TítuloLa membrana amniótica humana : caracterización de las células madre y su aplicación en terapia celular para reparar lesiones de cartílago articular humano

(1)UIVERSIDADE DA CORUÑA DEPARTAMETO DE MEDICIA. LA MEMBRANA AMNIÓTICA HUMANA : CARACTERIZACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE Y SU APLICACIÓN EN TERAPIA CELULAR PARA REPARAR LESIONES DE CARTÍLAGO ARTICULAR HUMANO. Tesis doctoral Emma Muiños López 2010.

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(3) UNIVERSIDADE DA CORUÑA DEPARTAMENTO DE MEDICINA. LA MEMBRAA AMIÓTICA HUMAA: CARACTERIZACIÓ DE LAS CÉLULAS MADRE Y SU APLICACIÓ E TERAPIA CELULAR PARA REPARAR LESIOES DE CARTÍLAGO ARTICULAR HUMAO. Memoria para optar al grado de Doctor en Biología presentada por. Emma Muiños López. 2010.

(4) Fotografías de la cubierta Imagen de la barriga de una embarazada de 26 semanas Imagen de una radiografía de una rodilla artrósica sometida a cirugía de reposición Imagen de células de origen mesenquimal marcadas con Vimentina (40X).

(5) D. Francisco Javier Blanco García, Director Científico del Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC) y Dña. Silvia Mª Díaz Prado, profesora del Área de Anatomía y Embriología Humana del Departamento de Medicina de la Universidad de A Coruña.. CERTIFICA :. Que Dña. Emma Muiños López, Licenciada en Biología, ha realizado bajo nuestra dirección. el. trabajo:. CARACTERIZACIÓ. “LA. MEMBRA A. AM IÓTICA. HUMA A:. DE LAS CÉLULAS MADRE Y SU APLICACIÓ. E. TERAPIA CELULAR PARA REPARAR LESIO ES DE CARTÍLAGO ARTICULAR HUMA O”. Dicho trabajo reúne las condiciones necesarias de originalidad y rigor científico para ser defendido públicamente y optar al grado de Doctor.. D. Francisco Javier Blanco García. Dña. Silvia Mª Díaz Prado. En A Coruña, 30 de Noviembre de 2010.

(6) A mi familia y a Iván.

(7) En primer lugar, quiero agradecer a mis directores de tesis, Dr. Francisco F. Blanco y Dra. Silvia Díaz, la oportunidad que me permite hoy optar al título de Doctora. Me han abierto las puertas del mundo de la Investigación que tanto ha supuesto en mi vida. A la Fundación Española de Reumatología (FER), al Centro de Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN) y al Servicio Galego de Saúde (SERGAS), sin cuya financiación sería imposible la realización de esta tesis doctoral. Por supuesto, a los pacientes. Nunca podré agradecer lo suficiente el altruismo de las personas que donan parte de sí, para que nosotros podamos realizar diariamente nuestros experimentos. Esto no sería posible sin ellos. Al Servicio de Criobiología y, en especial, a Esther Rendal, por su inestimable ayuda. A la Dra. Hermida Gómez. Tendría que dedicarle sólo a ella más páginas de agradecimientos de las que consta esta tesis. Me ha enseñado gran parte de lo que he aprendido y me ha hecho crecer personalmente a un nivel que sólo gente tan generosa, dispuesta y buena persona como ella puede conseguir. A mis inflamatorios e inmunológicos amigos. A Carlos, por escucharme, comprenderme y animarme. A Romi por la tozudez y por tener un corazón más grande que ella. A Laura, por aportar a este grupo orden, ilusión y exquisitez de hacer las cosas bien. A Noa, por el equilibrio, la serenidad, la dulzura y el sentido común que tanto hacen falta. Y a Mariana, por creer que se puede cambiar el mundo. Sin sus ánimos, su comprensión, su apoyo y su cariño diario, sería mucho más duro llegar a la meta. A todos los técnicos de este Instituto. Sois fundamentales en la formación de los estudiantes pre-doctorales. En particular, a Mariajo, por su inagotable torrente de energía y por ser mi apoyo lírico y danzarín en la sala de cultivos; y a Puri, por el entusiasmo con el que a veces nos deleita al ver una Hematoxilina-Eosina, que hace que cualquier trabajo parezca un futuro Premio Nobel de Investigación. Al grupo CIBER, en especial a Elena, que en muy poco tiempo se ha hecho un hueco en estas páginas. No sólo me ha ayudado cuando lo he necesitado, sino que me ha dado muy buenos consejos. Al grupo de oncología, especialmente a Isa, sin la cual estaría totalmente incomunicada sin batería. A mis niñas de prácticas: Ana Feijoo, Ana Nantón, Lorena y Marta. Habéis logrado que confíe un poquito más en mí misma y me habéis recordado la ilusión con la que empecé en el mundo de la investigación. A Isaac, por encontrar la palabra exacta y la frase correcta, y por ayudarnos con la intrincada red burocrática de la Universidad. A las hermanas Cal, Pilar y Natalia. A Pilar por el aplomo mostrado en momentos de mayor tensión y nerviosismo en los dead lines, así como por su discreción y capacidad para ejercer un papel como mediadora. A Natalia, porque no sabemos lo que tenemos.

(8) hasta que lo perdemos. Y por supuesto, a Emma R., que nos hace reír aún cuando le supera el trabajo día a día. A Cris y a la antiguamente conocida como @, por regalarme sus casi primeras imágenes. Serán un recuerdo que guardaré con mucho cariño. Y gracias a mi familia, especialmente a mis padres, mi hermano y mi abuela. Sin su sacrificio y esfuerzo, no podría haber estudiado una carrera y, por tanto, alcanzar el final del primer tramo de mi vida profesional. Sin su cariño, no habría superado muchos de los baches del camino. A Iván, por su comprensión, ya que el hecho de no pertenecer a este mundo, muchas veces hace muy difícil entender que este trabajo no se puede dejar atrás cuando cierras la puerta del laboratorio, sino que supone muchas veces sacrificar cierta vida personal, porque el día tiene menos horas de las que a veces nos gustaría. Y no pueden faltar los agradecimientos a mis mejores amigos Roberto, Raquel R., María G., Fernando, Vane, Noe, Eva S., Eva R., David, Ana T., Isa y Tamara H. Sois el verdadero pilar de mi vida y los que me habéis ayudado a ser mejor persona.. GRACIAS.. INIBIC. GRUPO CIBER.

(9) Índice. ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………………...XVII ÍNDICE DE TABLAS………………………………………………………………………XXV ABREVIATURAS………………………………………………………………………….XXIX RESUMEN……………………………………………………………………………….XXXVII 1.- INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1 1.1.- Epidemiología y coste económico de la artrosis................................................ 3 1.2.- Valoración de la artrosis ................................................................................... 4 1.2.1.- La escala de Kellgren y Lawrence ............................................................. 5 1.2.2.- La clasificación de Ahlbäck ....................................................................... 5 1.2.3.- La Escala Visual Analógica (EVA) ........................................................... 5 1.2.4.- La escala de Likert .................................................................................... 6 1.2.5.- Health Assessment Questionnaire (HAQ) ................................................ 6 1.2.6.- The Westerm Ontario and Mc Master Universities Osteoarthritis Index (WOMAC) ................................................................. 6 1.3.- Factores de riesgo para el desarrollo de la artrosis........................................... 7 1.3.1.- La edad como factor de riesgo endógeno ................................................. 7 1.3.2.- Riesgo genético ........................................................................................ 8 1.4.- Tratamientos aplicados a la artrosis.................................................................. 11 1.4.1.- Tratamiento no farmacológico ................................................................... 11 1.4.2.- Tratamiento farmacológico ........................................................................ 11 1.4.3.- Tratamiento quirúrgico .............................................................................. 14 1.4.4.- Terapias para reparar lesiones del cartílago articular ................................ 15 1.5.- Membrana amniótica ........................................................................................ 23 1.5.1.- Origen de la membrana amniótica............................................................. 23 1.5.2.- Estructura de la membrana amniótica ....................................................... 26 1.5.3.- Propiedades de la membrana amniótica ................................................... 27 1.5.4.- La membrana amniótica como soporte...................................................... 30 1.6.- La Terapia Celular y la artrosis ......................................................................... 36 1.6.1.- Tipo de células utilizadas en Terapia Celular ............................................ 39 1.6.2.- Tipos de células madre de la membrana amniótica ................................... 45 2.- JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS .......................................................................... 47 3.- OBJETIVOS ........................................................................................................ 53 4.- MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................... 57 4.1.- Aislamiento y cultivo de las células mesenquimales estromales y epiteliales de membrana amniótica .................................................................... 59. XIII.

(10) Índice 4.2.- Aislamiento y cultivo de las células mesenquimales estromales de médula ósea ...................................................................................................... 88 4.3.- Subcultivo celular.............................................................................................. 63 4.4.- Estudio del rendimiento obtenido en el aislamiento celular a partir de la membrana amniótica......................................................................................... 63 4.5.- Caracterización fenotípica mediante citometría de flujo .................................... 64 4.6.- Diferenciación in vitro de las CMEAh y CEAh ................................................... 66 4.6.1.- Diferenciación adipogénica ....................................................................... 66 4.6.2.- Diferenciación osteogénica ....................................................................... 67 4.6.3.- Diferenciación condrogénica ..................................................................... 67 4.7.- Análisis histológicos e inmunohistoquímicos ..................................................... 68 4.7.1.- Rojo alizarina ............................................................................................ 68 4.7.2.- Oil red O.................................................................................................... 69 4.7.3.- Hematoxilina-eosina .................................................................................. 70 4.7.4.- Tricrómico de Masson ............................................................................... 70 4.7.5.- Azul de toluidina ........................................................................................ 71 4.7.6.- Safranina O ............................................................................................... 71 4.7.7.- Protocolo tinciones inmunohistoquímicas .................................................. 71 4.8.- Análisis mediante inmunofluorescencia ............................................................ 72 4.9.- Extracción de ARN y síntesis de ADNc ............................................................. 73 4.10.- Análisis mediante PCR en Tiempo Real ......................................................... 75 4.11.- Análisis de los productos de amplificación de la PCR en Tiempo Real mediante secuenciación ........................................................ 77 4.12.- Realización del modelo de reparación ............................................................ 77 4.12.1.- Aislamiento de condrocitos...................................................................... 78 4.12.2.- Obtención de membrana amniótica ......................................................... 79 4.12.3.- Selección de la cara más apropiada de la membrana amniótica ............. 80 4.12.4.- Tratamiento de la membrana amniótica con tripsina para facilitar la penetración de las células cultivadas sobre ella...................... 81 4.12.5.- Cultivo de condrocitos, CMEAh o CEAh utilizando la membrana amniótica como soporte ........................................................ 82 4.12.6.- Obtención de los punch de cartílago ....................................................... 82 4.12.7.- Desarrollo del modelo in vitro de reparación del cartílago ....................... 85 4.13.- Análisis morfométrico del tejido de reparación en los modelos in vitro de reparación de lesiones focales de cartílago articular ......... 87 4.14.- Valoración de las tinciones de los glucosaminoglucanos y proteoglicanos ..... 88 4.15.- Análisis estadístico ......................................................................................... 88 5.- RESULTADOS .................................................................................................... 89 5.1.- Estudio descriptivo de la membrana amniótica ................................................. 91 5.2.- Aislamiento, caracterización y potencial de diferenciación de células de la membrana amniótica ................................................................................ 92 5.2.1.- Aislamiento y rendimiento de las células de la membrana amniótica......... 92. XIV.

(11) Índice 5.2.2.- Caracterización fenotípica de las células de la membrana amniótica ........ 99 5.2.3.- Potencial de diferenciación de las CMEAh y de las CEAh de la membrana amniótica .............................................................................. 101 5.2.3.1.- Diferenciación adipogénica ........................................................... 101 5.2.3.2.- Diferenciación osteogénica ........................................................... 105 5.2.3.3.- Diferenciación condrogénica ......................................................... 108 5.3.- Estudios descriptivo de la reparación de cartílago articular humano mediante modelos de reparación in vitro ............................................. 115 5.3.1.- Selección de la cara más apropiada de la membrana amniótica ............... 115 5.3.2.- Mantenimiento del fenotipo de los condrocitos humanos cultivados sobre la membrana amniótica .................................................................. 118 5.3.3.- El efecto de la tripsina en el crecimiento de los condrocitos sobre la membrana amniótica ................................................................................ 120 5.3.4.- Reparación in vitro de cartílago articular artrósico humano ....................... 121 5.3.5.- Reparación in vitro de lesiones focales del cartílago articular humano empleando condrocitos cultivados sobre la membrana amniótica ............. 126 5.3.6.- Reparación in vitro de lesiones focales del cartílago articular humano empleando CMEAh cultivadas sobre la membrana amniótica ................... 130 5.3.7.- Reparación in vitro de lesiones focales del cartílago articular humano empleando CEAh cultivadas sobre la membrana amniótica...................... 135 5.3.8.- Análisis morfométrico del tejido de reparación en los modelos in vitro de reparación de lesiones focales del cartílago articular ................................ 137 6.- DISCUSIÓN......................................................................................................... 139 6.1.- La membrana amniótica como fuente de células madre ................................... 141 6.2.- Comparación de los protocolos de extracción de células madre de la membrana amniótica: Alviano vs Soncini ................................................ 142 6.3.- Fenotipo de las células madre aisladas de la membrana amniótica .................. 143 6.3.1.- La membrana amniótica como fuente de células madre ......................... 141 6.3.1.- Comparación del fenotipo de las CMEAh y las CEAh obtenidas con el protocolo de Soncini .................................................... 144 6.4.- Capacidad de diferenciación celular de las células de la membrana amniótica ....................................................................................... 143 6.4.1.- Diferenciación condrogénica ................................................................. 149 6.4.2.- Análisis molecular de las diferenciaciones de las células de la membrana amniótica ............................................................................ 150 6.5.- La utilidad de la membrana amniótica como Terapia Celular para la artrosis.... 151 6.5.1.- Reparación de cartílago articular artrósico humano .............................. 154 6.5.2.- Reparación lesiones focales de cartílago articular artrósico humano .... 154 6.5.3.- Limitaciones de la reparación in vitro .................................................... 156 7.- CONCLUSIONES ................................................................................................ 159 8.- BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 163 9.- ANEXO ................................................................................................................ 181. XV.

(12) ÍNDICE DE FIGURAS.

(13) Índice de figuras. INTRODUCCIÓN Figura I1. Representación del coste anual por paciente de la OA de rodilla y de cadera. 3. Figura I2. Representación de la escala EVA para la valoración de la intensidad del dolor. 6. Figura I3. Ruta de la apoptosis mediada por la mitocondria. 10. Figura I4. Esquema en el que se resumen las diferentes estrategias terapéuticas a desarrollar en función del grado de afectación de la articulación. 14. Figura I5. Penetración del hueso subcondral. 16. Figura I6. Localización del periostio y del pericondrio. 17. Figura I7. Etapas de la técnica de la mosaicoplastia. 18. Figura I8. Etapas de la técnica de ACI. 19. Figura I9. Imagen real de una articulación sometida al tratamiento de ACI. 19. Figura I10. Diferentes fases del alotrasplante. 21. Figura I11. Biomateriales utilizados para la reparación de cartílago articular. 22. Figura I12. Estadio embrionario de 2 días con dos blastómeros. 23. Figura I13. Blastocisto maduro e implantación del blastocisto maduro en el endometrio. 24. Figura I14. Esquema de formación de las tres capas germinales. 25. Figura I15. Estructura de la MA. 27. Figura I16. Evolución de una úlcera varicosa tratada con la MA. 32. Figura I17. Fases del tratamiento de una quemadura ocular con la MA. 33. Figura I18. Pasos para el tratamiento de la periodontitis mediante el uso de una membrana porosa. 34. Figura I19. Diferentes etapas del tratamiento de corazones isquémicos de ratas utilizando la MA. 35. Figura I20. Articulación diartrodial de una rodilla en la que se expone el cartílago articular. 37. Figura I21. Detalle de la MEC mostrando la red de colágeno. XIX. 37.

(14) Índice de figuras. Figura I22. Esquema de la organización y composición de la MEC en las zonas territoriales e interterritoriales. 38. Figura I23. Tipos de células utilizadas en Terapia Celular, clasificadas en función de su origen. 41. MATERIALES Y MÉTODOS Figura M1. Protocolo de recepción de muestras de MA. 59. Figura M2. Esquema representativo de los dos protocolos de extracción de células de la MA. 61. Figura M3. Lavado de la médula ósea para la extracción de las CME-MOh. 62. Figura M4. Esquema del proceso de diferenciación condrogénica. 68. Figura M5. Pasos del proceso de aislamiento de condrocitos. 78. Figura M6. Pasos para la criopreservación de la MA. 79. Figura M7. Proceso de sembrado de las células sobre la MA. 82. Figura M8. Obtención de las biopsias de cartílago para el modelo de reparación in vitro de cartílago articular OA. 83. Figura M9. Esquema de la realización de la lesión en la cara superficial del cartílago, para la reparación in vitro de lesiones focales del cartílago articular humano. 84. Figura M10. Obtención de las biopsias de cartílago para la reparación in vitro de lesiones focales del cartílago articular humano. 84. Figura M11. Proceso de colocación de la MA sobre las biopsias de cartílago OA. 85. RESULTADOS Figura R1. Caracterización histológica e inmunohistoquímica de la MA. 91. Figura R2. Inmunolocalización de marcadores de células madre en tejido de MA. 93. Figura R3. Cultivo in vitro de las CMEAh obtenidas con el protocolo de Alviano y de las CMEAh obtenidas con el protocolo de Soncini. 94. Figura R4. Cultivo in vitro de células de la MA obtenidas con el protocolo de Soncini. 95. Figura R5. Inmunohistoquímica para CK-7. 96. XX.

(15) Índice de figuras. Figura R6. Rendimiento de CMEAh de la MA con distintos protocolos. 97. Figura R7. Rendimiento de CMEAh y de CEAh de la MA con el protocolo de Soncini. 98. Figura R8. Porcentaje de positividad para diferentes marcadores de las CMEAh aisladas de MA con los protocolos de Alviano y de Soncini. 100. Figura R9. Porcentaje de positividad de las células aisladas de MA con el protocolo de Soncini para distintos marcadores. 100. Figura R10. Diferenciación adipogénica de las células extraídas de la MA mediante el protocolo de Alviano y de Soncini, comparándola con la obtenida en la CME-MOh. 102. Cuantificación del porcentaje de positividad para la tinción Oil Red-O de las células extraídas de la MA mediante el protocolo de Alviano y de Soncini, utilizando las CME-MOh como control positivo. 103. Expresión relativa de genes específicos de diferenciación celular adipogénica en las células de MA obtenidas con el protocolo de Soncini, cultivadas en medio DMEM y en medio de diferenciación adipogénica. 104. Figura R13. Diferenciación osteogénica de las células aisladas de MA con los protocolos de Alviano y de Soncini y de las CME-MOh. 105. Figura R14. Porcentaje de positividad para la tinción rojo alizarina en las células extraídas de la MA mediante los protocolos de Alviano y Soncini, utilizando las CME-MOh como control positivo. 106. Expresión relativa de genes específicos de diferenciación celular osteogénica en las células de MA obtenidas con el protocolo de Soncini, cultivadas en medio DMEM y en medio de diferenciación osteogénica. 107. Estructura de las micromasas obtenidas con las células aisladas de MA con los protocolos de Alviano y Soncini y con las CMEMOh. 108. Figura R17. Presencia de PG en micromasas obtenidas con células aisladas de MA con los protocolos de Alviano y Soncini y con CME-MOh. 109. Figura R18. Tinciones inmunohistoquímicas para Col-I, Col-II y Agg C20 en micromasas obtenidas con células aisladas de MA con CME-MOh. 110. Figura R11. Figura R12. Figura R15. Figura R16. XXI.

(16) Índice de figuras. Figura R19. Porcentaje de positividad de las tinciones inmunohistoquímicas para Col-I, Col-II y Agg C20 en micromasas obtenidas con células aisladas de MA y con CME-MOh. 111. Expresión relativa de genes específicos de diferenciación condrogénica en las células de MA obtenidas con el protocolo de Soncini, cultivadas en medio DMEM y en medio de diferenciación condrogénica. 113. Figura R21. Dispositivo Cell Crown. Condrocitos creciendo sobre la MA tras 34 semanas de cultivo in vitro. 115. Figura R22. Sembrado de condrocitos sobre la cara estromal de la MA. 116. Figura R23. Sembrado de condrocitos sobre el lado epitelial de la MA. 116. Figura R24. Monocapa sobre la cara estromal de la MA de CEAh obtenidas con el protocolo de Soncini. 117. Figura R25. Monocapa de CMEAh obtenidas con el protocolo de Soncini. 118. Figura R26. Inmunohistoquímica para Col II del tejido neoformado tras el cultivo de condrocitos sobre la capa estromal de MA. 119. Figura R27. Efecto de la tripsina sobre el crecimiento de las células cultivadas in vitro sobre la MA. 120. Figura R28. Reparación in vitro de cartílago articular OA humano por células cultivadas sobre MA. 121. Figura R29. Reparación in vitro de cartílago articular OA humano por engrosamiento de la MA. 122. Figura R30. Reparación in vitro de cartílago OA. 123. Figura R31. Integración de la MA en la reparación in vitro del cartílago OA con condrocitos sembrados en MA. 123. Figura R32. Reparación in vitro de cartílago OA con condrocitos sembrados en MA. 124. Figura R33. Biomoléculas de la MEC del tejido de reparación tras el implante in vitro de condrocitos sembrados en MA en cartílago OA. 125. Figura R34. Cultivo en placa del modelo de reparación in vitro de lesiones focales del cartílago articular humano. 126. Figura R35. Reparación in vitro de lesiones focales de cartílago articular humano con condrocitos sembrados sobre MA y solución de condrocitos. 127. Figura R20. XXII.

(17) Índice de figuras. Figura R36. Reparación in vitro de lesiones focales de cartílago articular con condrocitos sembrados sobre MA y solución de condrocitos. 128. Figura R37. Biomoléculas del tejido de reparación laxo y denso tras el implante in vitro en lesiones focales de cartílago articular de condrocitos sembrados en MA y solución de condrocitos. 129. Tinción inmunohistoquímica para Agg C-20 en la reparación in vitro de defecto focal de cartílago articular con condrocitos en soporte de MA. 130. Figura R39. Adherencia in vitro de la MA sembrada con CMEAh a la superficie del cartílago articular. 131. Figura R40. Reparación in vitro de lesiones focales de cartílago articular con CMEAh sembradas sobre MA y solución de CMEAh. 132. Figura R41. Tejido de reparación in vitro de lesiones focales de cartílago articular con CMEAh sembradas sobre MA y solución de CMEAh. 132. Figura R42. PG del tejido de reparación tras el implante in vitro en lesiones focales de cartílago articular de CMEAh sembradas en MA y solución de CMEAh. 133. Biomoléculas del tejido de reparación tras el implante in vitro en lesiones focales de cartílago articular de CMEAh sembradas en MA y solución de CMEAh. 134. Figura R44. Reparación in vitro de lesiones focales de cartílago articular con CEAh sembradas sobre MA y solución de CEAh. 135. Figura R45. Biomoléculas del tejido de reparación tras el implante in vitro en lesiones focales de cartílago articular de CEAh sembradas en MA y solución de CEAh. 136. Figura R38. Figura R43. XXIII.

(18) ÍNDICE DE TABLAS.

(19) Índice de tablas. INTRODUCCIÓN Tabla I1. Ventajas e inconvenientes de los diferentes tipos de células troncales. 42. MATERIALES Y MÉTODOS Tabla M1. Tabla M2. Tabla M3. Tabla M4. Anticuerpos empleados en la caracterización fenotípica mediante citometría de flujo Secuencias y características de los cebadores empleados en la qPCR para la amplificación de los ARNm humanos específicos de la diferenciación adipogénica, osteogénica y condrogénica Secuencias y características de los cebadores empleados en la qPCR para la amplificación de los genes de referencia para realizar el algoritmo del geNORM Tabla para la valoración de los modelos de reparación in vitro de lesiones focales de cartílago articular humano. 65. 75. 76. 87. RESULTADOS Tabla R1. Tabla R2. Tabla R3. Relación entre los porcentajes de positividad de las inmunotinciones para Col I y Col II en micromasas obtenidas con células aisladas de MA con los protocolos de Alviano y Soncini y con CME-MOh Resumen de los resultados de diferenciación condrogénica obtenidos para los diferentes tipos celulares Valoración ICRS de la reparación del cartílago articular humano utilizando el modelo de reparación de lesiones focales in vitro. XXV II. 112. 114 137.

(20) ABREVIATURAS.

(21) Abreviaturas. µg. Microgramo. µl. Microlitro. µm. Micrómetro. €. Euro. 3D. 3 dimensiones. A. Absorbancia. AA. Ácido ascórbico. Ac. Anticuerpo. ACAN. Aggrecan. ACI. Autologous Chondrocyte Implantation. ACR. American College of Rheumatology. ADN. Ácido desoxirribonucleico. ADNc. Ácido desoxirribonucleico complementario. ADNmt. Ácido desoxirribonucleico mitocondrial. AGEs. Advanced glicosilation endproducts. Agg. Aggrecan. AH. Ácido hialurónico. AINE. Antiinflamatorio no esteroideo. ALCAM. Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule. ALP. Alkaline Phosphatase. APC. Allophycocyanin. APEs. Antigen-presenting cells. APM1. Adiponectin. AR. Ácido retinóico. ARN. Ácido ribonucleico. ARNm. Ácido ribonucleico mensajero. ARNr. Ácido ribonucleico ribosómico. AT. Azul de toluidina. ATP. Adenosín trifosfato. bFGF. Basic Fibroblast Growth Factor. BM-MSCs. Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells. BTUB. Beta Tubulin. CD. Cluster of differentiation. XXXI.

(22) Abreviaturas CE. Capa esponjosa. CEAh. Células epiteliales amnióticas humanas. CK. Citoqueratina. cm. Centímetro. cm. 2. CMEAh. Centímetro cuadrado Células mesenquimales estromales amnióticas humanas. CME-MOh. Células multipotentes mesenquimales estromales de médula ósea humana. CME. Células multipotentes mesenquimales estromales (anteriormente. denominadas. células. mesenquimales, CMM) CO2. Dióxido de carbono. Col I. Colágeno tipo I. Col II. Colágeno tipo II. COL2A1. Colágeno tipo 2A1. COMP. Cartilage Oligomeric Matrix Protein. COX-2. Ciclooxigenasa-2. CS. Condroitín sulfato. Ct. Cycle threshold. CTL. Control. CTL-. Control negativo. DAB. 3,3´-diaminobenzidina tetrahidroclorada. DAPI. 4',6-diamidino-2-phenylindole. DEPC. Dietilpirocarbonato. DMEM. Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium. DMOADS. Disease Modifying Osteoartritis Drugs. DMSO. Dimetilsulfóxido. DNAsa I. Deoxyribonuclease I. EA. Epitelio amniótico. EDTA. Ethylenediaminetetraacetic acid. EGF. Epidermal Growth Factor. ELISA. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. EULAR. European League Against Rheumatism. XXXII. madre.

(23) Abreviaturas EVA. Escala Visual Analógica. FABP4. Fatty Acid Binding Protein 4. FACS. Fluorescence Activated Cell Sorting. FCS. Fetal Calf Serum. FITC. Fluorescein Isothiocyanate. g. Gramo. G/C. Guanina/Citosina. GAG. Glucosaminoglucanos. GAPDH. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. GPI. Glycosylphosphatidylinositol. GUSB. Glucuronidase, beta. h. Hora. HAQ. Health Assessment Questionnaire. HCAM. Homing-Associated Cell Adhesion Molecule. H-E. Hematoxilina-eosina. HGF. Hepatocyte Growth Factor. HGFR. Hepatocyte Growth Factor Receptor. HLA. Human Leukocyte Antigen. HPCA-1. Hematopoietic progenitor cell antigen 1. HPRT. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase. hTGFβ-3. Human Transforming Growth Factor beta 3. Ig. Inmunoglobulina. IL. Interleucina. KGF. Keratinocyte Growth Factor. KGFR. Keratinocyte Growth Factor Receptor. KO. Knockout. KOH. Hidróxido de potasio. l. Litro. LCA. Leukocyte Common Antigen. LPL. Lipoprotein lipase. LSCD. Limbal Stem Cell Deficiency. MA. Membrana amniótica. MATN3. Matrilin-3. MCR. Mitochondrial Respiratory Chain. XXXII I.

(24) Abreviaturas MEC. Matriz extracelular. mg. Miligramo. MgCl2. Cloruro magnésico. MHC. Major Histocompatibility Complex. MIF. Macrophage Migration Inhibitory Factor. min. Minuto. ml. Mililitro. mm. Milímetro. mM. Milimolar. MM. Tricrómico de Masson modificado. MMP. Metaloproteasa. MSC. Mesenchymal Stem Cell. MSCh. Human Mesenchymal Stem Cell. MTG. Monotioglicerol. n. Tamaño muestral. NaCl. Cloruro sódico. ng. Nanogramo. NGFR. Nerve Growth Factor Receptor. Nk. Natural killer. nl. Nanolitro. nm. Nanómetro. Nº. Número. nt. nucleótido. º. Grado. OA. Osteoarthritis. ºC. Grados centígrados. OMS. Organización Mundial de la Salud. OP. Secreted Phosphoprotein 1. OXPHOS. Oxidative Phosphorylation System. P/E. Penicilina/Estreptomicina. pb. Pares de bases. PBS. Phosphate Buffered Saline. PCR. Polymerase Chain Reaction. PE. Phycoerythrin. XXXI V.

(25) Abreviaturas PG. Proteoglicano. PGE2. Prostaglandina E2. PIB. Producto Internacional Bruto. pmol. Picomolar. PPIA. Peptidylprolyl isomerase A (Cyclophilin A). qPCR. Quantitative Polymerase Chain Reaction. qRT-PCR. Quantitative Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction. RNasa. Ribonucleasa. ROS. Reactive Oxygen Species. RPE. R-phycoerythrin. RPLP0. Ribosomal protein, large, P0. RPMI. Roswell Park Memorial Institute. RRN18S. 18S ribosomal RNA. RT-PCR. Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction. s. Segundo. Saf-O. Safranina O. SBF. Suero Bovino Fetal. SCFR. Stem Cell Factor Receptor. SER. Sociedad Española de Reumatología. SG. Sulfato de glucosamina. SLPI. Secretory Leukocyte Protease Inhibitor. SMOADS. Symptom Modifying Osteoartritis Drugs. Sox9. SRY (sex determining region-Y)-box 9. SRLP. Small Leucine-Rich Repeat Proteoglycan. ß-Actina. Beta-actina. SYSADOA. Symptomatic Slow Acting Drugs for Osteoarthritis. T0. Tiempo cero de diferenciación. Tª. Temperatura. TBP. TATA box binding protein. TGF. Transforming Growth Factor. TIMPs. Tissular inhibitors of MMPs. TNF. Tumour necrosis Factor. TRAIL. TNF-related apoptosis-inducing ligand. XXXV.

(26) Abreviaturas TRANS. Transferrina. U. Unidades. UBC. Ubiquitin C. VCAM-1. Vascular Cell Adhesion Molecule 1. VEA. Very Early Activation Antigen. Vf. Volumen final. VLA. Very Late Antigen. WOMAC. Westerm Ontario and Mc Master Universities Osteoarthritis Index. xg. Fuerza centrífuga relativa. YWHAZ. Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5monooxygenase activation protein, zeta polypeptide. XXXV I.

(27) RESUMEN.

(28) Resumen. La capacidad de reparación del cartílago articular es muy limitada, debido principalmente a que es un tejido avascular. Actualmente no existen tratamientos farmacológicos eficaces para curar la artrosis (osteoarthritis, OA), aunque algunos fármacos podrían retardar su progresión. La mayoría de los esfuerzos realizados hasta la actualidad con la finalidad de reparar una lesión de cartílago articular van encaminados a superar las limitaciones que posee este tejido para cicatrizar las lesiones, implantar nuevas células con capacidad condrogénica y facilitar el acceso al sistema vascular. Pero el problema es que se genera un tejido de reparación fibrocartilaginoso que no reúne las condiciones del cartílago articular hialino natural. Para evitar la necesidad de reemplazo protésico, se desarrollaron diferentes tratamientos celulares basados en el empleo de células multipotentes mesenquimales estromales (CME), con el objetivo de formar un tejido de reparación con estructura, composición bioquímica y comportamiento funcional biomecánico iguales que los del cartílago articular natural. En la actualidad, las CME son consideradas como una potencial Terapia Celular para el tratamiento de un amplia variedad de enfermedades, incluída la OA. La médula ósea es, por excelencia, la fuente tisular empleada para la obtención de CME adultas, pero presentan una serie de desventajas. Por ello, la identificación de fuentes alternativas de CME con fines terapéuticos sería muy beneficioso. En este estudio se ha demostrado la localización y aislamiento de dos poblaciones de CME procedentes de membrana amniótica humana (MA), las células mesenquimales estromales amnióticas humanas (CMEAh) y las células epiteliales amnióticas humanas (CEAh). Ambas poblaciones celulares mostraron similares perfiles de expresión de marcadores de superficie de progenitores mesenquimales. Sin embargo, mostraron diferencias en cuanto a su rendimiento celular y su potencial de diferenciación hacia los principales linajes mesodérmicos. En este sentido, nuestros estudios de diferenciación celular demostraron que las CMEAh poseen una mayor capacidad de diferenciación mesodérmica in vitro que las CEAh, indicando que las CMEAh contienen más células progenitoras mesenquimales.. XXXIX.

(29) Resumen En este trabajo se estudió no sólo la utilidad de la MA como fuente de CME, sino también como soporte o andamiaje. Los modelos de reparación in vitro de cartílago articular humano, empleando condrocitos, CMEAh y CEAh cultivadas sobre la MA, mostraron la síntesis de un tejido de reparación fibrocartilaginoso que mostró buena integración con el tejido nativo. Además, nuestros resultados sugieren que la reparación era de mayor calidad cuando se empleaban CME de MA, ya sean CMEAh como CEAh, que cuando se utilizaban condrocitos humanos. La posibilidad de poder obtener, mediante técnicas no invasivas, un tejido fetal que pueda ser empleado como soporte o andamiaje y que además proporcione un alto rendimiento en la recuperación de CME con una gran capacidad de proliferación, convierte a la MA en una fuente tisular alternativa de gran utilidad en el campo de la Medicina Regenerativa.. XL.

(30) Resumen. A capacidade de reparación do cartilaxe articular é moi limitada, debido principalmente a que é un tecido avascular. Actualmente non existen tratamentos farmacolóxicos eficaces para curar a artrose (osteoarthritis, OA), aínda que algúns fármacos poderían retardar a súa progresión. A maioría dos esforzos realizados ata a actualidade coa finalidade de reparar unha lesión do cartilaxe articular van encamiñados a superar as limitacións que posúe este tecido para cicatrizar as lesións, implantar novas células con capacidade condroxénica e facilitar o acceso do sistema vascular. Pero o problema é que se xenera un tecido de reparación fibrocartilaxinoso que non reúne as condicións do cartilaxe articular hialino natural. Para evitar a necesidade de remplazo protésico, desenvolvéronse diferentes tratamentos celulares co obxectivo de formar un tecido de reparación con estrutura, composición bioquímica e comportamento funcional biomecánico iguais ós do cartilaxe articular natural. Na actualidade, as células multipotentes mesenquimais estromais (CME) son consideradas coma unha potencial terapia celular para o tratamento dunha ampla variedade de enfermidades, incluída a OA. A medula ósea é, por excelencia, a fonte tisular empregada para a obtención de CME adultas, pero presentan unha serie de desvantaxes. Por elo, a identificación de fontes alternativas de CME con fins terapéuticos sería moi beneficiosa. Neste estudo demostrouse a localización e illamento de dúas poboacións de CME procedentes de membrana amniótica humana (MA), as células mesenquimais estromaiss amnióticas humanas (CMEAh) e as células epiteliais amnióticas humanas (CEAh). Ambalas dúas poboacións celulares mostraron similares perfís. de. expresión. de. marcadores. de. superficie. de. proxenitores. mesenquimais. Nembargantes, mostraron diferencias en canto ó seu rendemento celular e ó seu potencial de diferenciación de cara ós principais linaxes mesodérmicos. Neste senso, os nosos estudos de diferenciación celular amosaron que as CMEAh posúen unha maior capacidade de diferenciación mesodérmica in vitro que as CEAh, indicando que as CMEAh conteñen máis células proxenitoras mesenquimais.. XLI.

(31) Resumen Neste traballo estudiouse non só a utilidade da MA como fonte de CME senon tamén como soporte ou andamiaxe. Os modelos de reparación in vitro de cartilaxe articular humano, empregando condrocitos, CMEAh e CEAh cultivadas sobre a MA, amosaron a síntese dun tecido de reparación fibrocartilaxinoso que amosou boa integración co tecido nativo. Ademáis, os nosos resultados suxiren que a reparación era de maior calidade cando se empregaban CME de MA, xa sexan CMEAh coma CEAh, que cando se utilizaban condrocitos humanos. A posibilidade de poder obter, mediante técnicas non invasivas, un tecido fetal que poida ser empregado coma soporte ou andamiaxe e que ademáis proporcione un alto rendemento na recuperación de CME cunha gran capacidade de proliferación, convirte á MA nunha fonte tisular alternativa de gran utilidade no campo da Medicina Rexenerativa.. XLII.

(32) Resumen. Cartilage has a very limited capacity for self-repair, mostly due to its lack of vasculature. As of today, there are no pharmacological treatments that successfully cure osteoarthritis (OA), although some of them might slow down its progression. Most current efforts to repair articular cartilage are directed towards overcoming its limitations to heal these lessions, implant new cells with chondrogenic capacity and facilitate vascular access. But the main problem is that this approach leads to a fibrocartilaginous repair tissue that does not show the same properties as natural hyaline articular cartilage. To avoid the need to implant a joint prosthesis, different treatment options based on the use of multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) have been developed with the objective of achieving a repair tissue with a structure, biochemical makeup and functional behaviour similar to those of native articular cartilage. At present, MSCs are being considered as potential candidates for cell therapy in a wide variety of illnesses, including ostheoarthritis. Bone marrow is the most commonly employed source of adult MSCs, but it shows some disadvantages. For this reason, the identification of alternative sources of MSCs with therapeutic potential would be very advantageous. In the present study, the localization and isolation of two populations of MSCs,amnion mesenchymal stromal cells (hAMSC) and amnion epithelial cells (hAEC) from human amniotic membrane (hAM) has been demonstrated. Both populations showed similar profiles of mesenchymal progenitor surface markers. However, they showed differences in cellular yield and exhibited different potential of differentiation towards the main mesodermic lineages. In this sense, our studies of cellular differentiation demonstrated that hAMSC show a higher potential for mesodermic differentiation in vitro than hAEC, indicating that the hAMSC population contains a higher percentage of mesenchymal progenitors. In the present work, the usefulness of hAM, not only as a MSC source, but also as a scaffold, was investigated. The in vitro repair models for human articular cartilage, involving chondrocytes, hAMSC and hAEC cultured over the hAM, showed the synthesis of a fibrocartilaginous tissue with good integration with the surrounding native tissue. Moreover, our results suggest that the quality of. XLIII.

(33) Resumen the repair tissue resulting from the use of MSCs from hAM, either hAMSC or hAEC was better than when human chondrocytes were used. The possibility of obtaining, through non-invasive techniques, a foetal tissue that can be used as a cell delivery scaffold and in addition can provide a high yield of MCSs with high proliferative capacity, reveal hAM as an extremely valuable alternative cell source in the field of regenerative medicine.. XLIV.

(34) 1.. INTRODUCCIÓN. "La ciencia se compone de errores, que a su vez, son los pasos hacia la verdad." Julio Verne.

(35) Introducción. 1.1. EPIDEMIOLOGÍA Y COSTE ECONÓMICO DE LA ARTROSIS. La artrosis (osteoarthritis, OA) es la patología articular más frecuente en el mundo desarrollado, aunque su prevalencia no se conoce con exactitud. Esto se debe a la complejidad que conlleva el estudio de esta dolencia, que es altamente dependiente de los criterios utilizados para definir la enfermedad, la selección de las muestras y la localización de la OA (Comas et al., 2010; Fernández-López et al., 2008). En el año 2001, la Sociedad Española de Reumatología (SER) desarrolló un estudio de prevalencia de enfermedades reumáticas en España, el estudio EPISER (Carmona et al., 2001). Este estudio no sólo demostró que se trata de la causa más importante de discapacidad entre la población española (Comas et al., 2010), al igual que sucede en el resto de países desarrollados, sino que es una de las causas más importantes de dolor, discapacidad y pérdida de calidad de vida. Además, consume una gran cantidad de recursos sanitarios (Carmona et al., 2001). Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la OA afecta al 80% de la población mayor de 65 años en los países industrializados. Estudios recientes sobre el coste de la OA en rodilla y en cadera en España han estimado un coste anual medio total de 1.502 euros (€) por paciente (Figura I1).. Figura I1. Representación del coste anual por paciente de la OA de rodilla y de cadera. Figura extraída y modificada de Loza et al. (2009).. 3.

(36) Introducción. Dado que la población española mayor de 20 años en 2007 era de 36.389.028 habitantes y que la prevalencia de la OA de rodilla y de cadera era de 10,2% y 4% respectivamente, se estimó un coste de 4.738 millones de € para esta enfermedad, lo que supone un 0,5% del producto interior bruto (PIB) (Loza et al., 2009). Estudios similares se han desarrollado en otros países, confirmando no sólo la alta prevalencia de esta enfermedad en todo el mundo (Kotlarz et al., 2009), sino también el elevado impacto económico relacionado con la misma (Loza et al., 2009; Kotlarz et al., 2009). El número de personas afectadas se ha incrementado rápidamente en años sucesivos, una tendencia que se espera continúe. De ahí los esfuerzos para incrementar la concienciación sobre esta enfermedad, proporcionar mejores sistemas de rastreo y selección e identificar pacientes con OA en estadios tempranos de la enfermedad, lo que podría ayudar a retrasar su progresión y sus efectos debilitantes (Kotlarz et al., 2009). El Colegio Americano de Reumatología (American College of Rheumatology, ACR) define la OA como un grupo heterogéneo de condiciones que conducen a síntomas y signos articulares, los cuales se asocian con defectos en la integridad del cartílago articular, alteraciones relacionadas con el hueso subcondral y cambios en los márgenes articulares (Woolf y Pfleger, 2003).. La OA se caracteriza por una pérdida de cartílago articular que a menudo se atribuye al desgaste natural. No obstante, el envejecimiento del sistema musculoesquelético incrementa la susceptibilidad a la OA, pero por sí mismo no la causa. Este concepto es consistente con la naturaleza multifactorial de la OA y con el conocimiento de que no todos los adultos desarrollan OA y no todas las articulaciones del cuerpo se ven afectadas en el mismo grado (Anderson y Loeser, 2010).. 1.2. VALORACIÓN DE LA ARTROSIS La OA se valora generalmente tanto por manifestaciones radiológicas como por el grado de dolor y discapacidad que conlleva.. 4.

(37) Introducción. Las clasificaciones radiológicas más utilizadas son la de Kellgren y Lawrence (1957) y la de Ahlbäck (1968). 1.2.1. Escala de Kellgren y Lawrence (1957).- Se basa en el grado de estrechamiento del espacio articular, la formación de osteofitos y la esclerosis del hueso subcondral. Para cualquier articulación: 0. No: ausencia de osteofitos, estrechamiento o quistes. 1. Dudosa: presencia sólo de osteofitos. 2. Mínima: presencia de pequeños osteofitos, estrechamiento moderado de la interlínea articular, presencia de quistes y esclerosis. 3. Moderada: presencia clara de osteofitos de tamaño medio y estrechamiento de la interlínea articular. 4. Severa: presencia de osteofitos de gran tamaño y estrechamiento grave de la interlínea articular. 1.2.2. Clasificación de Ahlbäck (1968).- Se basa en la valoración del espacio tibiofemoral para la estratificación de los cambios degenerativos en la articulación de la rodilla, clasificándolos en cuatro grupos: a). Estadio 0: Cartílago normal.. b). Estadio 1: Inflamación y debilitamiento.. c). Estadio 2: Pérdida de sustancia < 50%.. d). Estadio 3: Pérdida de sustancia > 50%.. e). Estadio 4: Hueso subcondral desnudo.. Para valorar el grado de dolor y discapacidad se usan diversos instrumentos como la Escala Visual Analógica de dolor (EVA), la escala Likert, el Stanford Health Asessment Questionnaire (HAQ) y el The Westerm Ontario and Mc Master Universities Osteoarthritis Index (WOMAC). 1.2.3. Escala Visual Analógica (EVA).- Permite medir la intensidad del dolor que describe el paciente con la máxima reproductibilidad entre los observadores. Consiste en una línea horizontal de 10 cm, en cuyos extremos se encuentran las expresiones extremas de un síntoma. En el izquierdo se ubica la ausencia o menor intensidad y en el derecho la mayor intensidad. Se pide al paciente que marque en la 5.

(38) Introducción. línea el punto que indique la intensidad del síntoma, la cual se mide con una regla milimetrada y se expresa en cm o mm.. Figura I2. Representación de la escala EVA para la valoración de la intensidad del dolor. Extraída de www.accurauhd.com/doc_escalas.html.. 1.2.4. Escala de Likert.- Cuantifica el dolor y la capacidad funcional de los pacientes, clasificando el dolor en 5 puntos: (1) sin dolor, (2) dolor leve, (3) dolor moderado,. (4). dolor. severo. y. (5). dolor. muy. severo.. (www.sochire.cl/filemanager/download/384/). 1.2.5. Health Assessment Questionnaire (HAQ).- Consiste en un cuestionario que realiza el paciente, en el que se valora la capacidad funcional para realizar actividades de la vida diaria. Está compuesto por 20 preguntas sobre el grado de dificultad física para realizar actividades de la vida diaria agrupadas en 8 áreas: vestirse, levantarse, comer, caminar, higiene, etc., evaluando cada actividad como: (0) ninguna dificultad, (1) alguna, (2) mucha y (3) incapaz de hacerlo (Battle-Gualda et al., 2002). 1.2.6. The Westerm Ontario and Mc Master Universities Osteoarthritis Index (WOMAC). - Es un cuestionario autoadministrado que se puede responder en cinco min. Contiene 24 cuestiones referidas a dolor, rigidez y capacidad funcional. Este índice se desarrolló como un instrumento de medida estándar y válido internacionalmente para evaluar los resultados de los tratamientos de la OA en ensayos clínicos (Ramón, 2001). También se emplea la clasificación de Altman (1986), de la ACR, que combina criterios clínicos, edad superior a 50 años y evidencia radiológica según la clasificación de Kellgren y Lawrence (1957).. 6.

(39) Introducción. 1.3. FACTORES DE RIESGO PARA EL DESARROLLO DE LA ARTROSIS. Estudios epidemiológicos han revelado que existen tanto factores de riesgo endógenos como exógenos implicados en el desarrollo de la OA (Anderson y Loeser, 2010). Entre los factores endógenos, se encuentran la edad, el sexo, la herencia, el origen étnico y los cambios post-menopáusicos. Los factores exógenos incluyen macrotraumas, microtraumas repetitivos, obesidad, cirugía resectiva de la articulación y factores relacionados con el estilo de vida como el alcohol y el tabaco (Michael et al., 2010). En relación a los macrotraumas, las lesiones en el ligamento cruzado anterior son la causa más común de desarrollo post-traumático de la OA de rodilla en jóvenes adultos, como resultado de lesiones deportivas (Anderson y Loeser, 2010).. 1.3.1. La edad como factor de riesgo endógeno La edad es uno de los factores endógenos más estudiados. Diferentes investigaciones han demostrado que los cambios relacionados con la edad en el menisco, así como el remodelado del hueso regional, contribuyen al desarrollo y a la progresión de la OA, aunque el mecanismo por el cual lo realizan no está del todo claro. Otro proceso típico que se relaciona con la edad es la calcificación y la formación de cristales de calcio en los tejidos articulares, denominada condrocalcinosis. A pesar del aumento en la prevalencia de este fenómeno, el papel de los cristales de calcio en la progresión de la OA no se conoce con claridad. Una de las condiciones asociadas con el envejecimiento es la pérdida de la capacidad de las células y los tejidos del cuerpo para mantener la homeostasis, es decir, la disminución de la capacidad de compensar estados de estrés. En el cartílago OA, las señales catabólicas e inflamatorias se encuentran en exceso con respecto a las señales anabólicas y anti-inflamatorias. Este desequilibrio desencadena un incremento de la producción de enzimas que degradan la matriz extracelular (MEC) del cartílago, como son las metaloproteasas (MMP), las agrecanasas y otras proteasas.. 7.

(40) Introducción. Con el envejecimiento también ocurren cambios en la MEC que podrían contribuir al desarrollo de OA (Anderson y Loeser, 2010). Estudios con imágenes de resonancia magnética han revelado que el cartílago de la rodilla disminuye su espesor conforme aumenta la edad, sugiriendo que se produce una pérdida gradual de la MEC. Una de las modificaciones más estudiadas es la que afecta al colágeno tipo II (Col II), que constituye el 90% del colágeno que compone la MEC, causada por el efecto de los productos finales de glicosilación avanzada (advanced glicosilation endproducts, AGEs). Los AGEs producen un incremento del entrecruzamiento de las moléculas de colágeno, aumentando la rigidez del cartílago, haciéndolo más quebradizo y más susceptible a un fallo por estrés mecánico. Al mismo tiempo, se producen cambios en la molécula de agrecano (Agg), la segunda proteína más abundante de la MEC. En esta proteína, durante el envejecimiento, se han detectado cambios en el tamaño, la estructura y la sulfatación, que afectan a la hidratación y la elasticidad del cartílago. Cuando el Agg se degrada, el fragmento que contiene la región de unión al ácido hialurónico (AH) se acumula en el cartílago debido a la baja capacidad de movimiento. El fragmento que permanece unido al AH, ocupa el espacio en el que se podría unir una molécula recién sintetizada de Agg. De esta manera, estarían presentes agregados de proteoglicanos (PG) más pequeños. Otro factor asociado con el envejecimiento en diferentes tejidos, incluido el cartílago, es el daño oxidativo debido a la producción crónica de las especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species, ROS) o de radicales libres. Un incremento en la producción de ROS conduce a un estrés oxidativo en el que la cantidad de ROS excede la capacidad anti-oxidante de la célula. En la OA, existen varios mediadores inflamatorios que se encuentran incrementados, como la interleucina (IL)-1, IL-6, IL-8 y el factor de necrosis tumoral (tumour necrosis factor, TNF)-α, que estimulan la producción de ROS. El exceso de producción de ROS por los condrocitos puede dañar directamente a las proteínas intracelulares y a la MEC, así como provocar la producción y la actividad de las MMPs, lo que puede estimular la degradación del cartílago (Anderson y Loeser, 2010).. 1.3.2. Riesgo genético Desde los años 40 han surgido evidencias sobre la predisposición genética a la OA (Valdes y Spector, 2010). Estudios realizados en Oxford demostraron una fuerte 8.

(41) Introducción. agregación familiar, menor que para las artropatías inmunes, no mucho menores que para la artritis reumatoide y mucho más elevadas que para enfermedades metabólicas como la diabetes tipo 2 (Valdés y Spector, 2010). Dichos estudios determinaron que la influencia de los factores genéticos en la OA de mano, cadera y rodilla en mujeres estaba entre un 39% y un 65%, independientemente de los factores demográficos o ambientales. Análisis genéticos realizados a gran escala en el genoma de familias pequeñas o en parientes/familiares de gemelos afectados por la OA, determinaron intervalos genómicos que podrían albergar susceptibilidad a esta patología en los cromosomas 2, 4, 7, 11, 16, 19 y el cromosoma X (Valdes y Spector, 2010). Aún así, hasta ahora, no se han identificado genes de susceptibilidad ligados por sí solos. Como se ha mencionado anteriormente, la conservación del cartílago articular depende, en gran medida, del mantenimiento de la biomecánica del hueso subcondral y cortical (O´Driscoll, 1998), ya que es fundamental para absorber las fuerzas de impacto. Es por ello que las alteraciones en los genes que mantienen la biología del cartílago articular, tales como colágeno tipo 2A1 (COL2A1), matrilin-3 (MATN3) o la proteína oligomérica de la matriz del cartílago (cartilage oligomeric matrix protein, COMP), provocan cambios en el cartílago que causan una incapacidad en la absorción de cargas. Esto deriva en un impacto directo sobre el hueso subcondral que termina destruyéndolo. Entre los efectos visibles de esta progresiva destrucción, se encuentran la formación de osteofitos y esclerosis, características que encontramos en la OA. En muestras de pacientes OA se ha encontrado una proporción significativamente más alta de condrocitos apoptóticos que en los controles. La muerte del condrocito puede producirse mediante dos vías: la mediada por receptores y la mediada por la mitocondria. En la vía mediada por receptores se observa una estimulación de un grupo de la familia del receptor del TNF, como es el Fas ligando, que promueve la muerte de condrocitos primarios en la OA. La vía apoptótica mitocondrial es la más importante de muerte programada en el condrocito (Figura I3). En este sentido, se ha demostrado que la producción de radicales libres mitocondriales compromete la función del condrocito (Kim y Blanco, 2007). Este orgánulo juega un papel fundamental en la síntesis de adenosín trifosfato (ATP) vía fosforilación oxidativa (Oxidative Phosphorylation System, OXPHOS). Varios estudios han demostrado la. 9.

(42) Introducción. relación existente entre los diferentes haplogrupos, definidos como sitios polimórficos en las regiones del ADN mitocondrial (ADNmt) codificantes que definen grupos de ADNmt relacionados, con la OA (Rego et al., 2010). En el año 2008 se pudo confirmar un efecto protector del haplogrupo J en la OA de rodilla y de cadera (Fernández-Moreno et al., 2008; Rodríguez-Lopez et al., 2008). En esos estudios, se propuso como hipótesis que mutaciones en estas regiones del ADNmt característico de este haplogrupo podrían desacoplar la OXPHOS. De esta manera, se disminuiría la producción de ROS, incrementando la oxidación mediante la cadena de transporte de electrones, reduciendo de este modo el daño oxidativo y la apoptosis.. Figura I3. Ruta de la apoptosis mediada por la mitocondria. Extraída de http://www.sabiosciences.com /pathway.php?sn=Mitochondri al_Apoptosis. El riesgo de padecer OA en rodilla y cadera se ha asociado a variaciones en el ADNmt, ya que desempeña un papel fundamental en la apoptosis mediada por la mitocondria (Blanco et al., 2007). El análisis comparativo entre condrocitos de individuos carentes de patología artrósica y los procedentes de pacientes con dicha patología ha demostrado una disminución significativa de la actividad de los complejos II y III de la cadena respiratoria mitocondrial (mitocondrial respiratory chain, MCR) (Maneiro et al., 2003). Además, la inhibición de los complejos III y V de. 10.

(43) Introducción. la MCR provoca una disminución de la respuesta inflamatoria, relacionada con un descenso en la producción de prostaglandina E2 (PGE2) y ROS (Cillero-Pastor et al., 2008).. 1.4. TRATAMIENTOS APLICADOS A LA ARTROSIS. Los procedimientos que actualmente están disponibles para el tratamiento de la OA no curan esta enfermedad. Son de tipo paliativo centrados en eliminar el dolor y la inflamación que se produce durante el proceso patológico. Existen distintos tipos de tratamientos aplicables según el grado y el estado del dolor del paciente.. 1.4.1. Tratamiento no farmacológico El tratamiento de los pacientes afectados por la OA comienza en un primer momento con el objetivo de prevenir que se desarrolle la incapacidad de la articulación afectada. Dentro de este tipo de tratamientos, se encuentra la educación sanitaria, que tiene como objetivo enseñar al paciente a vivir de acuerdo con sus limitaciones articulares, evitando sobrecargas, modificando posturas incorrectas y realizando actividades adecuadas. También se aconseja tratamiento dietético en aquellos pacientes afectados con obesidad. Se ha demostrado la eficacia de la actividad física en pacientes con OA de rodilla y cadera, realizando ejercicio acuático o caminando. En los casos en los que sea necesario, se recomendará el uso de instrumentos de apoyo, disminuyendo las fuerzas de carga sobre la articulación afectada.. 1.4.2. Tratamiento farmacológico Este tipo de tratamientos han de ser complementarios a las medidas no farmacológicas. Los tratamientos farmacológicos actúan minimizando el dolor y la inflamación de la articulación. El ACR y la Liga Europea contra el Reumatismo (European. League Against. Rheumatism,. farmacológico utilizado en la OA en dos grupos:. 11. EULAR) clasifican el tratamiento.

(44) Introducción.  Fármacos que modifican la sintomatología: Symptom Modifying OsteoArthritis Drugs (SMOADS). A. Fármacos de acción rápida. I. Analgésicos no opioides.- Estos analgésicos combaten el dolor, incluyendo el dolor articular, pero no afectan a la OA en sí misma. Tienen. un. bajo. coste,. menos. efectos. secundarios. que. los. antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y un fácil manejo. El más utilizado es el paracetamol. II. Analgésicos opioides.- No han demostrado una eficacia superior al paracetamol o al ácido acetilsalicílico en el alivio del dolor. III. Anti-inflamatorios no esteroideos (AINE).- Son un grupo heterogéneo de sustancias químicas con actividad anti-inflamatoria, analgésica y antipirética. Inhiben la síntesis de prostaglandinas y leucotrienos y la liberación de otros mediadores inflamatorios por los polimorfonucleares en la inflamación aguda y crónica. La toxicidad es la mayor razón para no recomendar el empleo de AINE como primera línea terapéutica en pacientes con OA. IV. Inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (COX-2).- Esta enzima está implicada en la inflamación, la mitogénesis y la transducción de señales. Los inhibidores selectivos de la COX-2 poseen una acción antiinflamatoria similar a la de los AINE convencionales, pero producen menos efectos gástricos indeseables (dispepsia, úlcera). V. Glucocorticoides intraarticulares.- Su inyección en la cavidad articular puede ser usada como monoterapia en pacientes seleccionados o como adyuvante a la terapia sistémica. Está indicada fundamentalmente en pacientes con OA de rodilla y dolor importante con o sin derrame articular. Se trata de una técnica invasiva. B. Fármacos de acción lenta: Symptomatic Slow Acting Drugs for Osteoarthritis (SYSADOA): I. Precursores de la matriz cartilaginosa • Sulfato. de. glucosamina. (SG).-. La. glucosamina. es. un. aminomonosacárido, precursor básico de la estructura de los glucosaminoglucanos (GAG) que forman la parte no celular del. 12.

(45) Introducción. tejido conectivo del organismo. Este componente intercelular es el principal responsable de la función mecánica del cartílago. En dos estudios de tres años de duración (Mongil et al., 2006), se ha demostrado que el SG reduce la progresión radiológica de la OA de rodilla. Respecto al perfil de seguridad, este fármaco es aceptable. Los efectos adversos más frecuentes son de tipo gastrointestinal (dolor epigástrico, náuseas, diarrea), prurito, reacciones cutáneas y cefaleas. • Condroitín sulfato (CS).- Es un polisacárido lineal, formado por repeticiones de disacáridos compuestos de un amino azúcar y un ácido urónico, es decir, es un componente de la familia de los GAG. Este medicamento podría actuar como nutriente del cartílago articular OA, aliviando la sintomatología y retrasando la evolución de la enfermedad. • Ácido hialurónico (AH).- Es un GAG lineal de longitud variable que forma parte de la matriz MEC del tejido conectivo. El objetivo de este tratamiento sería tanto la atenuación del dolor y de la impotencia funcional, como la restauración de la homeostasis articular. II. Moduladores de las citocinas: • Diacereína.- Tras su administración oral, este medicamento se metaboliza completamente en reína, su metabolito activo, que actúa como un inhibidor de la IL-1. Inhibe. la producción y la. actividad de la IL-1 y la secreción de MMP, sin afectar a la síntesis de las prostaglandinas. También reduce la expresión de la enzima colagenasa, que produce la degradación del cartílago articular, disminuye la actividad fibrinolítica en el líquido sinovial y en los fibroblastos sinoviales y disminuye la producción de anión superóxido. • Piascledine.- Los ensayos in vitro realizados con este fármaco le otorgan propiedades inhibitorias sobre la IL-1 y estimuladoras de la síntesis de colágeno.. 13.

(46) Introducción. • Inhibidores de las metaloproteasas.- Entre estos se encuentran aquellos que inhiben la actividad de las MMP, la resorción ósea, la angiogénesis y la degradación de la MEC.  Fármacos modificadores de la enfermedad artrósica: Disease Modifying OsteoArthritis Drugs (DMOADS) (Figura I4). Actualmente no existe ningún fármaco al que se le haya reconocido la capacidad de frenar la enfermedad artrósica. Este tipo de tratamiento se recomendaría en estadios moderados de OA, de manera que se frene la progresión de la enfermedad evitando la prevalencia de los procesos catabólicos.. 1.4.3. Tratamiento quirúrgico Este tipo de tratamiento se reserva para pacientes con OA avanzada e incapacitante, muy sintomática y en la que no se haya obtenido una respuesta clínica satisfactoria con las terapias previamente descritas (Figura I4). La cirugía puede ser necesaria para atenuar el dolor y recuperar la mayor función posible de la articulación, o corregir una deformidad.. Figura I4: Esquema en el que se resumen las diferentes estrategias terapéuticas a desarrollar en función del grado de afectación de la articulación, medida en función de la masa de los diferentes tejidos que la componen. Extraído y modificado de Bay-Jensen et al. (2010).. 14.

(47) Introducción. Así, puede realizarse un tratamiento quirúrgico de tipo corrector como la osteotomía. Esta técnica permite realinear y colocar en posición correcta la articulación. Se aplica, sobre todo, a la rodilla y puede prevenir la progresión de la enfermedad. Otro tratamiento quirúrgico es la artrodesis, desarrollada principalmente en la columna vertebral, aunque también en el pie. En este caso, se realiza la fusión de superficies articulares, lo que produce una inmovilización de la articulación anulando el desgaste. Sólo se realizará en casos excepcionales. Un tratamiento más puede ser la artroplastia. Consiste en sustituir total o parcialmente las zonas deterioradas de la articulación, utilizando prótesis artificiales formadas por componentes de metal, plástico y cerámica. Las artroplastias más frecuentes son las de cadera y rodilla. A pesar de que los resultados obtenidos, en general son buenos, dependerán de múltiples factores: experiencia del equipo quirúrgico, momento en el que se lleve a cabo la cirugía, rehabilitación posterior, etc. (Lozano, 2003; Battle-Gualda et al., 2002; Ramón, 2001).. 1.4.4. Terapias para reparar lesiones del cartílago articular. Los defectos en el cartílago articular hialino causados por traumas mecánicos propician el desarrollo de un proceso artrósico. El cartílago articular adulto se caracteriza por una escasa capacidad de reparación espontánea. Además, el tejido de reparación generado carece de la estructura histológica, la composición bioquímica y el comportamiento funcional del tejido nativo. Para evitar la necesidad de reemplazo protésico, se han desarrollado distintos tratamientos de terapia celular con el objetivo de regenerar un tejido con estructura, composición bioquímica y comportamiento funcional iguales a los del cartílago articular natural (Bedi et al., 2010; Fuentes-Boquete et al., 2007).. A. Penetración del hueso subcondral.- Esta técnica se basa en abrir la lesión que afecta al cartílago hacia el hueso subcondral (Figura I5). Esto permite la migración de células mesenquimales estromales (CME) de la médula ósea, que llevan a cabo la reparación del defecto gracias a su capacidad de diferenciarse a fibrocondrocitos (Pelttari et al., 2009). La técnica quirúrgica. 15.

(48) Introducción. que ofrece los mejores resultados es la microfractura. La reparación del tejido está limitada por el tamaño del defecto y por la edad del paciente, ya que con la edad disminuye la población de CME. Diferentes estudios han demostrado que el tejido de reparación así formado es de tipo fibrocartilaginoso y, con el tiempo, muestra signos de degeneración (Pelttari et al., 2009). Sin embargo, los resultados clínicos contradicen, de algún modo, los hallazgos relativos a la calidad del tejido de reparación. En un estudio, en el que se realizó el tratamiento de rodillas con defectos osteocondrales mediante la microfractura, ha proporcionado buenos resultados clínicos transcurridos dos años posttratamiento (Knutsen et al., 2004).. A. B. Figura I5. Penetración del hueso subcondral. Eliminación del cartílago calcificado (A) para permitir la adhesión del coágulo del sangrado procedente de la médula; apertura de los canales al hueso subcondral (B). Imagenes tomadas y modificadas de Bedi et al. (2010).. B. Injertos de periostio y pericondrio.- El periostio es una vaina fibrosa situada alrededor de los huesos, que contiene las terminaciones nerviosas y los vasos sanguíneos que dan sensibilidad y nutren al hueso (Figura I6). El pericondrio es una cubierta fibrosa de tejido conjuntivo que rodea el cartílago (Figura I6). Estas membranas contienen CME que pueden experimentar condrogénesis (Duynstee et al., 2002; O’Driscoll et al., 2001).. 16.

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