INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATIA
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BIOMEDICINA MOLECULAR
ESTUDIO DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN EhYY1 DE Entamoeba histolytica
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRIA EN CIENCIAS EN LA
ESPECIALIDAD DE BIOMEDICINA MOLECULAR
P R E S E N T A
LILIA YVONNE TAPIA CHÁVEZ
MEXICO D.F. 2008
DIRECTORA DE TESIS
DRA. MARIA DEL CONSUELO GÓMEZ GARCÍA
COMITÉ TUTORIAL
DR. D. GUILLERMO PÉREZ ISHIWARA DRA. MARIA ESTHER RAMIREZ MORENO DR. CÉSAR AUGUSTO SANDINO REYES LÓPEZ
DR. ABSALOM ZAMORANO CARRILLO
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Biomedicina Molecular 1 de la Sección de Estudios de Postgrado e Investigación de la Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía bajo la dirección de la Dra. María del Consuelo Gómez García, Investigadora titular del Programa de Institucional de Biomedicina Molecular de la ENMH-IPN.
Este proyecto fue apoyado por el Programa Institucional para la Formación de Investigadores (PIFI), por el Programa de Becas Institucionales del IPN, por el programa de becas de maestría del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) registro 210310 y por los proyectos SIP-20070170, SIP-20080309 y CONACYT 39986- M.
DEDICATORIAS
A Dios
Por permitirme llegar hasta aquí iluminando mi camino y ponerme en el lugar y momento exacto.
A mi Mamá
Por darme la vida, por su ejemplo de lucha y esfuerzo día a día, por sus cuidados incansables y por estar siempre a mi lado apoyando todas mis ideas.
A mi sobrino Leo
Por entender la importancia de éste proyecto y por las horas de juego sacrificadas para la realización de ésta tesis.
A mi hermano Memo
Por su apoyo, fidelidad y compañía durante toda mi vida y a toda mi familia porque también son parte de éste proyecto.
A mi querido Betito
Por su cariño, comprensión, dedicación
y por volverse esa chispa de energía necesaria para la recta final de éste proyecto.
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Consuelo Gómez
Por esa gran oportunidad de integrarme a su equipo, por creer en mi, por ser un icono en mi formación académica, por su paciencia y dedicación. Aún recuerdo aquel día en que toqué a su puerta con la gran inquietud de conocer la Biomedicina Molecular, mil gracias!
Al Dr. Guillermo Pérez
Por su espíritu inquieto y entusiasmo contagioso de hacer ciencia y por estar siempre pendiente de la realización de éste trabajo.
A la Dra. Olivia Medel
Por ser maestra y amiga, por sus consejos y conocimientos transmitidos para la realización de este proyecto. Por las alegrías y enojos compartidos. Por su tolerancia y motivación que me hicieron continuar en los momentos difíciles. Gracias por tu Co- dirección.
A los Profesores del Comité Tutorial
Por su apoyo y tiempo dedicado para la revisión de éste trabajo, por sus amplias críticas y sugerencias para la realización de éste proyecto.
A todos mis profesores de la maestría Dra. Paula Figueroa
Dra. Doris Cerecedo Dra. Irene
Dra. Claudia Benitez Dra. Laurence Marchat Dr. Juan Salas
Por todos sus conocimientos transmitidos, por su paciencia para enseñar.
A mis compañeras de la maestría Lorena, Cinthia y Normande por su amistad y compañerismo. Gracias por su apoyo y palabras de motivación.
A mis compañeros del Laboratorio de Biomedicina Molecular 1, Oly, Esther, Elvira, Cesar, Julia, Jacky, Ricardo, Barbarita, Blanca, Maybe, Mariela, Mayra, Jose, Paty, gracias por los buenos tiempos compartidos.
A mi prima Vero por su apoyo y dedicación en la mejora de las imágenes de ésta tesis.
INDICE
LISTA DE ABREVIATURAS v
LISTA DE FIGURAS vi
LISTA DE TABLAS ix
RESUMEN
ABSTRACT
xi
xii
I. INTRODUCCION 1 1. AMIBIASIS 1
1.1 Patogenia y anatomía patológica 3
1.2 Manifestaciones clínicas 5
1.3 Tratamiento 6
1.4 Epidemiología 8
1.5 Ciclo de vida 11
II. ANTECEDENTES 13 2.1. Control transcripcional de E. histolytica 13
2.1.1. Secuencias consenso 14
2.1.2. Factores de transcripción 15 2.2. Actividad y estructura del promotor del gen EhPgp5 16
2.3. Proteínas de dedos de zinc 17
2.3.1. Estructura y clasificación 19
2.4. Factor transcripcional YY1 22
2.4.1. Estructura 22
2.4.2. Secuencias consenso de reconocimiento para el factor YY1 24 2.4.3. Secuencias aminoacídicas de interacción con el DNA del factor YY1 26 2.4.4. Modificaciones postraduccionales 26
2.4.5. Función 27
2.4.6. YY1 en diferentes organismos 30
2.5. Un factor homólogo a YY1 en E. histolytica 31 2.5.1 Análisis comparativo de las secuencias de aminoácidos de las
proteínas YY1 de diferentes organismos.
31
2.6 Identificación de una secuencia homóloga al factor YY1 en el genoma de E. histolytica.
33
2.7. Amplificación del gen EhYY1 del genoma de E. histolytica. 36
III. JUSTIFICACIÓN 37
IV. OBJETIVOS 38
4.1. OBJETIVO GENERAL 38
4.2. OBJETIVOS PARTICULARES 38
V.MATERIALESYMÉTODOS 39
5.1. Análisis “In silico” 39
5.1.1. Obtención de secuencias de proteínas de dedos de zinc y de factores
de transcripción YY1.
39
5.1.2. Identificación de dominios funcionales 39 5.1.3. Predicciones tridimensionales de estructuras terciarias 39 5.1.4. Búsqueda e identificación de los aminoácidos que interaccionan con el DNA en EhYY1
40
5.1.5. Análisis filogenético 40
5.2 Búsqueda de secuencias consenso de unión para el factor YY1 en regiones 5´ flanqueantes de otros genes amibianos.
41
5.2.1. Obtención de las secuencias de diversos genes de Entamoeba histolytica.
41 5.2.2. Obtención de las secuencias 5´-flanqueantes y búsqueda de
secuencias consenso de union para el factor YY1
42 5.3. Determinación de la expresión del gen EhYY1 42 5.3.1. Cultivo de trofozoítos de E. histolytica. 42 5.3.2. Obtención de RNA de los trofozoítos de E. histolytica. 42
5.3.3. Cuantificación del RNA 43
5.3.4. Geles desnaturalizantes de formaldehído al 1.2% 44 5.3.5. Tratamiento del RNA con DNAasa. 44
5.3.6. Ensayos de RT-PCR 44
5.4. Detección del factor YY1 46
5.4.1. Obtención de extractos nucleares de E. histolytica 46
5.4.2. Cuantificación de proteínas 47
5.4.3. Electroforesis de proteínas 47
5.4.4. Electroforesis de proteínas en geles con urea 48
5.4.5. Electrotransferencia 49
5.4.6. Western blot 49
VI. RESULTADOS 51
6.1. Análisis de las secuencias de proteínas de dedos de zinc y de factores de transcripción YY1 identificados en otros organismos.
51
6.2. Identificación de los dominios funcionales de la proteína EhYY1 58
6.3. Predicción de estructura terciaria 64
6.3.1. Evaluación de la calidad de los modelos 68 6.3.2. Análisis comparativo estructural de los modelos EhYY1 y HYY1 77 6.3.3. Análisis de los sitios de unión al DNA 78 6.4. Análisis filogenético del factor EhYY1 80 6.5. Búsqueda de secuencias consenso de unión para el factor YY1 en
regiones 5´ flanqueantes en diferentes genes amibianos
82
6.6. Expresión del gen EhYY1 87
6.7. Inmunodetección del factor EhYY1 96
6.7.1. Inmunodetección del factor YY1 en células HeLa 96 6.7.2. Expresión del factor EhYY1 en EN 97
VII.DISCUSIÓN 105
VIII.CONCLUSIONES 115
IX.PERSPECTIVAS 116
X.APENDICE 117
XI.REFERENCIAS 124
LISTA DE ABREVIATURAS BSA seroalbúmina
C2 clona 2 CA clona A
DNA ácido desoxirribonucléico
EhYY1 proteína YY1 de E. histolytica EN extractos nucleares
HSE elemento de respuesta a choque térmico HSTF factores de transcripción de choque térmico HYY1 proteína YY1 de humano
kDa kilodaltons
NMP-1 proteína de matriz nuclear-1 pb pares de bases
RNA ácido ribonucléico
TFYY1 factor de transcripción YY1 Ser aminoácido Serina
Thr aminoácido Treonina Tyr aminoácido Tirosina ZFP proteínas de dedos de zinc.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de vida de Entamoeba histolytica. 12 Figura 2. Representación esquemática del dominio de dedo de zinc 19 Figura 3. Representación esquemática de la proteína YY1 de humano. 24 Figura 4 Alineamientos de las secuencias de los aminoácidos correspondientes a los genes YY1 de H. sapiens, M. musculus, X. laevis y B. rerio
32
Figura 5. Secuencia de bases del gen EhYY1 33
Figura 6. Secuencia de aminoácidos correspondientes al gen EhYY1. 34 Figura 7. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos correspondientes a los
genes YY1 de diferentes organismos con la secuencia de E. histolytica.
35
Figura 8. Amplificación del gen EhYY1. 36
Figura 9. Alineamiento múltiple entre las diferentes proteínas de dedos de zinc y la proteína EhYY1.
54
Figura 10. Alineamiento múltiple entre las diferentes TFYY1 y la proteína EhYY1. 55 Figura 11. Esquema representativo de las posiciones de los dominios dedos de zinc de diferentes proteínas ZFP.
56
Figura 12. Esquema representativo de las posiciones de los dominios dedos de zinc de diferentes factores de transcripción YY1.
57
Figura 13. Representación esquemática de los dominios de la proteína YY1 de humano (HYY1) y YY1 de amiba (EhYY1).
60
Figura 14. Representación esquemática de la conformación atómica de la estructura
de los dominios de dedos de zinc denominado C2H2. 62
Figura 15. Esquema de representación de los dominios de dedos de zinc identificados en la secuencia aminoacídica de la proteína EhYY1.
63
Figura 16. Predicción de estructura terciaria de la proteína EhYY1. 65
Figura 17. Predicción de estructura terciaria de la proteína EhYY1. 67
Figura 18. Gráfico de Ramachandran. 69
Figura 19. Gráficos de Ramachandran de las proteínas EhYY1 y YY1 de humano 1Ubd.
71
Figura 20. Gráficos de Ramachandran. Se muestran los gráficos de los templados el panel EhYY1b y 2Gli.
73
Figura. 21. Superposición de los modelos EhYY1 y HYY1. 77 Figura 22. Árbol filogenético de las proteínas de dedos de zinc (ZFP) de diferentes organismos con los factores de transcripción YY1 de diferentes organismos y con EhYY1.
81
Figura 23. Integridad del RNA de los trofozoítos de la clona A. 89 Figura 24. Detección de la expresión del gen EhYY1 en la CA de E. histolytica
mediante ensayos RT-PCR.
90
Figura 25. Amplificación de un fragmento del gen de actina mediante RT-PCR (control positivo).
91
Figura 26. Detección de la expresión del gen EhYY1, en trofozoítos de la CA de E.
histolytica crecidos bajo un estrés térmico, mediante ensayos RT-PCR.
92
Figura 27. Amplificación del fragmento del gen de actina mediante RT-PCR
(controles positivos). 93
Figura 28. Densitometría óptica de la expresión del gen EhYY1 en trofozoítos
crecidos en condiciones basales y bajo estrés térmico. 93 Figura 29. Detección de la expresión del gen EhYY1, en trofozoítos de la CA de E.
histolytica crecidos bajo un estrés químico, mediante ensayos RT-PCR.
94
Figura 30. Expresión del gen de actina en los trofozoítos crecidos con 8µM de emetina (controles positivos).
95
Figura 31. Densitometría óptica de la expresión del gen EhYY1 en trofozoítos crecidos en condiciones basales y bajo estrés químico.
95
Figura 32. Detección de la proteína EhYY1 con el anticuerpo heterólogo HYY1. 96
Figura 33. Gel SDS-PAGE 98
Figura 34. Detección de la proteína EhYY1 con el anticuerpo heterólogo HYY1. 100 Figura 35. Detección de la proteína EhYY1 con el anticuerpo heterólogo HYY1. 101 Figura 36. Detección de la proteína C/EBP con el anticuerpo anti-C/EBP. 102 Figura 37. Detección de la proteína EhYY1 en gel de urea. 104
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Casos por entidad federativa de Enfermedades Infecciosas y Parasitarias del Aparato Digestivo hasta la semana epidemiológica 39 del 2008.
10
Tabla 2. Lista de secuencias promotoras de diferentes genes donde se muestra la secuencia consenso conservada para YY1.
25
Tabla 3. Lista de genes implicados en la virulencia de E. histolytica. 41 Tabla 4. Dominios identificados y su localización específica. 59 Tabla 5. Resultados de los gráficos de Ramachandran EhYY1 y 1Ubd. 71 Tabla 6. Resultados de los gráficos de Ramachandran EhYY1 y 2Gli 73 Tabla 7. Resultado del análisis del enlace omega de los modelos 74 Tabla 8. Resultado del análisis de la geometría de la cadena principal de los
modelos.
76
Tabla 9. Aminoácidos conservados de cada uno de los dedos de zinc de HYY1 y
EhYY1. 79
Tabla 10. Lista de genes amibianos implicados en patogenicidad y virulencia. 83 Tabla 11. Tabla de posiciones de las posibles secuencias consenso de unión para el YY1.
84
Tabla 12. Tabla comparativa de los TFYY1 de diferentes organismos. 106 .
RESUMEN
La amibiasis, causada por el parásito E. histolytica, es una enfermedad que presenta altos índices de morbimortalidad a nivel mundial. Por lo cual es importante conocer la organización genética y biología molecular de éste parásito para identificar los mecanismos que desarrolla para su adaptación y sobrevivencia. En E. histolytica se ha evidenciado la presencia de secuencias consenso de unión para el factor de transcripción YY1, así como la presencia de una proteína que pudiera reconocer dicha secuencia. Por lo que en el presente trabajo llevamos a cabo el estudio estructural y molecular del factor de transcripción YY1 de E. histolytica. Primeramente, mediante la utilización de herramientas bioinformáticas realizamos un análisis “In silico” de la proteína, identificando porcentajes de homología e identidad que van de 53-54% y de 33 a 34%
respectivamente, entre los YY1 identificados en diferentes organismos a lo largo de la escala evolutiva. Estructuralmente esta proteína presenta un dominio de unión al DNA caracterizado por tener cuatro dedos de zinc y sitios potenciales de fosforilación y de miristilación. Asimismo, mediante la utilización de los programas Swiss-Model y Wincoot realizamos una predicción de estructura terciaria y un estudio estereoquímico de la proteína respectivamente. Los resultados mostraron que la proteína EhYY1 es muy similar estructuralmente al factor YY1 de humano, mostrando un muy conservado dominio de unión al DNA. El análisis filogenético utilizando las secuencias de ZFP y TFYY1 sugiere que nuestra proteína probablemente se encuentra en una etapa de transición entre ambos grupos protéicos debido tal vez al grado evolutivo que tiene E.
histolytica. Por otro lado, utilizando el programa TESS, encontramos posibles secuencias consenso de unión al factor YY1 en regiones 5´-flanqueantes de genes amibianos implicados en patogenicidad y virulencia, sugiriendo que el factor EhYY1 pudiera estar regulando su expresión.
Ensayos de RT-PCR con RNA de trofozoítos sometidos a diferentes condiciones de crecimiento como lo fueron estrés por calor y por exposición a un fármaco, mostraron la expresión del gen EhYY1 en condiciones basales en trofozoítos crecidos sin ningún estrés.
Sin embargo, detectamos una disminución del 70% en la expresión de éste cuando los trofozoítos fueron sometidos a diferentes condiciones de estrés.
Finalmente, mediante ensayos de Western blot con EN de trofozoítos crecidos bajo diferentes tiempos de choque térmico y por exposición a un fármaco, observamos una sobreexpresión de la proteína ante las situaciones de estrés, la cual parece estar formando dímeros y trímeros.
En conjunto estos resultados dan evidencia de que E. histolytica presenta un factor EhYY1-like con una gran similitud a nivel estructural con el factor HYY1, por lo que éste pudiera estar realizando funciones similares a las presentadas por otros factores YY1 descritos en otros organismos.
ABSTRACT
Amebiasis, caused by the parasite E. histolytica, it’s a disease that displays high morbimortality levels around the world. Thus, it’s important to know the genetic organization and molecular biology to understand the mechanisms that develop for their adaptation and survival. It has been demonstrated the presence of consensus binding sites for YY1 transcription factor and a putative YY1 gene has been isolated from E.
histolytica. In order to know if the ameba presents a YY1-like factor, in this thesis we realize a structural and molecular study of E. histolytica YY1 transcription factor. First, using bioinformatics tools we performed an “In silico” analysis about our protein. We identified a 33-34 % and 53-54% at identity and homology, with the YY1 factors identified in different organisms throughout the evolutionary scale. Structurally, this protein present a DNA binding domain, characterized to have four zinc fingers and phosphorylation and myristoylation potential sites. Likewise, by use of Swiss-model and Wincoot programs, we realized a tertiary structural prediction and a stereochemic study of the protein respectively. Results showed that EhYY1 protein is structurally very similar to the human factor YY1, it showed a DNA binding domain very conserved. The phylogenetic analysis using the ZFP secuences and TFYY1 suggests that our protein probably is in a transition stage between both proteins group maybe due to the evolutionary degree of E. histolytica. Using TESS program, we found possible binding consensus secuences for YY1 transcription factor in the 5’-flanking regions of amebic genes involved in virulence and pathogenicity. Suggest that EhYY1 regulates it’s transcription.
RT-PCR assays performed with RNA of trophozoites grow thunder heat shock or drug stress, showed the expression in the EhYY1 gene in trophozoites growth with out stress.
Nevertheless, the EhYY1 gene expression diminished when the trophozoites were exposed to different stress conditions.
In contrast, by Western blot assays using EN of the trophozoites growth under heat shock and drug expositions, we observed an EhYY1 over expression. Interestingly, we observed two peptides of 64 and 44 kDa but when we use an urea reactive. We observed a only 20 kDa peptide. All this results gives evidence that E. histolytica present a YY1-like factor
with high similarity to the HYY1 factor at structural level, and it could be perform similar functions present in other YY1 factors described in other organisms
I. INTRODUCCIÓN
1. AMIBIASIS
La amibiasis, es una enfermedad ubicua que afecta a grandes poblaciones en el mundo, y es causada por el protozoario Entamoeba histolytica, el cual fue descubierto en 1875 por Fedor Aleksandrovich Lesch en un paciente con disentería, sin establecer la relación causa-efecto entre la amiba y los síntomas del paciente (Olaeta y col. 2004).
A principios del siglo pasado, predominó en la protozoología médica la teoría de la unicidad de las amibas, propugnada por la escuela anglosajona. Según esta teoría, todo paciente que presentara infección intestinal con E. histolytica, tendría un grado mayor o menor de lesión en la mucosa del intestino grueso, pero siempre las amibas vivirían a costa de ulcerar el epitelio del huésped. Las diferentes modalidades clínicas de la infección poco aparente en la mayoría de los casos y de evolución fatal en una pequeña proporción de ellos a menos de administrar terapia adecuada, serían tan sólo el resultado de las reacciones diversas del organismo humano frente a la infección amibiana. Así, la exitosa defensa del organismo, en el caso de los portadores, daría por resultado escasos síntomas, mientras que la ineficacia de dichas defensas en los pacientes con formas graves de amibiasis invasora, produciría complicaciones tales como la colitis fulminante y el absceso hepático. Otra posibilidad dentro de la teoría unicista es que la amiba sea potencialmente patógena en todos los portadores, pero su virulencia o su poder invasor permanecen latentes, en tanto que no actúan factores externos (como bacterias,
alteraciones de la función gastrointestinal, alimentación o clima), que disminuyen la resistencia del huésped y afectan la integridad de la pared intestinal (Martínez, 2002).
Esta concepción unicista fue sostenida, entre otros, por Clifford Dobell, uno de los protozoólogos más eminentes del siglo XX, quien mucho influyó para que la escuela norteamericana, representada por Faust, Craig y D'Antoni, adoptaran la misma teoría según la cual el poder de patogenicidad de E. histolytica es el mismo en amibas aisladas de cualquier región del mundo. Dobell pensaba que estos protozoarios viven en y de su huésped y fue quién logró por vez primera analizar el ciclo completo de este parásito.
Fue en 1925 cuando el parasitólogo francés Émile Brumpt emitió la hipótesis de la dualidad de las amibas. Basado en consideraciones epidemiológicas, Brumpt recalcó que la amiba de distribución cosmopolita es un parásito no patógeno al que llamó E. dispar, mientras que la localizada en ciertos países tropicales en los que la disentería y el absceso hepático son frecuentes, es otra amiba, a la que dio el nombre de E. dysenteriae. Insistió que no era posible precisar diferencias morfológicas entre ambas pero según Brumpt, los datos epidemiológicos eran incontestables y sólo podían fundamentarse en la existencia de dos especies diferentes de amibas, unas patógenas y otras no patógenas (Chac Bonilla, 2001).
En la actualidad se reconoce que Entamoeba contiene dos especies morfológicas idénticas: 1) E. dispar (cerca del 90%), que permanece en el colon como un comensal estable, es avirulenta y produce un estado de portador asintomático y 2) E. histolytica, la cual muestra grandes variables de virulencia que van desde un estado comensal en el colon, en donde no causa enfermedad y sin embargo es potencialmente invasiva, hasta
penetrar la pared intestinal, dando como resultado diarrea aguda o crónica y disentería.
(Goldsmith, 2005).
Tanto E. histolytica como E. dispar se presentan como dos formas en la luz intestinal y en las criptas de la mucosa del intestino delgado: quistes de aspecto idéntico (10-14 μm) y trofozoítos móviles (12-50 μm). Los quistes en heces, agua y suelo pueden durar de 8 días hasta un mes a temperatura de 10°C y pueden resistir el efecto del cloro a concentraciones empleadas para purificar el agua, aunque pueden ser destruidos con yodo a concentraciones de 200 ppm, con ácido acético o temperaturas superiores a 68°C
(Corachan Cuyas, 2004).
1.1 Patogenia y anatomía patológica.
Una vez ingeridos, los quistes superan la barrera ácida del estómago. Tras experimentar una última división nuclear, la pared quística se disuelve en el intestino delgado, y los trofozoítos quedan en libertad. Son arrastrados entonces al intestino grueso, en cuya luz viven como comensales alimentándose de bacterias y detritus (Corachan Cuyas, 2004).
Por estudios in vitro realizados con las líneas celulares epiteliales CaCo2 y HT-29 se determinó que las amibas patógenas se unen mediante lectinas al epitelio y presentan una capacidad citotóxica muy elevada. Mediante microscopia electrónica se logró detectar (a los 10 min de la adherencia) daño celular. Esta capacidad adherente podría ser contrarestada fisiológicamente por las proteasas pancreáticas y sales biliares en combinación con las glucosidasas bacterianas (Kumate, 2001).
La cisteína-proteinasa representa la fracción más activa de las proteinasas amibianas, y un grupo grande de genes codifican para estas proteínas, entre los que se encuentran el
ACP 1 (presente sólo en los zimodemas patógenos) y los ACP 2 y 3, que se hallan
presentes en todas las especies de E. histolytica. Así se forman microúlceras que luego crecen hasta constituir las úlceras amebianas, que representan la lesión anatomopatológica fundamental de la amibiasis intestinal. La característica de estas úlceras es que la necrosis suele detenerse al alcanzar la muscular de la mucosa y luego se extiende lateralmente, por lo que la lesión adquiere la forma característica de cuello estrecho y base ancha (Kumate, 2001).
Microscópicamente llama la atención la necrosis, con escasa respuesta inflamatoria linfocitaria y polimorfonuclear, excepto cuando existe una sobreinfección secundaria. Las amibas, que se encuentran sobre todo en los bordes de las úlceras, se pueden observar con hematoxilina-eosina, pero destacan como corpúsculos rojos brillantes con la técnica de PAS (Corachan Cuyas, 2004).
La úlcera amebiana profundiza y atraviesa las capas muscular y serosa de la pared intestinal, originando una perforación y peritonitis consecutiva. La mayoría de las úlceras curan sin cicatriz, pero en algunas se forma abundante tejido de granulación escleroso capaz de producir estenosis, que alternan con protuberancias de características inflamatorias. Ello constituye los denominados amebomas, cuyas localizaciones preferentes son la sigmoidea y la cecal, pudiendo ser múltiples (Corachan Cuyas, 2004).
Estos parásitos, a través de la vena porta, pueden alcanzar el hígado y en ocasiones originan la formación de un absceso hepático, que es la manifestación más frecuente e importante de la amibiasis extraintestinal. Este absceso, a diferencia de los bacterianos, suele ser único, de tamaño considerable, y se presenta más a menudo en el lóbulo derecho del hígado que en el izquierdo, debido a la distribución anatómica de la sangre portal.
Histológicamente este absceso se halla bien delimitado por una estrecha corona de tejido hepático con infiltración linfocítica y polimorfonuclear (Corachan Cuyas, 2004).
También por vía hemática, las amibas pueden, rara vez, alcanzar otros órganos y originar abscesos pulmonares, cerebrales y esplénicos (Corachan Cuyas, 2004).
1.2 Manifestaciones clínicas.
La amibiasis se clasifica en enfermedad intestinal y extraintestinal; la intestinal se puede correlacionar con lesiones histopatológicas específicas subdividiendose en: diarreica- disentérica, colitis fulminante, apendicitis y ameboma (Goldsmith, 2005).
De acuerdo a los signos y síntomas que se presenten la amibiasis intestinal puede clasificarse en:
a) Colitis de grado leve a moderado (colitis no disentérica). Se presentan algunas evacuaciones al día, semiformadas con moco sin sangre, además de cólicos abdominales, flatulencia, astenia y adinamia.
b) Colitis grave o disentérica. Incrementan la cantidad de evacuaciones, líquidas con presencia de estrías hemáticas. El paciente presenta fiebre, tenesmo, vómito e hipersensibilidad abdominal.
c) Lesiones ulcerosas localizadas en el colon.
d) Lesiones granulomatosas o amebomas. Lesión pseudotumoral, caracterizada por necrosis como resultado de la producción excesiva de tejido de granulación en respuesta a la infección amibiana. Predomina en el adulto.
La amibiasis extraintestinal se clasifica de acuerdo al órgano dañado, siendo mas afectado el hígado causando absceso hepático (Goldsmith, 2005).
1.3 Tratamiento
Los fármacos disponibles pueden clasificarse en las tres categorías siguientes: a) amebicidas luminales; b) amebicidas tisulares, y c) amebicidas hepáticos (Corachan Cuyas, 2004).
Amebicidas luminales. Actúan sobre los trofozoítos de la luz intestinal, pero son ineficaces sobre las amibas hísticas. Entre ellos figuran: el furoato de diloxamida, eficaz y bien tolerado, a dosis de 500 mg, 3 veces al día durante 10 días; la paromomicina en dosis de 500 mg, 3 veces al día, durante 7 días, y las tetraciclinas (1-2 g/día durante 5 días), cuya acción amebicida directa es mínima, pero se utiliza sobre todo como bactericida por su acción sobre las infecciones sobreañadidas.
Amebicidas tisulares. Destruyen las formas tisulares. Entre ellos se incluyen la dihidroemetina es un derivado sintético de la emetina, pero menos tóxico que ésta gracias a que se elimina con mayor rapidez. Se utiliza a dosis de 1,25 mg/kg/día (máximo 90 mg) durante 10 días.
El metronidazol es el amebicida más utilizado. Se administra a dosis de 750 mg, 3 veces al día, durante 7-10 días según la gravedad del cuadro. En principio no debería emplearse en el embarazo, aunque se ha utilizado sin problemas aparentes en el tercer trimestre.
El tinidazol es un derivado sintético del nitroimidazol, mejor tolerado que el metronidazol y más eficaz, con pautas de tratamiento más cortas. Se utiliza a dosis diarias de 2 g durante 2-6 días según la gravedad.
Amebicidas hepáticos. Son la cloroquina, el metronidazol y la dihidroemetina. En cuanto a la cloroquina, su acción antiprotozoaria y su eliminación por vía biliar la hacen recomendable en esta situación.
A fin de evitar recaídas y la diseminación de la enfermedad, se recomienda la administración de un amebicida luminal una vez concluida la pauta con un amebicida tisular. Sólo de esta forma se eliminarán con seguridad los quistes infectantes. El secnidazol, que se administra en 2 dosis de 1 g separadas por 4 h de intervalo (Corachan Cuyas, 2004).
La quinfamida, derivado del dicloro-acetilquinolinol, es activo sobre los trofozoítos de E.
histolytica, localizados en la luz y pared intestinal. Por eso resulta un fármaco adecuado
no solamente para el tratamiento de la colitis amibiana, sino también para tratar al sujeto portador sano que se constituye primordialmente como la principal fuente de emisión de quistes. Se utiliza exclusivamente por la vía oral y se presenta en tabletas de 100 mg y en suspención con 50 mg por cada 5 ml. En ambos casos se administra por un solo día, a la dosis de 300 mg en adultos y, en los niños a razón de 3-4 mg/kg/día (Romero et al., 1997).
1.4. Epidemiología
Las infecciones están presentes en todo el mundo, pero son más frecuentes y graves en áreas subtropicales y tropicales bajo condiciones de hacinamiento, así como sanidad y nutrición deficientes. De 500 millones de personas que están infectadas en todo el mundo con Entamoeba, la mayoría está infectada con E. dispar y 10% (50 millones) con E.
histolytica; una forma invasiva, lo que constituye una mortalidad de 100 000 personas
por año (Goldsmith, 2005; WHO, http://www.who.int/).
Aunque E. histolytica puede infectar el tubo digestivo de varios animales, como perros, gatos, ratas y monos, el principal huésped y reservorio es el ser humano. La distribución de E. histolytica es mundial; pese a esta difusión cosmopolita, existen áreas de “alto riesgo”, como México, región oeste de Sudamérica, oeste de África, Sudáfrica, Egipto, sudeste asiático, la India y Nepal (Corachán Cuyas, 2004).
Según el Boletín Estadístico de Epidemiología de México durante el año 2008 se han acumulado 416, 155 casos nuevos de ésta enfermedad, hasta la semana epidemiológica 39 del 2008, las entidades federativas más susceptibles a ésta enfermedad y que ocupan los primeros lugares en frecuencia son: Estado de México con 38,866 casos reportados, Oaxaca con 35,191 casos y Chiapas con 34,934 casos, siendo el género femenino el más afectado (www.ssa.gob.mx) (Tabla 1).
Como los trofozoítos no son capaces de enquistarse fuera del intestino y mueren en cuanto lo abandonan, el contagio no suele producirse a partir de pacientes con enfermedad activa, sino de los portadores sanos que eliminan los quistes con las heces y se constituyen en el principal problema epidemiológico. La transmisión se produce de forma fecal-oral, ya sea por vía directa de persona a persona o bien indirecta a través de
alimentos o aguas. Otros factores de riesgo importantes son la promiscuidad sexual, y los viajes a zonas endémicas (Corachán Cuyas, 2004).
Amibiasis Intestinal
2008 2007 Acum.
ENTIDAD FEDERATIVA
M F Acum
Aguascalientes 1685 2048 3466
Baja California 858 1109 2353
Baja California Sur 1450 1654 2576
Campeche 3180 3585 6480
Coahuila 2347 2774 5651
Colima 1250 1459 2925
Chiapas 15027 19907 39607
Chihuahua 2336 2950 5769
Distrito Federal 7451 9677 19692
Durango 2040 2410 5091
Guanajuato 3948 4919 10750
Guerrero 12799 17047 31043
Hidalgo 8109 10712 20706
Jalisco 7149 7797 18270
México 17005 21861 42419
Michoacán 3720 4606 8660
Morelos 3602 5011 10721
Nayarit 3660 4181 8862
Nuevo León 2910 3491 7641
Oaxaca 14820 20371 36590
Puebla 10457 13712 27311
Querétaro 2283 2899 6572
Quintana Roo 2693 3220 6369
San Luis Potosí 4217 5757 8499
Sinaloa 6075 7994 16913
Sonora 1520 1833 3621
Tabasco 11487 12642 29923
Tamaulipas 3080 4012 8301
Tlaxcala 2262 2969 5510
Veracruz 13497 17735 31708
Yucatán 7165 8950 17269
Zacatecas 3028 3753 7243
Total 183110 233045 458511
Tabla 1. Casos por entidad federativa de Enfermedades Infecciosas y Parasitarias del Aparato Digestivo hasta la semana epidemiológica 39 del 2008
1.5 Ciclo de vida
E. histolytica existe en dos formas: el trofozoíto, o forma patógena invasiva, y el quiste, o
forma infectante para el hombre.
1. La forma vegetativa grande o tisular, denominada trofozoíto, vive en la luz intestinal o
adherida a la pared del colon. Las bacterias y las células epiteliales descamadas, además de los hidratos de carbono procedentes de los alimentos, le proporcionan el alimento necesario para su metabolismo y confieren al medio intestinal cierto grado de anaerobiosis, un potencial redox algo disminuído y un pH moderadamente bajo (6 - 6.5) que son las condiciones óptimas para la subsistencia del parásito. Al llegar a la región ileocecal, el trofozoíto comienza su multiplicación por fisión binaria. Cada uno de ellos mide 15-60 mm de diámetro y está dotado de notable movilidad. Se traslada mediante la rápida emisión y contracción sucesiva de seudópodos. En su centro se advierte un núcleo de 4-8 mm de diámetro, provisto de un nucléolo esferoide y que difícilmente se logra reconocer en fresco. Cuando E. histolytica se vuelve patógena, se nutre a expensas de las células de la pared intestinal que fagocita, por lo que es más fácil advertir en su ectoplasma hematíes, restos de leucocitos, fragmentos de células fagocitadas que justifican la denominación de histolytica (Figura 1).
2. A medida que avanzan por el colon (ambiente más seco y oxigenado) algunos de los
trofozoítos se redondean, pierden sus inclusiones, y su interior contiene una gran vacuola de glucógeno para nutrirlos, la cual se tiñe de color pardo con la solución de Lugol, constituyendo los denominados prequistes. En la región rectosigmoide o incluso en el exterior, el prequiste forma una pared celular rígida y deja de ser uninucleado para convertirse en cuadrinucleado, es decir, se transforma en un quiste ya maduro o infectante
debido a la acción de las secreciones intestinales que digieren la pared del quiste, quedando en libertad ocho formas amibianas o trofozoítos dispuestos a continuar el ciclo.
Los trofozoítos que son expulsados en la materia fecal mueren con rapidez pero los quistes pueden permanecer viables y por tanto ser infectantes por periodos variables de tiempo bajo ciertas condiciones ambientales (Goldsmith, 2005).
Figura 1. Ciclo de vida de Entamoeba histolytica.
Tomado de http://www.entornomedico.org/salud/saludyenfermedades/alfa- omega/amibiasis-intestinal-contenido.html
II. ANTECEDENTES
2.1 CONTROL TRANSCRIPCIONAL DE E. histolytica.
La transcripción de E. histolytica es un evento génico poco estudiado. Se sabe que sus genes se transcriben de una manera monocistrónica por una RNA polimerasa II insensible a altas concentraciones de α-amanitina (Lioutas y Tannich, 1995) sugiriendo la presencia de una RNA polimerasa con diferentes propiedades a las de los eucariontes superiores.
En general, los genes estructurales no están interrumpidos; sin embargo existen reportes de genes con un intrón y se ha demostrado la presencia de un gen que codifica para el RNA pequeño nuclear U6, un componente de la maquinaria de corte y empalme del RNA (splicing), sugiriendo que E. histolytica tiene un “spliceosoma” funcional (Davis et al., 2007)
Las regiones codificantes se localizan muy cercanas entre si, lo que sugiere que las secuencias intergénicas son relativamente cortas de 200 a 2000 pb. Se considera que en éstas secuencias se encuentran todos los elementos cis requeridos para llevar a cabo el inicio y termino de la transcripción de los genes adyacentes.
Actualmente, en el Proyecto Genoma de E. histolytica se ha realizado la caracterización inicial de las secuencias encontrándose que un 40% de las secuencias leídas son elementos repetitivos. Asimismo en un 15% de los genes codificantes de proteínas se identificaron intrones; esto resultó ser más alto de lo esperado, porque solo se han identificado algunos genes de E. histolytica con intrones. Graham Clark y Mehereen Zaki han descubierto que el 13% de las 49,000 secuencias examinadas contienen genes de RNA de transferencia, la mayoría de ellos se encuentran arreglados en tandem. Otros hallazgos han sido la identificación de una familia de genes de más de 100 proteínas,
conteniendo el motivo CXXC, el cual incluye la subunidad intermedia de la lectina Gal/GalNac de E. histolytica (Mann, 2002).
2.1.1. Secuencias consenso.
La transcripción generalmente inicia en las secuencias consenso ATTCA ó ATCA, la cual se ha identificado en la mayoría de los casos a no más de 20 bases del codón de inicio de la traducción (ATG). En la mayoría de los genes aproximadamente 30 pb río arriba del sitio de inicio de la transcripción se localiza la secuencia consenso TATTTAAA, que se sugiere que es la caja TATA de los genes amibianos. En el gen que codifica para la enzima enolasa existe una secuencia con mayor similitud a la caja TATA de organismos superiores (TATAAG), que es capaz de unir factores nucleares y que compite con la secuencia consenso TATTTAAA por la unión de estos factores, lo que sugiere que ambas secuencias pueden funcionar como caja TATA en E. histolytica (Hernández y col, 1997).
En la actualidad solo ha sido estudiada la actividad funcional de los promotores de los genes de actina, hg15, EhRabB, EhPgp1 y EhPgp5 (Ortiz y col. 2002; Purdy y col. 1996;
Romero y col.2007; Perez y col. 1998; Marchat y col. 2002). En estos estudios se encontró que el promotor mínimo de dichos genes se localiza alrededor de las primeras 300 pb río arriba del sitio de inicio de la transcripción (Pérez y col, 1998).
Purdy y col. (1996) realizaron estudios de eliminación y reemplazamiento de regiones del promotor del gen hg15 encontrando el elemento GAAC denominado CE2 entre las bases –30 a –14 pb, y un elemento iniciador inusual denominado CE1 entre la posición –21 y – 1 pb con respecto al ATG. Así mismo identificaron las secuencias URE1, URE2, URE3, URE4 y URE5 involucradas en el control transcripcional de dicho gen.
En 1998 Gómez y col. y Pérez y col. estudiaron el control transcripcional de los genes de resistencia a múltiples fármacos de E. histolytica (EhPgp), donde se demostró la relación entre la resistencia a drogas y la regulación transcripcional de los genes EhPgp1 y EhPgp5.
El promotor del gen EhPgp1, el cual se transcribe constitutivamente, carece de una caja TATA y de las secuencias consenso de inicio de la transcripción descritas para éste parásito. Así mismo, este gen inicia su transcripción en diferentes sitios. Las evidencias concuerdan con las características de los promotores de los genes cuya expresión es constitutiva. En el promotor del gen EhPgp1 se identificaron secuencias consenso similares a los sitios de unión para los factores C/EBP, GATA-1, HOX, OCT entre otras.
Encontrándose que las secuencias involucradas en la activación transcripcional de este gen son las C/EBP y una secuencia repetida R9 (Marchat y col., 2002; Ramírez y col., 2005).
2.1.2. Factores de transcripción
En la actualidad solo han sido descritos seis factores de transcripción en E. histolytica el primero y segundo factores descubiertos corresponden a las proteínas EhEBP1 y EhEBP2 de 28 y 18 kDa respectivamente. Estos presentan regiones homólogas con los motivos de reconocimiento de RNA (RRM) (Shaenman y col., 1998). El tercero es el factor C/EBP, el cual presenta un dominio bZIP altamente conservado (Orozco, 2000). El cuarto es el factor URE3-BP de 22.6 kDa que presenta dos motivos de uniòn a calcio EF-hand. El quinto es la proteína de unión a la caja TATA (TBP). Este gen muestra un 55% de similitud con el gen de la TBP de humano (Luna y col., 1999) y la proteína es capaz de interaccionar específicamente con la secuencia consenso de la caja TATA descrita para
éste parásito (De Dios Bravo, 2004). Y mas recientemente se identificó a una familia de tres factores de transcripción de choque térmico (HSTF) (Gómez y col., 2007).
2.2 ACTIVIDAD Y ESTRUCTURA DEL PROMOTOR DEL GEN EhPgp5.
El gen EhPgp5 es uno de los miembros de la familia de genes de resistencia a múltiples fármacos de E. histolytica. La transcripción de éste gen es en parte, responsable de la resistencia a altas concentraciones de emetina observada en éste parásito. Este gen presenta un patrón de expresión inducible, ya que cuando los trofozoítos de la clona C2 son crecidos en concentraciones crecientes de emetina en el medio, la cantidad de su transcrito también se ve incrementada (Descoteaux y col., 1995).
Este promotor posee una caja TATA (TATTTAAA) en la posición –31 pb y un sitio único de inicio de la transcripción (ATTCG), localizado tres nucleótidos río arriba del ATG. La presencia de estos dos elementos conservados, probablemente le permite tener una regulación mas precisa en su transcripción como ha sido descrito para otros genes (Pérez y col., 1998).
El promotor del gen EhPgp5 se encuentra en las primeras -235 pb y diversas secuencias descritas en eucariontes superiores como consenso para la unión de factores de transcripción fueron identificadas en éste, aunque su función en la actividad transcripcional aún se desconoce.
Recientemente Nieto y col., 2005 mostraron que en la región de –111 a –170 pb del promotor del gen EhPgp5 se encuentran los elementos de respuesta a la emetina (ERE).
En esta región se identificaron secuencias consenso de unión para los factores CdxA, YY1 y un elemento de respuesta a choque térmico (HSE). En donde al analizar la funcionalidad de estas secuencias se encontró que la responsable de activar la expresión
del gen EhPgp5 es el elemento HSE. No obstante, cuando se eliminó y mutó la secuencia YY1 se observaron cambios en la actividad transcripcional del promotor del gen EhPgp5, ya que se disminuyó la expresión del gen reportero CAT. Por lo que probablemente la secuencia YY1 este involucrada en la activación del gen EhPgp5 aunque no con la misma intensidad que la secuencia HSE (Nieto, 2007 Tesis).
La proteína que potencialmente podría reconocer a ésta secuencia es el factor transcripcional YY1, el cual ha sido blanco de muchos investigadores por sus múltiples funciones en procesos biológicos y se han encontrado diversas características estructurales en éste factor. Una de ellas es la presencia de dominios de dedos de zinc que se encuentran presentes en un amplio grupo de proteínas denominadas ZFP (del inglés zinc fingers proteins).
2.3 PROTEINAS DE DEDOS DE ZINC
La concentración intracelular de iones metálicos está estrictamente controlada debido a que juegan un papel crucial en la mayoría de los procesos bioquímicos. En particular, el ión zinc (Zn2+) es el segundo ión metálico más abundante en organismos vivientes después del hierro. Este ión no sufre reacciones de óxido-reducción gracias a que su orbital δ se encuentra completo, lo que lo hace sumamente estable, dándole dos funciones esenciales posibles en la naturaleza: catalítica y estructural. El ión zinc es el componente principal de uno de los motivos más comúnmente hallados en las proteínas: los dedos de zinc o motivos zinc fingers.
Estos motivos fueron caracterizados por primera vez hace más de dos décadas en el factor transcripcional TFIIIA de Xenopus laevis (Miller et al., 1985) y su descubrimiento revolucionó la biología celular estructural.
Actualmente se sabe que los dominios de dedos de zinc participan en diversos procesos biológicos que involucran interacciones específicas entre dominios estructurales presentes en distintas macromoléculas y son uno de los motivos estructurales más encontrados en proteínas humanas ya que cerca de 3,000 genes humanos codifican para proteínas que contienen motivos zinc fingers (García y col. 2006).
En un primer momento, las proteínas zinc fingers fueron observadas como posibles factores de transcripción, ya que son capaces de interactuar de forma específica con el DNA, por lo cual son llamadas también proteínas de unión al DNA (Klug et al., 1995).
Posteriormente fue posible evidenciar como ciertas estructuras cristalográficas de proteínas regulatorias ZFP se unían a sus secuencias DNA blanco; sin embargo ya hace algunos años se sabe que las proteínas zinc fingers llevan acabo varias funciones en los distintos procesos celulares como traducción, metabolismo, señalización, uniéndose también a RNA u otras proteínas que presentan estos motivos, además de funcionar algunos como factores de transcripción (Klug et al., 2005).
2.3.1 Estructura y Clasificación
Los dominios de dedos de zinc forman estructuras únicas muy sólidas, sostenidas en la mayoría de los casos por residuos aminoácidicos de cisteínas (C) e histidinas (H). Cada dominio consiste en aproximadamente entre 30 a 60 residuos, constituidos todos por plegamientos de dos hojas β antiparalelas y una α-hélice (ββα), sostenidos y ensamblados por el átomo de zinc. Las láminas β se encuentran en la región N-terminal, mientras que la α-hélice se encuentra en el extremo C-terminal del dominio. En medio de las cisteínas e histidinas se encuentran los residuos que forman el dedo que une al DNA (Klug et al.
1995) (Figura 2).
Figura 2. Representación esquemática del dominio de dedo de zinc. Tomado de
pps00.cryst.bbk.ac.uk/course/section10/dna.html
Cisteinas Histidinas
Existen una gran variedad de diferentes dominios de dedos de zinc, algunos de los más importantes son:
C2H2: Se encuentran en su mayoría en proteínas de mamíferos. Este dominio contiene aproximadamente entre 25 – 30 residuos. La posición y distribución en que se encuentren los residuos en el dominio es importante para que se de un plegamiento correcto y estable del motivo zinc de la proteína. Algunas de las proteínas caracterizadas que presentan este motivo son: el factor de transcripción TFIIIA de X. laevis, el factor de transcripción humano asociado a la RNA polimerasa I, Sp1 y el factor de transcripción murino, Zif268, entre otros (García C. 2006).
C2HC: Este dominio se presenta principalmente en la proteína de la nucleocápside NCp7 de los retrovirus. Esta proteína está involucrada en funciones esenciales para la replicación y el empaquetamiento del RNA viral.
C4 (lazo o cinta): Las proteínas que contienen este motivo son en su mayoría enzimas involucradas en la replicación y transcripción del DNA, como las primasas de los fagos T4 y T7 que presentan motivos C4 reconociendo específicamente tres pares de nucleótidos (5´GTC 3´) de una hebra simple de DNA.
C4 (familia GATA): La familia GATA incluye factores de transcripción que regulan la expresión de genes en diversos tejidos durante el desarrollo celular. El factor GATA-1 está involucrado en la regulación del desarrollo de los glóbulos rojos y presenta dos dedos de zinc del tipo C4.
C6: La proteína más estudiada que presenta este motivo es la GAL4 de las levaduras ya que activa la transcripción de genes involucrados en la utilización de la galactosa y la melibiosa, y es un monómero en ausencia de DNA, sin embargo se une a una secuencia de 17 pares de bases del DNA en forma de dímero.
C8: Este motivo esta presente en varios receptores intracelulares protéicos como el de estrógeno, de glucocorticoides y del ácido retinóico. La unión al DNA requiere la dimerización del motivo C8.
RING fingers (C3HC4 – C3H2C3): Este dominio tiene la particularidad de reunir dos subtipos denominados C3HC4 (RING-HC) y C3H2C3 (RING-H2). En este grupo se encuentran proteínas de diversos orígenes como Rad5 involucrada en la reparación del DNA de levaduras, la proteína humana RAG1, esencial para el rearreglo de los genes de las inmunoglobulinas, el péptido del gen 63 del virus herpes equino tipo 1, la proteína Z de los arenavirus y la proteína humana de la leucemia promielocítica PML (Joazeiro et al., 2000).
H2C2 finger: Este dominio se encuentra altamente conservado en las integrasas de los retrovirus. Estos dominios al unirse a su molécula blanco, cambian la conformación de la proteína.
Dominio LIM: constituye un motivo zinc fingers “doble” y se le encuentra en una gran variedad de proteínas como cinasas y proteínas involucradas en la organización del citoesqueleto, desarrollo de órganos y linaje celular de diversos organismos.
Muchas de las proteínas que presentan motivos zinc fingers en sus secuencias pertenecen a diversos microorganimos peligrosos para la salud humana, patógenos para los cuales no existe todavía ningún tipo de tratamiento efectivo. Estos microorganismos dependen absolutamente de estas proteínas zinc fingers para llevar a cabo su proliferación. Una mutación en los motivos de dedos de zinc lleva a la desestabilización de la estructura protéica que lo contiene, por lo que la conservación de los mismos es esencial para la sobrevivencia del agente patógeno (Garcia, 2006).
2.4 FACTOR TRANSCRIPCIONAL YY1.
2.4.1 Estructura
El Ying Yang 1 (YY1) es un factor de transcripción con una gran versatilidad funcional, ya que como su nombre lo indica es tanto activador como represor transcripcional de diversos genes. El factor YY1 de mamífero es una proteína altamente conservada de 414 aminoácidos con un peso molecular de 44 kDa (Bushmeyer et al., 1995). Sin embargo, el YY1 migra en geles SDS-PAGE a un peso molecular de 65-68 kDa probablemente debido a la estructura de la proteína. En Xenopus la secuencia de aminoácidos de YY1 es muy similar a la de los mamíferos, aunque es más pequeña, ya que consta de 373 aminoácidos, no obstante conserva los cuatro dedos de zinc (Pisaneshi et al., 1994).
A lo largo de la secuencia protéica del factor YY1 de mamífero se han identificado diversos sitios funcionales. Dos regiones acídicas del residuo 1 al 50 y del 81 al 153, las cuales se han identificado como un sitio de activación de éste factor.
En los residuos 70 al 80 se ha identificado un cluster de histidinas y hacia el residuo 154- 198 se ha encontrado un alto porcentaje de glicinas y alaninas (aproximadamente el 55%) el cual es un dominio importante de transactivación (Austen et al. 1996) (Figura 3).
Con mayor relevancia en todos los factores YY1 caracterizados hasta el momento se han identificado cuatro dedos de zinc del tipo C2H2 localizados hacia el extremo carboxilo terminal. Como por ejemplo en el factor YY1 de humano, estos dedos están localizados hacia los residuos 298 al 397, los cuales corresponden a la secuencia específica del dominio de unión al DNA (Hariharan et al., 1991). Ha sido aislado y caracterizado en diversos organismos, como son: en H. sapiens, B. taurus, M. musculus, R. norvegicus, X.
laevis, D. rerio e I. punctatus.
Austen y col. en 1996, realizaron un estudio el cual consistió en la generación de un gran panel de proteínas mutantes YY1 para definir con precisión los dominios y regiones de este factor. Encontrando que el factor YY1 está conformado por cuatro dominios de dedos de zinc, en donde el segundo y tercero son importantes para la localización nuclear de YY1 en células RK13 (riñón de conejo). Ya que en éstos se reveló la presencia de un número de aminoácidos básicos que funcionan en la localización nuclear. También presenta una región espaciadora entre los dedos de zinc de la cual aún no se ha identificado su función. La eliminación en el cluster de histidinas o en la región rica en glicina y alanina no afecta la actividad de transactivación comparada con el YY1 silvestre. Las proteínas con eliminaciones en cualquiera de las dos regiones acídicas o en la región espaciadora entre la región rica en glicina y alanina, y el dominio de unión al DNA muestra una reducción del 50% de la actividad transcripcional. También se encontró que todas las proteínas mutantes con eliminaciones en la región carboxi terminal inhiben la unión al DNA, de ahí la relevancia de los dedos de zinc YY1 contiene un dominio de transactivación bipartita compuesto de las dos regiones acídicas en la porción amino terminal (Austen et al. 1996).
Las proteínas YY1 de mamífero y de rana son altamente similares con solo un aminoácido diferente que se encuentra en los últimos 186 residuos, sin presentar ninguna diferencia en su función (Pisaneshi et al. 1994).
Figura 3. Representación esquemática de la proteína YY1 de humano.
2.4.2. Secuencias consenso de reconocimiento para el factor YY1
Hyde-DeRuyscher y col. (1995) identificaron una secuencia consenso de reconocimiento para el factor YY1, la cual contiene la siguiente composición de bases:
5´-(C/g/a) (G/t) (C/t/a) CATN (T/a) (T/g/c)-3´.
Interesantemente las secuencias CCAT y ACAT presentan una mayor afinidad por la secuencia protéica de YY1.
Al hacer un estudio de la búsqueda de las secuencias consenso para el factor YY1 en la base de datos de los promotores eucarióticos, se encontraron 46 sitios potenciales para YY1 en los promotores de 624 genes de vertebrados y 37 sitios en promotores de 154 genes virales, siendo la secuencia más frecuente CCATNTT (Shrivastava et al. 1994).
NH3 COO_
Esto sugiere que YY1 puede estar involucrado en la regulación de la expresión de diversos genes en varios organismos (Hyde-DeRuyscher et al. 1995).
Tabla 2. Lista de secuencias promotoras de diferentes genes donde se muestra con letras mayúsculas la secuencia consenso conservada para YY1. Tomado de Hyde- DeRuyscher et al. 1995).
2.4.3 Secuencias aminoacídicas de interacción con el DNA del factor YY1
Houbaviy y col. en 1996 realizaron un análisis de las interacciones entre el factor YY1 y el DNA identificando los residuos específicos que interaccionan con el DNA en cada uno de los dedos de zinc de la proteína HYY1. En el primer dedo de zinc, que se localiza hacia del residuo 298 al 320, se identificaron ocho aminoácidos que interaccionan con el DNA que son Lys305, Arg308, Asp309, Arg314, Lys315, His316, His318 y Arg323. En el segundo dedo de zinc que comprende del residuo 327 al 352, se identificaron nueve residuos que son Val335, Glu336, Ser337, Ser338, Lys339, Arg342, His343, Val346 y Lys351. En el tercer dedo de zinc, localizado hacia los residuos 355 al 382, se encontraron nueve residuos que interaccionan con el DNA que son Lys362, Ser365, Leu366, Asp367, Phe368, Asn369, Arg371, His373 e Ile376. Finalmente, hacia los residuos 385 al 412, donde se localiza el cuarto dedo de zinc, se han identificado únicamente cuatro residuos que interaccionan con ácidos nucléicos, que son Gln396, Thr398, Asn399 y Thr405. Interesantemente se identificó un alto grado de flexibilidad en el reconocimiento del factor YY1 por su secuencia consenso, ya que existe una gran heterogeneidad en los sitios consenso de unión para éste factor (Hyde-DeRuysher y col.
1995). No obstante este factor interactúa con una secuencia compuesta de 12 pb de manera muy específica.
En éste mismo estudio se demostró que estas interacciones se deben a puentes de hidrógeno y fuerzas de Van der Walls principalmente.
2.4.4. Modificaciones postraduccionales
Una de las características de éste factor es que presenta varios sitios potenciales de fosforilación, dos de éstos identificados dentro de los dominios de dedos de zinc. Un estudio realizado con fosfatasa, sugirió que la defosforilación del factor puede tener
efectos diferenciales en la habilidad del YY1 para unirse a los diferentes sitios de reconocimiento, ya que al defosforilarse la proteína ya no se une a los ácidos nucléicos y por lo tanto pierde su función (Shi et al., 1997).
En otro estudio, se demostró que YY1 sin condiciones de estrés no es capaz de unirse a su secuencia consenso en el promotor. Motivo por el cual se ha creído que las condiciones de estrés pueden causar modificaciones de YY1 en una forma que determine la eficiencia de este factor para interaccionar con el promotor (Li et al., 1996).
2.4.5. Función
YY1 es una proteína de expresión ubicua que ha sido mostrada su participación en la regulación de una gran variedad de genes y en un número de tipos celulares. Esta presencia ubicua siguiere su importancia en el adecuado funcionamiento y estabilidad celular. Es un factor de transcripción multifuncional implicado tanto en la regulación negativa como positiva de los genes, particularmente en la iniciación de la transcripción, se ha demostrado la interacción de este factor con el coactivador p300 relevante en la determinación de la función de YY1 como activador o represor (Bushmeyer et al. 1995).
Por otro lado, YY1 es una proteína que puede estimular la transcripción basal in vitro en combinación con TFIIB y la RNA polimerasa II, aún en ausencia de la proteína de unión a caja TATA (TBP) (Usheva et al. 1994).
Otro aspecto de la función de YY1 ha sido descubierto demostrando su unión a la proteína de matriz nuclear NMP-1 (Guo et al. 1995). Este dato implica que YY1 puede también estar involucrada en aspectos de la organización de la cromatina.
YY1 también participa en la expresión de un número de genes regulatorios del crecimiento y desarrollo en modelos de cultivos celulares de tejidos primarios, en la
las interacciones YY1-promotores entre otros, tanto activando como reprimiendo a éstos genes (Galvagni et al. 1998).
El factor YY1 también juega papeles importantes en los procesos biológicos de mamíferos. Donohoe y col. en 1999 examinaron el genotipo de embrión de ratón en diferentes etapas gestacionales, mostrando que una mutación en el alelo de YY1 provocó la muerte de la mayoría de los embriones y los sobrevivientes mostraron defectos como retardo en el crecimiento y daño neurológico, sugiriendo la importancia funcional de la actividad del factor YY1 durante las diferentes etapas embriológicas. Resultados similares se han identificado en el desarrollo embriológico de X. laevis (Morgan et al., 2004).
Kurisaki y col. en 2003 identificaron que YY1 interactúa con las algunas de las principales proteínas de señalización intracelular como el factor de crecimiento transformante (TGF-β) y la proteína morfogénica de hueso (BMP), ambas responsables del adecuado crecimiento y diferenciación celular.
Se ha demostrado un aumento en la estimulación de la poli (ADP-ribosa) polimerasa -1 (PARP-1) en células HeLa transfectadas para sobreexpresar YY1 después de la exposición con metil-N-nitro-N´-nitrosoguanidina, un agente que causa arresto en la fase G1 o G2 del ciclo celular. PARP-1 modula la reparación de DNA por la vía de excisión de bases. La sobreexpresión de YY1 en células HeLa estimula la catálisis de PARP-1, resultando en la aceleración de la reparación del DNA (Oei y Shi, 2001), lo que indica que el factor YY1 es importante en los casos de daño al DNA.
Algunas de las investigaciones realizadas con el factor transcripcional YY1 han evidenciado que es un componente del complejo ribonucleoprotéico (mRNP) en los ovocitos de Xenopus, indicando una importante función en el almacenamiento o metabolismo de los transcritos maternos (Ficzycz y Ovsenek, 2002).
Por otro lado también se ha demostrado que participa en la generación de péptidos beta- amiloides, precursores de los principales componentes de las placas seniles en pacientes con enfermedad de Alzheimer, ya que interactúa con su secuencia consenso localizada en el promotor del gen BACE1 estimulando su actividad y favoreciendo la expresión de dicho gen (Nowak et al., 2006).
Un estudio demostró la asociación entre YY1 y la proteína de adenovirus E1A, una proteína que activa al promotor P5 de adenovirus (Chang et al., 1989). La presencia de E1A induce la activación transcripcional mediada por YY1, en ausencia de la proteína E1A el papel de YY1 es revertido convirtiéndolo en un represor transcripcional ya que no se lleva acabo la transcripción (Shi et al., 1997), sugiriendo la posibilidad de que el factor YY1 sufre diversos cambios conformacionales al momento de interaccionar con otras proteínas determinando así sus múltiples funciones.
Wandong y col. en 2000 demostraron que YY1 puede inhibir la replicación in vitro del Virus del Papiloma Humano tipo 6 (HPV-6) debido a que en el promotor del gen E1 esta presente la secuencia consenso de unión para este factor, la cual reconoce provocando la represión de la expresión del gen E1. Otro estudio realizado en 2004 por Sui y col., señaló que YY1 es un regulador negativo de p53, ya que la disminución de éste resulta en la acumulación de p53 debido a una reducción de la ubiquitinación in vivo de p53.
Inversamente, la sobreexpresión de YY1 estimula la degradación y ubiquitinación de p53.
También demostraron de manera significativa que la proteína recombinante YY1 es suficiente para inducir poliubiquitinación de p53 in vitro mediada por Hdm2, ya que identificaron las interacciones físicas directas de YY1 con Hdm2 y p53 y mostraron que la base para la regulación por YY1 en la ubiquitinación de p53 es su capacidad de facilitar la interacción entre Hdm2 y p53 sugiriendo así un posible papel de este factor en
La supuesta participación del factor YY1 en la tumorogenésis se debe a las conocidas interacciones con diferentes proteínas del ciclo celular, estás interacciones han sido reportadas por Cicatiello y col., en 2004 quienes reportaron que la activación del promotor del gen de la ciclina D1, en respuesta al estímulo estrogénico en cáncer de mama en humano, esta determinada por el factor YY1.
En conclusión YY1 es un factor de transcripción que participa en diferentes mecanismos vitales de una célula activando y/o reprimiendo diferentes genes.
2.4.6. YY1 en otros organismos.
En la actualidad son pocos los factores de transcripción YY1 que han sido identificados en organismos representativos en toda la escala evolutiva. La proteína YY1 mas pequeña corresponde a la identificada en I. punctatus (Q4JHY9), la cual es una proteína de 160 aminoácidos y tiene un peso molecular de 18.06 kDa. X. laevis fue el primer organismo en donde se identificó al factor YY1 (Q4JHY9), denominado también TFIIIA, el cual regula la expresión génica de la subunidad S5 del RNA ribosomal (Miller et al.1985).
Esta proteína tiene una longitud de 390 aminoácidos y tiene un peso molecular de 43.2 kDa.
En D. rerio se identificó a éste factor con una longitud de 357 aminoácidos con un peso molecular de 39.8 kDa (Q7T1S3) (Chen, 2001), al cual se le atribuyen funciones importantes para el adecuado desarrollo embriológico de éste organismo.
La proteína YY1 de R. norvegicus tiene una longitud de 411 aminoácidos con un peso molecular de 44.4 kDa, de la cual se ha descrito un papel importante en la regulación de la expresión genica en genes de diabetes en ratón.
