FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
TESIS DOCTORAL
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Ana Margarita Pozo Méndez
Madrid, 2015
© Ana Margarita Pozo Méndez, 1983
Aislamiento de antígenos cancerosos específicos de la membrana plasmática de la célula cancerosa
Departamento de Bioquímica
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' 5 3 0 9 8 6 2 5 8 3 *
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
A IS L A M I E N T O DE ANTIGENOS CA N C E R O S O S E S F E C I F I C O S DE LA M E MBRANA PLASM A T I C A DE LA C E L U LA CANCEROSA
D epartamento de Bioqufmica Facultad de Cien c i a s Quimicas
Universidad Complutense de Madrid 1983
HiBLiOTE r,!
^ Ana Margarita Pozo Mandez
Edita e Imprime la Editorial de la Universidad Complutense de Madrid. Servlelo de Reprografla Novlclado, 3 Madrid-8
Madrid, 1983 Xerox 9200 XB iSO
Depdslto Legal: M -3 9 6 8 7 -I9 8 3
A IS LA M IF .N T O PE AN TIG GN QS CANCEROSOS I-S P E C I F I C O S . P E LA
MEMBRANA PLA SM A TICA DE LA C E LULA CANCEROSA
TcA-ci doc^onaZ dO U glda pofi eJt Pa. V&ZdKo VaJUiadan.z& S& nchtz, Pac^caoa dc lnvej>tXgacA.6n deZ
CoMAejo SupeJiZoA. de. hivzA ttgacioncs CXentZ^Lc/xh, PxAectoA deX. VepoAtamento d& RioquXnicca Onao£j6gZca, ceJitAo coofidinado deZ C . S . I . C . ,
iM tC tu to UacZomZ de OncoZogZk, Uadfiid 3
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS
SECCION DE qUIMICAS AfiO 1981
AGRADECIMIENTO
E s t e t r a b a j o d e i n v e s t i g a c i ô n h a s i d o r e a l i z a d o en e l D e p a r ta - m ento de B io q u îm ica O n c o lô g ic a , d e l I n s t i t u t e N a c io n a l de O n c o lo g îa (M i- n i s t e r i o d e l T r a b a jo , S a n id a d y S e g u rid a d S o c i a l ) , c e n t r e c o o rd in a d o d e l C o n sejo S u p e r i o r d e I n v e s t i g a c i o n e s C i e n t î f i c a s . A t r a v é s de una ayuda p r iv a d a a l j e f e d e l D e p arta m e n to s e r e c i b e u na im p o r ta n te s u b v e n c io n de l a F u n d a c io n C i e n t î f i c a de l a A s o c ia c io n E sp a n o la C o n tra e l C a n c e r, que ayuda a f i n a n c i a r to d a s l a s i n v e s t i g a c i o n e s . Dey p u es l a s g r a c i a s a d ic h a Funda
c io n p o r h a b e r c o n tr i b u i d o a que e s t e t r a b a j o s e l l e v a r a a c a b o .
N i a g r a d e c im ie n to ta m b iê n a l C o n se jo S u p e r io r de I n v e s t i g a c i o n e s C i e n t î f i c a s , que me h a h ech o b e n e f i c i a r i a de u na b e c a p r e d o c t o r a l , e s tim u - la n d o a s î m i d e d ic a c iô n a l a i n v e s t i g a c i ô n .
A g ra d ez c o mucho a l D r. Y s id r o V a l la d a r e s S a n c h e z , P r o f e s o r de I n v e s t i g a c i ô n d e l C o n se jo S u p e r i o r de I n v e s t i g a c i o n e s C i e n t î f i c a s y j e f e d e l D e p a rta m e n to de B io q u îm ic a O n c o lô g ic a , a s î como a l D r. Ysm ael A lv a re z R o d rîg u e z , j e f e a d ju n t o d e l m ism o, su ayuda m o ra l y m a t e r i a l d u r a n te l a d i - r e c c i ô n c i e n t î f i c a de e s t e t r a b a j o .
G r a c ia s a l P r o f e s o r A. H a r t în M u n ic io , j e f e d e l D ep arta m e n to de B io q u îm ica de l a F a c u lt a d de C i e n c i a s d e l a U n iv e r s id a d C o m p lu ten se de Ma
d r i d , p o r c o n s i d e r a r d ig n a d e p r e s e n t a c i ô n a e s t a m em oria p a r a o p t a r a l g ra d o d e d o c t o r .
A g rad ezco asim ism o l a i n e s ti m a b l e ayuda de l a D ra . J o s e f a A lv a re z Noves en e l c u r s o d e l o s e x p e rim e n to s y a R ocîo A lv a re z p o r l a t r a n s c r i p - c iô n d e l m a n u s c r ito y l a l a b o r f o t o g r a f i c a .
E sto y ta tr b ié n c a rin o sa m e n te . r e c o n o c id a p o r s u ayuda y g r a t a com- p a n îa a m is com paneros y am igos A l i c i a Ruano, Ma. D o lo re s B r io n e s , A u ro ra Munoz, E le n a A l g a r r a , C o n cep cio n R e la n o , J o s e V ic e n te C a r c ia y A u r e lia n o A lv a r e z .
PROLOGO
E l D e p arta m e n to de B io q u îm ica O n c o lô g ic a t i e n e p la n tc a d o un a rab i- c io s o p ro g ram s d e in m u n o te r a p ia a c t i v a e s p e c îC ic a c o r r e g i d a d e l c a n c e r , f i - n a n c ia d o p o r l a A d m in is tr a c iô n I n s t i t u c i o n a l d e l a S a n id a d N a c io n a l (AISNA), d e l M i n i s t e r i o d e l T r a b a jo , S a n id a d y S e g u rid a d S o c i a l , e l C ortsejo S u p e r io r de I n v e s t i g a c i o n e s C i e n t î f i c a s , l a F u n d a c iô n C i e n t î f i c a d e l a A s o c ia c iô n E s p a n o la C o n tra e l C a n ce r y l a C om isiôn A s e s o ra d e I n v e s t i g a c i ô n C i e n t i f î c a y T ê c n ic a , d e l M i n i s t e r i o d e E d u ca ciô n y C i e n c i a .
E l p r o y e c to d e s a r r o l l a d o en e s t e t r a b a j o form a p a r t e de d ic h o p ro g ra m s .
A c tu a lm e n te s e a p l i c a l a in m u n o te r a p ia o l a m o d u la c iô n i n e s p c c î f i - c a s d e l c a n c e r , p o r e je m p lo , con BCG, s u r e s i d u o de e x t r a c c i ô n m e ta n ô lic a o MER, e l C o ry n e b a c te riu m parvim i, e l le v a m is o l y , en p le n o d e s a r r o l l o , e l i n t e r f e r o n .
En f a s e e x p e r im e n ta l s e h a l l a l a in m u n o te r a p ia e s p e c î f i c a q u e , d e m om ento, s e s i r v e d e c e l u l a s c a n c e r o s a s e n t e r a s d e s v i t a l i z a d a s p o r i r r a d i a - c iô n y au m en tad a s u in m u n o g e n ic id a d p o r t r a t a m i e n t o con i o d o a c e t a t o . Tam
b i ê n s e ban em p lead o e x t r a c t o s a n t i g ê n i c o s b r u t o s o c o m p le jo s a n t i g ê n i c o s . P c r o , l a v e r d a d , e s que no s e han a i s l a d o y c a r a c t e r i z a d o l o s a n - t î g e n o s o n c o a s o c ia d o s y o n c o e s p e c îf i c o s y p o r l o t a n t o , no e x i s t e t o d a v îa u n a in m u n o te r a p ia a c t i v a e s p e c î f i c a g e n u in a , d ig n a d e t a l nom bre.
En e l t e r r e n o d e l a i s l a m i e n t o y c a r a c t e r i z a c i ô n de l o s a n tî g e n o s o n c o a s o c ia d o s y o n c o e s p e c î f i c o s , e s t e t r a b a j o p r e te n d e c o n s e g u ir l a p rim e r a p a r t e : o b t e n e r a n tî g e n o s c a n c e r o s o s d e t i p o s e s p e c î f i c o y a s o c ia d o .
comb in a n -u n a m c to d o lo g îa b i o l ô g i c a y b io q u îm ic a , l a c u a l in c .lu y e una t ê c n i ca de in m u n iz a c iô n s e l e c t i v a en c o n e jo s q u im era in m u n o lo g ica p a r a l a o b te n - c io n de a n ti c u e r p o s a n ti c a n c e r o s o s e s p e c î f i c o s , l a p u r i f i c a c i ô n de l a s i n - m u n o g lo b u lin a s e s p e c i f i c a s m e d ia n te r e c i c l o a s c e n d a n te en colum na c ro m a to - g r â f i c a de c u e n ta s de 10-40 ym de d ia m è tr e , de d e x tra n o e n t r e l a z a d o con e p i - c l o r o h i d r i n a y l a c r o m a to g r a f îa de a fx n id a d en a g a r o s a a c t i v a d a con brom ure de c ia n ô g e n o e n t r e in m u n o g lo b u lin a s a n t i c a n c e r o s a s e s p e c i f i c a s y a n tîg e n o s de membrana p la s m â tic a de c e l u l a s c a n c e r o s a s s o l u b i l i z a d a s p o r f ra g m e n ta c iô n u l t r a s o n i c s .
Hemos a lc a n z a d o e s t e p rim e r o b j e t i v o , s i b i e n , p a r a s e r s i n c e r o s , no e s t a c o m p le te . Con l a m e to d o lo g îa u t i l i z a d a co n seg u irao s o b te n e r un com- p l e j o de a n tî g e n o s o n c o a s o c ia d o s y o n c o e s p e c îf i c o s en peq u en a c a n t i d a d . Es n e c e s a r i o a h o ra p e n s a r en una t ê c n i c a p r c p a r a t i v a p a r a p o d e r i n d i v i d u a l i z a r y c a r a c t e r i z a r cad a a n tî g e n o .
INDICE
P a g in a s
INTRODUCCION 1
MATERIAL Y METODOS 15
I . CULTIVO DE TEJIDOS ESTACIONARIOS EN MONOCAPA 15
A. C a r a c t e r î s t i c a s de l a s c e l u l a s u t i l i z a d a s . 15
A . l . C e lu l a s HeLa. 15
A .2 . C e lu la s EREA. 17
B. T ê c n ic a de s u b c u l t i v o . 17
C. S o lu c io n e s y m ed io s de c u l t i v o , 19
I I . CULTIVO DE CELULAS EN SUSPENSION 22
A. C a r a c t e r î s t i c a s de l a s c e l u l a s u t i l i z a d a s . 22
A . l . C ê lu la s CAE. 22
B. T ê c n ic a de s u b c u l t i v o . 22
I I I . CULTIVO DE CELULAS "IN VIVO" 24
A. C a r a c t e r î s t i c a s de l a s c ê l u l a s u t i l i z a d a s . 24
A . l . C ê lu la s CAEL. 24
B. T ê c n ic a de t r a s p l a n t e . 24
IV . AISLAMIENTO DE LA MEMBRANA PLASMATICA 24
A. T ê c n ic a u t i l i z a d a . 24
A . l . P a r a c ê l u l a s c u l t i v a d a s " i n v i t r o " . 25 A .2 . P a r a c ê l u l a s c u l t i v a d a s " i n v i v o " . 28
A .3. P a ra t e j i d o s . 28
B. D is o lu c io n e s em p lead as ' 30
V. SOLUBILIZACION DE LA MEMBRANA PLASMATICA 32
A. Tê c n i c a u t i l i z a d a . 33
B. D is o lu c io n e s e m p le a d a s . 34
V I. INMUNIZACION DE CONEJOS , 34
A. T ê c n ic a de in m u n iz a c iô n s i m p le . 35
B. T ê c n ic a de in m u n iza c iô n en c o n e jo s q u im e ra
in m u n o lo g ic a . 36
V I I . OBTEN.CION DE INMUNOSUEROS 36
A. T ê c n ic a . 36
V I I I . AISLAMIENTO DE INMUNOGLOBULINAS POR CROMATOGRAFIA
DE FILTRACION EN RECICLO ASCENDENTE 37
A. T ê c n ic a . 40
B. D is o lu c io n e s e m p le a d a s . 42
IX. a isl a m ien to DE ANTIGENOS POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD 43
A. T ê c n ic a . - 44
A . l . P r e p a r a c iô n d e l le c h o . 44
A .2 . O f e r ta de l a m ez cla de a n t î g e n o s . 45
B. D is o lu c io n e s e m p le a d a s . 48
X. valoracion de PROTEINAS 50
A. T ê c n ic a de a n â l i s i s . 50
B. D is o lu c io n e s e m p le a d a s . 51
X I. INMUNODIFUSION 53
A. T ê c n ic a . 53
B. D is o lu c io n e s e m p le a d a s . 55
X I I . INMIINOELECTRO PORES IS ' 56
A. T ê c n ic a . 56
B. D is o lu c io n e s e m p le a d a s . 57
X I I I . MICROMETODO PARA TITULACION DE CITOTOXICIDAD 58
A. T ê c n ic a de t i t u l a c i o n de c i t o t o x i c i d a d de l o s
a n t i s u e r o s . 58
B. T ê c n ic a d e t i t u l a c i o n de i n h i b i c i o n de c i t o t o x i c i d a d de l o s a n t i s u e r o s p re v ia m e n te a b s o r b id o s con a n t i -
g e n o s . 59
XIV. PRUEBA DEL ANILLO 59
A. T ê c n i c a . 60
XV. CURVA DE PRECIPITACION CUANTITATIVA 60
A. T ê c n ic a . 60
XVI. INMUNOGENICIDAD 61
A. T ê c n ic a . " 61
X V II. INMUNOPEROXIDASAS - 62
A. T ê c n ic a de c o n .ju g a c io n . 62
B. T ê c n ic a p a r a l a o b s e r v a c io n a l m ic r o s c o p ic o p t i c o . 63 C. T ê c n ic a p a r a l a o b s e r v a c io n a l m ic r o s c o p ic e l e c t r o -
n i c o . 64
D. D is o lu c io n e s e m p le a d a s . 65
X V III. MEDIDA DE RADIACTIVIDAD 67
A. T ê c n ic a . 67
B. D i s o l u c io n e s e m p le a d a s . 68
XIX. METODOS CITOLOGICOS 68 A. T ê c n ic a de f i j a c i o n y t i n c i o n de c u l t i v o s c e l u l a r e s . 68 B. T ê c n ic a p a r a r e c u e n to de c ê l u l a s t o t a l e s . 69 C. T ê c n ic a p a r a r e c u e n to de v i a b i l i d a d c e l u l a r . 69 D. D i s o l u c io n e s , f i j a d o r e s y c o l o r a n t e s e m p le a d o s. 70
RESULTADOS 72
I . OBTENCION DE LA MEMBRANA PLASMATICA 72
A. E n say o s p r e v i o s . 72
A . l . H o m o g e n eiza c iô n . 72
A .2 . E s tu d io d e l g r a d ie n te de s a c a r o s a . 85
B. R e s u l ta d o s . , 99
B . l . C ê lu la s HeLa. 99
B .2 . C ê lu la s CAEL. 99
B .3 . C ê lu la s CAE. 100
B .4 . T e jid o s n o rm ale's. 101
I I . SOLUBILIZACION DE MEMBRANAS 101
A. E s t u d io de a g r e g a c i o n . 101
A . l . F a c to r e s que i n f lu y e n en l a a g r e g a c io n y
e v o lu c iô n en e l tie m p o . 102
A .2. D is o lu c io n e s e m p le a d a s . 114
I I I . INMUNOSUEROS OBTENIDOS 118
A. Inm u n o su ero a n t i - p e r o x i d a s a s . 118
A . l . P ru e b a d e l a n i l l o . 118
A .4 . P u n to de e q u i v a l e n c i a . 119
A .5 . V a le n c ia a n t i g e n i c a . 120
B. In m u n o su e ro s a n ti- m e m b r a n a s . 120
B . l . P ru e b a d e l a n i l l o . 122
\ B .2 . M icrom etodo p a r a t i t u l a c i o n de c i t o t o x i c i d a d 123
a . In m u n o su ero a n ti-m e m b ra n a s d e c e l u l a s
n o r m a le s . 123
b . Inm u n o su ero a n ti-m e m b ra n a de c e l u l a s
CAEL. 123
c . In m u n o su ero a n ti-m em b ran a de c e l u l a s
CAEL o b te n id o de c o n e jo s q u im e r iz a d o s . 124 c . l . V a io r a c io n c u a l i t a t i v a de l o s
in m iin o su ero s o b te n id o s p o r d i f e - r e n t e s p r o c e d i m i e n to s . 127 C . 2 . E s p e c i f i c i d a d de l o s a n t i c u e r
pos o b te n id o s p o r in m u n iz a c iô n s e l e c t i v a en c o n e jo s q u im e ra
in m u n o lô g ic a . 131
IV . AISLAMIENTO DE INMUNOGLOBULINAS ^ 134
A. E n say o s p r e v i o s . 134
B. R e s u l t a d o s . 144
V. OBTENCION DE ANTIGENOS POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD 150
A. P r u e b a s p r e v i a s . 150
A . l . E s tu d io de l a d e s n a t u r a l i z a c i ô n d e l l ig a n d o . 150 A .2. F i j a c i o n de p r o t e î n a s a S e p h a ro sa 4B a c t i v a
da con CNBr. 151
B. E x p e rim e n to s c o n t r o l . 151
B . l . S is te m a p e r o x id a s a s / a n t i c u e r p o s a n t i p e r o -
x i d a s a s . 151
C. O b te n c io n de a n tîg e n o s o n c o e s p e c îf i c o s y o n c o a s o
c i a d o s . 172
C . l . C ro m a to g ra fîa de a f i n i d a d en m icro co lu m n as
con a n tîg e n o s r a d i a c t i v o s . 172
C .2 . S is te m a membranas de C A E L /an.ticuerpos a n t i -
a n tîg e n o s n o rm a le s . 186
C .3 . S is te m a membranas de C A E L /an ticu erp o s a n t i -
a n tîg e n o s c a n c e r o s o s . 188
V I. PRUEBAS DE INMUNOGENICIDAD 191
DISCUSION 216
I . INTRODUCCION Y ESQUEMA GENERAL DEL PROYECTO 216
I I . OBTENCION DE FRAGMENTOS DE MEMBRANA PLASMATICA
SOLUBILIZADA 219
I I I . OBTENCION DE ANTICUERPOS ANTICANCEROSOS ESPECÎFICOS 221
IV . OBTENCION DE ANTIGENOS CANCEROSOS ESPECIFICOS POR
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD 223
CONCLUSIONES 234
BIBLIOGRAFIA 236
Uno de l o s o b j e t i v o s p r i o r i t a r i o s e n l a i n v e s t i g a c i ô n o n c o lô g ic a h a s i do l a b u s q u e d a de d i f e r e n c i a s en l a c o m p o s ic iô n de l a s c ê l u l a s c a n c e r o s a s y n o rm a le s c a p a c e s de i n d u c i r una r e s p u e s t a in m u n o lô g ic a .
D u ra n te mucho tiem p o s e d e b a t i ô l a e x i s t e n c i a de e s t a s d i f e r e n c i a s , p e - ro e l d e s a r r o l l o de l a s t ë c n i c a s in m u n o lô g ic a s e x p é r im e n ta le s pen n t i ô d e - m o s tr a r l a p r e s e n c i a e n l a s c ê l u l a s c a n c e r o s a s de a n tîg e n o s no d é t e c t a b l e s en l a s c ê l u l a s n o rm a le s de l o s t e j i d o s h o m ô lo g o s.
P . E h r li c h (1 9 0 6 ) demost r ô que l o s r a to n e s a l o s que s e t r a s p l a n t a b a un tum or e r a n c a p a c e s de r e d i a z a r un seg u n d o t r a s p l a n t e d e l mismo tu m o r. L.
G ro ss (1 9 4 3 ) u t i l i z ô c ep a s î n s i t a s de r a to n e s (a n im a le s h o m o z ig ô tic o s r é s u l t a n t e s d e l c ru c e c o n s a n g u în e o d u r a n te 25 g e n eV a c io n e s) lo g r a n d o u na m ayor B u p e r v iv e n c ia e n l o s g ru p o s de a n im a le s que h a b îa n s id o p re v ia m e n te in m u n i- za d o s con l a s mismas c ê l u l a s t u m o r a le s . G ro ss p ro v o c ô sa rco m a s con m c t i l c o - l a n t r e n o y l o s t r a s p l a n t ô a r a to n e s s i n g ê n ic o s m e d ia n te in o c u l a c i ô n i n t r a - d ê rm ic a . A lre d e d o r d e l 20 % de l o s a n im a le s d e s a r r o l l a r o n d u r a n te c i e r t o tie m p o tu m o re s in tr a d ê r m i c o s q u e lu e g o r e g r e s a r o n ; e s t o s r a to n e s e r a n r e s i s t e n t e s a p o s t e r i o r e s t r a s p l a n t e s de l a misma l î n e a tu m o r a l.
D iez anos mas t a r d e , E . J . F o le y (19 5 3 ) o b tu v o l o s mismos r e s u l t a d o s e s t u d ia n d o l a c a p a c id a d de r e c h a z o de i s o t r a s p l a n t e s de tu m o res i n d u c id o s p o r m e t i l c o l a n t r e n o en a n im a le s en l o s q u e s e h a b îa h e ch o r e g r e s a r c l m is
mo tu m o r i n t e r rum piendo l a c i r c u l a c i ô n p o r l i g a d u r a v a s c u l a r . Los r a to n e s e m p le ad o s p o r . F o le y e r a n en dogâm icos p e ro no i s o a n t i g ê n i c o s y s u s r e s u l t a d o s f u e ro n c r i t i c a d o s dada l a p o s i b l e i n f l u e n c i a de f a c t o r e s h e t e r o z i g ô t i -
En 1957 e s t o s e x p e rim e n to s fu e ro n a m p lia d o s y c o n firm a d o s p o r R .T . P re h n y J.M . Main , q u ie n e s e lim in a r o n e l p ro b le m s de l o s f a c t o r e s h e t e r o z i - g o t ic o s r e s i d u a l e s u t i l i z a n d o a n im a le s a d e c u a d o s , d e ja n d o a s î t o ta lm e n te d e m o stra d a l a e x i s t e n c i a de a n tîg e n o s e s p e c î f i c o s en l a s c ê l u l a s c a n c e r o s a s .
En lo s tu m o res in d u c id o s p o r c a n c e r îg e n o s q u îm ic o s , l o s a n tîg e n o s e n - c o n tr a d o s s e co m p o rtab an como e s p e c î f i c o s de cad a tum or e i n d i v i d u a l e s , e s to e s , dos tu m o res in d u c id o s en e l mismo a n im a l p o r e l mismo c a n c e r îg e n o d e m o s tra b an p r o p ie d a d e s a n t i g ê n i c a s d i f e r e n t e s y p a r t i c u l a r e s , no e x i s t i e n - do r e a c c io n e s c r u z a d a s e n t r e l o s a n tîg e n o s de ambos tu m o re s.
En l o s tu m o res p ro d u c id o s p o r v i r u s o n côgenos s e pudo d e m o s tr a r p o s t e - r io r m e n te q u e , ademas de a n tî g e n o s e s p e c î f i c o s de c ad a tu m o r, s e pueden de- t e c t a r a n tîg e n o s comunes muy p o t e n t e s en to d o s l o s tu m o res p ro d u c id o s p o r un mismo v i r u s , s e a en d i s t i n t o s a n im a le s de l a misma r a z a , en d i s t i n t a s r a z a s de una misma e s p e c i e , e i n c l u s o en tu m o re s in d u c id o s p o r e l mismo v i r u s en a n im a le s de d i s t i n t a s e s p e c l e s . L as c ê l u l a s tu m o r a le s que p r e s e n t a n l a mayor gama de a n tî g e n o s son l a s tr a n s f o rm a d a s p o r v i r u s o n c o g e n o s ; en e l l a s s e pueden d i s t i n g u i r :
1. A n tîg e n o s que form an p a r t e de l a s p a r t î c u l a s v î r i c a s m ad u ra s, 2. a n tî g e n o s n e c e s a r i o s d u r a n te l a s î n t e s i s de l o s a n t e r i o r e s y 3. a n tî g e n o s v i r o i n d u c i d o s :
a ) q u e s o l o f u n c io n a n como te c u e r d o d e l d e s a r r o l l o f i l o g e - n ê t i c o , pued en d a r l u g a r a r e a c c i o n e s c r u z a d a s ,
b ) que s o l o fu n c io n a n como r e c u e r d o de a lg u n o s momentos d e l
l u l a s p le n a m e n te d i f e r e n c i a d a s .
En l a t a b l a I tom ada d e Y. V a l la d a r e s ( 1 9 7 7 ) , s e p u ed e v e r l a c o m p l e ji - dad y v a r ie d a d a n t i g é n i c a de l o s v i r u s de l a le u c e ra ia m u rin a . E s to s a n t î g e n os pued en s e r d e te ç t a d o s en to d o s lo s tu m o re s in d u c id o s p o r e s t o s \ v i r u s (F . L i l l y y R. S t e e v e s , 1 9 7 4 ). .
En l a t a b l a I I s e r e l a c i o n a n l o s a n tîg e n o s d é t e c t a b l e s en l a s d ê l u l a s l i n f o i d e s humanas tr a n s f o r m a d a s p o r c l v i r u s de E p s t e i n - B a r r . E s te a g e n te e s e l mas p r o b a b le c a n d i d a t e de e t i o l o g î a v î r i c a de un tum or hum ano, e l lin f o m a de B u r k i t t , p e ro p a r e c e n e x i s t i r o t r o s h e r p e s v i r u s r e l a c i o n a d o s con tu m o res humanos (H . z u r H a u se n , 1975; Y. V a l l a d a r e s , 1 9 7 7 ).
En l a t a b l a a n t e r i o r s e h a c e r e f e r e n c i a a l a s t é c n i c a s u t i l i z a d a s p a r a i d e n t i f i c a r l o s a n tî g e n o s tu m o r a le s c o n o c id o s , p e ro c x i s t e n adem as o t r o s a n tî g e n o s en e s e m odelo que s o l o pu ed en d e t e c t a r s e p o r e x p e rim e n to s de r e c h az o d e t r a s p l a n t e .
P o r s î s o l o s l o s p ro c e d im ie n tc fs q ue e s t u d i a n e l r e c h a z o de t r a s p l a n t e p e r m ite n d e te r m i n a r un num éro muy l i m i t a d o de a n t î g e n o s , y a que s o l o d e t e c - t a n a q u e l l o s a n tî g e n o s que so n in m u n o g é n ico s y e f i c a c e s , o s e a , q u e s o n c a p a c e s de i n d u c i r una r e s p u e s t a in m u n o lô g ic a e f e c t i v a c o n tr a l a s c ê l u l a s t u m o r a le s . Hoy sabem os que e x i s t e n , ad em as, num ero so s a n tî g e n o s que so n inm u- n o g ê n ic o s p e ro no e f i c a c e s , e s d e c i r , que in d u ce n una r e s p u e s t a in m u n o lô g i
c a , d e t e c t a b l e p o r d i s t i n t o s p r o c e d i m i e n to s , p e ro in c a p a z d e r e c h a z a r a l t u mor y sabem os q ue e x i s t e n ta m b iê n a n tî g e n o s tu m o r a le s no in m u n o g é n ic o s , q u e no p ro v o c a n n in g u n t i p o de r e s p u e s t a y q u e s o l o p u ed en s e r d e te ç t a d o s p o r
ANTIGENOS DE LOS V inU S DE LA LEUCEMIA MURINA (MuLV)
G licoprolelnas 69-7J (gp69/71) = anligeno Jntcrespecifico 11; 8 % de 1ns p ro te in a s viricas; an tîg en o intciespecH lco (2 nioléculas de 69.000 y 71.000 dallons); fo rm a la cubierta. El antîgeno gp69/7l se h a cncontrodo en alg u n o s tum ores hum anos.
P ro leln a 12 (pl2) (12.000 dallons); posee d éterm in an tes d e g rupo y de tlpo; es superficial.
VEA («Virus Envelope Antigens*):.
Su b g ru p o virico MiiLV-i: especifico de) virus de Cross.
Su b g ru p o virico MuLV-2:
Tipo A V irus LLV-Friend, virus de Graffi, viru s B/T-L de Tennant.
viru s SimLV, virus de Rowson-Parr.
Tipo B: Virus de Moloney, virus de Abclson.
Tipo C: LLV-Rauscher, v iru s de Rich, viru s de B reycre M oloney.
Tipo D: V irus de B uffet 334C.
gs-] (grup specific-1) 30 % de las p rctein as viricas; envuelve al nu cleoide; especie especifico (solo en virus m urinos) r: antipeno interespe- cifico I = p ro ie in a 30 (p30) (30.000 dallons) contiene el d éterm in an te gs-3.
A ntîgeno Interespeclfico (en virus de raton, ra ta , criceto y gato, pero no en v iru s de polio y prim ates). p30 se ha cncontrado recientem ente en algunos tum ores hum anos. .
T ran sc rip ta sa Inversa, 70.000 dallons, es subunidad de u n com plejo pro teico m ayor. Se en cu en tra en el nucleoide. Posee d éterm in an tes Inter- especlficos y de grupo. La contienen algunos tum ores hum anos.
P ro teln a 15 (pis) (15.000 daltons). A ntîgeno del nucleoide no asociado a la BNP.
P ro teln a 10 (plO ) • (lO.CCO daltons); se asocia a la RNP del nucleoide; es g rupo especîfica
CSA («Cell S urface Antigens*):
G rupo G (antîgenos de la leucem ia de Gross) antîgeno G y antlgc- no Cix. El an tîgeno G existe solo en m em brana celular y en fo rm a so
luble en el suero, pero no en cl viriôn; el antîgeno Gix es controlado g en éticam en te y ap arece en linfocitos AKR no Icucém icos y en tlino de cepas como la 129, caren'.c de MuLV.
G rupo FMR (Friend Moloney Rauschor) Existe en los v iru s de Friend.
Moloney, R euscher y G raffi. El antîgeno FMR se révéla en la superficie c elu lar y en form a soluble en el suero. No obstante, p arece existir antl- geno FMR en proyecciones de la cubierta, en form a no inm unogénica.
NA: antîgenos niicleares viroinform ados y viroinducidos.
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La f a l t a de e f i c a c i a de a lg u n o s a n tîg e n o s p a r a prom over una r e s p u e s t a in m u n o lo g ic a e s uno de l o s t o p ic o s mas a p a s io n a n te s de l a in m u n o lo g îa tumo
r a l . La c a p a c id a d de r e s p u e s t a a n t e c u a l q u i e r a n tîg e n o e s t a g e n é tic a m e n te c o n tr o l a d a y l o s g e n es im p lic a d o s en e s t e c o n t r o l în tim a m e n te r e la c i o n a d o s con l o s que d e te rra in a n l o s a n tî g e n o s de h i s t o c o r a p a t i b i l i d a d ( I . G re e n , 1974).
F o r o t r a p a r t e , e l s is te m a de v i g i l a n c i a in m u n o lo g ic a ju e g a un p a p e l muy im p o r t a n t e en e l r e c o n o c im ie n to y l a r e s p u e s t a d e l o rg a n ism e c o n tr a c u a l q u i e r a n tî g e n o , de t a l m anera que a n tîg e n o s p r o p io s d e l o rg a n ism e que s e p ro d u c e n en l a s p r im e r a s f a s e s d e l d e s a r r o l l o e m b r io n a r io y d e ja n de p r o d u c i r s e a n t e s de que s e d e s a r r o l l e e l s i s t e m a in ra u n o lo g ic o pueden s e r c a p a c e s de d e s - p e r t a r u l t e r i o r m e n t e una r e s p u e s t a in m u n o lo g ic a (e n fe rm e d a d e s a u to in m u n e s ) . P o r e l c o n t r a r i o , a n tîg e n o s e x tr a n o s a l o rg a n is m e que s e p ro d u z ca n a n t e s de l a m ad u racio n d e l s is te m a de v i g i l a n c i a in m u n o lo g ic a , pued en s e r a c e p ta d ô s p a r c ia lm e n te como p r o p io s p a r a im p e d ir una r e s p u e s t a in m u n o lô g ic a i n t e n s a q u e s e r î a l é t a l p a r a e l o rg a n is m e ( c o r i o m e n i n g i t i s l i n f o c i t a r i a ) .
U t i li z a n d o d i v e r s a s t é c n i c a s (JR. W e il, 1978) s e h a d e rao stra d o l a e x i s t e n c i a en d i s t i n t a s c ê l u l a s tu m o r a le s de a n tî g e n o s que no c o rre s p o n d e n a l t i p o h i s t o l ô g i c o d e l que d é r i v a e l tu m o r, p e ro q ue so n n o rm a le s y s e e x p r e - s a n h a b itu a lm e n te en o t r o s t e j i d o s a d u l t e s d e l mismo o rg a n is m e . Tam biên s e han d e s c u b ie r to en muchos tu m o res a n tîg e n o s que no c s t a n p r é s e n t e s en l a s c ê l u l a s n o rm a le s a d u l t a s , p e ro q u e s i n em bargo s e p ro d u c en en d i s t i n t o s mo
m entos d e l d e s a r r o l l o e m b r io n a r io y f e t a l .
En l a t a b l a I I I , tom ada d e Y. V a ll a d a r e s ( 1 9 7 7 ) , s e re co g e n a lg u n o s de l o s a n tîg e n o s humanos b i e n c a r a c t e r i z a d o s que in d u c e n r e a c c io n e s i n r a u n o l ô -
INMUNOLOGICAS CITOTOXICAS
T lp o d e t u m o r y a n t î g e n o s
M o r illd o d e te c tr o f o r é
l i c a e n P A G E te n c m ) C o m p o s ic iô n q u lm lc a P . M . a p r o x im a d o t*l
C A R C IN O M A E P ID E R M O ID E
A g F I Ag F 2 A g F 3 Ag F 4 A g HSV TA
5.3 8.4 9.2 10.2 3,25; 3.85
Protelna Lipoprolelna Protelna Protelna Protelna
51.000 d 100.000 d 400.000 d 500.000 d 61.000 d; 40.000 d
A D E N O C A R C IN O M A
Ag F 3 A g F 4 Ag TA 1 Ag TA 2
9.2 10.2 5,4 7.3
P rotelna Protelna P rotelna Protelna
400.000 d 500.000 d 51.000 d 80.000 d
T V M O R D E C E I.U L A S D E A V E N A
Ag TA 1 Ag TA 2 Ag TA 3
5.4 7.3 6.6
Pro teln a Pro teln a LIpoproteIna
51.000 d 80.000 d 76:500 d
P U L M O N F E T A I D E 7 S S E M A N A S
A g F 1 Ag F 3 Ag F 4
5.3 9.2 10.2
Protelna Protelna P rotelna
51.000 d 400.000 d 500.000 d
P U L M O N F E T A L D E S M E S E S Y P U L M O N A D U L T O N O R M A L
A g F 2 8.4 LIpoproteIna 100.000 d
A ( o A n llK e n o r = F * l« l . TA = Tum or-stociado
H5V = Herpesviruf «Impie» hominis tlpo I
* Juzgado por el P. M. de proteinas tipo de movilidnd electroforétira similar.
PAGE = eleclroforesls en geles de poliacrllamida.
g è n es son e m b r io n a r io s o f e t a l e s .
Los a n tîg e n o s f e t a l e s h a n s id o r e v is a d o s p o r v a r i e s a u t o r e s , e n t r e lo s que s e puede d c s t a c a r P . A le x a n d e r (1 9 7 2 ).
Los a n tîg e n o s o n c o f c t a l e s pueden a p a r e r e c e r en c u a l q u i e r t i p o de c é l u l a c a n c e r o s a , so n m ac ro m o lé cu la s p r é s e n t e s en e l f e t o y g e n e ra lm e n te a u s e n te s en e l i n d iv i d u o n o rm al a d u l t e . R e p re s e n ta n e l fenomeno de e x p r e s i ô n r e t r o - g e n é t i c a .
Ya en 1906, G. S ch One e n c o n t r e que in y e c ta n d o r a to n e s con t e j i d o s t’é t a l e s , e s t e s a d q u ir î a n c a p a c id a d de r e c h a z a r t r a s p l a n t e s de t e j i d o s tu m o ra
l e s , m ie n tr a s que l o s t e j i d o s a d u l t e s no p ro d u c îa n e s t a r e s p u e s t a .
En 1930, L. H i r s f e l d y W. M alb er d e te c t a r o n l a p r e s e n c i a de a n tîg e n o s e m b r io n a r io s en e x t r a c t o s de tu m o re s , p e ro no s e e s t u d i a r o n b i e n h a s t a mu
cho d e sp u ê s d e b id o a l a s c a n t i d a d e s ta n p eq u eh as que s e e n c o n tr a b a u , que n e c e s i ta b a n t é c n i c a s mas s o f i s t i c a d a s d e s a r r o l l a d a s p o s t e r i o r m e n t e , como e l
ra d io in m u n o e n s a y o .
En 1963, G . I . A b e lev e s t a b l e c i ô que l a a - f e t o p r o t e î n a e n c o n tr a d a e n l o s tu m o res de h îg a d o e r a a n tig é n ic a m e n te i d é n t i c a a una a - g l o b u l i n a d e te c t a d a en 1957 p o r C. B e rg s t r a n d y B. C zar en f e t o s hum anos, que e s s i n t e t i z a d a p o r e l p arén q u im a d e l h îg a d o f e t a l y p o r l a e x tre m id a d c e f â l i c a d e l tu b o e m b r io n a r io d i g e s t i v e .
La a - f e t o p r o t e î n a t i e n e un p e so m o le c u la r d e l o rd e n de 7 2 .0 0 0 D, mo- t i l i d a d a , c o n s t a n t e de s e d im e n ta c io n de 4 ,5 S y c o n tie n e 2 ,3 % de h i d r a - t o s de c a rb o n o . Se p u ed e d e t e c t a r s u p r e s e n c i a p o r d o b le d i f u s i o n y r a d io -
O tr a p r o t e i n a s e n c o n tr a d a en c ê lv ila s de o r i g e n f e t a l e s l a H f e r r o p r o - t c î n a e n c o n tr a d a p o r D. B iiffe y c o l s . (1 9 7 0 ); tam b ién s e p ro d u c e e n e l h î - gado f e t a l y e s t a r e l a c i o n a d a con l a f e r r i t i n a ; e s una a - g l o b u l i n a .
En 1965, P . G old y S . Freedm an d e s cu b r i e r o n una s u s t a n c i a e n c o n t r a d a en c l c a rc in o m a de c o lo n que denom inaron a n tîg e n o c a r c in o e m b r io n a r io ( a b r e - v ia d o CEA, p o r c^ a rc in o -em b ry o n ic a n t i g e n ) ; e s t e com puesto s e d é t e c t a tant- b i e n en l o s ô rg a n o s de f e t o s humanos de 2 a 6 m e s e s .
S o b re l o s a n tîg e n o s c a r c in o e m b r io n a r io s s e b a n r e a l i z a d o muchos e s t u - d io s como e l de P. A le x a n d e r (1 9 7 2 ) o e l de D.G. P r i t c h a r d y c o l s . (1 9 7 8 ) s o b r e a q u îm ic a de e s t o s c o m p u e s to s .
E l a n tîg e n o c a r c in o e m b r io n a r io e s una g l i c o p r o t e î n a con una r e l a c i o n . g l u c i d o s t p r o t e î n a s v a r i a b l e , d e l o rd e n de 3 : 1 , s ie n d o e l p r i n c i p a l h i d r a - t o de c a rb o n o l a N - a c e t il g l u c o s a m i n a . Es r e la ti v a m e n t e a s t a b l e . Da un u n ic o p ic o en u l t r a c c n t r i f u g a c i o n a n a l î t i c a , con un c o e f i c i e n t e de 6 , 8 5 , se g u n l o s e s t u d i o s de J . E . C o lig a n y c o l s . ( 1 9 7 2 ) . Su p e so m o le c u la r p ro m ed io e s - t u d ia d o p o r H .S . S l a y t e r y J . E . C o lig a n (19 7 5 ) m e d ia n te e l e c t r o f o r e s i s en g e le s de p o l i a c r i l a m i d a con d o d e c i l s u l f a t o de s o d io e s de 180.0 0 0 D.
En i n m u n o e l e c t r o f o r e s i s en a g a r a pH 8 ,6 l o s CEA e m ig ran a l a r e g io n de l a s P - g l o b u l i n a s , se g u n e s t u d i o s de J . K rupey y c o l s . (1 9 6 8 ).
Tam bién s e h an r e a l i z a d o e s t u d i o s de l o s CEA a l m ic r o s c o p io e l e c t r o n i - co (U .S . S l a y t e r y J . E . C o l ig a n , 1 9 7 5 ), q u e n o s l o s m u e s tra n como una p o - b l a c i ô n hom ogènes de p a r t i c u l e s con form a de v a r i l l a e n r o s c a d a con d im en - s i o n e s de 9 x 40 nra. Los CEA p o s e e n una c a d e n a p o l i p e p t î d i c a s i m p le , y a que
no s e p ro d u c e v a r i a c i o n en s u p e so m o le c u la r p o r a l q u i l a c i o n o r e d u c c io n . Los CEA t ie n e n 6 p u e n te s d i s u l f u r o con c i s t i n a y no t ie n e n g ru p o s c i s - t e i n a l i b r e s , seg u n l a s i n v e s t i g a c i o n e s de J . l l . Westwood y P . Thomas ( 1 9 7 5 ) , D ebido a s u a l t o c o n te n id o e n h i d r a t o s de carb o n o so n s o l u b l e s en a c i - do p e r c l o r i c o , l o que p e r m ite s e p a r a r l o s d e l r e s t o de l a s p r o t e i n a s .
Su p r e s e n c i a puede s c r d e te c t a d a p o r i n m u n o e l e c t r o f o r e s i s , dobl e d i f u s i o n y ra d io in m u n o e n s a y o .
O tr a p r o t e i n a de o r i g e n f e t a l e s l a e n c o n tr a d a p o r R .C . N a irn y c o l s ■ ( 1 9 6 2 ) , l a s u l f o g l i c o p r o t e i n a f e t a l , que a p a r e c e en l o s c a rc in o m a s de e s t o - mago. En c o n d ic io n e s n o rm a le s e s un com ponente i n t e s t i n a l e m b r io n a r io y f e t a l que d e s a p a r e c e d e sp u e s d e l n a c im ie n to , p c ro que a p a r e c e de nuevo en l a s n e o p l a s i a s , y a s e a n b e n ig n a s o m a lig n a s .
O tro s a n tîg e n o s menos e s t u d ia d o s son y - f e t o p r o t e î n a , que no t i e n e e s - p e c i f i c i d a d dc e s p e c i e y s e h a d e s c r i t o en e l 75 % de l o s t e j i d o s tu m o ra le s y e l a n tîg e n o c a r c i n o f e t a l g l i a l (CECA), d e s c r i t o en g lio m a s hum anos.
S i hubo una e p o c a en l a que s e dudaba de l a e x i s t e n c i a de a n tîg e n o s p r o p io s de lo s tu m o re s, hoy e s t a l l a d i v e r s i d a d de a n tîg e n o s tu m o ra le s que e s n e c e s a r i o u n i f i c a r c o n c e p to s y t e r m i n o lo g i e s .
A l p r i n c i p l e to d o s l o s a u t o r e s d e s c r i b î a n como a n tîg e n o s o n c o e s p e c î f i - c o s , tu m o r - e s p e c î f i c o s o c â n c e r - e s p e c î f i c o s a c u a l q u i e r a de l o s a n tî g e n o s d e te c ta d o s en un tum or que no e x i s t i e s e n en l a s c e l u l a s n o rm ales hom ologas d e l mismo t i p o de t e j i d o y ô rg a n o . A sî s e v ie n e h a b la n d o de a n tîg e n o s tum or- e s p e c î f i c o s de r e c h a z o de t r a s p J a n t e ( a b r e v ia d o TSTA p o r ^um or s p e c i f i c J t r a n s p l a n t a t i o n a n ti g e n ) o de a n tîg e n o s tu m o r - e s p e c î f i c o s de l a s u p e r f i c i e
c e l u l a r ( a b re v ia d o TSSA p o r _tumor s p e c i f i c £ u r f a c e ja n tig e n s ) .
Al d e s c u b r i r que g ra n p a r t e de lo s a n tîg e n o s d e s c r i t o s como e s p e c î f i - cam ente tu m o r a le s so n u n a s v e c e s a n tî g e n o s v î r i c o s , o t r a s v e c e s p r o t e î n a s n o rm ales que s e p r e s e n t a n con una l o c a l i z a c i d n t é m p o r o - e s p a c ia l a n o rm a l, a n tî g e n o s e m b r i o n a r i o s , f e t a l e s o e c t è p i c o s , a lg u n o s a u to r e s em p ezaro n a h a b l a r de a n tî g e n o s o n c o a s o c ia d o s en g e n e r a l , r e s e r v a n d o e l te rm in o de
o n c o e s p e c îf i c o s p a r a d e s i g n a r a q u e l l o s a n tîg e n o s i n t r î n s e c a ÿ e s p e c î f i c a - m ente r e la c i o n a d o s con l a t r a n s f o r m a c iô n n e o p l â s i c a y e l c a r a c t e r c a n c e r o -
8 0. S in em b arg o , a c tu a lm e n te s e s ig u e n u t i l i z a n d o ambas t e r m i n o l o g î à s . Los a n tî g e n o s o n c o e s p e c îf i c o s y o n c o a s o c ia d o s s e pueden c l a s i f i c a r de a c u e rd o con d i s t i n t o s c r i t e r i o s . Podemos d i s t i n g u i r :
a ) De a c u e rd o a s u o r i g e n . a . 1) P r o p io s d e l o rg a n is m e
- e m b r io n a r io s - ' f é t à l e s - e c t ô p i c o s
a . 2) E x tr a n o s a l o rg a n is m e - v î r i c o s
- n e o a n tîg e n o s
b ) De a c u e rd o a s u c a p a c id a d p a r a p r o d u c ir una r e s p u e s t a inm u- n o l o g ic a :
b.l) In m u n o g én ico s - e f i c a c e s - i n e f i c a c e s b . 2 ) No in m u n o g é n ico s
c) De a c u e rd o con s u l o c a l i z a c i o n to p o g r a f i c a a n i v e l dc l a c e - l u l a
c . l . ) I n t e r n e s - n u c le a r e s - c ito p la s in ic o s
m lt o c o n d r ia le s r ib o s o m ic o s
r e t i c u l o - e n d o p l a s m a t i c o s . s o l u b l e s
C . 2 ) S u p e r f i c i a l e s
- de l a m eirbrana p la s m a tic a o a s o c ia d o s a e l l a
E s ta c l a s i f i c a c i o n d e s c r i p t i v e , m a tiz a n d o l a l o c a l i z a c i o n c e l u l a r , p e r m ite c o n o c e r s i l a s d i f e r e n c i a s o b s e rv a d a s en l a in m u n o g e n icid ad de un a n tîg e n o dependen de su a c c e s i b i l i d a d a l re c o n o c im ie n to y s o b r e to d o a l a r e s p u e s t a d e l s is te m a in m u n o lo g ic o . A s î, p o r e je m p lo , sabem os q ue to d o s lo s a n tîg e n o s TSTA so n TSSA, p e ro no to d o s lo s a n tîg e n o s TSSA so n TSTA. E.W.
Lamon (1974) h a e s t u d ia d o l a r e s p u e s t a in im m o lo g ic a f r e n t e a l o s a n tîg e n o s o n c o a s o c ia d o s in d u c id o s p o r lo s v i r u s y R .B . H erberm an (1977) h a a n a liz a d o e l p ro b lem a de l a in m u n o g e n ic id a d de l o s a n tîg e n o s tu m o r a le s .
L as p o s i b i l i d a d e s de u t i l i z a c i o n p r â c t i c a que pueden d e r i v a r de un me- j o r c o n o c im ie n to de e s t o s a n tîg e n o s son muy g r a n d e s . P ero e s n e c e s a r io po
ne r a p u n to p r o c e d im ie n to s que p c r m ita n s u a is l a m i e n t o , i d e n t i f i c a c i o n y p u r i f i c a c i o n .
Es to fu e l o que n o s movio a p l a n e a r una s e r i e de e x p e rim e n to s con l o s c u a l e s , com binando p r o c e d im ie n to s b i o l o g i c o s y b io q u îm ic o s , fueram os c a p a -
c e s de a i s l a r l o s a n tî g e n o s o n c o e s p e c îf i c o s y o n c o a s o c ia d o s . A l e f e c t o d isen am o s e l p r o y e c to e s q u e m a tiz a d o en l a f i g u r a 1,
A ISlAtC BrrO DE ANTIGENOS CAHCEKOSOS ESPECIFICOS E 5 Q D E M A C É H E K A L
CROHATOCSAFIA DE SEEHAinSA AB (CNBr)
CAECA DE I g
OFERIA DE ANTTCEBOS OFERIA DE ANTICENOS ( -
lEMDHOSDEEOS
OBTESCIOH DC PEUCBAS K tHHDWXZNIClDAS
SEPHAWSA «B (CNBr) SCniABOSA «B (C N B r)
AISLAMIEHTC T CAKACtEKIZACIOR
qUUCRIZACIOM INMDHOLOCICA E TNMmiIZACION SELECT IVA
AISLAHIEKtO DE Ig
SEPHADEE C-150
AISLA M U no DC I g FOC EECICIO SCFRADEE C-1 5 0
AISLAMIENTO DE I g
SEFHAOEX C-1 5 0
MATERIAL Y METODOS
I . CULTIVO DE TEJIDOS ESTACIONARIOS EN MONOCAPA
S e u t i l i z a r o n l a s l î n e a s c e l u l a r e s HeLa y EREA. Son l î n e a s e s t a b l e c i - d a s o c o n t i n u a s , y a que s e ban c o n s e g u id o a d a p t a r a c re c .e r " i n v i t r o " d e form a p o t e n c i a l m e n t e i n d e f i n i d a .
A. C a r a c t e r l s t i c a s dé l a s c e l u l a s u t i l i z a d a s . A . I . C e lu la s HeLa. ( F i g u r a 2 ) .
L as c e l u l a s HeLa f u e ro n e s t a b l e c i d a s p o r G.O. Gey , W.D. Coffman y M.T. K u b ic ek en 1951 a p a r t i r de un c a rc in o m a e p id e rm o id e de c u e l l o u t e r i n e hum ano, p r o c é d a n te d e u na m u je r n c g r a lla m a d a H elen L a n t s i n g , a p r o v e - c h an d o l a s l e t r a s i n i c i a l e s d e l nom bre y a p e l l i d o p a r a l a d e s ig n a c io n d e l a l i n e a c e l u l a r . L as c e l u l a s p r o c é d a n te s d e l tum or f u e ro n c u l t i v a d a s en me
d i o e s e n c i a l mînim o d e E a g le en s o lu c io n s a l i n a e q u i l i b r a d a de Hanks y s u - p le m e n ta d a con 10 X d e s u e r o d e t e r n e r a .
La c a r a c t e r i z a c i o n d e e s t a l i n e a c e l u l a r p r o p r o c io n o l o s d a to s s i g u i e n t e s :
M o r f o lo g îa ; e p i t e l i o i d e .
C ic lo c e l u l a r : tie m p o d e g e n e r a c i o n , 19 b o r a s ; d u r a c io n d e l a Ea
s e G1 , 6 b o r a s 25 m in u t o s ; d u r a c io n de l a f a s e S , 8 b o r a s ; d u r a c io n d e l a f a s e G2, 3 b o r a s 30 m in u to s y d u r a c io n de l a f a s e M 65 m in u to s .
Numéro de crom osom as: t r o n c o con num éro m odal de 82 croroosomas y
FIGURA 2
A s p e c to de una m onocapa p r e ç o n f l u e n t e de c é i u l a s HeLa. Se observant n u m ero sas m i t o s i s . E s ta l i n e a c e l u l a r s e o r i g i n o de un c a rc in o m a e p id e rm o id e de c u e l l o u t e r i n o hum ano.
on d e s p e r d ig a m ie n to d e l r e s t e d e l a p o b la c iô n e n t r e 70 y 164 crom osom as.
E f i c i e n c i a de p la n c h e o : 90 %.
S u s c e p t i b l e a v i r u s : p o l i o v i r u s 1 y a d e n o v ir u s 2 . A .2. C e lu la s EREA. ( F i g u r a 3 ) .
E s ta l i n e a c e l u l a r f u e e s t a b l e c i d a en n u e s t r o D e p arta m e n to en 1978. L as c e l u l a s p ro c e d e n d e un c u l t i v e p r im a r io de c e l u l a s t o t a l e s d e em- b r iô n d e r a t o n .
E n tr e s u s c a r a c t e r i s t i c a s podemos d e s t a c a r :
M o r f o lo g îa : a t r a v ê s d e l o s s u b c u l t i v o s r e a l i z a d o s d u r a n te v a r i e s an o s han ro a n te n id o d o s t i p o s c e l u l a r e s , une e p i t e l i o i d e y o t r o f i b r o b l a s t o i - d e .
Numéro d e crom osom as: e l num éro m odal de cromosomas e s d e 40 p a r a l a s c e l u l a s f i b r o b l a s t o i d e s y de 70 p a r a l a s e p i t e l i o i d e s .
Tiempo d e g e n e r a c i o n : 21 h o r a s p a r a l a s c e l u l a s f i b r o b l a s t i c a s y 28 h o r a s p a r a l a s e p i t e l i o i d e s .
E f i c i e n c i a de p la n c h e o : menos d e l 10 % cuando s e sie m b ra n 1 0 .0 0 0 c è l u l a s / m l .
T u m o r ig e n ic id a d : l a i n o c u l a c i ô n d e 10^ a 10^ c e l u l a s p o r v i a s u b - c u tâ n e a a r a to n e s r e c i é n n a c id o s c a r e c e de p r o p ie d a d e s tu m o r i g é n ic a s .
B. T é c n ic a de s u b c u l t i v o .
Ambos t i p o s de c e l u l a s s e m a n tie n e n p o r s u b c u l t i v o s s e r i a d o s , de a c u e rd o con l o s m éto d o s e s t a n d a r ( R .C . P a r k e r , 1 9 6 1 ). L as c e l u l a s d e l c u l t i v e a n t e r i o r s e d e s p re n d e n c o n d i s o l u c i ô n d e t r i p s i n a a l 0 ,2 %, s e p r é p a r a u n a s u s p e n s io n c e l u l a r hom ogênea y s e h a c e un r e c u e n to d e l num éro d e c e l u l a s . Se toman a l i c u o t a s que s e s ie m b ra n b i e n d i s p e r s a d a s en f r a s c o s d e c u l -
•*
P r r p n r / i L ' i ' j ! ? : ! c r r l u l x i s I R K A . S r î i ^ T i n g . i n n c i a i x
m i l e l e s dcf: * i p c e c r l ü l f i r e . . , rp.' I c i , ' n / i r y f f h r o b l n
t o i d e , q u e r o mp o n c n r s l a l i u e n c e l u l a r , p r e c e d e n c e de
c e l u i ae e i n b r i n n n r i n s de r a t o n .
t i v o e s t e r i l e s , afiadienclo l a c a n t i d a d n e c e s a r i a de m edio de c u l t i v o d e f o r ma que qued en se m b rad a s 1 0 0 .0 0 0 c e l u l a s / m l , s e in c u b a n a 37*C y s e m a n tie nen con c am b io s p e r i o d i c o s de m edio d e c r e c im i e n t o , g e n e ra lm e n te a l o s 4 d i a s . Cuando l a s c e l u l a s a lc a n z a n e l e s t a d o de c o n f lu e n c i a en m onocapa, s e p ro c é d é a l s i g u i e n t e s u b c u l t i v o , l o q u e s u e l e h a c e r s e a l o s 7 d i a s .
L as c e l u l a s s e m a n tie n e n co n m edio e s e n c i a l mînimô de E a g le s u - p le m e n ta d o con 10 % de s u e r o de t e r n e r a y 1 % de a m in o a c id o s no e s e n c i a l e s .
C. S o lu c io n e s y m ed io s d e c u l t i v o . 1. R ojo f e iio l a l 1 %
R ojo f e n o l --- ' 10 g NaOH 0 ,0 5 N --- — 60 ml
HgO t r i d e s t i l a d a 20 ml
A j u s t a r pH 7 ,0 -r7 ,5 con NaOH 0 ,0 5 N --- 5 ml HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . 100 ml E s t e r i l i z a r en a u to c l a v e a 121®C d u r a n te 15 m in u to s . 2 . GKN
G lu CCS a --- 1 ,0 g K C l --- 0 ,4 g N a C l --- 8 ,0 g R ojo f e n o l a l 1 % --- 1 ,0 ml A g u a . t r i d e s t i l a d a , c . s . p . 1000 ml E s t e r i l i z a r en a u t o c l a v e a 121*C d u r a n te 15 m in u to s .
1 l i t r o :
3. T r i p s i n a a l 0 ,2 %
T r i p s i n a D ifc o 1:2 5 0 --- 2 , 0 g
GKN, c . s . p . 1000 ml
E s t e r i l i z a r p o r f i l t r a c i o n .
4 . M edio e s e n c i a l minimo de E a g le modi f i c a d o
E s te m edio s e compone de l a s s i g u i e n t e s f r a c c i o n e s , r e f e r i d a s a
4 . 1 . M ezcla de a m in o a c id o s e s e n c i a l e s g /1 L - A r g i n in a - H C l --- 1 2 0 ,4 0 L - C i s t e î n a --- 2 4 ,0 2 L - G l u ta m in a --- 2 9 2 ,3 0 L - H is tid in a - H C l'H20 --- 4 1 ,9 0 L - l s o l e u c i n a --- 5 2 ,5 0 L - L e u c i n a --- 5 2 ,5 0 L -L is in a -H C l --- 7 3 ,0 6 L - M e t i o n i n a --- 1 4 ,0 9 L - F e n i l a l a n i n a --- 3 3 ,0 2 L -T re o n in a --- 4 7 ,6 4 L - T r ip to f a n o --- 1 0 ,2 0 L - T i r o s i n a --- 3 6 ,2 2 L - V a l i n a --- — 4 6 ,9 0 4 . 2 . M ezcla de v ita m in a s
P a n t e o t e n a t o de c a l c i o --- 1 ,0 0 C lo ru ro de c o l i n a --- 1 ,0 0 A cido f o l i c o --- 1 ,0 0
N i c o t i i i a m i d a --- 1,00 i - I n o s i t o l --- 2,00
P i r i d o x a l - H C l --- '--- 1 ,0 0 R i b o f l a v i n a --- 0 ,1 0
T ia m in a - H C l--- 1 ,00
4 . 3 . S o lu c io n e q u i l i b r a d a de Hanks
C l C l g --- 0 ,1 4 D - G lu c o s a --- 1 ,0 0
MgSO^ THgO--- 0 ,2 0
K C l --- 0 ,4 0
N a C l :--- 8 ,0 0 Ro j o f e n o l ————————————————————————— 0 ,0 1 NagHPO^ H g O --- 0 ,0 6 4 . 4 . ‘A rain acid o s no e s e n c i a l e s
L - A l a n i n a --- 8 ,9 0 L—A s p a r a g in a H 2 0 ——— ————————————— —— 1 5 ,0 0 A cid o L - a s p a r t i c o --- 1 3 ,3 0 G l i c i n a --- 7 ,5 0 A cid o g lu ta m ic o ——— ——————————————— — 1 4 ,7 0 L - P r o l i n a --- ■;--- . 1 1 ,5 0 L - S e r i n a --- 1 0 ,5 0 4 . 5 . S o lu c io n de NaHCO^ a l 1 ,4 % ( i s o t o n i c a )
N aH CO j--- 7 ,0 g HgO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . --- 500 ml
E l m edio de c u l t i v o s e e s t e r i l i z a p o r f i l t r a c i o n .
I I . CULTIVO DE CELULAS EN SUSPENSION
A. C a r a c t e r î s t i c a s de l a s c e l u l a s U t i l i z a d a s . A .1. C e lu la s CAE. ( F ig u r a 4 ) .
Las c e l u l a s CAE p ro c e d e n de c e l u l a s de c a n c e r a s c î t i c o de E h r li c h de r a to n a d a p ta d a s en e l D ep arta m e n to a l c u l t i v o en s u s p e n s io n " i n v i t r o " , en 1972. P a ra a d a p t a r l a s , s e a v e n a ro n c e l u l a s CAE c u l t i v a d a s " i n v iv o " me
d i a n t e i n o c u la c io n i n t r a p e r i t o n e a l de r a t o n e s . De l a p a r a c e n t e s i s d e un a n i m al s e o b tu v ie r o n 7 ml con 20*10^ c ê l u l a s / m l , s e la v a r o n en s o l u c io n s a l i n a f i s i o l ô g i c a y s e sem b raro n en tu b o s de 25 x 150 mm a u na c o n c e n tr a c io n dft 3*10^ c é l u l a s / m l en m edio e s e n c i a l mînimo d e E a g le su p le m e n tad o con 20 % de s u e r o de t e r n e r a , con un volum en t o t a l de 25 m l.
A lgunos tu b o s p r o g r e s a r o n y d e s p u e s de v a r i o s s u b c u l t i v o s s e c o n - s i g u i e r o n a d a p t a r a s u s p e n s io n .
B. T é c n ic a de s u b c u l t i v o .
E s ta s c e l u l a s , a l e s t a r en s u s p e n s io n , s e s u b c u l ti v a n s i n n e c e s i - dad de d e s p r e n d e r l a s . Se r e a l i z a un r e c u e n to de l a s u s p e n s io n y s e sie m b ra n n u ev o s tu b o s con 2 0 0 .0 0 0 c é l u l a s / m l y 25 ml de volum en t o t a l , que s e in c u b an en l a e s t u f a a 37®C c .o lo cad o s en un tam b o r g i r a t o r i o a 55 r e v o lu c io n e s p o r m in u to , p a ra m a n te n e r l a s c e l u l a s en s u s p e n s io n m o n o d is p e rs a .
Como m edio d e c r e c im ie n to s e u t i l i z e m edio e s e n c i a l m înim o de E a g le su p le m e n tad o con 20 % de s u e r o d e t e r n e r a y 1 % d e a m in o a c id o s no
FIGURA 4
# • e
F r c p a r a c iô n de c e l u l a s CAE p r o c é d a n te s d e l c a n c e r a s c î t i c o de E h r li c h de r a t o n , p u ed e o b s e r v a r s e l a v a r ie d a d de fo rm as y tam anos de e s t a s c e l u l a s a s î como t r è s m e ta fa -
8e s a n o r m a le s .
e s e n c i a l e s
I I I . CULTIVO ÜE CELULAS IN VIVO
A. C a r a c t e r i s t i c a s de l a s c e l u l a s u t i l i z a d a s A .I , C e lu la s CAEL.
E s ta s c e l u l a s so n una v a r i a n t e de l a s CAE, que s e m a n tie n e n p o r t r a s p l a n t e s i n t r a p e r i t o n e a l e s s e r i a d o s en r a t o n e s d e l a c e p a S w is s .
B. T é c n ic a de t r a s p l a n t e .
E l t r a s p l a n t e s e r e a l i z a e x tr a y e n d o d e l a n im a l d o n a d o r e l l i q u i de a s c î t i c o con l a s c é l u l a s que c re c e n en ê l , d ilu y e n d o l a s u s p e n s io n coA NaCl 0 ,1 4 M p a r a o b te n e r 1 ,5 x 10^ c é l u l a s / m l e in o c u la n d o i n t r a p e r i t o n e a l - m en te 1 5 0 .0 0 0 c é l u l a s CAEL en 0 ,1 m l.
S o lu c io n de NaCl 0 ,1 4 M ( s o l u c io n s a l i n a f i s i o l o g i c a ) N a C l --- 8 ,1 8 g HjO t r i d e s t i l a d a , c . s . p . --- 1000 ml
IV . AISLAMIENTO DE LA MEMBRANA PLASMATICA
A. T é c n ic a u t i l i z a d a .
E l p r o c e d im ie n to em pleado p a r a e l a is l a m i e n t o de membrana p l a s m a t ic a de l a s c é l u l a s e s e l d e s c r i t o p o r T .K . Ray (19 7 0 ) con a lg u n a s v a r i a n t e s que ha s i d o n e c e s a r i o i n t r o d u c i r p a ra a d a p t a r e l m étodo a n u e s t r a s c o n d ic i o n e s .
E s te m étodo c o n s i s t e en l a s e p a r a c io n d e l o s d i s t i n t o s co m p o n en tes c e l u l a r e s p o r s u s d i f e r e n t e s tam an o s y d e n s id a d e s .
E sq u e m â tic a ro e n te , e l p r o c e s o c o n s i s t e en : a) l a v a r l a s c e l u l a s p a r a e l i m i n a r e l m edio d e c u l t i v o y l a a c c iô n d e s u s c o m p o n e n te s ; b ) s o m e te r a c o n ti n u a c i ô n l a s c é l u l a s a un choque l i i p o t ô n i c o , q ue l a s h in c h a y f a c i l i t a s u r o t u r a d u r a n te l a h o m o g e n e iz a c io n ; c) s e p a r a r l o s n u c le o s d e l r e s t o d e l o s co m p o n en tes c e l u l a r e s p o r c e n t r i f u g a c i ô n d i f e r e n c i a l a b a j a v e lo c i d a d ; l o s n u c le o s s e re c o g e n en l a p e l l a y e l r e s t o d e l o s com ponentes c e l u l a r e s queda en e l s o b r e n a d a n te ; d) s e p a r a r l o s co m p o n en tes s o l u b l e s d e l c i t o p l a s - ma d e l r e s t o , e s t r u c t u r a l e s , m e d ia n te c e n t r i f u g a c i ô n d i f e r e n c i a l a a l t a v e
l o c i d a d ; en l a p e l l a s e e n c u e n tr a n m it o c o n d r ia s , f r a c c i ô n m ic ro sô m ic a y mem
b r a n e s p l a s m a t ic a y d e l r e t î c u l o e n d o p la sm ic o y e l s o b r e n a d a n te s e r a com
p u e s to p o r e l c i t o s o l ; e ) f i n a l m e n t e , l o s co m p o n en tes d e l a p e l l a d e l p a so a n t e r i o r s e s e p a r a n p o r c e n t r i f u g a c i ô n en g r a d i e n t e de d e n s id a d , en e l c ü a l co d a e s t r u c t u r a e m ig ra h a s t a a lc a n z a r u na zona en l a que su d e n s id a d c o i n c id e con l a de l a z o n a . A s î s e c o n s ig n e u na p e l l a q ue c o n t i e n s l a s m ito c o n d r i a s , y 4 b a n d a s que c o r r e s p o n d e s , d e a b a jo a a r r i b a , a m ic ro so m a s, membra
n e s , l i p o p r o t é i n e s y l î p i d o s .
La p r e p a r a c i ô n de l a s s o l u c io n e s a l a s que s e h a c e r e f e r e n d a a l d e s - c r i b i r l a t é c n i c a s e i n d i c e mas a d e l a n t e (IV . B ) .
A . 1. T é c n ic a p a r a c é l u l a s c u l t i v a d a s " i n v i t r o " .
1. De l o s c u l t i v e s en m onocapa e s t a c i o n a r i a s e re c o g e n l a s c é l u l a s la v a n d o l o s f r a s c o s con s o l u c io n s a l i n a c i t r a t a d a (S S C ), ra s p a n d o l a m onoca
pe con e s p a t u l a p a r a d e s p r e n d e r l a s c é l u l a s y r e s u s p e n d iê n d o la s en s o l u c i o n d c D u lb e cc o . S i l a s c é l u l a s s e c u l t i v a n en s u s p e n s io n , s e o b t ie n e n c e n t r i - fu g a n d o a b a j a v e lo c i d a d (9 0 x y re s u s p e n d ie n d o l a p e l l a en l a s o l u c i o n m c n c io n a d a .
2 . Se t r a n s f i e r e n l a s c e l u l a s a un tu b o de c e n t r î f u g a y s e la v a n con SSC u t i l i z a n d o un volum en 10 a 20 v e c e s s u p e r i o r a l de l a p e l l a c e l u l a r . Se mi de e l volumen f i n a l y s e toma a 'ii c u o ta p a r a r e c u e n to c e l u l a r .
3. Se c e n t r i f u g a n l a s c é l u l a s a 300 x £ d u r a n te 15 m in u to s . 4 . Se d e c a n ta y d e s p r e c i a e l s o b r e n a d a n te y s e mide e l volum en de p e l l a c e l u l a r o b te n id o .
5 . Se l a v a o t r a s dos v e c e s en l a s mismas c o n d ic i o n e s , p e r o u t i l i zando NaCl 0 ,1 4 M con T r i s 20 mM a pH 7 ,4 .
6. Se re s u s p e n d e l a p e l l a en 1 volumen i g u a l a l de e l l a de s o l u c io n h i p o t o n i c a de NaHCO^ y CaClg su p le m e n tad o con f l u o r u r o de f e n i l - m e t i l - s u l f o n i l como i n h i b i d o r de en zim as p r o t e o l î t i c a s .
7. A p a r t i r de e s t e momento s e t r a b a j a a 4°C.
8. Se m a n tie n e e l p r o d u c to a 4°C d u r a n te 2 h o r a s p a r a p r o d u c i r l a r o t u r a de l a s c é l u l a s p o r l a h i p o t o n i c i d a d d e l m ed io .
9 . Se p ro c é d é a l a b o m o g e n e iz a c iô n , en un h o ro o g en eizad o r de P o t t e r de v i d r i o - t e f l ô n , g ir a n d o a 3000 rpm d u r a n te 3 m in u to s y a 3500 rpm 1 m in u to .
10. Se t r a n s f i e r e e l homogenado a un ti4>o de c e n t r î f u g a , s e mide e l volumen y s e toma una a l î c u o t a p a r a a n â l i s i s c u a n t i t a t i v o de p r o t e î n a s p o r e l m étodo de O.H. Lowry y c o l s . ( 1 9 5 1 ) , que s e d e s c r i b e mas a d e l a n t e .
11. Se c e n t r i f u g a a 300 x g d u r a n te 15 m in u to s .
12. Se re c o g e e l s o b r e n a d a n te , q ue c o n t i e n s c ito p la s m a y m en b ra n a, y s e d e s p r e c i a l a p e l l a , que e s t a form ada p o r l o s n u c le o s .
13. Se t r a n s f i e r e e l s o b r e n a d a n te a o t r o tu b o de c e n t r î f u g a , s e mi
de e l volum en y s e toma una m u e s tra p a r a a n a l i s i s c u a n t i t a t i v o de p r o t e î n a s . 14. Se c e n t r i f u g a a 14.000 x ^ d u r a n te 15 m in u to s .
15. Se r e c o g e p o r s e p a ra d o e l s o b r e n a d a n te ( c i t o s o l ) y l a p e l l a ( p r o t e î n a s e s t r u c t u r a l e s d e c ito p la s m a y m em b ran a).
16. Se l a v a l a p e l l a con s d l u c io n h i p o to n i c a de NallCO^ y CaClg, c e n t r if u g a n d o a c o n ti n u a c i ô n en l a s mismas c o n d ic io n e s d e l p a so 14.
17. Se d e s p r e c i a e l s o b r e n a d a n te y s e re s u s p e n d e l a p e l l a en un volum en de s o l u c io n h i p o t o n i c a de NaHCO^ y CaCl^ t a l que e l volum en f i n a l de l a s u s p e n s iô n s e a d e 3 ,4 m l.
18. Se a n ad e n 7 ,5 ml de s a c a r o s a a l 70 % (p e s o /v o lu m e n ) y s e toma a l î c u o t a p a r a a n a l i s i s c u a n t i t a t i v o d e p r o t e î n a s .
19. En un tu b o d e u l t r a c e n t r î f u g a s e form a un g r a d i e n t e en b a n d a s d e s a c a r o s a d e 48 % a 37 %, con l a s s i g u i e n t e s c a n t i d a d e s , d e p o s i ta d a s d e l fo n d o a l a b o c a con c u id à d o p a r a que no s e m e z c le n :
1 0 ,9 m l de s u s p e n s iô n con l a s membranes en s a c a r o s a a l 48 %, 9 ,7 ml de s a c a r o s a a l ,45 %,
1 2 ,0 ml de s a c a r o s a a l 41 % y 2 ,4 ml de s a c a r o s a a l 37 %.
2 0 . Se c e n t r i f u g a e l p r o d u c to a 6 2 .0 0 0 x d u r a n te 120 m in u to s . 21 . Se re c o g e l a b an d a que a p a r e c e en l a i n t e r f a s e 4 5 - 4 1 , c o r r e s - p o n d ie n te a l a zona con u na d e n s id a d 1 ,1 6 g /m l. Se m ide e l volum en y s e t o ma una a l i c u o t a p a r a a n a l i s i s c u a n t i t a t i v o de p r o t e î n a s .
22 . Se la v a n l a s m em branas o b t e n i d a s con un volum en a b o n d a n te de EDTA 1 mM, p a ra e l i m i n a r l o s io n e s c a l c i o y l a s a c a r o s a . Se c e n t r i f u g a a 2 4 .0 0 0 X ^ d u r a n te 30 m in u to s .
2 3 . Se d e c a n ta y d e s p r e c i a e l s o b r e n a d a n te y s e c o n g e la l a p e l l a a -90*C h a s t a su u t i l i z a c i o n , e x c e p to s i v a a s e r in m e d ia ta .
