Caracterización estructural de los metabolitos secundarios de Senecio polypodioides

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

PROSGRADO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA

Caracterización estructural de los

metabolitos secundarios de Senecio

polypodioides

T e s i s

Para obtener el grado de

Maestro en Ciencias Quimicobiológicas

Presenta:

Claudia Villanueva Cañongo

Director de tesis:

Dr. Eleuterio Burgueño Tapia

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El presente trabajo se llevó a cabo en el departamento de Química Orgánica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Eleuterio Burgueño Tapia, con el apoyo de la beca CONACyT 232536 y PIFI 20100709.

Este trabajo forma parte del proyecto CONACyT “Estudio químico-biológico y por RMN de terpenoides, alcaloides y derivados del ácido shiquímico de origen vegetal” (62213) y del proyecto SIP 20100709.

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v

A mi Madre y a mis hermanas:

A mi Madre y a mis hermanas:

A mi Madre y a mis hermanas:

A mi Madre y a mis hermanas: A mi hermosa familia donde

tuve el privilegio de nacer.

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vi

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo de investigación no hubiera sido posible sin el apoyo de mucha gente. Gracias al Dr. Eleuterio Burgueño Tapia, quien leyó mis numerosas revisiones y me ayudó a dar sentido a la confusión. Gracias también a los miembros de mi comité de tesis. Gracias a la Dra. Beatriz Hernández Carlos, por brindarme en todo momento su apoyo y confianza. Gracias a mi Maestro Carlos Guillermo Hernández, por su enorme cariño, por su apoyo incondicional. A mi maestra Paula Cecilia Guadarrama Mendoza por su amoroso apoyo y cariño. Gracias a mi familia y mis amigos que me facilitaron el paso por este camino ofreciéndome siempre apoyo y amor.

Me llevaría todas las hojas de este escrito en agradecer a todas y cada una de las personas involucradas en este trabajo, por lo que me limito a agradecerles con mi pensamiento y mi infinito cariño, ya que sin todas esas personas no hubiera logrado empezar, desarrollar y finalizar este proceso. Gracias a todos, juntos hemos terminado y yo sólo lo escribí en estas hojas.

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RESUMEN

El género Senecio, de la familia Asteraceae, se caracteriza por contener dentro de sus metabolitos secundarios principales a alcaloides pirrolizidínicos, además de eremofilanólidos y furanoeremofilanos. Algunos de estos compuestos han mostrado cierta actividad biológica contra insectos y otros han mostrado actividad fitotóxica en algunas especies vegetales y actividad citotóxica en líneas celulares. El género Senecio cuenta con una amplia variedad de especies, se conocen alrededor de 1500 alrededor del mundo. En México se conocen alrededor de 165 de esas especies, de las cuales la mayoría no han sido estudiadas, su estudio es limitado o no tienen estudios químicos relacionados con sus metabolitos secundarios. Un ejemplo de ello es Senecio polypodioides que sólo cuenta con un estudio químico. Tomando en consideración lo anterior, en este trabajo de investigación se decidió estudiar los metabolitos secundarios presentes de esta especie de Senecio.

En el estudio químico de los extractos hexánico de la parte aérea y metanólico de la raíz de Senecio polypodioides (Asteraceae) se aislaron por cromatografía en columna abierta, el nuevo eudesmanoide (63) y a los alcaloides pirrolizidínicos ya descritos sarracina N-óxido (60), sarracina (61) y 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62). Se presenta la caracterización estructural de los compuestos aislados de los extractos hexánico de la parte aérea y metanólico de la raíz de S. polypodioides. La asignación de los datos espectroscópicos de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de 1H y 13C se hizo a través

del análisis de los experimentos en una y dos dimensiones (gCOSY, gHSQC, gHMBC, NOE difference y NOESY 2D). Así como, su análisis conformacional llevado a cabo a través del análisis de las constantes de acoplamiento (3JH-H) y métodos computacionales a

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viii ÍNDICE Dedicatorias ... v Agradecimientos ...vi Resumen ... vii Índice ... viii Índice de figuras ... x

Índice de cuadros ... xii

1. INTRODUCCIÓN ... 1

2. ANTECEDENTES ... 2

2.1. Género Senecio ... 2

2.2. Metabolitos secundarios en Senecio ... 3

2.2.1. Alcaloides ... 3

2.2.2. Alcaloides pirrolizidínicos (APs) ... 5

2.2.3. Eremofilanos ... 9

2.3. Alcaloides pirrolizidínicos y eremofilanos aislados de especies de Senecio ... 10

2.4. Actividad biológica ... 12 3. HIPÓTESIS ... 14 4. OBJETIVOS ... 14 4.1. Objetivo general ... 14 4.2. Objetivos específicos ... 14 5. METODOLOGÍA ... 15

5.1. Colecta del material vegetal ... 15

5.2. Extracción de la raíz de Senecio polypodioides ... 15

5.3. Extracción de la parte aérea de Senecio polypodioides ... 15

5.4. Aislamiento de los alcaloides pirrolizidínicos (APs) de la raíz de Senecio polypodioides ... 16

5.4.1. Cromatografía del extracto CHCl3 ... 16

5.4.2. Reducción de la sarracina N-óxido ... 16

5.4.3. Aislamiento del componente minoritario del extracto CHCl3 ... 16

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ix

5.5. Aislamiento del componente mayoritario de la parte aérea de Senecio

polypodioides ... 17

5.6. Análisis conformacional ... 17

5.7. Obtención de los datos espectroscópicos ... 18

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 19

6.1. Extractos ... 19

6.2. Elucidación del compuesto mayoritario de la raíz de Senecio polypodiodes ... 19

6.3. Reducción de la sarracina N-óxido ... 24

6.4. Elucidación del compuesto minoritario de la raíz de Senecio polypodioides ... 26

6.5. Análisis conformacional del compuesto minoritario de la raíz de Senecio polypodioides ... 34

6.6. Elucidación del compuesto mayoritario de la parte aérea de Senecio polypodioides ... 38

6.7. Análisis conformacional del compuesto mayoritario de la parte aérea de Senecio polypodioides ... 51

7. CONCLUSIONES ... 53

8. ANEXO ... 54

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ÍNDICE DE FIGURAS Figura

1. Parte aérea de Senecio polypodioides ... 3

2. Raíz de Senecio polypodioides ... 3

3. Compuestos reconocidos como alcaloides, que no entran en la definición de alcaloide descrita por Winterstein y Trier. ... 4

4. Base necínica y ácidos nécicos más comunes en APs. ... 5

5. APs comúnmente presentes en la familia Senecioneae ... 5

6. Porcentajes (%) de distribución de 14C en S. vulgaris como una medida de biosíntesis de senecionina N-óxido. ... 6

7. Transformaciones de la senecionina N-óxido para dar lugar a la variedad de APs ... 7

8. Biosíntesis de la base necínica de los APs ... 8

9. Las cinco estructuras básicas de los alcaloides pirrolizidínicos. ... 9

10. Sesquiterpenoides ... 9

11. Esqueleto básico de los furanoeremofilanoides y eremofilanólidos... 10

12. Iodantina aislada de las especies mexicanas, S. iodanthus y S. bracteatus ... 10

13. APs aislados de especies mexicanas del género Senecio ... 11

14. Eremofilanoides aislados de la especie mexicana de Senecio. S. mairentianus ... 11

15. Eremofilanoides aislados de especie mexicana de Senecio. S. pericalia y S. sinuatus Gilib ... 12

16. Eremofilanoides y APs con actividad inhibitoria de la alimentación (IA) ... 12

17. APs con actividad biológica: actividad IA, fitotóxica y citotóxica ... 13

18. Eremofilanoides con actividad inhibitoria de la alimentación en insectos ... 13

19. Espectro de RMN 1H del extracto metanólico de S. polypodiodes en DMSO-d 6 (500 MHz) ... 21

20. Espectro de RMN 1H de la sarracina N-O presente en la raíz de S. polypodiodes (60) en CDCl3 (500 MHz). ... 22

21. Espectro de RMN de 13C de la sarracina N-O presente en la raíz de S. polypodioides (60) en CDCl3 (125 MHz). ... 23

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22. Espectro de RMN 1H de la sarracina (61) como compuesto mayoritario de la raíz de

S. polypodioides en CDCl3 (500 MHz) ... 25

23. Espectro de RMN de 1H de 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) presente en la raíz de S. polypodioides en CDCl3 (500 MHz) ... 29

24. Espectro de RMN 13C de 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) presente en la raíz de S. polypodioides en CDCl3 (125 MHz) ... 30

25. Experimento DEPT de 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) ... 31

26. Experimento RMN NOE difference 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) ... 32

27. Espectro de RMN 1 H de 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) en CDCl3 después de filtrado en alúmina neutra (500 MHz) ... 33

28. Confórmeros de mínima energía DFT/B3LYP/6-31G* de 62 ... 36

29. Confórmero de menor energía 62a y sobreposición de sus análogos 62c y 6co ... 36

30. Espectro de RMN 1H del compuesto mayoritario 63 de la parte aérea de S. polypodioides en CDCl3 (500 MHz). ... 40

31. Espectro de RMN 13C del compuesto mayoritario 63 de la parte aérea de S. polypodioides en CDCl3 (125 MHz) ... 41

32. Sección del experimento gCOSY del compuesto 63 ... 42

33. Sección del experimento gHSQC del compuesto 63 ... 46

34. Sección del experimento gHSQC para la asignación de los metilenos del compuesto 63. ... 47

35. Experimento gHMBC del compuesto 63 ... 48

36. Sección del experimento gHMBC del compuesto 63. . ... 49

37. Experimento NOESY 2D del compuesto 63. ... 50

38. Confórmero de mínima energía DFT/B3LYP/6-31G* de 63a y sobreposición de 63a-c y 63e. ... 52

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ÍNDICE DE CUADROS Cuadro

1. Datos de desplazamientos químicos de RMN de 1H y de 13 C de la sarracina N-óxido

(60) y sarracina (61) ... 26 2. Datos de desplazamientos químicos de RMN de 1H y de 13C de

7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) ... 34 3. Energía relativa (kcal/mol) y porcentaje de población conformacional de 62 al nivel de

cálculo MMFF94 y B3LYP/6-31G* ... 35 4. Valores de las constantes de acoplamiento (J en Hz) calculadas y experimentales para

62 ... 37

5. Datos de desplazamientos químicos de RMN de 1H y de 13C del compuesto

mayoritario de la parte aérea de S. polypodioides 63 ... 45 6. Energía relativa (kcal/mol) y porcentaje (%) de población conformacional de 63 al

nivel de cálculo MMFF94 y B3LYP/6-31G* ... 51 7. Valores de las constantes de acoplamiento (J en Hz) calculadas y experimentales para

63. ... 52 Página

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1. INTRODUCCIÓN

El género Senecio cuenta con una amplia variedad de especies, se conocen alrededor de 1500 alrededor del todo el mundo (Christov et al., 2002), y en México se conocen alrededor de 165 de esas especies (Romo de Vivar et al., 2007). Debido a su amplia distribución en la naturaleza, algunas de estas especies no han sido estudiadas, su estudio es limitado o no tienen estudios químicos relacionados con la elucidación estructural de sus metabolitos secundarios.

El género Senecio se caracteriza por tener como metabolitos secundarios principales a alcaloides pirrolizidínicos, además de eremofilanólidos y furanoeremofilanos (Bohlmann, 1977; Rizk, 1991; Reina M. et al., 2001; Burgueño-Tapia et al., 2003; 2004; 2007), algunos de estos compuestos han demostrado cierta actividad biológica, relacionada con la actividad inhibitoria de la alimentación sobre algunas larvas o insectos en su estado adulto (Reina M. et al., 2001; Burgueño-Tapia et al., 2007), además se ha documentado actividad fitotóxica en algunas especies vegetales, así como también actividad citotóxica en líneas celulares (González-Coloma et al., 2008).

Tomando en cuenta lo anterior, en este trabajo de investigación se decidió estudiar los metabolitos secundarios presentes en Senecio polypodioides.

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2. ANTECEDENTES 2.1. Género Senecio

La familia de las Asteraceae cuenta con 13 tribus, siendo la más amplia la Senecioneae que tiene alrededor de 3000 especies (Romo de Vivar et al., 2007). El género Senecio, es el más importante de la tribu Senecioneae pues tiene alrededor de 1500 especies distribuidas en todo el planeta (Christov et al., 2002).

En México y Centroamérica, la tribu Senecioneae está representada por 19 géneros con aproximadamente 165 especies. En México se han descrito de 102 especies que representan el 62% de las especies descritas en la región México- Centroamérica (Romo de Vivar et al., 2007).

Las especies de Senecio del estado de Oaxaca que tienen estudio Químico son S. polypodioides y S. callosus (Romo de Vivar et al., 2000, 2007) donde se aislaron los alcaloides pirrolizidínicos conocidos como platifilina (1), 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (2) así como los alcaloides pirrolizidínicos tipo platinecina (3) y (4).

N AngO H 2 N AngO H 3 R= 5-hidroxiAng 4 R= 5-hidroxiTig OR N Platifilina (1) O O O HO O H O Ang = O Tig =

Senecio polypodioides (Figuras 1 y 2), es una especie que se puede encontrar en el estado de Oaxaca, cuenta con sólo un estudio químico (Romo de Vivar et al., 2000). S. polypodioides crece en bosques de pino y encino alrededor de 1600 metros sobre el nivel del mar (msnm).

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Figura 1. Parte aérea de Senecio polypodioides. Figura 2. Raíz de Senecio polypodiodes.

2.2 Metabolitos secundarios en Senecio

Los alcaloides pirrolizidínicos, los eremofilanólidos y los furanoeremofilanos son los metabolitos secundarios que con mayor frecuencia se han aislado de las especies del género Senecio.

2.2.1 Alcaloides

El nombre de alcaloide fue descrito por primera vez por W. Meissner en 1819, haciendo referencia a los productos naturales de origen vegetal que mostraban propiedades similares a las bases inorgánicas (álcalis) (Aniszewski, 2007). El término “oide” del griego ειδω (eidw) que siginifica “parecido”, sigue siendo utilizado hoy en día para sugerir alguna similitud de estructura o actividad entre moléculas (Fattorusso, 2008), por ejemplo, terpenoide, eremofilanoide, capsaicinoide, capsinoide, entre otros.

Winterstein y Trier en 1910, acuñaron el término de alcaloide verdadero a aquellos productos naturales que además de presentar basicidad, tenían que cumplir con cuatro características (Fattorusso, 2008):

1. El átomo de nitrógeno debe estar en un sistema heterocíclico 2. La estructura debe ser compleja

3. La actividad farmacológica debe ser potente

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4

Sin embargo, esta definición presenta varios problemas, por ejemplo, algunos compuestos reconocidos como alcaloides no presentan propiedades básicas en el nitrógeno como en la colchina (5), las sales de amonio como la sanguinarina (6) o las aminas N-óxido como la indicina N-óxido (7). En cuanto a su exclusivo origen vegetal también hay conflicto, Qu et al., 2006 menciona que la bufoteina (8) que originalmente se aisló de un sapo (Bufo, bufo), y que después se aisló de plantas del género Piptadenia, específicamente del hongo conocido como amanita mappa y que incluso se ha detectado en orina humana, tampoco podría entrar en la anterior definición por sus diferentes fuentes de aislamiento.

Una definición más reciente para el término alcaloide fue propuesta en 1984 por S.W. Pelletier: “Un alcaloide es un compuesto que contiene nitrógeno en un nivel negativo de oxidación (−3 para aminas, amidas y sales de amonio, −1 para aminas N-óxido) caracterizándose por una distribución limitada en la naturaleza” (Pelletier, 1993). Con esta definición se incluye a compuestos de diferentes fuentes naturales, y es probablemente la definición más adecuada en términos de química de productos naturales. MeO MeO OMe O NH MeO O N O O O O Me N HO O O OH HO O 5 6 7 N H HO N 8

Figura 3. Compuestos reconocidos como alcaloides, que no entran en la definición de alcaloide descrita por Winterstein y Trier (Fattorusso, 2008).

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2.2.2. Alcaloides pirrolizidínicos (APs)

Los APs son un grupo de productos naturales que contienen en su estructura uno de los cuatro isómeros de la 1-hidroximetilpirrolozidina (9), lo que se conoce como necinas o base necínica, dichas bases necínicas pueden tener un doble enlace en el carbono C-1, un grupo hidroxilo (OH) en C-7 y la posición 2 y/o 6 puede estar oxidada. Los grupos OH pueden estar esterificados por ácidos monocarboxílicos, como el ácido angélico (10) o ácido tíglico (11), o por ácidos dicarboxílicos como el ácido senecionico (12) (Romo de Vivar et al., 2007). N H OH 1 2 3 6 5 7 9 9 CO2H 10 CO2H 11 CO2H HO CO2H 12

Figura 4. Base necínica y ácidos nécicos más comunes en APs.

Los APs que tienen en su esqueleto básico a la retronecina (13), otonecina (14) o a la heliotridina (15) son altamente tóxicos, la toxicidad se incrementa cuando un éster cíclico está presente como es el caso de la senecionina (16), que es el APs más común en la familia Senecioneae (Romo de Vivar et al., 2007).

N Retronecina (13) OH HO H N OH HO O Otonecina (14) N Heliotridina (15) OH HO H N Senecionina (16) O O O HO O H

Figura 5. APs comúnmente presentes en la familia Senecioneae.

Los APs generalmente se encuentran en varios géneros de la familia Astereacea, particularmente en la tribu Senecioneae, género Senecio; tribu Eupatorieae, género Eupatorium, así como en la tribu Boraginaceae (Heliotropium y Cynoglossum), y en

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6

algunos géneros de las Fabaceae (Crotalaria), Apacynaceae (Parsonsia) y Orchidaceae (Phalaenopsis).

En las especies de Senecio los APs se sintetizan en las raíces como N-óxidos y son transportados por la ruta del floema hacia los sitios de almacenamiento como pueden ser las inflorescencias (Hartmann et al., 1989). En la Figura 6, se muestran los resultados obtenidos por Hartmann et al., 1989 con relación a la biosíntesis y almacenamiento de la senecionina N-óxido en S. vulgaris. A esta especie se le suministró arginina, putrecina y espermidina marcada isotópicamente con 14C in vitro, mostrando que en las raíces se

encontró la mayor proporción de la senecionina N-óxido, concluyendo así que, es este el sitio de síntesis de los APs como N-óxidos para la mayoría de especies de Senecio.

Figura 6. Porcentajes (%) de distribución de 14C en S. vulgaris como una medida de biosíntesis de

Senecionina N-óxido en A 20 horas y B 70 horas.

En diferentes especies de Senecio el producto de biosíntesis común es la senecionina N-óxido, la cual posteriormente sufre cambios estructurales a través de reacciones específicas, dando lugar con ello a la diversificación de los APs (Figura 7) (Hartmann, 1995).

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Figura 7. Transformaciones de la senecionina N-óxido para dar lugar a la variedad de APs.

Spenser en 1985 y Robins en 1989, demostraron que el esqueleto carbonado de la base necínica se origina de la arginina y ornitina vía putrescina, se tiene evidencia de que la homospermidina es un intermediario en la ruta de la biosíntesis de la retronecina (Figura 8); sin embargo, varios ácidos nécicos se forman también de aminoácidos como la isoleucina (como en la senecionina), valina o leucina (Hartmann, 1995).

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8

NH2 NH2 H2N NH2 + N NH2 NH2 H sym-homospermidina N NH2 N CHO Iones iminium CH2OH H (-) trachelantamidina CH2OH H RO Éster de retronecina putrescina putrescina

Figura 8. Biosíntesis de la base necínica de los APs.

Como se mencionó antes, los APs son alcaloides de éster que tienen una base de necina, esterificada con ácido nécico. Se conocen APs en forma de diéster macrocíclicos, diéster de cadena abierta o monoésteres. Hartmann (1995) ha clasificado en cinco estructuras básicas a los APs: tipo senecionina (16) (característica de la tribu Senecioneae); tipo triangularina (17) (tribu Senecioneae); tipo monocrotalina (18) (tribu Fabaceae); tipo licopsamina (19) (tribu Eupatorieae y familias Botaginaceae y Apocinaneae) y tipo falaenopsina (20) (Orchidaceae) (Figura 9).

(21)

9

N O O O HO O H Senecionina (16) N O O O O H Triangularina (17) N O O O O H OH OH Monocrotalina (18) N OH H Licopsamina (19) O O OH OH N H Falaenopsina (20) O O O O HO HO

Figura 9. Las cinco estructuras básicas de los alcaloides pirrolizidínicos.

2.2.3. Eremofilanos

Los eremofilanos son sesquiterpernos que derivan biogenéticamente de los eudesmanos por migración del grupo metilo del C-10 al C-5 (Mann et al., 1994) (Figura 10).

1 2 3 4 8 5 10 6 11 12 9 7 13 1 2 3 4 8 5 10 6 11 12 9 7 13 15 14 14 15

Esqueleto de los eremefilanos (22)

Esqueleto de los eudesmanos (21)

Figura 10. Sesquiterpenoides

Los eremofilanoides del género Senecio, contienen en su esqueleto básico a un sistema decalina (23) y la gran mayoría se encuentran como furanoeremofilanos (24) o eremofilanólidos (25) (Figura 11).

(22)

10

O O O 24 25 23

Figura 11. Esqueleto básico de los furanoeremofilanoides (24) y eremofilanólidos (25).

2.3 Alcaloides pirrolizidínicos y eremofilanos aislados de especies de Senecio

Hasta el año de 1993, en la revisión hecha por Logie et al. (1994), se describen alrededor de 350 APs en la literatura internacional.

En trabajos más recientes, descritos para las especies mexicanas de Senecio, Pérez-Castorena et al. (1999) describe al nuevo AP de nombre iodantina (26) (Figura 12), aislado de S. iodanthus y S. bracteatus, que muestra la característica del doble enlace C-15 y C-16 con geometría Z. En ese mismo año, se realizó el estudio químico de cuatro especies que para ese entonces no habían sido estudiadas; S. polypodioides, S. runcinatus, S. madrensis y S. prionopterus (Liddell, 2001) donde se aislaron los APs platifilina (1), senecionina (16), platifilina N-óxido (27), rosmarinina (28), rosmarinina N-óxido (29) y retrorsina (30) (Figura 13). N O O OH O O H Iodantina (26) 14

(23)

11

N

27 Platifilina N-óxido R1= H R2 = O 28 Rosmarinina R1= OH R2 = . .

29 Rosmarina N-óxido R1 =OH R2 = O

O O O HO O H N Retrorsina (30) O O O HO O H OH R2 N Integerrimina (31) O O H O HO O H R1

Figura 13. APs aislados de especies mexicanas del género Senecio.

Una revisión hecha por Romo de Vivar et al., 2007, de las especies mexicanas de la tribu Senecioneae, muestra que los APs aislados de S. madrensis fueron (16 y 1); S. mairentianus (16 y 31); S. prionopterus y S. procumbens (16 y 30) y los eremofilanoides (32-35) aislados de S. mairentianus, así como (36 a-d, 37a-m, 38a-c) de S. pericalia.

O O O O O R1 OH 33 R1= OMe O O OH OH OH R1 O 32 34 35

Figura 14. Eremofilanoides aislados de la especie mexicana de Senecio. S. mairentianus (32-35)

O

36a 36b 36c 36d R= MeSen Ang Tig Sen RO OH O R1O OH O R2

R1= MeSen MeSen MeSen Tig Tig

R2= H OH OMe H OH

37a 37b 37c 37d 37e

37f 37g 37h 37i 37k

R1= Tig Sen Sen Sen Ang

R2= OMe H OH OMe OH

37l 37m

R1= Ang H

R2= OMe OMe

(24)

12

O O 39 AngO OH H O Ang = O Sen = O Tig = O 38a 38b 38c R=Ang Tig Sen RO

OH

O

Figura 15. Eremofilanoides aislados de S. Pericalia (36a-d, 37 a-m, 38 a-c) y S. sinuatus Gilib (39).

Burgueño-Tapia et al., 2007, menciona la presencia de un nuevo eremofilanólido en la especie mexicana de S. sinuatus Gilib (39), además de 37b, 37d y 37k.

2.4. Actividad biológica

Recientemente se ha descrito que algunos APs y eremofilanoides muestran actividad biológica en contra de algunos insectos herbívoros de interés agrícola. Reina M. et al., en 2001 mostraron que los eremofilanoides 40 y 41 y los APs integerrimina (31) y su N-óxido (42) aislados de S. miser (Figura16), tuvieron actividad inhibitoria de la alimentación (IA) sobre Myzus persicae y Lepinotarsa decemlineata, respectivamente. Los APs aislados de S.bollei 12, 31, 43- 45 (Figura 17), han demostrado actividad IA en larvas de Spodoptera Littoralis, L. decemlineata, M. persicae y Rhopalosiphum y efecto fitotóxico en Latuca sativa, además de efecto citotóxico en células Sf9 de S. frugiperda y células CHO de mamíferos (González-Coloma et al., 2008).

H O O R2 R R1 40 R= OAc; R1 = H; R2 = OMe

41 R= OAng; R1 = OH; R2= OMe

N Integerrimina N-óxido (42) O O H O HO O H O

(25)

13

N Senecifilina (43) O O O HO O H N Espartioidina (44) O O O HO O H N O O O HO O H H H Senecivernina (45)

Figura 17. APs con actividad biológica: actividad IA y citotóxica (12), fitotóxica y citotóxica (31, 43-45).

Los eremofilanoides 46-57 han demostrado actividad IA en larvas de S. littoralis, L. decemlineata y en insectos M. persicae (Burgueño-Tapia et al., 2007).

O OR O OAc OAc O O R2 O R1 O OR 46 R= Me 47 R= Ac 48 49 R1= CH2O-iVal R2= H 50 R1= CH=O R2= OH 51 R1= CH=O R2= OAc 52 R= H 53 R= Ac O O OR O O 54 R= H 55 R= Ac 56 R= H 57 R= Ac

Figura 18. Eremofilanoides con actividad inhibitoria de la alimentación en insectos.

Con base en estos antecedentes y considerando la limitada información acerca de los metabolitos secundarios presentes en S. polypodioides se decidió hacer el estudio químico de esta especie con la finalidad de cubrir la necesidad de dicha información así como la posibilidad de identificar novedosos metabolitos secundarios.

(26)

14

3. HIPÓTESIS

La extracción, aislamiento y purificación de los metabolitos secundarios presentes en S. polypodioides permitirá la obtención de alcaloides tipo pirrolizidínicos así como sesquiterpenos tipo eremofilanoides.

4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo General

Aislamiento, purificación y elucidación estructural de los metabolitos secundarios presentes en los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico de S. polypodioides y análisis conformacional de algunos compuestos seleccionados.

4.2. Objetivos específicos

• Recolección, secado y molienda de la planta de S. polypodioides. • Obtención de los extractos hexánico, de acetato de etilo y metanólico. • Separación, purificación por técnicas cromatográficas y/o químicas de los

metabolitos secundarios presentes en dichos extractos.

• Obtención de sus propiedades físicas y espectroscópicas necesarias para la elucidación estructural de estos metabolitos secundarios.

• Análisis conformacional a través de métodos computacionales y análisis de las 3JH-H.

(27)

15

5. METODOLOGÍA 5.1. Colecta de material vegetal

La raíz y parte aérea de S. polypodioides, se colectó en San Miguel Suchixtepec, Miahuatlan, Oaxaca, en marzo de 2009. Una especie se depositó para su identificación en el herbario de la Universidad Autónoma de Chapingo (UACh), Texcoco, México. Las especies destinadas para el trabajo químico se secaron a la sombra a temperatura ambiente.

5.2Extracción de la raíz de Senecio polypodiodes

La raíz seca de S. polypodioides (1.34 Kg), se extrajo a reflujo con 6 L de hexano (Hx) durante seis horas (x 4), posteriormente con acetato de etilo (AcOEt) (x 4) y metanol (MeOH) (x 4). Después de la evaporación de cada uno de los disolventes a presión reducida, se obtuvieron 2.75 g (0.20%) de extracto hexánico, 11.88 g (0.88%) de extracto de AcOEt y 118.03 g (8.8%) de extracto metanólico. Del extracto metanólico se obtuvo un precipitado blanco 16.60 g (1.23%). 10.10 g de extracto metanólico, se disolvieron en 75 mL de agua y se extrajeron con 75 mL de cloroformo (CHCl3)(x 4), obteniendo 2.3 g

(22.78%) de la fracción soluble en cloroformo.

5.3. Extracción de la parte aérea de Senecio polypodiodes

1.08 Kg de la parte aérea de S. polypodioides se reflujó con 8 L de Hx durante seis horas (x 4), posteriormente con AcOEt (x 4) y MeOH (x 4). Después de la evaporación de cada uno de los disolventes a presión reducida, se obtuvieron 9.64 g (0.89%) de extracto hexánico 15.30 g (1.42%) de extracto AcOEt y 80 g (7.42%) de extracto metanólico. El extracto hexánico se disolvió en 100 mL de MeOH y se dejó precipitar a 0 °C, se filtró a vacío y se eliminó el disolvente a precisión reducida, obteniendo así el extracto hexánico 6.5 g (0.60%) con la menor cantidad de hidrocarburos, como ceras o ácidos grasos inherentes a la parte aérea.

(28)

16

5.4. Aislamiento de los alcaloides pirrolizidínicos (APs) de la raíz de S. polypodiodes

5.4.1 Cromatografía del extracto CHCl3

1.0 g de extracto clorofórmico de la raíz seca, se empleó para su separación en una columna empacada con sílica-gel (SiO2) (100-200 mallas, Natland International

Corporation), de 2.0 cm de diámetro y 30 cm de altura usando como fase móvil CH2Cl2

-MeOH con gradiente de elución. De acuerdo a la cromatografía en capa fina (CCF) (sílica-gel 60F254, Merck) revelada con reactivo de Dragendorff, las fracciones (20 mL)

28 a 33 de la fase móvil CH2Cl2-MeOH (8:2) se reunieron y se precipitaron en una

mezcla de Hx-CHCl3 para dar 105 mg (10.5%) de un sólido blanco de p.f. = 119.6 a

120.4 °C como componente mayoritario que correspondió a la sarracina N-óxido (60).

5.4.2. Reducción de la sarracina N-óxido

30 mg del compuesto 60 se disolvieron en 2 mL de MeOH, se acidificó con 1.0 mL de H2SO4 al 2.5%, se le agregó Zinc en polvo (10 mg) y se agitó por 9 horas para su

reducción. Al término de este tiempo se le adicionó NH4OH (2.5%) hasta pH 11, se le

agregaron 50 mL de agua y se procedió a la extracción con CHCl3 (3 x 50 mL), se

separó la fase orgánica y se eliminó el disolvente a presión reducida, obteniendo directamente del crudo de reacción a la sarracina (61) (10 mg).

5.4.3. Aislamiento del componente minoritario del extracto CHCl3

De una segunda columna empacada con SiO2 (100-200 mallas, Natland International

Corporation) de 6.0 cm de diámetro y 30 cm de altura y con 3.0 g de extracto clorofórmico de la raíz de S. polypodioides, se obtuvo la fracción 20 (50 mL) de la fase móvil CH2Cl2-MeOH (93:7). Esta fracción se recromatografió en SiO2 (100-200 mallas,

Natland International Corporation) en una columna de 2.0 cm y 26 cm de altura, obteniendo a las fracciones: 12 a 25 (10 mL) CH2Cl2-MeOH (97:3) y 1 a 29 (10 mL)

(29)

17

anteriores se volvieron a cromatografiar en CCF, placas de SiO2 de 5.0 x 3.0 cm (sílica –

gel 60 F254, Merck) utilizando como fase móvil CH2Cl2-MeOH (7:3), obteniendo así 18.5

mg (0.62%) de 62.

5.5. Aislamiento del componente mayoritario de la parte aérea de S. polypodiodes

3.5 g de extracto hexánico se sometieron a cromatografía en columna (CC) en SiO2

(200-300 mallas, Natland International Corporation) de 6.0 cm de diámetro y 21 cm de altura y utilizando como fase móvil mezclas de Hx:AOcEt con gradiente de elución.

De acuerdo a la CCF revelada con sulfato cérico (CeSO4) en solución de H2SO4 y calor,

las fracciones (10 mL) 14 a 28 de la fase móvil Hx-AcOEt (8:2) se reunieron para dar 193.1 mg (5.52%) de muestra, la cual se cromatografió por CCF en una placa de SiO2 de

20 x 20 cm (Sílica-gel, 1500 micrones, Analtech), usando como fase móvil una mezcla de Hx-AcOEt (7:3). Revelando con luz ultravioleta (UV) con una longitud de onda de 254 nm se detectó y se raspó el compuesto, se extrajo con 50 mL de AcOEt y agitación por 15 minutos, se filtró a vacío y se recuperó el disolvente a presión reducida. Se obtuvieron así 67.6 mg (1.93%) del compuesto mayoritario del extracto Hexánico de la parte aérea de S. polypodioides 63.

5.6. Análisis conformacional

El análisis conformacional de 62 y 63 se inició con un protocolo Monte Carlo a nivel de Mecánica Molécular MMFF94 como se encuentra implementado en el programa Spartan ´08. Los confórmeros que se obtuvieron en un ∆E de 10 kcal/mol fueron sometidos a un cálculo usando Teoría de Funcionales de la Densidad (DFT) al nivel B3LYP/6-31G*. Este cálculo se hizo sin considerar el efecto del disolvente. Las constantes de acoplamiento (3JH-H) de los confórmeros se calcularon usando ecuaciones

tipo Karplus como se encuentran implementadas en el programa PCMODEL y considerando la distribución de población de Boltzman.

(30)

18

5.7. Obtención de los datos espectroscópicos

Los datos espectroscópicos de RMN de 1H, 13C en 1D y 2D fueron obtenidos en un

equipo Varian System 500, usando CDCl3 como disolvente y TMS como referencia

interna. Las masas de alta resolución se determinó en un Espectrómetro de Masas Jeol JCMateII a 70 eV.

(31)

19

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Extractos

Después del proceso de extracción de la raíz seca de S.polypodioides se obtuvieron 2.75 g (0.20%) de extracto Hx, 11.88 g (0.88%) de extracto AcOEt y 118.03 g (8.8%) de extracto metanólico. En la CCF de los extractos Hx, AcOEt y MeOH de la raíz seca dieron positivos a la prueba de Dragendorff, dicha prueba es un indicio de la presencia de alcaloides. Los espectros de RMN 1H de los extractos de Hx, AcOEt y MeOH de la raíz

seca, mostraron señales de protones vinílicos alrededor de 6.0 partes por millón (ppm) y señal de protón base de éster a 5.0 ppm (Figura 19). El análisis de las señales de RMN de

1H de cada uno de los extractos mostró que, a pesar de que Romo de Vivar et al., 2000

describen la presencia de platifilina (1), en el extracto metanólico de la parte aérea de S. polypodiodes, en ninguno de los extractos obtenidos en este trabajo se observaron las señales correspondientes a la platifilina descritas por Trigo et al. en 2004. Tomando en cuenta este hecho se continúo con el proceso de separación y purificación de los principales metabolitos secundarios.

6.2 Elucidación del compuesto mayoritario de la raíz de S. polypodioides

De la cromatografía del extracto clorofórmico de la raíz de S. polypodioides se obtuvo principalmente un compuesto que después se hizo precipitar con una mezcla de Hx-CHCl3 obteniendo un polvo blanco con punto de fusión 119.6 a 120.4 °C como

compuesto mayoritario 60.

El espectro de RMN de 1H (Figura 20) del sólido obtenido 60 mostró a las señales características de un grupo angeloilo en 6.20 (1H, cc, J = 7.5, 1.5 Hz) y en δ 2.02 (3H, dc, J = 7.5, 1.5 Hz) y δ 1.91 (3H, q, J = 1.5 Hz). Adicionalmente se observó la señal de otro protón vinílico a δ 6.37 como una señal cuádruple de triples (1H, J = 7.0, 1.0 Hz), que junto con la señal del metilo a δ 2.03 que se observó como una señal doble de triples (3H, J = 7.0, 1.0 Hz) que junto con las señales del metileno base de oxígeno a δ 4.38

(32)

20

(1H, dd, J =11.0, 7.0 Hz) y 4.25 (1H, dd, J =11, 9.2 Hz) sugirieron la presencia del grupo sarracinoiloxi. La sustitución de dos ésteres en O-7 y O-9 dado por las señales de H-7, H-9b y H-9a con desplazamientos de 5.71 (1H, ddd, 5.5, 5.5, 1.4 Hz), 4.38 (1H, dd, J =11.0, 7.0 Hz) y 4.25 ppm (1H, dd, J =11, 9.2 Hz), sugirió que el AP correspondía a una base necínica saturada. Lo anterior, corresponde a un AP en forma de diéster acíclico, lo que hizo pensar que el compuesto obtenido se trataba de la sarracina (Stermitz y Roby 1984) (61) (a = señal a campo alto, b= señal a campo bajo, c = cuartete, d = doblete, t = triplete, q = quinteto).

Sin embargo, los desplazamientos químicos a campo bajo de los protones adyacentes al nitrógeno de la base necínica, es decir, los protones H-3, H-5 y H-8, son característicos para un N-óxido, del experimento gHSQC se asignó al C-8 con un desplazamiento químico de 86.3 ppm que es una señal diagnóstico para un N-óxido (Roby y Stermitz, 1984). Además, tomando en cuenta su punto de fusión de 119.6 a 120.4 ° C, corresponde con el descrito por Culvenor y Geissman (1961) de 125 a 126 °C para la sarracina N-óxido hidratada. Del análisis de la masa de alta resolución del ión molecular se dedujo la fórmula condensada C18H27NO6, lo cual mostró que el compuesto aislado se trataba de la

sarracina N-óxido.

El espectro de RMN de 13C (Figura 21) mostró las dos señales de grupo carbonilo de éster a δ 166.5 (C-17) y 165.6 (C-11) y las cuatro señales de los carbonos vinílicos a δ 141.8 (C-19), 140.3 (C-13), 132.2 (C-12) y 125.8 (C-18) de los grupos angeloiloxi y sarracinoiloxi. Por otro lado los carbonos base de heteroátomo se observaron en δ 86.3 (C-8), 73.7 (C-7), 70.1 (C-3), 68.1 (C-5), 63.7 (C-15) y 61.9 (C-9). Es importante mencionar que los carbonos C-3, C-5 y C-8 muestran los desplazamientos químicos característicos de pirrolizidina N-óxido, pues cuando se trata de amina libre se encuentran desplazados hacia frecuencias más bajas. Finalmente, el grupo metino C-1 se observó en δ 37.5, los metilenos C-6 y C-2 en δ 32.3 y 28.5, respectivamente. Los metilos se observaron a δ 20.6 (C-21), 15.8 (C-14) y 15.6 (C-20).

(33)

21

Fi gur a 19 . E sp ec tr o de R M N 1 H d el e xt ra ct o m et anól ic o de S . pol y p odi o de s en D M SO -d6 ( 50 0 M H z) .

(34)

22

Fi gur a 20 . E spe ct ro de R M N 1 H d e la s ar ra ci na N -O pr es ent e en la r aí z de S . po ly podi ode s (60 ) en C D C l3 (500 M H z) . N O O H 60 3 11 1 7 14 1 3 7 12 8 6 5 1 2 1 8 2 1 20 O O O H O 1 5 1 9 |

(35)

23

Fi gur a 21 . E spe ct ro de R M N d e 13 C de la s ar ra ci na N -O p re se nt e en la r aí z de S . p ol y pod ioi d e s (6 0) e n C D C l3 (125 M H z) . 3. 8 5 m 3 .7 4 m 4 .1 6 d d 3 .7 8 m N O O H 60 3 1 1 17 14 1 3 7 12 8 6 5 1 2 1 8 2 1 20 O O O H O 1 5 19 |

(36)

24

6.3 Reducción de la sarracina N-óxido

Para confirmar la presencia de la sarracina N-óxido (60) el compuesto fue reducido con Zinc/H2SO4 para obtener a la sarracina (61) (Figura 22). Por su parte, las masas de alta

resolución del ión molecular mostraron una fórmula condensada de C18H27NO5. Los

datos de 1H y de 13C están de acuerdo con los descritos por Stermitz y Roby 1984 y Logie et al., 1993 para la sarracina, con lo que se confirmó la presencia de la sarracina N-óxido (60) como compuesto mayoritario del extracto clorofórmico de la raíz de S. polypodioides. Esto concuerda con el hecho de que en las especies de Senecio los alcaloides pirrolizidínicos se sintetizan en forma de N-óxidos en las raíces (Hartmann et al., 1989). Tomando en cuenta que la fracción clorofórmica se obtuvo directamente desde la partición por extracción del extracto metanólico, sin ser sometido a un tratamiento con Zn/H+ como tradicionalmente se hace, es probable que se obtenga los APs como N-óxido. Los desplazamientos químicos de 1H y 13C tanto para la sarracina como para su N-óxido se describen en la Cuadro 1, donde se puede observar la diferencia en desplazamientos químicos de los protones H-8, H-3b, H-3a, H-5b y H-5a de 0.55, 0.65, 0.95, 0.45 y 1.01 ppm, respectivamente, hacia frecuencias más altas en el N-óxido (60). Mientras que en la RMN 13C el C-8 sufrió un desplazamiento de 17.5 ppm hacia frecuencias más altas en (60). Cabe mencionar que en la literatura no se encuentran descritos ni asignados los desplazamientos químicos de RMN de 1H y de 13C de la sarracina N-óxido y esta es la

primera vez que se describen la constantes de acoplamiento que se muestran en la Cuadro 1.

(37)

25

Fi gur a 22 . E spe ct ro de R M N 1 H d e la s ar ra ci na ( 61 ) c om o com pu es to m ayor ita ri o de la r aí z de S . pol y pod ioi d e s en C D C l3 ( 500 M H z) . N O H 61 3 11 1 7 14 1 3 7 12 8 6 5 1 2 1 8 2 1 20 O O O H O 1 5 1 9

(38)

26

6.4 Elucidación del compuesto minoritario de la raíz de S. polypodioides

De la cromatografía en columna del extracto clorofórmico de la raíz de S. polypodiodes, y después de una cromatografía en CCF placas de SiO2 de 5.0 x 3.0 cm (sílica –gel 60 F254, Merck) utilizando como fase móvil CH2Cl2-MeOH (7:3), se obtuvieron 18.5 mg

(0.62%) del compuesto minoritario 62.

Cuadro 1. Datos de desplazamiento químicos RMN de 1H y de 13 C de la sarracina

N-óxido (60) y sarracina (61) (J en Hz) a 60 61 Átomo 1H 13C 1H 13C 1 3.49 m 37.5 2.76 m 40.2 2b 2.49 dddd (12.6 7.9, 7.9, 4.8) 28.5 1.90 m 28.7 2a 1.98 m 28.5 1.83 m 28.7 3b 3.85 ddd (11.7, 8.7, 4.8) 70.1 3.20 ddd (9.4, 7.5, 7.5) 55.1 3a 3.74 ddd (11.7, 7.9, 7.9) 70.1 2.82 m 55.1 5b 3.78 m 68.1 3.33 ddd (9.4, 9.4, 1.1) 53.5 5a 3.78 m 68.1 2.77 m 53.5 6b 2.90 dddd (14.6, 9.2, 9.2, 5.5) 32.3 2.12 m 35.0 6a 2.08 m 32.3 2.08 m 35.0 7 5.71 ddd ( 5.5, 5.5, 1.4) 73.7 5.36 ta 75.1 8 4.16 dd (8.5, 5.5) 86.3 3.61 dd (8.1, 3.6) 68.8 9b 4.38 dd (11.0, 7.0) 61.9 4.41 dd (10.9, 7.6) 63.9 9a 4.25 dd (11.0, 9.2) 61.9 4.25 dd (10.9, 8.3) 63.9 11 165.6 166.8 12 132.2 131.9 13 6.37dc (7.0,1.0) 140.3 6.36 dc (7.0, 1.0) 140.2 14 2.03 dt (7.0,1.0) 15.8 2.05 dt (7.0, 1,0) 15.7 15 4.21t (1.0) 2H 63.7 4.23 sa (2H) 64.7 17 166.5 166.7 18 125.8 127.0 19 6.20 cc (7.5,1.5) 141.8 6.11 cc (7.5, 1.5) 139.7 20 2.02 dc (7.5, 1.5) 15.6 2.01 dc(7.5, 1.5) 15.6 21 1.91q (1.5) 20.6 1.91q (1.5) 20.7 a 1H a 5000 MHz y 13C a 125 MHz en CDCl 3

(39)

27

El espectro de RMN de 1H de 62 (Figura 23) mostró a las señales características de un

grupo angeloilo en 6.14 (1H, cc, J = 7.5, 1.5 Hz), 1.99 (3H, dc, J = 7.5, 1.5 Hz) y 1.85 ppm (3H, q, J = 1.5 Hz). A diferencia de la sarracina N-O (60), no se observó la presencia del grupo sarracinoiloxi; sin embargo, se observó la presencia de los protones vinílicos H-9b y H-9a en δ 5.25 (1H, c, J = 2.0 Hz) y δ 5.07 (1H, c, J = 2.0 Hz), típicos de un doble enlace exocíclico lo que indicaban que se trataba de un APs acíclico, se observó también una señal en δ 4.82 (1H, da, J = 3.2 Hz) característico del átomo de hidrógeno de la fusión del biciclo de pirrolizidína (H-8α), a campos más altos se observaron señales del resto de los protones metilénicos de dicho biciclo.

El espectro de RMN de 13C del compuesto 62 (Figura 24), mostró señales para trece átomos de carbonos, de los cuales según el experimento DEPT (Figura 25), tres corresponden a metinos, uno de ellos con hibridación sp2 (C-13 a 140.4 ppm), mientras que los otros dos corresponden a metinos con hibridación sp3 (C-7 a 72.9 y C-8 a 72.0 ppm). También se observó la presencia de cinco metilenos a 111.8 (C-9), 53.5 (C-3), 52.8 (C-5), 34.0 (C-6) y 33.0 (C-2) ppm. Finalmente, se observó la presencia de dos metilos a 20.4 (C-15) y 15.8 (C-14).

La asignación completa de los datos de RMN de 1H y de 13C del compuesto 62 (Cuadro 2) se llevó a cabo con la ayuda de los experimentos gCOSY, gHMQC y gHMBC (Anexo 3).

La estereoquímica relativa de los carbonos C-7 y C-8 se determinó a través del experimento de RMN NOE difference (Figura 26). Asumiendo que H-8 está en posición α, como es en la mayoría de los APs (Liddell y Logie, 1993), la asignación de la estereoquímica relativa -α de H-7 se asignó después de observar que al saturar al H-7, la señal correspondiente a H-8 mostró un incremento sustancial. De la misma forma se asignó a los protones correspondientes del metileno vinílico como H-9b al que se encuentra del mismo lado que el CH2-2 y H-9a al que está del lado opuesto. La

irradiación del grupo CH2-2 en el experimento NOE difference mostró un incremento en

(40)

28

Cabe mencionar que para la asignación estructural del compuesto 62 se tuvo que discernir entre otras señales presentes en los espectros de RMN de 1H (Figura 23) y de 13C (Figura 24). Como se mencionó anteriormente, la asignación se hizo con ayuda de

experimentos de RMN en 1D y 2D.

Durante el proceso de asignación de los datos de RMN de 62 se observó que, en una segunda y tercera adquisición, los desplazamientos químicos de protón se movían a campo más bajo con respecto a la primera adquisición de datos, por lo que se decidió filtrar el CDCl3 en alúmina neutra (Al2O3, 70-230 mallas, Merck) y así utilizarlo para

disolver la muestra y obtener la RMN de 1H, además de filtrar también el compuesto 62 en alúmina. El espectro se muestra en la Figura 27. Con esta adquisición de RMN de 1H se pudieron medir las contantes de acoplamiento para cada una de las señales de protón (Cuadro 2). Probablemente la acidez generada en el CDCl3 durante su almacenamiento

sea la causa de este comportamiento en los desplazamientos químicos de 1H, y una vez que el CDCl3 se filtró en alúmina neutra dejó de tener dicho efecto. Adicionalmente, las

señales del componente contaminante ya no se observaron, lo que hizo pensar que éste se trataba del ácido angélico, que quedó atrapado en la alúmina.

Liddell y Logie (1993) describieron por primera vez al compuesto 62 como 7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina, aislado de S. chrysocoma, un segundo artículo escrito por Romo del Vivar et al. en 1999 menciona su presencia en S. doratophyllus, en ambos estudios se encontró al compuesto 62 además de los APs sarracina (61) o sarracina N-óxido (60), lo que concuerda con el presente trabajo. Probablemente la presencia de estos APs implique una relación biogenética a través de la liberación del N-óxido en 61 para generar el alcaloide libre 60, y posterior eliminación del ácido sarracinoico para generar 62.

Por otra parte, en los trabajos de Liddell y Romo de Vivar no se describen las constantes de acoplamiento para los diferentes protones, lo que en este trabajo se presenta en la Cuadro 2.

(41)

29

F igur a 23 . E spe ct ro d e R M N de 1 H d e 7β -a nge lo il ox i- 1-m et ile n-8α -p ir ro loz idi na ( 62 ) pr es ent e en la r aí z de S. pol y pod ioi d e s en C D C l3 ( 500 M H z) . N O H 3 1 1 7 8 6 5 1 2 1 2 15 14 O 13 9 62

(42)

30

Fi gur a 24 . E sp ec tr o de R M N 13 C de 7 β -a nge loi lox i- 1-m et ile n-8α -p ir ro loz idi na ( 62 ) pr es ent e en la r aí z de S. po ly podi o ide s en C D C l3 ( 125 M H z) N O H 3 1 1 7 8 6 5 1 2 1 2 15 14 O 13 9 62

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Fi gur a 25 . E xpe ri m en to D E PT de 7 β -a nge loi lox i- 1-m et ile n-8α -p ir ro loz idi na ( 62 ) en C D C l3 N O H 3 1 1 7 8 6 5 1 2 12 1 5 14 O 1 3 9 62

(44)

32

F igur a 26. E xp er im ent o R M N N O E d if fe re n c e de 7 β -a ng el oi loxi -1 -m et il en-8α -pi rr ol oz id in a (6 2) , s e obs er va la c or re la ci ón a tr av és d e es pa ci o de l pr ot ón H -7 con H -8 N O H 3 1 1 7 8 6 5 1 2 12 1 5 14 O 1 3 9 62

(45)

33

Fi gur a 27 . E spe ct ro de R M N 1 H de 7 β -a nge loi loxi -1-m et ile n-8α -pi rr ol oz id ina ( 62 ) de r aí z en C D C l3 de spu és d e fi ltr ado en al úm ina ne ut ra ( 500 M H z) . N O H 3 1 1 7 8 6 5 1 2 12 1 5 14 O 1 3 9 62

(46)

34

Cuadro 2. Datos de desplazamientos químicos de RMN de 1H y de 13C

de7β-angeloiloxi-1-metilen-8α-pirrolozidina (62) (J en Hz) a,b Átomo 1H 13C HMBC 1 140.1 2α 2.78 mc 33.0 C-9 2β 2.77 mc 33.0 C-9 3α 3.67 ddd (9.7, 7.0, 5.8) 53.5 3β 3.08 ddd (9.7, 7.4, 7.4) 53.5 5α 3.95 ddd (10.3, 8.0, 2.5) 52.8 C-3 5β 3.10 ddd (10.3, 10.3, 6.7) 52.8 C-3 6α 2.47 dddd (13.5, 10.3, 8.0, 4.6) 34.0 6β 2.28 dddd (13.5, 6.7, 2.5, 1.5) 34.0 7α 5.75 ddd (4.6, 4.6, 1.5) 72.9 8α 4.82 da (4.6) 72.0 C-9, C-5 9b 5.25 cda (2.0, 0.5) 111.8 9a 5.07 ca (2.0) 111.8 11 165.8 12 126.5 13 6.14 cc (7.5,1.5) 140.4 C-15, C-14 14 1.99 dc (7.5, 1.5) 15.8 C-15 15 1.85 q (1.5) 20.4 C-14 a 1H a 500 MHz y 13C a 125 MHz en CDCl 3

b Las constantes de acoplamiento fueron medidas desde el espectro de RMN de 1H

obtenido con CDCl3 filtrado en alúmina

c Desplazamiento químico obtenido desde el experimento gHMQC. La asignación

puede estar intercambiada.

6.5 Análisis conformacional del compuesto minoritario de la raíz de S. polypodioides

El análisis conformacional del compuesto 62, se inició con un protocolo Monte Carlo a nivel de Mecánica Molécular (Chang et al., 1989) MMFF94 (Halgren T. 1996a, 1996b, Halgren T. 1996c, Halgren T. y Nachbar R.B. 1996d, Halgren T. 1996e) como se encuentra implementado en el programa Spartan ´08. Una vez eliminadas aquellas estructuras que se duplicaron, se obtuvieron 27 confórmeros en un ∆E de 10 kcal/mol, los cuales fueron sometidos a cálculos usando Teoría de Funcionales de la Densidad

(47)

35

(DFT) (Perdew, 1986) al nivel B3LYP/6-31G*. Así se obtuvieron 20 confórmeros en un ∆E de 5.0 kcal/mol, de los cuales únicamente 13 contribuyen a la distribución poblacional (Cuadro 3).

Cuadro 3. Energía relativa (kcal/mol) y porcentaje de población conformacional de 62 al nivel de cálculo MMFF94 y B3LYP/6-31G*

Confórmero ∆E MMFF94a %b ∆E B3LYP/6-31G*c %b

62ª 0.00 17.6 0.33 17.5 62b 0.11 14.7 d ---- 62c 0.24 11.8 0.45 14.4 62d 0.43 8.5 0.00 30.8 62e 0.51 7.4 1.61 2.0 62f 0.63 6.0 d ---- 62g 0.66 5.8 d ---- 62h 0.79 4.6 0.41 15.4 62i 0.93 3.7 2.16 0.8 62j 0.93 3.6 1.52 2.4 62k 0.99 3.3 d ---- 62l 1.05 3.0 1.85 1.4 62m 1.14 2.6 3.58 0.1 62n 1.24 2.2 d ---- 62ñ 1.32 1.9 1.63 2.0 62o 1.48 1.5 0.57 11.8 62p 1.55 1.3 2.20 0.7 62q 2.04 0.6 4.32 0.0 62r 2.85 0.1 2.16 0.8 62s 5.12 0.0 5.31 0.0 62t 5.55 0.0 d ---- 62u 6.22 0.0 d 0.0 62v 6.26 0.0 6.40 0.0 62w 7.66 0.0 5.70 0.0 62x 8.18 0.0 d ---- 62y 9.79 0.0 4.60 0.0 62z 9.84 0.0 5.73 0.0

a Con respecto a 62a

EMMFF94 = 47.19 kcal/mol, calculado con el programa Spartan ´08

b Calculado considerando ∆G = - RTln K c Con respescto a 62c

B3LYP/6-31G* = - 446781.68 kcal/mol, calculado co el programa Spartan ´08

d Después de la optimización de la geometría al nivel B3LYP/6-31G* se observaron confórmeros

(48)

36

Los 5 confórmeros de mayor estabilidad 62a, 62c, 62d, 62h y 62o (Figura 28) contribuyen con el 89.9% a la distribución conformacional, siendo el confórmero 62d el de mayor estabilidad (EDFT = − 446781.68 kcal/mol, 30.8%). Se pudo observar que el

biciclo de pirrolozidina en los confórmeros 62d y 62h permanece prácticamente constante, cambiando únicamente la conformación del grupo angeloiloxi. En el confórmero 62a se observó una modificación en los ángulos diedros del anillo B (Figura 28, Anexo 4), lo mismo se observó para los confórmeros 62a, 62c y 62o. En la Figura 29 se muestra la sobreposición de los estos confórmeros, donde se puede observar que esencialmente es el grupo angeloiloxi el que sufre modificaciones conformacionales.

Figura 28. Confórmeros de mínima energía DFT/B3LYP/6-31G* de 62.

Figura 29. Confórmero de menor energía 62a y sobreposición de sus análogos 62c y 62o.

Es importante mencionar que para el análisis conformacional del compuesto 62, se siguió el protocolo Monte Carlo seguido de la optimización con DFT, en forma independiente,

(49)

37

para las dos configuraciones del átomo de nitrógeno. Sin embargo, para la segunda configuración del nitrógeno, se observó que, al confórmero de mayor estabilidad le corresponde un valor de EDFT = − 44777.37 kcal/mol, lo que muestra un ∆E de 4.3

kcal/mol entre el confórmero más estable de la primera optimización descrita y el confórmero más estable de esta segunda optimización. En consecuencia, el confórmero más estable de la segunda optimización no contribuye a la población conformacional de

62. Por lo anterior, se deduce que el nitrógeno del biciclo de 62 no sufre conversión de la

configuración.

Las constantes de acoplamiento de los confórmeros de mayor estabilidad de 62 se calcularon usando ecuaciones tipo Karplus, y considerando la distribución de población de Boltzmann. Las constantes de acoplamiento (3JH-H) calculadas desde los confórmeros

62a–62p mostraron una buena correlación con las observadas experimentalmente

(Cuadro 4), validando así el análisis conformacional que se llevó a cabo.

A través de las constantes de acoplamiento de los confórmeros se asignó la orientación relativa de los protones α y β del biciclo de la pirrolozidina (Cuadro 2), observando una tendencia de los protones α al par de electrones libres del átomo de nitrógeno por tener un desplazamiento químico a campo más bajo, lo que concuerda con lo descrito por Rivera et al. (2000), donde también se observó que los protones cis al par de electrones del átomo de nitrógeno se desplazan a campos más bajos.

Cuadro 4. Valores de las constantes de acoplamiento (J en Hz) calculadas y experimentales para 62

J cal. J exp. 2α, 3α 7.1 7.0 2α, 3β 6.2 7.4 2β, 3α 5.5 5.8 2β, 3β 7.0 7.4 5α, 6α 7.0 8.0 5α, 6β 0.6 2.5 5β, 6α 11.4 10.3 5β, 6β 6.8 6.7 6α, 7α 4.3 4.6 6β, 7α 2.0 1.5 7α, 8α 4.8 4.6

(50)

38

6.6. Elucidación del compuesto mayoritario de la parte aérea de S. polypodiodes

Del extracto hexánico se obtuvo por CC en SiO2 (200-300 mallas, Natland International

Corporation) y utilizando como fase móvil mezclas de Hx:AOcEt con gradiente de elución las fracciones 14 a 28 de la fase móvil Hx-AcOEt (8:2) para dar 193.1 mg (5.52%) de muestra, la cual se cromatografió por CCF en una placa de SiO2 de 20 x 20

cm (Silica-gel, 1500 micrones, Analtech), usando como fase móvil una mezcla de Hx-AcOEt (7:3). Se detectó y se raspó el compuesto y se extrajo con 50 mL de Hx-AcOEt. Se obtuvieron así 67.6 mg (1.93%) del compuesto mayoritario del extracto hexánico de la parte aérea de S. polypodioides 63.

El espectro de RMN de 1H del compuesto 63 (Figura 30) mostró señales de protones vinílicos: uno de ellos, el protón H-19, δ 6.13 (1H, cc, J = 7.3, 1.5 Hz) que con dos grupos metilo CH3-20, δ 2.01 (3H, dc, J = 7.3, 1.5 Hz), y CH3- 21,δ 1.90 (3H, q, J = 1.5

Hz) son señales características del grupo angeloiloxi; el otro protón vinílico H-8 se observó a δ 5.53 (1H, dddd, J = 6.0, 2.5, 1.0, 1.0 Hz). Se observó un protón base de éster H-1, δ 5.17 (1H, dd, J = 12.0, 4.2 Hz) así como también un protón base de grupo hidroxilo H-9 δ 3.41 (1H, d, J = 6.0 Hz). A campos altos se observó el protón H-11 δ 2.24 (1H, hept, J = 6.0), una señal múltiple que integra para dos protones H-6 δ 2.18 a 2.04 (2H, m), H-5 δ 1.80 (1H, dd, J = 11.5, 6.0 Hz), una señal ddd de un protón H-3α δ 1.76 (1H, ddd,15.7, 5.1, 5.1 Hz), así como una señal múltiple que integra para dos protones alrededor de 1.65 ppm que corresponde a los protones H-2α δ 1.67 (1H, m,) y H-3β δ 1.64 (1H, m). En la región de los metilos, se observó una señal simple del CH3-15

δ 1.23 (3H, s), una señal triple CH3-12 y CH3-13 δ 1.05 (6H, t, J = 6.0 Hz) y el metilo

CH3-14 δ 0.94 (3H, s).

El espectro de RMN de 13C de 63 mostró la presencia de 20 carbonos (Figura 31) de los cuales cinco corresponden a carbonos con hibridación sp2 y quince con hibridación sp3, de éstos, tres están unidos a átomos de oxígeno.

(51)

39

El análisis de masas de alta resolución mostró al ión fragmento C20H30O3 (masa

calculada = 318.2195, masa medida = 318.2192) resultado de la pérdida de una molécula de H2O, lo que permitió la deducción de la fórmula condensada C20H32O4 para el

compuesto 63.

La asignación de la conectividad del compuesto 63 se llevó a cabo con los experimentos gCOSY, gHSQC, gHMBC y NOESY 2D.

En el experimento gCOSY de 63 (Figura 32), el protón vinílico H-8 en 5.53 ppm mostró una correlación con el protón base del grupo hidroxilo H-9 (δ 3.41), mientras que el protón base de éster 1 (δ 5.17) mostró correlación con los protones 2β (δ 2.16) y H-2α (δ 1.67) , por su parte el H-11 (δ 2.24 ) mostró una correlación con los metilos CH3

-12 (δ 1.06) y CH3-13(δ 1.04) y para el protón H-5 (δ 1.80) se observó una correlación

(52)

40

F igur a 30. E sp ec tr o de R M N 1 H de l c om pue st o m ayo ri ta ri o 63 d e la p ar te a ér ea de S . p ol ypodi ode s en C D C l3 ( 500 M H z) . O O H O H H O H 7 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 6 3

(53)

41

F igur a 31. E spe ct ro de R M N 13 C d el c om pue st o m ayo ri ta ri o 63 d e la p ar te a ér ea de S . p ol y po di od e s en C D C l3 ( 12 5 M H z) . O O H O H H O H 7 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 6 3

(54)

42

F igur a 32. S ec ci ón de l e xpe ri m en to gC O SY de l c om pue st o 63 , s e m ue st ra n la s cor re la ci on es d e H -8 y H -9, H -1 y H -2 . O O H O H H H O 7 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 6 3 1 2

(55)

43

La asignación de las señales de RMN 13C de los átomos de carbonos protonados se hizo

con base al experimento gHSQC (Figura 33). De las correlaciones observadas en el experimento gHSQC (C-H) para los protones de los metilos a campos bajos CH3-20 δ

2.01 y CH3-21 δ 1.90 mostraron correlación con las señales de 13C a δ 15.9 y 20.7

respectivamente, estos metilos corresponden al grupo angeloiloxi.

También se observó las correlaciones de los otros cuatro metilos a campos altos, es decir, CH3-15 δ 1.23, CH3-12 δ 1.06, CH3-13 δ 1.04 y CH3-14 δ 0.94 mostraron correlación con

las señales de 13C a δ 29.7, 21.2, 21.6 y 12.4, asignando así a los carbonos 15, 12, 13 y 14, respectivamente.

Para las señales de los protones de los metilenos se observó que: H-2β δ 2.16 y H-2α δ 1.67 correlacionaron con la señal de δ 23.5 asignando con ello al C-2, los protones H-6β δ 2.12 y H-6α δ 2.09 por su parte mostraron correlación con la señal de 13C δ 23.9,

asignándose así al C-6, mientras que los protones H-3β δ 1.64 y H-3α δ 1.76 tuvieron correlación con la señal de 13C δ 39.0 asignando con ello al C-3 (Figura 34).

Las señales de los metinos vinílicos en δ 6.13 y 5.53 correlacionaron con las señales de

13C δ 139.1 y 117.7, respectivamente, asignándose así a C-19 que corresponde al grupo

algeloiloxi y C-8 correspondiente al otro grupo metino vinílico. Por su parte, los metinos base de oxígeno H-1 δ 5.17, H-9 δ 3.41 tuvieron correlación con la señal δ 74.8 y 69.7 respectivamente, asignándose los carbonos 1 y 9. La señal del metino H-5 que aparece en δ 1.80 mostró correlación con la señal de 13C a δ 39.9 asignando así el C-5.

La asignación de los carbonos cuaternarios se realizó con la ayuda del experimento gHMBC (C-H), a través de correlaciones a dos y tres enlaces (Figura 35). La asignación del grupo carbonilo del grupo angelato se determinó por la correlación que mostraron los protones H-1 (δ 5.17) y H-21 (δ 1.90), con la señal δ 169.1 asignado con ello al C-17, mientras que para el carbono cuaternario de este angelato se observó las correlaciones de los protones H-20 (δ 2.01) y H-21 (δ 1.90) con la señal de 13C δ 127.6, asignándose así al C-18. Por su parte, los protones H-9 (δ 3.41), H-11 (δ 2.24), H-6β (δ 2.12), H-6α (δ 2.09) y H-13 (δ 1.04) correlacionaron con la señal en δ 147.2 asignando con esto al C-7. La asignación del C-4 se hizo por desplazamiento químico (δ 71.0) y su correlación a dos enlaces con H-15 (δ 1.23). La señal H-8 (δ 5.53) y H-14 (δ 0.94) correlacionó con la

(56)

44

señal de 13C δ 69.7, asignando así al C-9, mientras que los protones H-1 (δ 5.179, H-5

(δ 1.80) y H-14 (δ 0.94) correlacionaron con la señal de 13C δ 41.8, asignado esta señal al carbono cuaternario C-10 (Figura 36).

La estereoquímica relativa del compuesto 63 se estableció a través de las correlaciones observadas en el experimento NOESY 2D (Figura 37) y tomando en cuenta consideraciones biogenéticas para los eudesmanoides. Asumiendo así la orientación relativa β para el Me-14. La estereoquímica relativa del grupo angeloiloxi se estableció a través de la correlación mostrada por el protón base de éster a δ 5.17 (H-1) con la señal a δ 1.80 (H-5). Por otro lado, se observó una correlación entre el Me-14 (δ 0.94) y el protón base del grupo hidroxilo (H-9) en δ 3.41, asignado de esta manera la configuración relativa β de H-9. De igual forma, la estereoquímica relativa del C-4 se asignó a través de la correlación observada entre la señal correspondiente para el Me-15 (δ 1.23) y la señal de H-5 (δ 1.80).

(57)

45

Cuadro 5. Datos de desplazamientos químicos de RMN de 1H y de 13C del compuesto mayoritario de la

parte aérea de S. polypodioides 63 (J en Hz) a.

Átomo 1H 13C HMBC 1α 5.17 dd (12.0, 4.2) 74.8 C-17, C-9, C-10, C-2 2β 2.16 m 23.5 2α 1.67 m 23.5 3β 1.76 ddd (17.6, 3.8, 3.8) 39.0 C-2 3α 1.64 ddd (17.6, 13.8, 3.8) 39.0 C-2 4 71.0 5α 1.80 dd (11.5, 5.8) 39.9 C-10, C-6, C-14 6β 2.12 m 23.9 C-7, C-8, C-10, C-5, C-11 6α 2.09 m 23.9 C-7, C-8, C-10, C-5, C-11 7 147.2 8 5.53 dddd (6.0, 2.0, 1.0, 1.0) 117.7 C-9, C-10, C-11, C-6 9β 3.41 d (6.0) 69.7 C-7, C-8, C-5 10 41.8 11 2.24 hept a (6.0) 34.8 C-13, C-8, C-5 12 1.06 d (6.0) 21.2 C-7, C-11 13 1.04 d (6.0) 21.6 C-7, C-11 14 0.94 s 12.4 C-1, C-9, C-10, C-5 15 1.23 s 29.7 C-4 17 169.1 18 127.6 19 6.13 cc (7.3, 1.5) 139.1 C-21, C-20 20 2.01 dc (7.3, 1.5) 15.9 C-19, C-18 21 1.90 q (1.5) 20.7 C-17, C-19, C-18 a 1H a 500 MHz y 13C a 125 MHz, en CDCl 3.

(58)

46

F ig ur a 33 . S ec ci ón d el e xpe ri m ent o gH SQ C de l c om pu es to 6 3. O O H O H H H O 7 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 6 3

(59)

47

F igur a 34. S ec ci ón de l e xp er im ent o gH SQ C p ar a la a si gna ci ón d e los m et ile nos de l c om pu es to 6 3. O O H O H H H O 7 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 6 3

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