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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA SECCIÓN DE POSTGRADO E INVESTIGACIÓN
" La contracción isométrica aumenta la actividad de la sintasa de óxido nítrico endotelial de forma dependiente del complejo Ca2+/calmodulina en la aorta de rata.”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN FARMACOLOGÏA PRESENTA:
José Edmundo Ochoa Terrones
México, D.F., enero del 2008
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ESTA TESIS FUE REALIZADA EN EL LABORATORIO MULTIDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN DE LA SECCIÓN DE POSGRADO DE LA ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA DEL INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL, BAJO LA DIRECCION DEL DR. ENRIQUE F. CASTILLO HENKEL Y LA DRA. RUTH MERY LÓPEZ MAYORGA.
Agradecimientos
Gracias a mi Dios, cuyo nombre es Jehová, por permitirme vivir, ser y hacer.
Gracias a la novia de mi juventud que tal como un faro me ha guiado en las tormentas y como un cimiento me ha apoyado para seguir.
Gracias a mis padres por aún estar conmigo.
Gracias a mis hijos por aceptar llevar el orgullo familiar una generación más.
Gracias a mi Institución por conducirme en la superación personal y permitir que con honor lleve el escudo politécnico en donde me encuentre.
Gracias a mis tutores, que más bién siendo grandes amigos, me han compartido su saber y habilidades, dándome el honor de ser uno más de su equipo, para poder ser más, porque estamos juntos.
Gracias a aquellos, que participaron, con una firma, un documento, un consejo, una corrección, o tan solo una sonrisa de ánimo; pues contribuyeron a allanarme el difícil camino de la superación personal.
Gracias, siete veces, gracias.
Indice: Página 6
Glosario 8
Resumen. 10
Abstract. 11
1.0. Introducción. 12
1.1. Hipertensión Arterial Sistémica 12
1.2 Epidemiología de la hipertensión 12
1.3 Fisiopatogenia de la hipertensión 14
1.4. EL endotelio 18
1.5 Las sintasas del óxido nítrico 21
1.6 El óxido nítrico 24
1.7 Reacciones moleculares del óxido nitrico 25
1.7.1 Reacción del óxido nítrico con algunas especies radicales 26
1.7.2 Efectos indirectos del óxido nítrico 27
1.8 Relajación del músculo liso por el óxido nítrico 28
1.8.1 Regulación del calcio intracelular por el óxido nítrico 29
1.8.2 Regulación de la sensibilidad al calcio 31
1.8.3 Regulación de los filamentos delgados 33
1.9 El óxido nítrico como agente que moviliza calcio 34
1.10 El óxido nítrico en el tejido vascular 36
1.11 El óxido nítrico en la disfunción endotelial 39
1.12 Relevancia de la L- Arginina 40
2.0. Justificación. 44
3.0 Hipótesis 46
4.0. Objetivos. 46
5.0 Material y Métodos 47
6.0. Protocolos experimentales. 49
6.1 Curvas acumulativas concentración respuesta para el L-NAME y el ODQ bajo condiciones de tono pasivo 49
6.2 Curvas acumulativas concentración respuesta para el L-NAME y el ODQ bajo condiciones de tono activo 49
7.0 Análisis de datos . 50
8.0. Drogas. 50
9.0. Resultados. 51
9.1. El efecto del L-NAME y ODQ en anillos aorticos no contraidos 51
9.2. Contracciones provocadas por el L-NAME y ODQ en tejidos aórticos a diferentes niveles de pre contracción 55
9.3 Los efectos del Calmidazolio en los incrementos edel tono contráctil producidos por el L-NAME 65
10.0. Discusión. 68
11.0 Conclusiones. 71
12.0. Referencias. 72
Glosario:
Ach Acetil colina
AMPc Adenosín monofosfato cíclico Ang ll Angiotensina ll
AR-α1 Receptores adrenérgicos α 1 ATP Adenosín trifosfato
CaM Calmodulina BDK Bradicinina BH4 Tetrahidrobiopterina CMZ Calmidazolio DAG Diacilglicerol
DSM Dimetil sulfoxido
ESM Error estandar de la media ET Endotelina FAD Flavin adenosín dinucléotido FEN Fenilefrina FMN Flavín mononucléotido
GMPc Guanosín monofosfato cíclico
GTP Guanosín trifosfato
HAS Hipertensión arterial sistémica IL Interleucina IP3 Inosositol 1,4, 5-trifosfato
L-NA Métil éster de la NG-nitro-L-arginina
D-NAME Métil éster de la NG-nitro-D-arginina L-NMMA NG-monometil-L-arginina (L-NMMA) LDL Lipo-proteínas de baja densidad MBS Subunidad que enlaza miosina MLCK Cinasa de las cadenas ligeras de miosina MCP-1 Promotor de colonias de monocitos-1 MLV Músculo liso vascular
NADPH Nicotín adenín dinucléotido reducido NOS Sintasa del óxido nítrico
NOSi Sintasa inducible del ON NOSe Sintasa endotelial del ON NOSn Sintasa neuronal del ON
ODQ 1H-[1,2,4]oxadiazolo-[4,3]-alquinoxalina-1-one ON Oxido nítrico
PAI-1 Inhibidor del activador del plasminóeno-1
PGI2 Prostaciclina
PKA Proteína cinasa A PKC Proteína cinasa C PKG Proteína cinasa G
ROS Especies reactivas de oxígeno
SNC Sistema nervioso central
SNS Sistema nervioso simpático
STOC Corrientes salientes espontáneas transitrias TBX Tromboxano
TNFα Factor de necrosis tumoral alfa
Resumen.
En el presente se examinó la posibilidad de que la contracción isométrica active la sintasa de óxido nítrico endotelial (NOSe) de manera dependiente del complejo calcio/calmodulina (Ca2+/CaM), o por medio de una tirosina cinasa independiente de Ca2+. Inicialmente, se obtuvieron respuestas contráctiles estables, escalonadas, a la fenilefrina (precontracciones) en anillos aórticos con y sin endotelio. La administración subsiguiente del inhibidor de la NOS, el éster metilo de la NG nitro-L- arginina (L-NAME), o del inhibidor de la guanilil ciclasa soluble, el 1H-[1,2,4]- oxadiazolo-[4,3]-alquinoxalina-1-one (ODQ), aumentaron las precontracciones en forma dependiente de la concentración de cada uno de los inhibidores. La magnitud de los incrementos en el tono contráctil inducidos por el L-NAME y el ODQ fue dependiente del nivel de precontracción; siendo máximos, cuando las arterias fueron precontraídas con fenilefrina al 67% de su efecto máximo. En arterias no contraídas con endotelio intacto, el L-NAME y el ODQ indujeron pequeños pero significativos aumentos en el tono contráctil, de forma dependiente de la concentración.
Ni el L-NAME ni el ODQ tuvieron efecto en las preparaciones sin endotelio.
También, en los anillos aórticos con endotelio precontraídos con soluciones despolarizantes de K+, el L-NAME indujo contracciones en forma dependiente de la concentración y del nivel de precontracción. El antagonista de la calmodulina, calmidazolio, inhibió de manera no competitiva los efectos del L-NAME sobre el tono de los anillos aórticos con endotelio precontraídos con fenilefrina (sin afectar la precontracción). En conclusión, la contracción isométrica aumenta la actividad de la NOSe mediada por del complejo Ca2+/CaM en la aorta de la rata.
Abstract
In this work, the possibility that isometric contraction activates endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in a Ca2+/calmodulin-dependent manner was examined in rat thoracic aorta. Step-wise stable contractile responses (pre-contractions) to phenylephrine were obtained in endothelium-intact and endothelium-denuded aortic rings. The subsequent addition of the NO synthase inhibitor, NGnitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), or the soluble guanylyl cyclase inhibitor, ODQ, further augmented pre-contractions in a concentration-dependent manner. The amplitude of L-NAME- and ODQ-induced increases in tone were dependent on the level of pre- contraction; the maximal increments for L-NAME and ODQ were observed in arteries pre-contracted with phenylephrine at 67 of its maximal effect. Likewise, in endothelium-intact non-contracted arteries, L-NAME and ODQ induced small but significant increases in tone. Neither L-NAME nor ODQ had any effect in endothelium-denuded preparations. Also, in endothelium-intact aortic rings pre- contracted with depolarizing solutions of K+, L-NAME elicited contractions dependent on pre-contraction level. The calmodulin antagonist, calmidazolium, inhibited in a non-competitive manner the effects of L-NAME on the tone of endothelium-intact phenylephrine-precontracted aortic rings. In conclusion, isometric contraction increases the activity of the eNOS by means of the Ca2+/calmodulin complex in rat aorta.
Introducción.
Hipertensión Arterial Sistémica (HAS.)
En México la hipertensión arterial sistémica es un problema de salud pública. Tiene una prevalencia ascendente y se distribuye ampliamente entre la población (Velásquez, Pastelín, 2002). Se le reconoce como un padecimiento con morbilidad y mortalidad propias y como elemento causal de aterosclerosis. Su efecto nocivo se potencia cuando se asocia con otros factores que incrementan el riesgo global (Rosas, Pastelín, 2005; WHO 2003).
Se identifica una tendencia familiar, cuya expresión clínica está propiciada por algunos factores contribuyentes del estilo de vida. Susceptibles de modificación a través de la educación higiénico-dietética en México apropiada y el pronóstico se puede mejorar con tratamiento farmacológico.
Epidemiología de la hipertensión.
La Encuesta Nacional de Salud (ENSA 2000) (Velásquez, Pastelín, 2002) estimó una prevalencia 30.05%; es decir, que en México existen 15.2 millones de personas entre los 20 y 69 años de edad con hipertensión arterial sistémica. Sin embargo, a partir de los 50 años la prevalencia supera el 50% o, dicho de otra manera, uno de cada dos mexicanos la padece. El incremento en la prevalencia se debe a varios factores: aumento de la población en riesgo, mayor esperanza de vida y asociación
de otros factores de riesgo, como: obesidad, tabaquismo, diabetes y factores genéticos.
Los censos de salud en nuestro país muestran que en los últimos 50 años las principales causas de muerte han sido sustituidas por las enfermedades del corazón.
(Velásquez, Pastelín, 2002). La HAS, al lado de otras enfermedades crónico degenerativas, tienen en común alteraciones en factores humorales y vasculares que en conjunto promueven el desarrollo de la patología cardiovascular, con lo que se ha producido una transición epidemiológica en la cual, la enfermedad cardiovascular se ha convertido en la principal causa de defunción en nuestro país.
La mortalidad nacional por hipertensión arterial sistémica muestra, al igual que en el contexto internacional (WHO 2003), una tendencia ascendente; por ejemplo, en 1980 la tasa de mortalidad fue de 4.8/100,000 habitantes y para el año 2002 de 9.9 /100,000 habitantes, con aumento relativo del 97%.(ENSA 2000) Además, forma parte de las causas multifactoriales de la enfermedad cerebrovascular y la cardiopatía isquémica. Se considera que está involucrada en 42% de las muertes por enfermedad cerebrovascular y en 27% de las debidas a cardiopatía isquémica.
(ENSA 2000) En el año 2002 se registraron 48,573 defunciones por enfermedades del corazón, con una tasa de 47.4 /100,000 habitantes y 26,583 defunciones por enfermedad cerebrovascular con una tasa de 25.9/ 100,000 habitantes. (Velásquez, Pastelín, 2002)
HAS por su frecuencia y gravedad se considera una de las principales entidades asociadas al riesgo de sufrir un evento cardiovascular mayor, incluyendo la muerte.
La HAS forma parte de un síndrome que incluye alteraciones metabólicas (dislipidemias, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y diabetes Miellitus), hiperactividad del tono adrenérgico y en México modificaciones de la reabsorción
renal de sodio. Todo este complejo de alteraciones es conocido como síndrome metabólico. La HAS tiene una etiología multifactorial por lo cual en su desencadenamiento participan factores ambientales como el sedentarismo, el tabaquismo y el consumo de alcohol así como factores genéticos. (Rosas, Pastelín, 2005; WHO 2003).
Fisiopatogenia de la hipertensión.
La fisiopatogenia de la HAS es compleja ya que en ella existe una participación importante de varias moléculas, tejidos y órganos. Entre ellos tenemos al sistema nervioso simpático. (Brook, 2000). Se ha determinado que un incremento en la actividad de este sistema conlleva un aumento en la presión arterial. El sistema nervioso simpático contribuye al inicio y mantenimiento de la HAS por estimulación del corazón, vasculatura periférica y riñones, que se traduce por un aumento del gasto cardíaco, la resistencia vascular y retención de líquidos. (Mark, 1996).
Teniendo presente que cualquier alteración en la estructura, propiedades mecánicas y función de las pequeñas arterias puede generar resistencia vascular, propiciandose asi que aumente la presión arterial. (Folkow, 1982). Algunos factores como la edad, la falta de estrógenos, la ingesta elevada de sodio, el tabaquismo y los niveles altos de homocisteína pueden reducir la elasticidad de las arterias produciendo rigidez en ellas. Esta rigidez puede inducir aterosclerosis por depósito de colágena, hipertrofia de células de músculo liso, engrosamiento, fragmentación y ruptura de las fibras de elastina. El endotelio vascular está ampliamente involucrado en la HAS ya que participa en la regulación del tono vascular, en los mecanismos de
hemostasia y trombosis, en el crecimiento celular, en la apoptosis y en la migración y modulación de la composición de la matriz extracelular. En el endotelio se producen sustancias tanto vasodilatadoras (óxido nítrico (ON), las bradikininas (BDK) y prostaciclina (PGI2)), así como vasoconstrictoras (angiotensina II (Ang ll), la endotelina (ET) y los tromboxanos (TBX)). (Vanhotte, 1991). El ON además de ser vasodilatador, también tiene propiedades antitrombóticas, antiinflamatorias, inhibidor del crecimiento y antiaterogénico. Su contraparte es la angiotensina II que presenta acciones contrarias. La angiotensina II forma parte del sistema renina-angiotensina, el cual está involucrado de forma importante en HAS. (Carey, 2003). La angiotensina II tiene importantes propiedades vasocontrictoras y aumenta la presión arterial por un doble mecanismo vasocontrictor agudo y lento, estimula el sistema nervioso simpático a varios niveles e inhibe el tono vagal, tiene también varios efectos sobre el riñón y estimula la secreción de hormonas antidiuréticas y de la aldosterona. (Griffin, 1991)
Múltiples trabajos realizados en las últimas dos décadas, han demostrado el importante papel que tiene el estrés de rozamiento y el estrés oxidativo como precursores de disfunción endotelial, lo que promueve la expresión de moléculas en la superficie endotelial que en condiciones de normofunción no se manifiestan.
(Chae, 2001). La expresión de moléculas de adhesión permiten que los elementos formes de la sangre tengan oportunidad de adherirse, y bajo ciertas condiciones, incluso migrar al espacio subendotelial. Así, los monocitos son capaces de asirse de la pared endotelial a pesar del flujo laminar de alta velocidad (Chae, 2001). Un gradiente electroquímico dado por la presencia de sustancias oxidadas como las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y la presencia de especies reactivas de
oxígeno (ROS), permite la liberación de factores quimioatractores que favorecen el ingreso de los monocitos y/o macrófagos, y por procesos de señalización subendotelial estimulan la expresión de receptores barredores en el monocito. Los cuales tienen gran selectividad por las LDL oxidadas (LDLox), que son fagocitadas por el macrófago; quien desarrolla lipotoxicidad y libera citocinas de respuesta inflamatoria al no poderlas destruir (Bautista, 2005). Las citocinas liberadas tales como el factor de necrosis tumoral-alfa (TNFα), interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), y factores de crecimiento (MCP-1), promueven una cascada de señalización, que culmina con procesos de remodelación tisular favoreciendo la rigidez arterial y el desarrollo de placas de ateroma. (Bautista, 2005). La liberación de estas substancias tendrá efecto también en procesos de proliferación de las células del músculo liso, y alteraciones en la función del endotelio, induciendo alteraciones en la trombomodulación; incrementando la liberación del inhibidor del activador del plasminógeno-1(PAI-1). El proceso inflamatorio también es transmitido a la zona de la adventicia y hoy se reconoce que juega un papel muy importante en la diferenciación de monocitos a fibroblastos, permitiendo así, la liberación de colágena y otros derivados que habrán de remodelar la matriz extracelular. (Chae, 2001).
Los mecanismos involucrados que interactúan en el daño vascular debido a la tensión arterial crónicamente elevada son: el flujo pulsátil con lesión mecánica directa, afectación de las células endoteliales, la remodelación y el crecimiento de las células musculares lisas (Fig. A). La patogénesis de la hipertensión induce cambios estructurales bajo los términos de remodelación e hipertrofia sobre las arteriolas, lo que se traduce en un incremento de las resistencias. (Kaplan, 1998)
El proceso de remodelación vascular, involucra cambios en uno o más de los siguientes eventos: crecimiento celular, muerte celular, migración celular y producción o degradación de la matriz extracelular; esto es dependiente de la interacción dinámica entre factores de crecimiento generados localmente, substancias vasoactivas y estímulos hemodinámicos. Estudios experimentales en ratas y ratones genéticamente hipertensos, en los que se evaluó el grado de apoptosis de los órganos afectados por la hipertensión (corazón, riñón y cerebro) evidenciaron un incremento en la apoptosis en dichos órganos. Específicamente en miocitos ventriculares, en células corticales y medulares del riñon, y en células de la corteza cerebral, hipocampo y tálamo del SNC; mostraron un mayor número de inductores apoptóticos, en los cultivos de células de músculo liso vascular, comparado con especímenes normotensos de la misma edad (Kaplan 1998).
Esto enfatiza la importancia de una regulación anormal de muerte celular programada que ocurre en la hipertensión, distinta de la que ocurre con lesión celular o necrosis y distinta de la que ocurre con las células endoteliales normales.
El Endotelio
La capa de la pared vascular más próxima a la luz arterial recibe el nombre de íntima (Rhodin, 1980), formada por una sola capa de células escamosas, llamada endotelio, que descansa en una delgada lámina basal que la separa de un breve espacio subendotelial; este colinda con la lámina elástica interna y posteriormente con la capa media fibromuscular.
El endotelio de los vasos sanguíneos participa fundamentalmente en la regulación hemodinámica, mediante la síntesis y liberación de sustancias vasoactivas.
El endotelio vascular, más que funcionar como un simple tejido, ha sido evaluado en las últimas décadas, en cuanto a sus funciones complejas, llevandolo ha considerar como un órgano (Koenigsberger et. al, 2005). Estas funciones se pueden resumir en tres principales, en las que interviene regulando:
a) la contractilidad de la pared de los vasos sanguíneos en respuesta a hormonas o factores circulantes y locales.
b) la interacción vaso-plaqueta y la producción local de factores coagulantes y la producción de trombos, y finalmente.
c) la proliferación y/o migración de células musculares lisas hacia la íntima, que conducirán al estrechamiento vascular.
En condiciones fisiológicas, la funcionalidad del endotelio, se mantienen en un delicado equilibrio que puede ser modificado por diversas patologías, entre ellas la hipertensión arterial. (Koenigsber et. al. 2005). La disfunción endotelial posee una prevalencia similar a la de la hipertrofia ventricular izquierda. (Schiffrin, 2001).
Considerado como una barrera inerte de difusión entre la sangre y el músculo liso vascular, el endotelio es ahora reconocido como un órgano vital endocrino y paracrino que juega un papel clave en la prevención de la ateroesclerosis. Entre las funciones importantes del endotelio están el mantenimiento del tono vascular, la regulación del crecimiento celular vascular, de la adhesión leucocitaria y plaquetaria, de la trombosis y fibrinólisis y mediación de la inflamación. (Koenigsberger et. al, 2005). El endotelio normal detecta cambios en distintos factores hemodinámicos (Mateev, 2006), (por ejemplo cambios de presión y fuerzas de rozamiento) la presencia de hormonas (Mateev, 2006), y de sustancias vasoactivas (que se producen en las células sanguíneas y plaquetas), e induce la síntesis y liberación de sustancias biológicamente activas que mantienen la homeostasis vascular (Mateev, 2006; Moncada, 1988; Vanhoutte, 1989)
El endotelio controla la respuesta vascular mediante la liberación de varias substancias, incluidos sustancias vasodilatadoras como la prostaciclina (PGI2) (Moncada, 1988), el óxido nítrico (ON) (Moncada, 1988), el factor hiper-polarizante derivado de endotelio (FHDE), el ATP y la adenosina (Vanhoutte, 1989), así como de sustancias vasoconstrictoras como el tromboxano A2 (Moncada, 1988), y las
endotelinas (Yangisawa, 1988). La liberación de estos factores por diversos estímulos, desempeña un importante papel en la regulación local del flujo sanguíneo, interviniendo en la patogénesis de la hipertensión arterial (Koenigsberger et. al, 2005), y reforzando el desbalance entre las substancias vasodilatadoras y vasoconstrictoras que lleva implícito un daño, y como consecuencia, una remodelación con cambios en la estructura vascular.
Se presume que los pacientes hipertensos tienen una bioactividad disminuida del ON y por ello una menor respuesta vasodilatadora y un aumento en la permeabilidad endotelial mediada por ET. (Feletow, 2006).
El tono vascular está regulado por la producción y liberación de varios factores dilatadores y constrictores. El factor vasodilatador endógeno más importante es el ON. El cual se genera por la conversión del animoácido L-arginina en ON por la isoforma de la enzima endotelial sintasa de ON (NOSe) (Feletow, 2006). El ON activa la guanil ciclasa en el músculo liso vascular, produciendo un incremento de concentraciones de GMPc que a su vez, activa la proteinquinasa dependiente de la GMPc (PKG), que disminuye las concentraciones de calcio citosólico, causando la relajación del músculo liso y disminuyendo el tono vascular. Además de su importancia como vasodilatador, el ON influye en muchos de los efectos vasoprotectores del endotelio normal (Feletow, 2006).
A la fecha, el ON es considerado primordial en la regulación de varios procesos fisiológicos y fisiopatológicos. El importante descubrimiento de que el ON de origen endotelial media los efectos vasodilatadores de agonistas como la acetilcolina y la bradicinina (Palmer et al., 1987; Ignarro et al., 1987), permitió el desarrollo del fecundo campo de la biología del ON. El progreso de este basto conocimiento, ha
tenido su base principal en la evidencia obtenida mediante la inhibición de la biosíntesis del ON por medios farmacológicos. Poco tiempo después del descubrimiento del ON como una molécula reguladora de la actividad del músculo liso vascular, se obtuvieron fármacos análogos estructurales de la L-arginina que son inhibidores de las enzimas que sintetizan al ON, las sintasas de ON (NOS) (Palmer et la., 1988). El extensivo uso experimental de estos análogos, ha permitido establecer la participación del ON en una variedad de efectos biológicos específicos.
Las sintasas del óxido nítrico.
La NOS se encuentra en tres isoformas, dos constitutivas y una inducible. La sintasa endotelial (NOSe) o isoforma III, es constitutiva, regulada por Ca2+ y calmodulina (CaM), y como su nombre lo indica se localiza preferentemente en las células del endotelio vascular (Sessa et al., 1992; Nishida et al., 1992). La actividad de la sintasa neuronal (NOSn) o isoforma I, también es regulada por el complejo Ca2+ - CaM, y es expresada constitutivamente en el sistema nervioso central (SNC), los ganglios del simpático, las glándulas adrenales y los nervios nitroxidérgicos (Bredt et al., 1990, 1991; Lowenstein y Snyder, 1992). Por último, la isoforma II o sintasa inducible (NOSi), es independiente de Ca2+, fue primero descrita en macrófagos (Lowestein et al., 1992) pero ha sido aislada de una gran variedad de células después de su inducción con mediadores inflamatorios y productos bacterianos (Lyons et al., 1992; Busse y Mulsch, 1990; Charles et al., 1993). No obstante, hay
evidencia de que la NOSi está presente en riñones normales de rata, que no han sido estimulados inmunológicamente (Mohaupt et al., 1994).
Las tres isoformas de la NOS favorecen la oxidación de uno de los nitrógenos del grupo guanidino de la L-arginina para producir ON y citrulina; utilizan O2 y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato en su forma reducida (NADPH) como cosubstratos, y requieren de los cofactores flavina adenina dinucleótido (FAD) y flavina mononucleótido (FMN) para transferir electrones (Bredt et al., 1991;
Dinermann et al., 1993; Marletta, 1993; Forstermann et al., 1995). Otro cofactor necesario para la activación de la NOS es la 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina (BH4) (Scott-Burden et al., 1994). Las tres isoformas tienen un sitio de enlazamiento para la proteína fijadora de calcio, CaM, el cual parece actuar como un interruptor que regula el flujo electrónico a través de las enzimas (Abu-Soud y Stuehr, 1995). Las enzimas constitutivas no contienen CaM enlazada, pero en presencia de Ca2+ la asociación ocurre con alta afinidad, resultando en la activación de las enzimas. De esta manera, in vivo, las formas constitutivas de la NOS requieren del incremento en la concentración del Ca2+ libre intracelular para su activación ([Ca2+]i).
(Schlossmann et.al. 2000,) El ON es generado en las células neurales y endoteliales solamente cuando la [Ca2+]i alcanza niveles superiores a 100 nM (Knowles et al., 1989). Este aumento puede alcanzarse por la activación de receptores específicos de la membrana celular como los activados por la acetilcolina (receptores muscarínicos) o la bradicinina (receptores B2); así, el incremento resultante de la [Ca2+]i activa a las NOS constituivas, causando la liberación de ON. En cambio, como ha sido mencionado, la actividad de la isoforma inducible es independiente de
calcio. Esta independencia ha sido atribuida al hecho de que la CaM está estrechamente enlazada a la NOSi en ausencia de Ca2+ (Katusic y Cosentino, 1994).
Un estímulo fisiológico para la producción de ON es el estrés por fricción de la sangre fluyendo por las células endoteliales. Rubanyi et al. (1986) observaron que la concentración de ON liberado por el endotelio de una arteria perfundida, aumentaba con la velocidad del flujo de la solución fisiológica (Brekke, 2006). El mismo mecanismo fue considerado responsable de la dilatación de la arteria coronaria que ocurre en respuesta al aumento del flujo coronario (Lamontagne et al., 1992).
También, hay evidencia de que el ON liberado por las células endoteliales cultivadas refleja la tasa de fricción del líquido fluyendo por las células (Buga et al., 1991;
Cooke et al., 1990). Por otra parte, el ejercicio, con su prolongado aumento en el estrés por fricción, conduce al acrecentamiento en la liberación de ON (Sessa et al., 1994).
El ON puede regular su propia síntesis a través de la nitrosilación del grupo hemo de la NOS. La capacidad oxidativa de las NOS es restringida por un mecanismo de retroalimentación negativa en el cual la formación del complejo Fe-ON previene el enlazamiento de O2 al sitio activo (Abu-Soud et al., 1995). Aún en condiciones de concentraciones altas intracelulares de Ca2+, esta inhibición previene la producción de especies reactivas de óxido de nitrógeno por las NOSn y NOSe. (Ma X. 2001) En comparación con las isoenzimas constitutivas, el complejo Fe-ON resultante en la NOSi tiene una estabilidad relativamente menor y, en consecuencia, la enzima muestra una susceptibilidad reducida a la inhibición por el ON (Ma X. 2001).
El óxido nítrico.
El ON es un gas de vida media corta, se oxida espontáneamente dando como productos terminales nitrito y nitrato (Ignarro, 1990). El ON es inactivado por el anión superóxido (Gryglewski et al., 1986) y por la hemoglobina (Martin et al., 1986). El ON de origen endotelial difunde hasta las células del músculo liso vascular y las relaja principalmente por estimular la enzima citosólica, guanilil ciclasa soluble, la cual cataliza la producción del segundo mensajero, responsable de inhibir la actividad contráctil, el 3’-5’-guanosín monofosfato cíclico (GMPc) (Schmidt et al., 1993). La producción basal de ON es importante en la regulación del tono vasomotor y la presión arterial (Feletow, 2006). La inhibición de la producción de ON por el tratamiento con un análogo de la L-arginina como la NG-monomethyl-L-arginina (L- NMMA), causa vasoconstricción (Vallance et al., 1989) y una respuesta presora (Johnson y Freeman, 1992). Esta observación indica que los vasos de resistencia están fisiológicamente en un estado de tono vasodilatador activo, en el que el ON endógeno es el responsable. El ON es liberado no solamente hacia el músculo liso que subyace al endotelio, sino también hacia la luz del vaso sanguíneo. Así, en la interfaz entre la sangre y la pared vascular, el ON inhibe la adhesión de plaquetas y leucocitos al endotelio (Cooke y Tsao, 1994; Vanhoutte, 2003). Adicionalmente, el ON inhibe la mitogénesis y la proliferación de las células del músculo liso vascular (Garg y Hassid, 1989).
Reacciones moleculares del óxido nítrico.
El ON reacciona con metales formando complejos nitrosilo. La mayoría de estas reacciones in vivo son con proteínas que contienen hierro. La nitrosilación, o formación de un aducto nitrosilo (·ON), con los grupos hemo es particularmente expedita y debe considerarse en cualquier mecanismo en el que participe el ON. El ON reacciona con los grupos hemo de varias proteínas que participan de manera importante en el metabolismo celular (Schlossmann, 2000).
La más notable hemoproteína que forma un aducto Fe-ON in vivo es la guanilil ciclasa soluble (Murad, 1986). Con la unión del ON, la posición del hierro dentro del anillo de porfirina cambia, de forma que la histidina distal es desacoplada en favor de un complejo nitrosilo, de cinco enlaces coordinados (Yu et al., 1994). Esta alteración en la configuración de la proteína, activa a la enzima con relativamente bajas concentraciones de ON (EC50 100 nM) y estimula la conversión, en el dominio GTPasa, del trifosfato de guanosina (GTP) a GMPc (Schlossmann, 2000). La producción de GMPc tiene lugar en varios tejidos, particularmente en el músculo liso vascular y en las plaquetas, en donde media la acción vasodilatadora y antiagregante del ON, respectivamente (Murad, 1986). También, hay evidencia de que la activación de la guanilil ciclasa por el ON, previene algunos procesos apoptóticos (Ma X. 2001)
Reacciones del ON con algunas especies radicales.
Los radicales centrados en carbono y lípidos son formados como resultado del metabolismo normal y el estrés oxidativo. El ON puede abatir los efectos que estos radicales tienen en los sistemas biológicos. Notablemente, el ON puede reaccionar con los oxirradicales formados durante la peroxidación de lípidos - siendo ésta un importante componente del proceso inflamatorio y muerte celular. Los oxirradicales convierten a los lípidos en una variedad de aductos lípido oxi y lípido peroxi, lo cual compromete a la membrana al través de la perpetuación de la oxidación de lípidos.
El ON protege contra la citotoxicidad de las especies reactivas de oxígeno mediante la terminación de la peroxidación de lípidos.
LOO· + ON → LOONO
La terminación de la cadena puede prevenir la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad en las células endoteliales y los macrófagos (McIntyre 1999; Maytin 1999).
De la misma forma, la reducción de los niveles de colesterol oxidado impide la iniciación de aterosclerosis mediada por macrófagos espumosos activados.
Efectos indirectos del ON.
En los sistemas biológicos la oxidación química y la nitrosilación son componentes constitutivos normales del metabolismo celular (Fridovich, 1999). Empero, estos procesos también pueden producir intermediarios químicos que estresen a las células y ocasionen toxicidad. En este caso, la situación química es referida como estrés que puede ser oxidativo o nitrosativo. Un producto normal del metabolismo aeróbico es la generación de intermediarios reactivos por la reducción de oxígeno molecular (O2). Estos incluyen al anión superóxido (O2-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (HO.) que se originan debido a la predisposición del O2 a las reducciones univalentes (Fridovich, 1999). Estas especies reactivas de oxígeno, amenazan a todas las macromoléculas celulares, y se requieren defensas específicas para evitar el estrés oxidativo. Varias enzimas participan de forma importante en la catálisis de las especies reactivas de óxígeno; entre las más importantes están: la superóxido dismutasa que convierte al O2- en O2 y H2O; las catalasas que a partir de H2O2 producen O2 y H2O; y las peroxidasas que reducen H2O2 en 2 H2O y ROOH en ROH y H2O (Fridovich, 1999). El papel del daño oxidativo en el envejecimiento y enfermedades degenerativas está bien fundamentado. Bajo condiciones de estrés químico, las proteínas y el ADN pueden dañarse de forma irreversible. Las reacciones de nitrosación afectan primariamente aminas y tioles.
Los óxidos de nitrógeno más altos N2O3, ONOO-, NO- y NO2, son considerados las especies químicas responsables por la etiología de numerosas enfermedades. La química nitrosativa puede resultar en la modificación de una variedad de macromoléculas, desde agentes reductores leves como las catecolaminas y los
centros metálicos, a aquellos con mayor potencial de oxidación como el ADN, las proteínas, y los lípidos.
Relajación del músculo liso por el óxido nítrico.
El ON es un regulador importante de la relajación del músculo liso vascular y visceral (Feletow, 2006). Es generalmente aceptado que la activación de la guanilil ciclasa soluble por el ON, es el proceso intracelular principal que inicia la relajación, pero los eventos que ocurren después de la formación del GMPc son todavía debatidos (Eigenthaler et al., 1999; Hofmann et al., 2000; Lincoln et al., 2000). El GMPc activa una familia de proteinas cinasas de residuos serina y treonina, las proteinas cinasas dependientes de GMPc (PKG), en las células del músculo liso; así, es probable que varios eventos diferentes de fosforilación ocurran en respuesta a la activación de la PKG y conduzcan a relajación (Lincoln et al., 2000). Han sido descritos al menos dos tipos de PKG, las PKG-I y PKG-II, que conducen señales de múltiples sistemas (Lohmann et al., 1997), pero es la PKG tipo I la que media muchos de los efectos del ON en las células cardiovasculares (Francis y Corbin, 1994; Lohmannn et al., 1997).
La importancia de la vía ON/GMPc/PKG en la regulación del tono del músculo liso puede ser atisbada en los estudios de supresión génica en ratones; aquellos que carecen de las NOSe o la PKG-I han mostrado moderada hipertensión, indicativa de un incremento en el tono vascular (Huang et al., 1995, 1995; Pfeifer et al., 1998).
Recientemente, otro papel regulador para la vía de la ON/GMPc/PKG ha sido propuesto: el control del fenotipo del músculo liso vascular (Uhrenholt, 2007). El ON inhibe la proliferación de las células del músculo liso vascular in vitro e in vivo, aunque el mecanismo no ha sido todavía elucidado.
Regulación de calcio intracelular por el óxido nítrico..
El primer mecanismo propuesto para el GMPc, en la relajación del músculo liso, fue la reducción de la concentración del calcio libre intracelular ([Ca2+]i ) (Johnson y Lincoln, 1985; Lincoln, 1983). A la vez, varios mecanismos han sido propuestos para explicar la regulación del Ca2+ citosólico dependiente del GMPc (Hofmann et al., 2000). Estos incluyen: el secuestro y remoción del Ca2+ libre intracelular por bombeo del catión, la inhibición de canales de Ca2+ regulados por voltaje y la interrupción del acoplamiento del receptor serpentina a la proteína G en el músculo liso (Isakson, 2007). Dos mecanismos adicionales han sido reportados y merecen consideración (Lincoln et al., 2000). El primero, es un incremento en la apertura de los canales de K+ de alta conductancia activados por Ca2+, denominados canales BK. El incremento en la actividad de los canales BK, hiperpolariza la membrana y reduce la entrada de Ca2+ extracelular a través de los canales de Ca2+ activados por voltaje (Isakson 2007; Regimbald, 2007). El aumento en la actividad de los canales BK parece originarse, por una parte, de la activación directa de los canales por la PKG y, por otra, de la actividad aumentada de corrientes salientes espontáneas transitorias (STOC) producidas por pequeños estallidos (bursts) de Ca2+ liberado del retículo sarcoplásmico superficial (Nelson et al., 1995). En el primer caso, ha sido propuesto que la PKG regula al canal BK, actuando ya sea como catalizador directo por fosforilación (Alioua et al., 1995; Archer et al., 1994; Fukao et al., 1999) o por activación de una proteína fosfatasa que desfosforila el mencionado canal (White et al., 1993; Wilcox 1992). Estos resultados implican que puede haber canales BK específicos para las células o los tejidos que son activados por PKG, un tipo activado por fosforilación y otro por desfosforilación. En el caso de la actividad
aumentada de las STOC, ha sido propuesto que la PKG incrementa la entrada de Ca2+ hacia el SR superficial, o activa los receptores a ryanodina (RyR), o ambos. El efecto neto sería una liberación localizada de Ca2+ del retículo sarcoplásmico al espacio por debajo del plasmalema para activar canales BK en la propia membrana (Porter et al., 1998). Como resultado de la activación de los canales BK, ocurre una disminución en el calcio intracelular global, que conduce a la desfosforilación de la cinasa de las cadenas ligeras de miosina (MLCK) y a la relajación (Isakson 2007;
Regimbald 2007). Los mecanismos moleculares del flujo de Ca2+ hacia adentro y fuera del SR mediados por la PKG no son claros, auque ha sido repetidamente propuesto que la fosforilación de la proteína del SR, fosfolambán, efectuada por la PKG, contribuye a aumentar el almacenamiento de Ca2+ en el SR (Cornwell et al., 1991; Karczewski et al., 1992; Luo et al., 1993; Mundian-Weilenmann et al., 2000;
Sarcevic et al., 1989).
El otro mecanismo importante, en el control de los niveles de Ca2+ intracelular por la vía ON/GMPc/PKG es la regulación del receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) en el retículo sarcoplásmico ( Li N 2003; de Wit, 2007). Los estudios de varios laboratorios han indicado que el receptor IP3 tipo I del músculo liso es fosforilado por PKG (Cavallini et al., 1996; Haug et al., 1999; Koga et al., 1994; Komalavilas y Lincoln, 1994, 1996; Murthy y Makhlouf, 1995; Murthy et al., 1993). El resultado de la fosforilación del receptor IP3 no ha sido claramente definido. Sin embargo, Hofmann et al (2000) mostraron que la fosforilación del receptor IP3, por la PKG, disminuye la liberación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico, y este efecto fue dependiente de la acción de la PKG en el retículo sarcoplásmico. Donde una proteína denominada substrato de la PKG-I asociada al recepetor IP3 de voltaje con siglas IRAG, (Isakson
2007; Regimbald 2007), ha sido caracterizada y considerada necesaria para la fosforilzación del receptor IP3 y es el objetivo de la PKG.
Regulación de la sensibilización al Ca2+.
La fosforilación de los residuos serina 19; de las cadenas ligeras de miosina, es necesaria para la activación, por la actina, de la ATPasa de miosina y la subsiguiente formación cíclica de los puentes cruzados entre las cabezas de miosina y la actina. Dos enzimas claves en el control de la fosforilación de las cadenas ligeras de miosina son la MLCK, una cinasa activada por Ca2+ y calmodulina, y la fosfatasa de las cadenas ligeras de miosina, una fosfatasa tipo I de residuos serina y treonina. Con respecto a la regulación de la MLCK, no hay evidencia de que su fosforilación por la PKG inhiba su actividad (Li, 2003; de Wit 2007). En cambio, los trabajos recientes sugieren que la PKG activa la fosfatasa de las cadenas ligeras de miosina inhibiendo, por ello, la fosforilación de las cadenas y la contracción. Los estudios iniciales por Nishimura y van Breemen (1989) y la subsiguiente caracterización por Lee et al. (1997) y otros (Kawada et al., 1997), mostraron que los análogos del GMPc inhibieron la sensibilización al Ca2+ en la contracción causada por substancias agonistas. Sensibilización al Ca2+ es el término usado para describir el incremento en la actividad contráctil producida por agonistas acoplados a las proteínas G en comparación con la actividad contráctil causada por despolarización.
Mayores niveles de contracción y fosforilación de las cadenas ligeras de miosina pueden alcanzarse con niveles bajos de Ca2+ intracelular, utilizando agonistas contráctiles que despolarizando con altas concentraciones de K+. Un componente
importante del mecanismo de sensibilización al Ca2+ que sigue a la estimulación de la contracción por agonistas, es la inhibición dependiente de la vía de la guanosín trifosfatasa, Rho, y la cinasa Rho (vía Rho-Rho cinasa), de la fosfatasa de las cadenas ligeras de miosina (Gong et al., 1996; Kimura et al., 1996). Aparentemente, la PKG se opone a la inhibición inducida por la Rho cinasa de la fosfatasa, mediante la fosforilación de la subunidad que enlaza miosina (MBS) de la fosfatasa de las cadenas ligeras de miosina, así activando la subunidad catalítica de la fosfatasa (Surks et al., 1999; Torrecillas et al., 2000). Estos estudios han también mostrado que la PKG es dirigida hacia la MBS, de esta forma colocándola idealmente para activar la fosfatasa de las cadenas ligeras de miosina. Este escenario, similar al propuesto para la dirección de la PKG hacia el receptor IP3, se basa en la localización de la PKG con sus substratos para la subsecuente inducción de relajación (Brekke, 2006).
Hay reportes adicionales de que la PKG pueda interferir directamente con la activación de la Rho cinasa dependiente de GTPasa Rho, posiblemente a través de la fosforilación de Rho (Sauzeau et al., 2000). Varios estudios han actualmente mostrado que varias de las pequeñas proteínas que enlazan GTP que convergen en la vía de contracción del músculo liso (e.g., Rho y Rap1) pueden ser substratos fisiológicos para la PKG (Miura et al., 1992; von Linting et al., 2000). Finalmente, Wu et al. (1998) mostraron que la insensibilización mediada por la PKG del músculo liso visceral puede comprender la fosforilación de la telokina. Claramente, el control del músculo liso vascular a través de la fosforilación de las cadenas ligeras de miosina, es un blanco importante del señalamiento de NO/GMPc/PKG.
Regulación de los filamentos delgados.
El papel del filamento delgado en la regulación de la contracción de las células del músculo liso ha sido motivo de controversia. Hay evidencia de la existencia de proteínas que se enlazan a los filamentos delgados regulando la actividad contráctil de la célula, pero son pocos los reportes que consideran el papel de los segundos mensajeros en la regulación de la función de las proteínas de los filamentos delgados. Una proteína que enlaza a los filamentos delgados de actina, la proteína de choque por calor de 20-kDa (heat shock-related protein; HSP20), ha concitado interés por su posible participación en la regulación de la contracción del músculo liso por vía de los filamentos delgados. Recientemente, la HSP20 ha conseguido atención como un blanco potencial para la acción de la PKG. La HSP27 y la HSP20 han sido implicadas en la regulación de la contracción del músculo liso (Beall et al., 1997; Yamboliev et al., 2000); particularmente, la HSP20 resultó ser un blanco específico para la fosforilación de la PKA y la PKG (Brophy et al., 1999; Beall et all., 1999). La fosforilación de la serina 16 por estas cinasas se asocia con la relajación del músculo liso. El músculo liso que no relaja en respuesta a los nucléotidos cíclicos (i.e., la arteria umbilical) no muestra fosforilación de la HSP20. Varios estudios utilizando péptidos inhibitorios para la HSP20, indicaron que esta proteína media relajación primeramente a través de interacciones con filamentos delgados (Beall et al., 1999; Brophy et al., 1999; Rembold et al., 2000). Resulta, pues, muy interesante la posible vías de relajación NO/cGMP/PKG/HSP20.
El óxido nítrico como agente que moviliza Ca2+.
El ON es un mediador incuestionable de la relajación del músculo liso vascular, en donde conduce a una disminución en la [Ca2+]i. Empero, un número creciente de reportes señalan que el tratamiento con ON, y donadores de ON, produce incrementos en la [Ca2+]i; por ejemplo, en las células intersticiales del intestino de mamífero (Publicover et al., 1993), una línea de macrófagos (Kong et al., 1994) y células pancreáticas (Willmott et al., 1995). Estos efectos persisten en la ausencia de Ca2+ extracelular, y pueden ser bloqueados con el tratamiento con ryanodina (Publicover et al., 1993; Willmott et al., 1995), lo cual sugiere que el ON puede estimular una cascada de transducción en la que se activan los canales de Ca2+
sensibles a la ryanodina (Lee, 1994).
Los receptores de ryanodina (RyRs) están presentes en los almacenes intracelulares de Ca2+ de un amplio número de tipos celulares (McPherson et al., 1992). Los RyRs pueden ser regulados por el nucleótido cíclico adenilildifosfato-ribosa (ADPRc) (Galione et al., 1991); este metabolito participa en la liberación de Ca2+ al citoplasma por activación de canales de Ca2+ en el retículo sarcoplásmico. La concentración celular del ADPRc es regulada por las actividades de su enzima sintética, ADP- ribosilciclasa, y su enzima degradante, la hidrolasa de ADPRc (el ADPRc es sintetizado a partir de NAD-H) (Lee et al., 1994). Las dos acciones parecen realizarse por una única enzima bifuncional. Esta enzima puede aumentar o disminuir la [Ca2+]i, es regulada por el GMPc y posiblemente de manera directa por el ON. A la fecha, la evidencia acumulada sugiere que el ADPRc es un modulador muy extendido de la liberación de calcio mediada por RyRs en muchos tipos
diferentes de células de mamífero (Hua et al., 1994; Meszaros et al., 1993; White et al., 1993; Takasawa et al., 1993; Thorn et al., 1994; Gromada et al., 1995;
Bourguignon et al., 1995). Recientemente, ha sido establecido que el ON moviliza calcio de almacenes intracelulares en los huevos del erizo de mar por vía de un camino que comprende en parte GMPc y conduce a la activación del mecanismo de liberación de calcio sensible a ADPRc (Lee, 1994; Willmott et al., 1996). El GMPc puede aumentar la síntesis de la ADPRc (Galione et al., 1993) y esto puede subyacer la movilización de calcio por el GMPc en los huevos de estrella de mar (Whalley et al., 1992; Lee et al., 1993; Lee, 1994; Willmott et al., 1996). En muchos sistemas, el ADPRc parece actuar como un modulador del mecanismo de liberación de calcio inducida por calcio (CICR) al través de RyR (Galione et al., 1993). El ADPRc se enlaza a los canales de calcio en la membrana del retículo endoplásmico para activar un mecanismo de liberación de calcio. Este mecanismo es, en sí mismo, potenciado por concentraciones elevadas de calcio citoplásmico. Así, el ADPRc puede funcionar como un regulador endógeno de la liberación de calcio inducida por calcio, y puede tal vez funcionar como un segundo mensajero que moviliza calcio (Galione y White, 1994). El ON ha sido identificado como un agonista que puede movilizar calcio intracelular mediante la activación selectiva una vía de señalización de calcio que comprende ADPRc, mientras que no tiene efecto en la vías de activación del receptor de IP3.
El ON también puede actuar de otra forma independiente del GMPc. La ribosilación por ADP de la deshidrogenasa de gliceraldehído 3-fosfato (GAPDH) es estimulada por ON (Dimmeler et al., 1992; Dimmeler y Brüne, 1993). Ya que esta ribosilación inhibe la acción de la GAPDH, el ON podría inhibir la glucólisis y contribuir a la injuria
por reperfusión y neurotoxicidad. La estimulación por ON de la ribosilación de la proteínas G puede inhibir su función y por lo tanto alterar la transducción de la señal en la membrana plasmática (Pozdnyakov et al., 1993). La inhibición por el ON de las enzimas hierro-azufre mitocondriales puede ser responsable de la citotoxicidad de los macrófagos de las células tumorales (Drapier y Hibbs, 1988).
El óxido nítrico en el tejido vascular.
Las isoformas de ON pueden encontrarse expresadas en tres diferentes tipos celulares de la pared arterial. Bajo condiciones fisiológicas, la isoforma constitutiva de las células endoteliales (isoforma III) parece ser la principal reguladora del tono arterial. Moncada et al. (1991) fueron pioneros en establecer que la desactivación de la SONe por los análogos de la L-arginina, produce un potente efecto vasopresor, y que la remoción de las células endoteliales inhibe la producción basal de ON.
Después, la medición de los niveles de ON mediante un sensible microsensor porfirínico, permitió establecer que las células endoteliales producen ON en respuesta a agonistas endógenos, seguido de elevación de los niveles de ON en el músculo liso vascular subyacente (Malinski y Taha, 1992; Malinski et al., 1993). La SONe libera picomoles de ON en respuesta a la estimulación de las células endoteliales con agonistas como la bradicinina, la acetilcolina, el ionóforo de calcio A23187, y el ATP (Moncada et al., 1991; Malinski y Taha, 1992; Toda y Okamura, 1989, 1991; Ignarro et al., 1990; Nozaki et al., 1993). La resultante relajación dependiente del endotelio vascular, ha sido mostrada in vitro en tejidos arteriales y venosos de diversos animales, incluyendo a los humanos (Furchgott y Zawadzki,
1980; Thom et al., 1985; Lüscher et al., 1988). La relajación parece ser mayor en las arterias que en las venas, y esta diferencia puede explicarse por una mayor eficiencia de la vía L-arginina/ON en las arterias (Lüscher et al., 1988).
Hay evidencia de que la SON isoforma I, influencia el tono vascular por su presencia en los nervios perivasculares (Toda y Okamura, 1989, 1991; Ignarro et al., 1990). En los grandes vasos, la SONn ha sido encontrada en las fibras nerviosas autónomas de la capa adventicia (Toda y Okamura, 1991). La isoforma neuronal también está expresada en el ganglio esfenopalatino. Las proyecciones de este ganglio a las grandes arterias cerebrales proporcionan inervación nitroxidérgica perivascular (Nozaki et al., 1993). La activación de estos nervios causa liberación del ON y relajación de las células musculares arteriales, indicando que la SONn desempeña un papel en la neurotransmisión inhibitoria de las arterias cerebrales (Toda y Okamura, 1991).
Es poco probable que la isoforma inducible participe en la regulación fisiológica del tono vascular, pero desempeña un papel en el menoscabo de la reactividad vascular durante el choque séptico (Buga et al., 1993; Moncada et al., 1991). Así, la SONi participa importantemente en la relajación patológica que ocurre en el choque endotóxico en animales y en humanos. La inducción de la enzima ocurre en el músculo liso vascular y en las células endoteliales, y resulta en la producción excesiva de ON, relajación vascular y resistencia a los vasoconstrictores (Wright et al., 1992; Petros et al., 1991). Vallance y Moncada (1992) mostraron que el grado de hipotensión durante el choque séptico producido experimentalmente en diversas especies, está directamente relacionado con los niveles de ON. De aquí que varías
estrategias enfocadas en la reducción de la producción de ON, han sido desarrolladas para el tratamiento del choque séptico (Petros et al., 1991; Vallance y Moncada, 1992; Keaney et al., 1994). Estas incluyen el uso de análogos de la L- arginina (Petros et al., 1991) y el uso de azul de metileno, un conocido inhibidor de la guanilil ciclasa, que además tiene actividad inhibitoria directa de la SON (Keaney et al., 1994; Mayer et al., 1993).
Garg y Hassid (1989) fueron los primeros en mostrar que los vasodilatadores que generan ON como la S-nitroso-N-acetilpenicilamina, el nitroprusiato de sodio, y el dinitrato de isosorbide, de forma dependiente de la dosis inhiben la mitogénesis y la proliferación de las células del músculo liso vascular. Los efectos antimitogénicos de los vasodilatadores que generan ON fueron parcialmente imitados por el 8-bromo- GMPc, lo cual sugiere que este efecto es mediado por el segundo mensajero GMPc.
Sin embargo, como muestran el reporte original de Garg and Hassid (1989), una publicación posterior de los mismos investigadores (Garg y Hassid, 1990), y otros reportes (Dubey, 1994), sólo aproximadamente la mitad de los efectos antimitogénicos del ON pudieron ser explicados por un mecanismo mediado por GMPc. Sarkar et al. (1994) han sugerido un mecanismo para la acción del ON que parece ser específico del ciclo celular pero independiente del GMPc.
También hay evidencia del papel del ON como agente antimitogénico in vivo. La proliferación excesiva del músculo liso vascular es una marca distintiva de la ateroesclerosis (Ross, 1991). La eliminación del endotelio, por ejemplo, en el modelo de lesión por balón (sonda inflada), es asociada con proliferación del músculo liso vascular subyacente (Dzau et al., 1991; Powell et al., 1989). Es probable que una de
las funciones de la vía de la L-arginina/ON endotelial, sea mantener quiescente el músculo liso vascular. Puede postularse, además, que en la pared vascular hay una continua influencia pro-crecimiento de la Ang II y otros factores de crecimiento, e influencias contrarias al crecimiento de las cininas y el ON. En condiciones patológicas como la aterosclerosis o lesión arterial inducida por balón, estas influencias promotoras de crecimiento actuarán más o menos sin oposición, dando como resultado la proliferación del músculo liso vascular (Dzau et al., 1991; Powell et al., 1989). Adicionalmente, los efectos protectores de los vasos e inhibidores de la proliferación de los fármacos inhibidores de la ECA, pueden comprender la disminución de la influencia promotora del crecimiento de la Ang II, y el incremento del efecto reductor del crecimiento celular de las cininas y el ON. Lo último es confirmado por datos de Farhy et al. (1993), quienes mostraron que el inhibidor de la NOS, éster metilo de la NG-nitro-L-arginina (L-NAME), revirtió los efectos protectores del inhibidor de la ECA en la formación de la neo-íntima después de la lesión por balón en la arteria carótida de la rata.
El ON en la disfunción endotelial.
La disfunción endotelial es caracterizada por un cambio en las funciones del endotelio hacia una reducida vasodilatación y un estado pro inflamatorio y pro trombótico. Es asociada con la mayoría de las formas de patología cardiovascular, tales como hipertensión, enfermedad de las arterias coronarias, insuficiencia cardiaca crónica, enfermedad arterial periférica, diabetes, y fallo renal crónico (Endemann y Schiffrin, 2004). Actualmente, se considera que las alteraciones en la
síntesis, liberación y disponibilidad del ON están implicadas en la patogénesis de la disfunción endotelial (Vanhoutte, 2003). Temprano, durante el curso de la arterioesclerosis, la disfunción endotelial puede ser detectada en varios lechos vasculares, incluyendo las arterias periféricas de los antebrazos y la circulación coronaria. Además, la disfunción endotelial parece predecir la prognosis de la enfermedad cardiovascular. Por lo tanto, es pertinente elucidar si la disfunción endotelial es simplemente un marcador de la enfermedad cardiovascular, o un participante activo en el progreso de la enfermedad. Un posible enlace entre arterioesclerosis, disfunción endotelial, y enfermedad cardiovascular es el estrés oxidativo. Los procesos inflamatorios implicados en la patogénesis de la arterioesclerosis aumentan la formación vascular de O2-, conduciendo a disfunción endotelial (Galle et al., 2003). El sistema renina angiotensina activado, junto con lipoproteínas de baja densidad oxidadas, puede desempeñar un papel prominente en el aumento del estrés oxidativo. En este contexto, el endotelio no es solamente un blanco de los radicales de oxígeno, pero puede también contribuir a la formación de O2- (Galle et al., 2003).
Relevancia de la L-arginina.
La L-arginina es la única fuente fisiológica del átomo de nitrógeno para la síntesis de ON (Palmer et al., 1988). Por tanto, las reacciones enzimáticas y otros procesos que regulan la disponibilidad del aminoácido, son consideradas cruciales en la regulación de la síntesis de ON (Palmer et al., 1988). A su vez, los procesos de la biosíntesis, catabolismo y transporte de la L-arginina, son especialmente importantes en la
modulación de sus niveles intracelulares y plasmáticos; las moléculas más importantes en estos procesos son la sintasa de argininosuccinato, las arginasas y los transportadores de aminoácidos catiónicos (CAT), respectivamente. Con respecto a la función vascular, ha sido propuesto repetidamente que la reactividad vascular anormal atribuida a la disfunción endotelial de los vasos de animales hipercolesterolémicos e hipertensos, puede ser corregida mediante la administración de L-arginina (Rossitch et al., 1991; Creager et al., 1992; Chen y Sanders, 1991;
Hayakawa et al., 1994). Los datos reportados permiten establecer que la hipercolesterolemia y la hipertensión aminoran la relajación derivada del endotelio y aumentan la sensibilidad de los vasos a los vasoconstrictores. En estas condiciones, la administración in vitro de la L-arginina normaliza la reactividad vascular de los vasos aislados de animales hipercolesterolémicos e hipertensos (Rossitch et al., 1991; Chen y Sanders, 1991; Hayakawa et al., 1994; Phivthong-ngam et al.1998;
Hayakawa y Raij, 1999). En los humanos hipercolesterolémicos, la función endotelial está impedida y el estrés oxidativo aumentado. La L-arginina mejora la función endotelial con disminución del estrés oxidativo. El aumento de la producción y liberación del ON ocasionado por la L-arginina, puede actuar como antioxidante y contribuir al mejoramiento de la función endotelial en los pacientes hipercolesterolémicos (Creager et al., 1992; Kato et al., 1999; Kawano et al., 2002;
Pereria et al., 2003). Así, la hipercolesterolemia y la hipertensión inducen una disfunción endotelial reversible que puede ser corregida mediante la administración del precursor de ON, L-arginina (Hayakawa y Raij, 1999; Phivthong-ngam et al.1998;
Kato et al., 1999; Kawano et al., 2002; Pereira et al., 2003; Gornik y Creager, 2004).
El análogo endógeno de la L-arginina, la dimetilarginina asimétrica (ADMA), puede estar participando en estados fisiopatológicos.
Un número creciente de reportes indican que inhibidores de la SON producidos de forma endógena, particularmente la dimetilarginina asimétrica (ADMA), regulan la generación de ON en estados de enfermedad (Vallance y Leiper, 2004). La ADMA es un inhibidor competitivo endógeno de la SON. No obstante, la ADMA inhibe la producción vascular de ON solamente con concentraciones encontradas en condiciones patofisiológicas. Así, los niveles elevados de la ADMA pueden explicar la “paradoja de la L-arginina” (Böger, 2004). Las vías bioquímicas y fisiológicas relacionadas con la ADMA son bien entendidas. Las dimetilargininas son el resultado de la degradación de las proteínas metiladas; el grupo metilo es derivado hacia S- adenosilmetionina. Tanto la ADMA como su isómero, dimetilarginina simétrica, son eliminadas del cuerpo por excreción renal; en cambio, solamente la AMDA es metabolizada mediante degradación hidrolítica a citrulina y dimetilamina por la enzima dimetilarginina-dimetilaminohidrolasa (DDAH) (Tran et al., 2003). Dos enzimas DDAH metabolizan ADMA. Tran et al. (2003) han postulado que la actividad de la DDAH es un determinante clave de los niveles de la ADMA in vivo. La actividad de la DDAH y su expresión pueden, por lo tanto, contribuir a la patogénesis de la disfunción endotelial en varias enfermedades. Los niveles plasmáticos de la ADMA están incrementados en humanos con hipercolesterolemia, aterosclerosis, hipertensión, fallo renal crónico, y fallo cardiaco crónico. Los niveles aumentados de ADMA están asociados con la disminución de la síntesis de ON, valorada indirectamente por la deteriorada vasodilatación dependiente de endotelio. En varios estudios prospectivos y de sección transversal (cross-sectional), la ADMA
evolucionó como un marcador de riesgo cardiovascular. Con el conocimiento aumentado del papel de la ADMA en la patogénesis de la enfermedad cardiovascular, la ADMA se está tornando una meta para las intervenciones terapéuticas. Entre otras estrategias potenciales que están siendo evaluadas, la administración de L-arginina ha mostrado mejorar las funciones vasculares dependientes de endotelio en sujetos con altos niveles de ADMA. Finalmente, la ADMA ha ganado importancia clínica recientemente porque varios estudios han mostrado que la ADMA es un factor independiente de riego cardiovascular.
Justificación.
En el sistema vascular, la síntesis de óxido nítrico (ON) por la sintasa de ON endotelial (NOSe) es estimulada por el enlazamiento de agonistas endógenos (v.gr., bradicinina) a receptores de la membrana de las células del endotelio, así como por fuerzas de fricción del flujo, actuando también en el endotelio (Moncada et la., 1991;
Stauss y Persson, 2000). Las respuestas estimuladas por agonistas son mediadas por la asociación del complejo calcio/calmodulina (Ca2+/CaM) con la NOSe; en cambio, el estrés por fricción de flujo activa a la NOSe de manera dependiente e independiente del complejo Ca2+/CaM. En este último caso, pueden estar implicadas varias proteínas cinasas (Fleming y Busse, 2003). Interesantemente, se ha podido mostrar que la activación de la NOSe no esta confinada exclusivamente a los vasodiladores endoteliales o al estrés por fricción dependiente de flujo.
Particularmente, en el endotelio de las arteriolas de la bolsa de la mejilla del Hámster y de las pequeñas arterias mesentéricas aisladas de la rata, se ha evidenciado un aumento en la concentración de calcio libre intracelular ([Ca2+]i) después de la administración del vasoconstrictor agonista de receptores adrenérgicos α1, fenilefrina, que estimula solamente las células musculares lisas (Dora et al., 1997, 2000). Este aumento en la [Ca2+]I en las células endoteliales, fue primeramente atribuido a la difusión de Ca2+ desde el músculo liso a través de uniones comunicantes (Dora et al., 1997, 2000). Una consecuencia funcional del aumento indirecto de la [Ca2+]i en las células endoteliales fue el incremento en la liberación de ON (Dora et al., 1997; 2000). Resultados similares fueron obtenidos cuando la respuesta contráctil en las arterias fue producida por potasio en lugar de fenilefrina (Dora et al., 1977). Sumariamente, la activación de la respuesta contráctil en los
vasos mencionados produce indirectamente la liberación de ON del endotelio que, a su vez, de manera paracrina, modula la propia contracción.
En la aorta de rata, las respuestas contráctiles producidas por los agonistas adrenérgicos (y otros fármacos) aumentan cuando el endotelio es eliminado mecánicamente, y con la inhibición farmacológica de la síntesis de ON (Malta et al., 1986; Godfraind et al., 1985; Eglême et al., 1984; Carrier y White, 1985; Murakami et al., 1985; Bullock et al., 1986; Martin et al., 1986; Kaneko y Sunano, 1993; Matsuda et al., 1995; Vinet et al., 1991). Estos datos indican que el ON desempeña un papel importante en la depresión dependiente del endotelio de las respuestas vasoconstrictoras. A la fecha, hay discrepancia acerca de la participación relativa de la liberación basal y la inducida de ON en la inhibición de las respuestas aórticas provocadas por agonistas contráctiles. En el caso particular de los agonistas adrenérgicos, varios grupos de investigadores (Eglème et al., 1984; Carrier and White, 1985; Godfraind et al., 1985; Vanhoutte, 2001) han considerado una posible contribución directa de receptores adrenérgicos del endotelio en la estimulación de la síntesis de ON. No obstante, recientemente, varios trabajos han puesto en duda que la estimulación de los adrenoceptores este participando en la activación de la NOSe en la aorta y otras arterias de la rata (Iwanaga et al., 1998; Artigues-Varin et al., 2002; Gürdal et al., 2005; Castillo et al., 2006).
Con base en los antecedente mencionados, cabe hacer notar que la influencia del proceso contráctil per se en la síntesis y liberación de ON en la aorta de rata, no ha sido considerada. En el presente estudio, nosotros evaluamos si la contracción
isométrica puede aumentar la síntesis de ON endotelial en la aorta de rata de manera dependiente del complejo Ca2+/CaM.
Hipótesis.
En el presente trabajo dos hipótesis relacionadas entre sí fueron examinadas:
- la contracción isométrica puede aumentar la síntesis de ON endotelial en la aorta de rata.
- la contracción isométrica activa a la NOSe de manera dependiente del complejo Ca2+/calmodulina.
Objetivo General.
El objetivo general de este estudio fue examinar si la contracción isométrica induce la activación de la NOSe.
Objetivos particulares:
- se estudiaron las relaciones concentración respuesta para el L-NAME, el ODQ, y el D-NAME en los anillos aórticos con endotelio y sin endotelio, en condiciones de tono pasivo (tono basal).
- se estudiaron las relaciones concentración respuesta para el L-NAME, el ODQ, y el D-NAME en los anillos aórticos con endotelio y sin endotelio, con diferentes niveles de tono activo.
- En tejidos tratados con el fármaco inhibidor de la calmodulina, calmidazolio, se examinaron las relaciones concentración respuesta para el L-NAME en los anillos aórticos con endotelio precontraídos.
Material y Métodos.
Las ratas machos Wistar (250-300 g de peso; 10-12 semanas de edad) se mantuvieron con un ciclo de luz y oscuridad de 12 por 12 horas, en un cuarto aislado, con libre acceso a agua y comida en sus cajas. Los experimentos fueron conducidos bajo los protocolos aprobados por el Comité de Cuidados y Uso Animal de nuestra Institución.
Preparación de los tejidos y medidas de la tensión isométrica.
Los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico (50 mg.kg-1, i.p.), y las aortas torácicas fueron extirpadas cuidadosamente para prevenir daño endotelial, se colocaron en solución Krebs-Bicarbonato (SKB) y limpiaron de tejido conectivo.
Después, las aortas se cortaron transversalmente en segmentos anulares de 4 a 5 mm. de longitud. En otras preparaciones, el endotelio fue dañado mediante frotación
