uniforme per la membrana plasmàtica sense associar-se amb cap àcid gras o cap polar dels fosfolípids.
Aquest compost permet de veure el nivell d’ordenament del lípids en la membrana gràcies a les seves propietats espectroscòpiques. S’obtenen valors de polarització generalitzada (GP) del compost que van de -1 a 1, essent els valors de -1 les membranes més fluides i les de 1 les més condensades. Aquesta tècnica permet la visualització dels rafts en cèl·lules vives i a temps real. En la foto es mostra la reconstrucció en 3D de la distribució de GP d’ un macròfag viu. Imatge extreta de (Gaus et al., 2003)
38
esfingosina-1P (Sph-1P) i la ceramida-1P (Cer-1P), actuaven com a molècules bioactives amb funcions com la regulació de vies de senyalització, l’ordenació de proteïnes d´interacció cèl·lula-cèl·lula i el reconeixement. A més, els esfingolípids s’agrupen juntament amb esterols per a formar microdominis lipídics, que funcionen tant com a centres de regulació de la transducció de senyals com en el reordenament de proteïnes (Simons and Ikonen, 1997).
4.4.4 Metabolisme dels esfingolípids
El metabolisme dels esfingolípids forma una xarxa complexa de reaccions, resultant en la formació de múltiples esfingolípids, amb Cer com a centre de la biosíntesi, catabolisme i com a precursora d’esfingolípids més complexos (figura 10).
La Cer pot ser formada per dues possibles vies. Una, és la síntesi de novo i l’altra és a partir de la hidròlisi de lípids complexos, especialment l’esfingomielina (SM) mitjançant l’acció de les esfingomielinases (SMases). La via de novo comença amb la condensació d’una serina i d’un palmitoil-CoA, catalitzat per l’enzim serina palmitoil transferasa generant 3-Ceto- dihidroesfingosina. 3-Ceto-dihidroesfingosina és seguidament reduïda per formar dihidroesfingosina (esfinganina), la qual és N-acilada per la ceramida sintasa per produir dhCeramida o Cer (Pewzner-Jung et al., 2006). En mamífers hi ha 6 gens que codifiquen per a la Ceramida sintasa, cada una de les isoformes presenta una preferència al substrat especifica segons la llargada del àcid gras CoA (Michel and van Echten-Deckert, 1997). La dhCer és llavors desaturada per la dhCer desaturasa, generant un doble enllaç en la posició trans 4,5 per formar ceramida (Tafesse et al., 2006).
En les següents reaccions de biosíntesi dels esfingolípids, la Cer és utilitzada preferentment per a la síntesi de SM transferint un grup fosfocolina de la fosfatidilcolina a través de l’acció de la SM sintasa, i generant diacilglicerol (Shinghal et al., 1993). La Cer també pot ser fosforilada per la ceramida cinasa (CerK), alhora que de nou pot passar a Cer per l’acció de la ceramida 1 fosfat fosfatasa (Cer1PP) (Mandon et al., 1992). Aixi mateix, la Cer també pot ser glicosilada per una glucosil o galactosil Cer sintasa (Ichikawa and Hirabayashi, 1998).
Pel que respecta a la via de hidròlisi, la SM pot ser tallada per les diferents SMases, alliberant fosfocolina i Cer. Les SMases es distingeixen pel seu rang òptim de pH, així com per la diferent localització subcel·lular. Més endavant es parlarà d´elles amb més profunditat.
39
Una altra font important de formació de Cer és deguda al trencament de glicoesfingolípids, a través de l’eliminació seqüencial de les regions hidrofíliques terminals, procés catalitzat per una sèrie de hidrolases especifiques (Tettamanti, 2003).
La Cer, és metabolitzada per les ceramidases (CDases), eliminant la amida lligada a l’àcid gras per formar esfingosina (Sph). Tres tipus de CDases han estat classificades segons el seu pH òptim i la localització subcel·lular: CDasa àcida, CDasa neutra/alcalina, i la CDasa alcalina (Mao and Obeid, 2008). L´esfingosina pot ser reciclada o pot ser fosforilada per una de les dues esfingosina cinases (SK), SK1 i SK2, per formar esfingosina-1-fosfat (S1P) (Hait et al., 2006). Així, la S1P alhora també pot ser defosforilada per l’acció de la S1P fosfatasa generant de nou Sph (Johnson, 2003). Finalment, la S1P liasa pot metabolitzar la S1P alliberant etanolamina fosfat i hexadecenal.
Figura 10. Metabolisme dels esfingolípids. Esquema representatiu del metabolisme dels esfingolípids on en vermell están marcats els esfingolípids bioactius. SPT, serine palmitoyl transferase; KDS, 3-keto- dihydrosphingosine reductase; DES, dihydroceramide desaturase; SPPase, Sph phosphate phosphatase;
CK, Cer kinase; C1PP, C1P phosphatase; SMS, SM synthase; PC, phosphatidylcholine; DAG, diacylglycerol;
GCS, glucosylceramide synthase; GCase, glucosyl CDase. Extret de (Bartke and Hannun, 2009).
40
Les esfingomielinases són enzims que catalitzen la hidròlisi de la esfingomielina en ceramida i fosfocolina. Samet i Barenholz varen proposar una útil classificació de les SMases segons la seva dependència a cations i el seu pH òptim d’acció (Samet and Barenholz, 1999):
La esfingomielinasa àcida (aSMasa)
La esfingomielinasa secretora depenent de Zn2+ (sSMasa)
La esfingomielinasa neutra depenent o no de Mg2+ (nSMasa)
La esfingomielinasa alcalina (bSMasa)
No obstant, s’ha proposat una altra categoria que no és present en la classificació de Samet i Barenholz, anomenada esfingomielinasa-phospholipasa C bacteriana. Dos representants d’aquesta categoria serien la -toxina de Clostridium perfringens i el producte del gen plcB de Listeria monocytogenes (Goni and Alonso, 2002).
aSMasa. És una glicoproteïna soluble amb un pH òptim de 5. L’absència d’aquest enzim és la responsable de la malaltia de Niemann Pick (Otterbach and Stoffel, 1995). L’activitat de la aSMasa, s´ha relacionat amb l´agrupament del receptor de Fas (CD95) en els microdominis rics en esfingolípids, i amb l’apoptosi. L’agrupament de CD95 és, probablement, el resultat de la segregació de la ceramida en microdominis (Grassmé et al., 2001).
sSMasa. Tant la aSMasa com la sSMasa són producte del mateix gen, però a diferència de la aSMasa, que és direccionada cap als lisosomes, la sSMasa és dirigida cap a les vies secretores del Golgi (Schissel et al., 1998a; Schissel et al., 1998b). La sSMasa és activada per concentracions fisiològiques de Zn2+, no obstant això, existeixen formes independents de Zn2+
(Schissel et al., 1998b). S’ha proposat que l´esfingomielinasa secretora participi en la
“atherogenesis” (Schissel et al., 1998a).
nSMasa depenent de Mg2+. L’activitat de l’enzim nSMasa va ser descrita per primer cop l’any 1967 per Scheider i kennedy, que varen trobar que la melsa de pacients amb la malaltia de Niemann-Pick (amb deficiencia de la aSMasa) contenia un enzim depenent de Mg2+ capaç de realizar la mateixa reacció que la aSMasa, però en un pH òptim de 7,4 (Schneider and Kennedy, 1967). Les diferents característiques de la aSMasa i la nSMasa posen de manifest que
41
els enzims són producte de diferents gens (Levade et al., 1991). Treballs amb cervell boví vàren demostrar múltiples isoformes de la nSMasa amb diferents propietats bioquímiques i cromatogràfiques (Jung et al., 2000). S’han clonat 3 tipus diferents de nSMasa, producte de 3 gens diferents:
La nSMasa1, va ser la primera en ser clonada l’any 1998, a partir de mostres humanes i murines, mitjançant homologia amb la nSMasa de bacteris (Tomiuk et al., 1998). No obstant, tot i que poseeix activitat nSMasa depenent de Mg in vitro, s’ha vist que la seva sobreexpressió no té cap efecte sobre el metabolisme de l´esfingomielina, suggerint que aquesta funciona com una Lyso-PAF fosfolipasa C (Sawai et al., 1999; Mizutani et al., 2000).
La nSMasa2 va ser clonada dos anys després de la nSMasa1, i a diferència d’aquesta, la nSMasa2 funciona tant in vitro com in vivo com a nSMasa (Marchesini et al., 2003).
La nSMasa 3 va ser clonada per Kronke i colaboradors (Krut et al., 2006). Aquest enzim té unes característiques molt similars a la nSMasa2 i el seu mRNA s’expressa de forma predominant en
cor i músculs esquelètics.
L’activitat nSMasa pot ser induïda per diferents estímuls com ara citoquines, estressos cel·lulars (com ara llum ultra violeta i fàrmacs quimioterapeutics) i estímuls patològics (com ara el pèptid -amiloide i lipopolisacàrids) (Levade et al., 2002; Marchesini and Hannun, 2004) (figura 11). El mecanisme de regulació de les nSMases es coneix de forma parcial, no obstant s’han identificat bastants activadors i reguladors de la seva activitat. Receptors de citoquines (com per exemple: el receptor TNF, el receptor IL-1 i Fas), proteïnes associades (com ara: FAN, RACK-1 i caveolina-1) s’ha vist que disparen l’activitat nSMasa (Augé et al., 2000; Clarke and Hannun, 2006). Les espècies reactives d’oxigen i de nitrogen, la depleció de GSH, el peròxid d’hidrògen i l’estrés oxidatiu activen la nSMasa, mentre que antioxidants com ara el glutatió reduït (GSH) i el coenzim Q són inhibidors (Clarke and Hannun, 2006). Diferents mediadors cel·lulars regulen l’activitat nSMasa, com ara fosfolípids aniònics, la proteïna cinasa fosfolipasa A2, la caveolina, Bcl-2, Bcl-xL i proteases (Clarke and Hannun, 2006; Coatrieux et al., 2007;
Tellier et al., 2007). S’han associat bastantes respostes biològiques a l’activitat de la nSMasa, entre elles inflamació, proliferació, diferenciació, aturada del creixement cel·lular i apoptosi (Kolesnick and Hannun, 1999; Augé et al., 2000; Marchesini, 2004; Clarke and Hannun, 2006).
42
ser actiu i no depén de Mg2+ . A més, la seva activitat no es induïble per glutatió. La manca d’aquest enzim s’ha relacionat amb el càncer de colon. Per a una revisió més complerta es pot consultar l’article de (Nilsson and Duan, 1999).
Figura 11. Esquema de les molècules reguladores i activadores de l’enzim nSMasa amb les possibles funcions biològiques que pot desencadenar. Adaptat de (Clarke and Hannun, 2006).
43
Taula 1. Classificació de les esfingomielinases àcides i neutres, on s’intenta agrupar el que es coneix de cada una d’elles. Adaptat de (Pavoine and Pecker, 2009)
44
Les reaccions enzimàtiques que tenen lloc en el metabolisme dels esfingolípids estan distribuïdes en diferents compartiments cel·lulars (figura 12).
Els primers passos de la via de novo en la formació de ceramida tenen lloc en la superfície citosòlica del reticle endoplasmàtic (RE) i, potencialment, en membranes associades al RE, com ara les membranes perinuclears o les membranes associades a la mitocòndria (Michel and van Echten-Deckert, 1997). La síntesi d’esfingolípids més complexos, com per exemple la SM o la glucosilceramida (GluCer), té lloc a l’aparell de Golgi. Existeixen dues vies conegudes de transport del RE cap al Golgi. En la primera, la SM és formada a través de ceramida transferida per la proteïna transportadora de ceramida (CERT), mentre que en la segona, la síntesi de GluCer es basa en la ceramida que prové del transport vesicular, i on a continuació la proteïna transportadora FAPP2 transporta la GluCer com a precursor per a la síntesi dels glicoesfingolípids (GSL) (Yamaji et al., 2008). Per altra banda, la síntesi dels GLS més complexos com ara els gangliòsids té lloc a la cara interna del Golgi. Per això la GluCer necessita translocar de la cara citosòlica cap a l’interior del Golgi. Aquest mecanisme el du a terme la proteïna transportadora P-glicoproteïna, també coneguda com MDR1 (Lannert et al., 1998).
Seguidament, la SM i els GSL complexos són transportats cap a la membrana plasmàtica mitjançant el transport vesicular. Aquí la SM pot ser metabolitzada a Cer per la esfingomielinasa àcida (aSMasa) en la membrana exterior o per la esfingomielinasa neutra (nSMasa) que resideix en la membrana interior de la bicapa lipídica.
De la membrana plasmàtica, els esfingolípids poden recircular per la via endosomal.
Així en el compartiment endosomal , la SM i la GluCer són metabolitzats a Cer per les SMases i les glucosidases, i la Cer llavors pot ser degradada per la ceramidasa àcida (aCDasa) formant Sph. Degut a la seva càrrega positiva, la Sph generada pot sortir del lisosoma, ja que presenta una solubilitat adequada per moure’s entre membranes, incloent-hi el RE, on pot ser reciclada (Riboni et al., 1998).
45 4.4.7 Senyalització dels esfingolípids bioactius
En el últims anys, han aparegut diverses evidències de que els esfingolípids funcionen com a components clau en la modulació de la resposta cel·lular i com a molècules de regulació i senyalització. Tot i això, per a comprendre i integrar el funcionament i la regulació dels esfingolípids, no es pot mirar una via de senyalització de forma individual, sinó que s’ha de mirar més enllà, en el complex metabolisme dels esfingolípids, ja que un esfingolípid bioactiu pot ser metabolitzat en un altre, i que sovint presenten funcions oposades. També és important tenir en compte el lloc d’acció dels esfingolípids bioactius, segons la compartimentalització dels enzims involucrats en la reacció, així com del substrat i del producte.
Figura 12. Compartimentació i regulació dels metabolits i els enzims en la via dels esfingolípids.
3KdhSph, 3-Cetodihidroesfingosina; dhSph, dihidroesfingosina; CERT, proteina de transferència de Cer; MAMs, membranes associades a mitocondria extret de (Bartke and Hannun, 2009).
46
La ceramida és un segon missatger essencial en els estímuls d’estrès, per això ha estat associat a l’apoptosi (Ruvolo, 2003), tot i que també ha estat descrita la seva participació en la supervivència cel·lular (Sharma and Shi, 1999; Plummer et al., 2005) (figura 13).
S’ha vist que la ceramida produïda per la SMasa àcida (aSMasa) en els endosomes àcids activa a la catepsina D, unint-se a la forma pre-procatepsina D i produint una proteòlisi autocatalítica, obtenint així les isoformes enzimaticament actives de 48/32 KDa que indueixen l’apoptosi (Heinrich et al., 1999). La ceramida també pot interaccionar directament amb la fosfolipasa A2 citoplasmàtica (cPLA2) a través del domini CaLB actuant com a mecanisme d’anclatge a la membrana i facilitant l’acció de la cPLA2 (Huwiler et al., 2000).
La proteïna cinasa supressora de ras (KSR) també és activada per ceramida.
Concentracions nanomolars de ceramida estimulen l’autofosforilació de KSR produint la transactivació de Raf-1 i la fosforilació de ERK 1/2 (Zhang et al., 1997). KSR activa a Raf-1 actuant com a proteïna adaptadora i incrementant l’activitat de Raf-1 de forma independent a l’activitat cinasa (Michaud et al., 1997). L’activació de Raf1/ERK estaria relacionada amb proliferació, no obstant, en presència de BAD, membre de la família de proteïnes de Bcl2.
L’activació de Raf-1 mitjançant KSR i ceramida promou l’apoptosi (Basu et al., 1998).
La ceramida uneix i regula de forma especifica l’activitat cinasa de la proteïna cinasa C zeta (PKC ) de forma bifàsica: Concentracions baixes de ceramida produeixen un augment en la autofosforilació de PKC mentre que a concentracions més grans, disminueix la fosforilació a nivells basals, podent causar també la insensibilitat de la PKC per als seus activadors (Müller et al., 1995). L’activació de la PKC està relacionada amb l’activació de la via de JNK (Bourbon et al., 2000), i amb la translocació al nucli del factor de transcripció NF-B, a través de la fosforilació de la subunitat reguladora IkB (Lozano et al., 1994). També s’ha vist que la PKC interacciona amb AKT/PKB actuant com un regulador negatiu (Doornbos et al., 1999).
L’apoptosi induïda per ceramida sovint involucra la via de SAPK/JNK. La PKC activada per ceramida participa en la formació del complex de senyalització de SAPK (Bourbon et al., 2000). La ceramida és un activador de Rac-1, una proteïna G soluble, que portarà a la fosforilació de JNK (Brenner et al., 1997), alhora la ceramida estimula l’activitat cinasa de TAK1 que també porta a la fosforilació de JNK (Shirakabe et al., 1997). Tal i com s’ha observat amb la ceramida, la conseqüència de la senyalització per JNK és depenent del tipus cel·lular i del
47
context, essent el creixement, la diferenciació o l’apoptosi possibles resultats de l’activació de JNK (Basu and Kolesnick, 1998). Així, JNK pot hiperfosforilar a Bcl2 inactivant la funció antiapoptotica d’aquest (Maundrell et al., 1997). També és el responsable de fosforilar el domini d’activació de diferents factors de transcripció com ATF2, ELK1 i c-jun incrementant la transcripció dels gens diana i de NFAT4, en el que la fosforilació per JNK en disminueix la transcripció (Jarvis et al., 1996; Basu and Kolesnick, 1998). La ceramida, a través de una SAPK desconeguda, pot també fosforilar a RAX, el qual fosforila PKR, que finalment acaba fosforilant a eIF2 en la serina 51, bloquejant així la traducció proteica (Ruvolo et al., 2001).
Una de les característiques de la ceramida és la seva capacitat d’activar fosfatases, havent-se demostrat la unió directa de la ceramida a la proteïna I2PP2A (inhibitor 2 of protein phosphatase 2A), regulant així l’activitat i la senyalització de la proteïna PP2A (Protein phosphatase 2A) (Mukhopadhyay et al., 2009). La proteïna PP2A està relacionada amb la defosforilació de diverses proteïnes com ara c-Myc (Mukhopadhyay et al., 2009), AKT (Salinas et al., 2000; Schubert et al., 2000), PKC (Lee et al., 1996, 2000), BAD (Chiang et al., 2001) i BCL2 (Ruvolo, 1999; Ruvolo et al., 2002). Totes aquestes defosforilacions estan enfocades a l’apoptosi.
Una altra fosfatasa que s’ha vist activada per la ceramida és la PP1, i a diferència de la PP2A, l’activació mediada per la ceramida potencia la supervivència cel·lular davant d’estímuls apoptòtics (Plummer et al., 2005), no obstant, hi ha indicis que marquen també la participació en l’apoptosi (Pettus et al., 2002).
Recentment s’ha vist que la ceramida produeix la sobreregulació del gen supressor de tumors anomenat Thioredoxin-interacting protein (Txnip), el qual produeix una activació de ASK1, que alhora activa les cascades de estrés reticular, i fosforila a p38 i a JNK, essent totes les senyals enfocades a l’apoptosi (Chen et al., 2008).
48 Altres derivats bioactius de la ceramida
Un dels possibles metabòlits de la ceramida, és l´esfingosina, la qual bàsicament està implicada en vies de senyalització apoptòtica. Aquesta, al ser fosforilada passa a S1P, que sembla ser una molècula promotora de tumors involucrada en proliferació, creixement cel·lular, supervivència, migració cel·lular, inflamació, angiogènesi i resistència a la mort apoptòtica (Bartke and Hannun, 2009). Finalment, la Cer pot ser fosforilada per la CERK generant Cer1P, la qual ha estat sempre relacionada amb la supervivència cel·lular (Gomez- Muñoz et al., 2005).
Catepsina D Ceramida
cPLA2
KSR
Ras GTP
Raf1
MEK1
ERK1 Bad
Tak1 PKC Rac1
JNK IKB
AKT
NF-kB
SAPK
RAX
PKR
EIF2 Apoptosi
Apoptosi Creixement Diferenciació
Bloqueig de la traducció de proteïnes
TXIP
Estrés reticular
PP1 PP2A
DAT
AA LPC
Supervivència Processos
inflamatoris
Figura 13. Esquema de les vies de senyalització que poden ser activades per la ceramida
49
4.5 Les neurotrofines
Les neurotrofines constitueixen una família de neuropèptids essencials per al desenvolupament del sistema nerviós dels vertebrats. La primera neurotrofina que es va descobrir va ser el NGF, (Nerve Growth Factor) (Levi-Montalcini, 1966), la qual es va pensar que seria l’únic factor tròfic. Posteriorment, es va descobrir que només unes quantes neurones del SNC i dels ganglis nodosos responien al NGF. Això va portar a l’aïllament d’altres factors, tal com el BDNF, (Brain-derived neurotrophic factor) (Hofer and Barde, 1988), la Neurotrofina-3 (NT-3) i les Neurotrofines 4/5 (NT-4/5) (Hohn et al., 1990; Berkemeier et al., 1991).
La teoria neurotròfica postula que la supervivència de les neurones depèn de que tinguin accessibilitat a les neurotrofines, que són alliberades de forma limitant per cèl·lules veïnes o per la mateixa neurona diana. D’aquesta manera les neurones que no aconsegueixen suficients factors de creixement moren per un sofisticat mecanisme de mort programada (apoptosi). Durant el desenvolupament embrionari, les neurones en excés que no aconsegueixen prou estímuls neurotròfics van morint per un procés de mort programada o mort apoptòtica (Schweigreiter, 2006). D’aquesta manera, la teoria neurotròfica ha estat la base per a acceptar la mort cel·lular com a un procés fisiològic en el desenvolupament neuronal.
4.5.1 Estructura de les neurotrofines
Les neurotrofines són sintetitzades inicialment com a pre-pro-proteïnes. Després del tall hidrolític del pèptid senyal en el reticle endoplasmàtic s´obté la forma ja activa de pro- neurotrofina. La pro-neurotrofina pateix una segona hidròlisi per donar la forma madura o bé és transportada a la membrana plasmàtica, on serà alliberada en forma de pro-neurotrofina.
En el medi extracel·lular, la pro-forma podrà ser processada depenent de l’accessibilitat a determinades proteases, específicament a metal·loproteases de la membrana, com la plasmina, que s’ha vist que és la responsable del tall hidrolític en el medi extracel·lular (Petti et al., 2004). La furina, i en menor mesura altres pro-convertases específiques, són les responsables del processament intracel·lular (Bresnahan et al., 1990) (figura 14).
50
Figura 14. Estructura de les neurotrofines. La família de les neurotrofines en mamífers la conformen 4 proteïnes, el NGF, el BDNF, la NT3 i la NT4 també coneguda per NT4/5. A) La regió biològicament activa del C-terminal és un 50% idèntica en les 4 neurotrofines (de clor blanc), amb regions idèntiques que inclouen els patrons característics de 6 residus de cisteïna que formen 3 ponts disulfur entre les cisteïnes que estan conservats. La regió aminoterminal de les proteïnes és funcional en la biosíntesi de les proteïnes i inclou un pèptid senyal (en gris fort) que sembla tenir un paper important en el plegament de la proteïna. La forma madura de les neurotrofines es produeix per un tall proteolític de la pro-seqüència en una regió rica en lisines (K) i arginines (R). B) En la seva forma madura les neurotrofines formen homodímers amb el plegament característic en fulles amb llaços que sobresurten. Els residus bàsics estan marcats en gris clar, mentre que els àcids ho estan el gris fort. Aquest patró de càrregues positives i negatives és característic per a cada neurotrofina i determina la interacció amb el receptor transmembrana específic.
