Diagnóstico microbiológico del género Streptococcus. TM Pedro Alarcón Laboratorio de Referencia Cocaceas Gram positivas Mayo 2011

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(1)

Diagnóstico microbiológico del

género Streptococcus

TM Pedro Alarcón

Laboratorio de Referencia Cocaceas Gram positivas

(2)

Dominio Phylium Clase Orden Familia Genero Bacterias Firmicutes Bacilli Bacillales Lactobacillales

Staphylococcaceae Lactobacillaceae Aerococcaceae Carnobacteriaceae

Gemella

Enterococcaceae Leuconostocaceae Streptococcaceae

Taxonomia Pediococcus Aerococcus Abiotrophia Dolosicoccus Eremococcus Flaklamia Globicatella Ignavigranum Alloiococcus Dolosigranulum Granulicatella Enterococcus Melissococcus Tetragenococcus Vagococcus Leuconostoc Oenococcus Weissella Streptococcus Lactococcus

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Género Streptococcus

• αα-Hemolíticosαα

• ββ-Hemolíticosββ

γγγγ-Hemolíticos

Los Streptococcus son un género de Bacterias Gram positivas, esféricas de menos de 2 um de tamaño. Estas bacterias crecen en cadenas o pares, donde cada división celular ocurre a lo largo de un eje. De allí que su nombre, del Griego streptos, significa que se dobla o retuerce con facilidad, como una cadena.

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Características Generales del genero

Streptococcus

• Son bacterias anaerobias facultativas

• La mayoría de las especies crece en un ambiente con CO2

(5%), son capnofilos

• Son homofermentativos, producen acido láctico a partir de

la fermentación de la glucosa sin formación de gas

• Son catalasa negativo

• Son oxidasa negativo

• Forman cadenas cuando crecen en medios líquidos

• Algunos poseen capsula, la cual los permite serotipificar

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Streptococcus α hemolíticos

Grupo viridans → heterogéneo e incluye

varios subgrupos

grupo mitisgrupo anginosusgrupo mutansgrupo salivariusgrupo bovisgrupo sanguis

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Grupo mitis

Asociado a endocarditis y caries dentales

Streptococcus mitis : En prótesis y válvulas

Streptococcus oligofermentans

Streptococcus oralis : En prótesis y válvulas

Streptococcus gordoniiStreptococcus cristatus Streptococcus infantis Streptococcus perorisStreptococcus australis Streptococcus pneumoniae

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Grupo anginosus

Asociado a abscesos subcutáneos y órganos

Streptococcus anginosus : Tracto urogenital,

abscesos abdominales, tejidos blandos, cabeza y cuello

Streptococcus constellatus : Tracto Respiratorio

subespecies constellatus y subespecie pharyngis

Streptococcus intermedius : En absceso de

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Grupo mutans

Asociado a endocarditis y caries dentales

Streptococcus mutans : En placa bacteriana

(principal agente productor de caries y bacteremia)

Streptococcus sobrinus : En placa bacteriana

(dental)

Streptococcus criceti (animales)

Streptococcus ratti (animales)

Streptococcus downei (animales)

Streptococcus macacae (animales)

(9)

Grupo salivarius

Asociado a endocarditis y caries dentales

Streptococcus salivarius : En boca,

especialmente lengua, mucosa y saliva. (bacteremia, endocarditis y meningitis)

Streptococcus vestibularis : En vestíbulo oral

Streptococcus thermophilus : En lecherías

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Grupo bovis

Infección del tracto biliar y urinario, endocarditis

Streptococcus infantarius II.1 (humanos)

*subsp. infantarius y subsp. coli

Streptococcus alactolyticus (animales)

Streptococcus equinus/bovis(animales)

Streptococcus gallolyticus *Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus (I)

(cancer gastrointestinal)

*Streptococcus gallolyticus subsp.pasteurianus II.2 (meningitis)

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Grupo sanguis/sanguinis

Asociado a bacteremias

Streptococcus sanguis biotipo 1

Streptococcus sanguis biotipo 2

Streptococcus sanguis biotipo 3

Streptococcus parasanguis

Streptococcus gordonii

Streptococcus sinensis

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Diferenciaci

Diferenciacióón fenotipica de n fenotipica de StreptococcusStreptococcus grupo grupo viridansviridans α αα α α α α

α -- hemhemóólisis,lisis, LAP +, PYR LAP +, PYR -- , Vancomicina S, Vancomicina S

Grupo viridans Arginina Dihidrolasa Hidrólisis de la Esculina Acetoina (VP)

Manitol Sorbitol Lactosa Actividad Ureasa Grupo Sanguis + + - - - + -Grupo Mitis - - - - - + -Grupo Mutans - + + + + + -Grupo Salivarius - + + - - + + Grupo Anginosus + + + - - + -Grupo Bovis - + + v - +

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Flujograma de diferenciación de Streptococcus grupo viridans

LAP (+), PYR (-),Lactosa (+), Vancomicina sensible Hidrólisis de Arginina (+) (-) grupo sanguis grupo anginosus grupo mitis grupo bovis grupo mutans grupo salivarius Producción de Acetoina (VP) (+) (-) grupo anginosus aroma dulce grupo sanguis Hidrólisis de la urea (-) (+) grupo salivarius grupo bovis grupo mutans grupo mitis Producción de Acetoina (+) (-) grupo mitis grupo bovis grupo mutans Acidificación de Sorbitol (+) (-) grupo bovis grupo mutans Latex D (+) Bilis esculina (+) Nacl (-)

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GENERO LAP PYR SUSCEP. VANCOMICINA MOVILI DAD CALDO SAL 6.5% Enterococcus + + S/R V + Abiotrophia + + S - -Granulicatella + + S - -Aerococcus V V S - + Helcococcus - + S - + Leuconostoc - - R - V Weisella - - R - + Pediococcus + - R - V Tetragenococcus + - S - + Gemella V + S -

-1- Características fenotipicas de otros Géneros bacterianos

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GENERO LAP PYR SUSCEP. VANCOMICINA MOVILI DAD CALDO SAL 6.5% Vagococcus + + S + + Alloiococcus + + S - + Globicatella - + S - + Facklamia + + S - + Dolosigranulum + + S - + Ignavigranum + + S - + Dolosicoccus - + S - -Eremococcus - - S - + Lactococcus + + S - V

2- Características fenotípicas de otros Géneros bacterianos

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Gru po miti s Gru po a ngi nosu s Gru po b ovis Gru po sal iva riu s Gru po s an gui s Gru po m utan s Aer oco ccu s vi rid an s Do los igra nulu m p igru m Gem ella hae mol ys ans Gem ella m orbi llo rum Glo bic atel la s ang uin is Gra nul icat ella ad iace ns 59 36 19 12 4 3 1 1 1 1 1 1 0 10 20 30 40 50 60 N u m e ro

Streptococcus grupo viridans (n:133)

Laboratorio de Referencia Cocaceas Gram positivas Año 2010

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(18)
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Streptococcus grupo mitis

Streptococcus pneumoniae

Kawamura et al. 1995 en estudio basado en comparación de secuencias de genes de 16S de rRNA encuentra una estrecha relación filogenética entre S. pneumoniae y

Streptococcus grupo viridans, sugiere

(20)

Streptococcus pneumoniae

Cocaceas gram Positivas

capsuladas con un tamaño de 0.5 a 1.2 um de diámetro, dispuestas en pares o diplos lanceolados

Son anaerobias facultativas

Para su crecimiento y desarrollo necesitan de una atmosfera de 8 a 10 % de CO2

Presenta colonias redondas,

mucosas y no pigmentadas, de 1 a 3 mm de diámetro, las cuales presentan un aspecto umbilicado,

con una depresión central

producida por una autolisis

progresiva.

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Factores de virulencia

Streptococcus pneumoniae

Adherencia( pspA y psaA): Capacidad de

adherirse a celulas blanco

Cápsula polisacárida: hay alrededor de 90

tipos capsulares

Pneumolisina (gen ply): Citotoxina que

destruye la membrana de globulos rojos

Neuraminidasa:(NamA-NamB) hidroliza glucoproteinas y glucolipidos celulares

Autolisina (gen lytA): hidroliza la capa de

peptidoglican, permite la division celular

Proteasa para IgA: inactiva la IgA1

presente en las mucosas, facilitando la adherencia y colonización

Hialuronidasa: diseminación de los organismos en los tejidos

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Pruebas Bioquimicas de Laboratorio Control Negativo Reacción positiva Solubilidad en bilis Desoxicolato de sodio 10%

Susceptibilidad a optoquina 5ug (Ethil hydrocupreina hydrochloride)

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Serotipificación por técnica de Quellung Método de Referencia

Se produce el aumento (hinchazón) de la capsula al añadir antisueros capsulares específicos lo que la

hace visible microscópicamente

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Serotipos de Streptococcus pneumoniae de muestras invasivas años 2008 a 2010

Instituto de Salud Publica de Chile

1 1 1 3 3 3 14 14 14 19F 19F 7F 7F 7F 19F 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Año 2008 Año 2009 Año 2010

c 1 3 4 5 8 13 14 29 34 38 10A 11A 12F 15A 15B 15C 15F 16F 18A 18C 18F 19A 19F 22F 23A 23B 23F 24F 28A 33F 35F 6A 6B 7F 9A 9L 9N 9V Otros

(25)
(26)
(27)
(28)

Susceptibilidad de Streptococcus pneumoniae aislados de cuadros invasivos años 2008-2010

Instituto de Salud Publica de Chile

Penicilina Meningitis (CIM)

Resistente Sensibles

Año Total casos n % n %

2008 120 30 25 90 75

2009 113 37 32,7 76 67,3

2010 109 35 32,1 74 67,9

Penicilina No Meningitis (CIM)

Resistente Sensibles Intermedia

Año Total casos n % n % n %

2008 796 0 0 780 97,9 16 2

2009 827 2 0,24 801 96,8 24 2,9

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Grupo de edad n

Ceftriaxona meningitis (CIM)

n

Ceftriaxona no meningitis (CIM)

Sensibles Intermedia Resistente Sensibles Intermedia Resistente

n % n % n % n % n % n % < 12 meses 21 17 81,0 1 4,8 3 14,3 72 64 88,9 7 9,7 1 1,4 12-23 meses 13 11 84,6 1 7,7 1 7,7 90 79 87,8 11 12,2 0 0,0 24-59 meses 8 5 62,5 0 0,0 3 37,5 78 66 84,6 11 14,1 1 1,3 ≥ 5 a 14 años 9 9 100,0 0 0,0 0 0,0 41 41 100,0 0 0,0 0 0,0 15 a < 60 años 37 34 91,9 2 5,4 1 2,7 171 164 95,9 6 3,5 1 0,6 ≥ 60 años 17 17 100,0 0 0,0 0 0,0 172 160 93,0 8 4,7 4 2,3 Sin edad 4 4 100,0 0 0,0 0 0,0 53 50 94,3 2 3,8 1 1,9 Total 109 97 89,0 4 3,7 8 7,3 677 624 92,2 45 6,6 8 1,2 Grupo de edad n Eritromicina (KB o CIM) n SXT (KB o CIM)

Sensibles Intermedia Resistente Sensibles Intermedia Resistente

n % n % n % n % n % n % < 12 meses 93 46 49,5 0 0,0 47 50,5 93 29 31,2 12 12,9 52 55,9 12-23 meses 103 45 43,7 0 0,0 58 56,3 103 39 37,9 15 14,6 49 47,6 24-59 meses 86 47 54,7 1 1,2 38 44,2 86 22 25,6 19 22,1 45 52,3 ≥ 5 a 14 años 50 46 92,0 0 0,0 4 8,0 50 18 36,0 18 36,0 14 28,0 15 a < 60 años 208 171 82,2 0 0,0 37 17,8 208 105 50,5 46 22,1 57 27,4 ≥ 60 años 189 143 75,7 1 0,5 45 23,8 189 100 52,9 30 15,9 59 31,2 Sin edad 57 42 73,7 2 3,5 13 22,8 57 26 45,6 15 26,3 16 28,1 Total 786 540 68,7 4 0,5 242 30,8 786 339 43,1 155 19,7 292 37,2 Grupo de edad n Cloranfenicol (KB o CIM) Sensibles Resistente n % n % < 12 meses 93 91 97,8 2 2,2 12-23 meses 103 101 98,1 2 1,9 24-59 meses 86 84 97,7 2 2,3 ≥ 5 a 14 años 50 50 100,0 0 0,0 15 a < 60 años 208 205 98,6 3 1,4 ≥ 60 años 189 187 98,9 2 1,1 Sin edad 57 57 100,0 0 0,0 Total 786 775 98,6 11 1,4

Susceptibilidad de Streptococcus pneumoniae aislados de cuadros invasivos (n°786)

(30)

Métodos de Concentración Inhibitoria

Mínima

(31)

Streptococcus beta hemolítico Grupo Piogénico

Streptococcus pyogenes

Streptococcus agalactiae

Streptococcus equi subespecie equi

Streptococcus equi subespecie zooepidermicus

Streptococcus dysgalactiae subespecie dysgalactiae

Streptococcus dysgalactiae subespecie equisimilis

Streptococcus canisStreptococcus iniaeStreptococcus porcinusStreptococcus phoacaeStreptococcus didelphisStreptococcus urinalis

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Streptococcus pyogenes

Caracteristicas:

• Cocaceas gram positivas dispuestas en cadenas

• Son colonias blancas de 1-2 mm de diametro con una marcada zona beta hemólisis

• Anaerobios facultativos

• Inmoviles no formadores de esporas, capsulados

• Son catalasa negativa

• Rango de temperatura de crecimiento es de 25-45ºC (optimo 37 ºC)

(33)

Streptococcus pyogenes

Pruebas de laboratorio:

• Colonias beta-hemolíticas con diámetro mayor a 0.5 mm

• Catalasa

-• PYR +

• LAP +

• Grupo de Lancefield A (año 1933)

• VP

-• Bacitracina 0,04U Sensible

• Cotrimoxazol Resistente

DNAsa Positiva

+

(34)

Streptococcus pyogenes

Factores de Virulencia

•Proteína M: principal factor de virulencia, confiere

resistencia a la fagocitosis por los polimorfonucleares, en base a esta proteína podemos serotipificar a

S.pyogenes, existen mas de 124 serotipos (

emm-gene sequence typing)

•Proteína F:adherencia y evasión del sistema inmune

•Acido Lipoteicoico: unión a fibronectina

•Enzimas: estreptoquinasas, DNAsas, amilasas, esterasas y hialuronidasas

•Toxinas: Estreptolisinas son hemolisinas (S y O)

capaces de lisar eritrocitos, leucocitos y plaquetas; Exotoxinas pirogénicas A, B y C (SpeA ,SpeB y SpeC)

(35)

Streptococcus pyogenes Cuadros clínicos en orden de frecuencia:

Enfermedades supurativas Faringitis Escarlatina Impétigo Erisipela Celulitis

Fascitis necrosante (gangrena estreptocócica) Sindrome del shock tóxico estreptocócico

Otras: sepsis puerperal, linfangitis, neumonía, bacteriemia, endocarditis, meningitis y artritis.

Enfermedades no supurativas

Fiebre reumática

(36)
(37)

emm typing

Secuenciamiento del gen emm que codifica a proteína M

•Reemplaza el convencional método serologico (1943)

•Se analiza la secuencia nucleotidica NH2-terminal (región

hipervariable)

La definición de un nuevo tipo emm se basa en la

identificación de mas de 160 bases nucleotidicas (mayor a 95% de similitud con el gen emm de referencia)

La secuencia de emm types puede ser encontrada online

en:

http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/strepblast.htm.

Los tipos emm mas frecuentemente encontrados son:

(38)

em m1 em m12 em m89 em m80 em m6 em m3 em m28 emm 4 em m33 em m87 emm 81 emm 11 em m22 em m44 em m48 emm 82 emm 90 10 9 7 6 5 4 4 3 3 3 2 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C a n ti d a d emm types

emm types encontrados en cepas de Streptococcus

pyogenes (N°62)

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SEROTIPO M SANGRE

LIQ.

ARTICULAR TEJIDOS

LIQ.

PERITONEAL SECRECIONES TOTAL

1 4 6 10 3 3 1 4 4 3 3 6 3 1 1 5 11 1 1 12 8 1 9 22 1 1 28 3 1 4 33 2 1 3 44 1 1 48 1 1 80 1 2 3 6 81 1 1 2 82 1 1 87 3 3 89 4 2 1 7 90 1 1 TOTAL 34 8 2 2 15 62

Distribución de Serotipo M de S. pyogenes por muestra Laboratorio de Referencia de Cocaceas gram positivas

(40)

Streptococcus agalactiae

Caracteristicas:

• Cocaceas gram positivas dispuestas en cadenas

• Catalasa negativas

• Colonias de color blanco con tamaño >0.5mm de diametro, presentando una pequeña beta hemolisis

• Anaerobio facultativo

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Streptococcus agalactiae

Factores de virulencia

Capsula: Antifagocitaria, especificidad tipo, 10

antigenos capsulares

Beta hemolisina/citolisina: Lisis de células de

epitelio pulmonar

Acido Lipoteicoico: adherencia celular como

primer paso en la infección

Enzima hialuronato liasa (gen hylB): Participa

en la diseminación rompiendo el acido hialuronico de la matriz extracelular, tejido de placenta, tejido fetal y liquido amniótico.

(42)

Patologías asociadas

*Es un importante patógeno en neonatos y

mujeres embarazadas produciendo cuadros de bacteremia, meningitis, neumonía, shock séptico y neutropenia.

*Causante de bacteriuria en mujeres embarazadas *Causa cistitis, pielonefritis, uretritis en hombres, mujeres no embarazadas y niños

(43)

Streptococcus agalactiae

• Pruebas bioquimicas : Catalasa

-- Látex (C. Lancefield ) B

- Test de CAMP + (>98%)

- Hidrólisis de Hipurato de sodio + - LAP + PYR -Hidrólisis de Hipurato + - + -Test CAMP

(44)

Prueba de CAMP

Streptococcus agalactiae (CAMP test positivo) Staphylococcus aureus (ATCC 25923)

Arcanobacterium haemolyticum (CAMP reverso positivo)

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Streptococcus agalactiae

Serotipificación

• La clasificación serológica está basada en la identificación de polisacáridos ( Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII y IX) y proteínas antigénicas (C, R y X)

• Los serotipos mas comúnmente aislados en

países americanos son Ia, Ib, II y III

• Serotipos VI y VIII han sido aislados en Japón

• El serotipo III se aísla con mayor frecuencia de casos de sepsis neonatal y meningitis.

(46)

Serotipos SAG Sangre LCR

Liquido

Articular Secreciones Total

Ia 23 4 0 0 27 Ib 6 0 0 0 6 II 11 1 1 4 17 III 61 11 0 4 76 IV 4 0 0 1 5 V 8 0 0 0 8 VI 0 0 0 0 0 VII 2 0 1 0 3 VIII 0 0 0 0 0 NT 2 2 0 0 4 Total 117 18 2 9 146

(47)
(48)
(49)

Resistencia de Eritromicina y Clindamicina en

Streptococcus pyogenes / Streptococcus agalactiae

Eritromicina y Clindamicina :S

Eritromicina : R y Clindamicina:S Fenotipo M gen mef (macrolide efflux)

E E E Cl Cl Cl Eritromicina y Clindamicina :R

Fenotipo MLSc gen erm (erythromycin ribosomal

methylase)

Eritromicina y Clindamicina :R inducida Fenotipo MLSi

E Cl

(50)

Pen icili na Clin dam icin a Erit rom icin a Van com icin a 0 103 1 102 2 101 0 103 0 20 40 60 80 100 120 C a n ti d a d Antibioticos

Susceptibilidad Streptococcus pyogenes año 2009 n: 103 Laboratorio de Referencia Sensible Resistente 0 136 10 126 11 125 0 136 0 20 40 60 80 100 120 140 Cantidad Pen icili na Clin dam icin a Erit rom icin a Van com icin a Antibioticos

Susceptibilidad de Streptococcus agalactiae año 2009 n:136 Laboratorio de Referencia Sensible Resistente Fenotipos encontrados M 1 MLSc 1 Resistencia a eritromicina 1.94% Resistencia a clindamicina 0.97% Fenotipos encontrados M 1 MLSc 8 MLSi 2 Resistencia a eritromicina 8.08% Resistencia a clindamicina 7.35%

(51)

Susceptibilidad de Streptococcus pyogenes año 2010 n:62 Laboratorio de Referencia 0 4 2 0 0 62 58 60 62 62 0 10 20 30 40 50 60 70 Peni cilin a Eritr omic ina Clin dam icin a Cefo taxi ma Vanc omic ina Antibioticos C a n ti d a d Sensible Resistente

Susceptibilidad de Streptococcus agalactiae año 2010 n:147 Laboratorio de Referencia 0 9 7 0 0 146 137 139 146 146 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Peni cilin a Eritr omic ina Clin dam icin a Cef otax ima Vanc om icin a Antibioticos C a n ti d a d Sensible Resistente Fenotipos encontrados M 3 MLSc 5 MLSi 2 Resistencia a eritromicina 6.16% Resistencia a clindamicina 4.79% Fenotipos encontrados M 2 MLSc 2 Resistencia a eritromicina 6.45% Resistencia a clindamicina 3.22%

(52)
(53)

Streptococcus β - hemolíticos

Grupos A,C, G → con diámetro de colonia mayor a 0,5 mm

Streptococcus dysgalactiae

subespecie equisimilis :

-

Catalasa

PYR

-- Látex (Grupo Lancefield) A,C,G VP

(54)

Streptococcus β- hemolíticos no piogenico

Grupos A, C, G → con diámetro de colonias menor a 0,5 mm

Streptococcus anginosus

(A, C, G, F, )

Streptococcus constellatus ( A,C, F, )

Streptococcus intermedius (F)

Catalasa

PYR

-- VP

+

- Trehalosa +

Sorbitol

-- + Voges-Proskauer

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Identificación Streptococcus β ββ β- hemolíticos Grupo Lancefield Tamaño de colonia

Especies PYR VP Hidrólisis almidón Sorbitol CAMP A Grande S. pyogenes + - - - -A,C,G,F Pequeña <5mm Streptococcus grupo anginosus - + -

-A,C,G Grande S. dysgalactiae

subesp equisimilis - - - - -B Grande S. agalactiae - - - - + C Grande S. dysgalactiae subesp disgalactiae - - - +

-C Grande S. equi subesp

equi

- - + -

-C Grande S. equi subesp

zooepidermicus

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-Control de Calidad

Staphylococcus aureus ATCC® 25923

Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619

Staphylococcus aureus ATCC® BAA-976 (Test D Negativo)

Staphylococcus aureus ATCC® BAA-977 (Test D Positivo)

Streptococcus pyogenes ATCC® 21547 (Latex A)

Streptococcus agalactiae ATCC® 13813 (Latex B)

Streptococcus dysgalactiae sp dysgalactiae ATCC® 27957 (Latex C)

(57)

Comentarios generales

• Streptococcus grupo viridans aislados de sangre u otros sitios estériles (LCR) se debe hacer estudio de susceptibilidad a PEN o AMP solo por método Concentración Inhibitoria Mínima.

• Streptococcus beta hemolíticos del grupo

anginosus se les debe hacer antibiograma de grupo viridans.

(58)

• Los test de susceptibilidad a penicilina y otros β-lactámicos aprobados por la FDA para el tratamiento de Streptococcus pyogenes o

Streptococcus agalactiae no es necesario

realizarlo de rutina, como también para vancomicina, ya que no se han reconocido cepas resistentes. Cualquier cepa considerada no susceptible DEBE enviarse al laboratorio de referencia para su confirmación.

(59)

MUCHAS GRACIAS

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