EFECTO FUNGISTÁTICO Y FUNGICIDA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE PROPÓLEOS SOBRE ESPECIES DE CANDIDA
Marielsa Gil 1, Milagros Joya 1, Luis González 2, Zoila Figueroa1, Esther Perozo1 1
Laboratorio de Diagnóstico Bacteriológico, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo, Venezuela.
marielsagilfd@hotmail.com 2
Unidad de Microbiología Ambiental, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo, Venezuela.
Resumen
El propóleos es una sustancia resinosa balsámica, elaborado por abejas productoras de miel (Apis mellifera). El objetivo del trabajo fue determinar el efecto fungistático y fungicida de un extracto etanólico de propóleos comercial al (70% v/v) proveniente de un apiario del Estado Cojedes Venezuela sobre 4 especies de Candida ATCC: C. parapsilosis, C. guilliermondii, Complejo C. albicans, C. glabrata. La metodología utilizada fue la técnica de macrodilución en tubo. El extracto de propóleos demostró efecto fungistático total a 15% sobre C. parapsilosis en 24 horas de incubación y sobre Complejo Candida albicans a 48 horas de incubación. El efecto fungistático parcial fue observado en 24 horas de incubación a una concentración de 8% para C. guillermondi, C. glabrata y Complejo C. albicans y en 48 horas de incubación a 11% para C. guilliermondii, 15% para C. parapsilosis y 19% C. glabrata. El efecto fungicida en 24 horas fue de 11% para C. guilliermondii, Complejo C. albicans y C. glabrata y de 19% para C. parapsilosis. El efecto fungicida en 48 horas de incubación fue de 15% para C. guilliermondii, 19% para C. parapsilosis y Complejo C. albicans y 23% para C. glabrata. Se evidencia que el tiempo de incubación más eficaz fue el de 48 horas y que la especie más sensible fue C. guilliermondii y la especie más resistente C. glabrata. El presente trabajo demostró que el extracto etanólico del propóleos tiene efecto fungistático y fungicida in vitro en las cepas estudiadas.
FUNGICIDAL AND FUNGISTATIC EFFECT OF THE ETHANOLIC EXTRACT OF PROPOLIS ON CANDIDA SPECIES
The propolis is a resinous balsamic substance, elaborated by honey maker bees (Apis mellifera). The object of this work was to determine the fungicidal and fungistatic effect of an ethanolic extract of commercial propolis at 70% v/v taken from a hive of Cojedes State, Venezuela on 4 ATCC Candida species: C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. albicans Complex, C. glabrata. The used method was the macro dilution in tube. The extract of propolis showed a total fungistatic effect to a 15% C. parapsilosis in a period of 24 hours of incubation and also on Candida albicans Complex in 48 hours. In 24 hours of incubation the partial fungistatic effect was observed in a concentration of 8% on C. guilliermondii, C. glabrata and C. albicans Complex, and in 48 hours of incubation 11% were for C. guilliermondii, C. albicans Complex and C. glabrata, and for C. parapsilosis it was of 19%. In 48 hours the fungicidal effect was of 15% for C. guilliermondii, 19% for C. parapsilosis and C. albicans Complex and 23% for C. glabrata. It is evidential that the most efficient incubation time was the 48 hours period and the most sensitive specie was the C. guilliermondii, also the most resistant specie was C. glabrata. This work demonstrated that the ethanolic extract of propolis has a fungicidal and fungistatic in vitro effect in the studied stumps.
Key Words: Ethanolic extract of propolis, fungistatic, fungicidal
Introducción
La candidiasis es una micosis primaria o secundaria ocasionada por levaduras endógenas y oportunistas del género Candida, especialmente el Complejo Candida albicans y es considerada como una de las infecciones por hongos oportunistas más frecuentes en seres humanos, ya que su incidencia se ha elevado durante los últimos 30 años, representando el 7 % de las micosis en general y el 25% de las micosis superficiales. De hecho afecta a individuos de cualquier edad, raza y sexo y no tiene relación con el clima, la situación geográfica ni el nivel socioeconómico. Las manifestaciones clínicas pueden ser localizadas, diseminadas o sistémicas y pueden afectar la piel, las mucosas; así como las estructuras profundas y los órganos internos (1-3).
El Complejo Candida albicans es la especie que origina el mayor número de manifestaciones patológicas. Sin embargo Candida parapsilosis se aísla con frecuencia en pacientes pediátricos con uso prolongado de catéter, Candida tropicalis desarrolla en el 50% de los colonizadores candidiasis invasora, Candida glabrata y Candida krusei se aíslan con frecuencia de pacientes con antecedentes de profilaxis antifúngica con fluconazol (4).
En la actualidad la búsqueda de nuevas alternativas para desarrollar tratamientos contra enfermedades infecciosas se hace necesaria debido a la rápida adquisición de mecanismos de multiresistencia de los microorganismos frente a los antibióticos o antifúngicos convencionales (5,6), por lo que muchos investigadores trabajan en el estudio de sustancias basadas en productos naturales derivados principalmente de las plantas y productos fabricados por los insectos, para encontrar soluciones que ofrezcan alternativas terapéuticas a un bajo costo (7 - 10).
Recientemente, se ha puesto especial atención en el propóleos, que es un producto natural que ha mostrado interesantes propiedades medicinales (11).
El propóleos es una sustancia resinosa balsámica, elaborado por abejas productoras de miel (Apis mellifera) a partir de la resina y exudados de varias plantas (12). Las abejas recolectan el exudado vegetal y forman pequeños grumos con sus mandíbulas, mezclando dicho
exudado con cera y productos de las glándulas salivales de ellas mismas (11,12). El material resultante es usado en la colmena para cerrar grietas, reducir al mínimo las vías de acceso, recubrir y aislar restos de animales que se hayan introducido en la colmena evitando su descomposición, consolidar componentes estructurales, barnizar el interior de las celdillas con fines desinfectantes y evitar vibraciones (11,13).
Por otra parte, el propóleos presenta numerosas propiedades biológicas, entre las que se destaca su actividad antimicrobiana, inmunomoduladoras, anti-inflamatorias y antimitogénicas (14,15). La propiedad antimicrobiana del propóleos puede ser atribuida principalmente, a los flavonoides, como la pinocembrina, galangina, pinobanskina y al éter bencil del éster fenetil de ácido caféico y la actividad antifúngica al ácido benzoico, sacranetina, perostibeno, estalibdenos bisabolol entre otros. Estos compuestos estarán presente en mayor o menor cantidad dependiendo de la ubicación geográfica, de las especies vegetales de las cuales fue obtenido, así como de la estación del año en que se obtuvo y la especie de abeja que la produjo (16). En este sentido, muchos investigadores han estudiado la actividad antimicrobiana y antifungica del propóleos proveniente de varios países, entre ellos México, Chile, Colombia, Cuba, Brasil, Argentina y Venezuela, a diferentes concentraciones frente a diversos microorganismos causantes de patologías. Entre los microorganismos probados se encuentran: Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Salmonellas sp, gardnerella vaginalis, Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, Enterococcus faecalis, Complejo Candida albicans entre otros; obteniendo resultados satisfactorios en la mayoría de los casos, según la concentración usada y el origen geográfico (10, 17 - 26).
Sin embargo, en Venezuela, existen pocos estudios en relación a las propiedades antimicrobianas que posee el propóleos producido en los distintos Estados del país (24-26)
y menos aún sobre el efecto antifúngico. Uno de los Estados del que se extrae el propóleo es en el estado Cojedes. Es por esto que este trabajo se dirigió a estudiar el efecto fungistático y fungicida del extracto etanólico de propóleos elaborada en el Estado Cojedes de Venezuela sobre especies de Candida.
Metodología
El estudio fue no experimental, descriptivo y de corte transversal.
Extracto Etanólico de Propóleos y Cepas Microbianas
Se utilizó extracto etanólico de propóleos comercial al 70% de abejas Apis mellífera fabricada en un Apiario ubicado en el Sector El Paradero del Municipio Lima Blanco del Edo. Cojedes, Venezuela. Las cepas utilizadas fueron las siguientes, Candida parapsilosis Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos (CVCM) 22019 Candida guilliermondii CVCM (1346), Complejo Candida albicans (American Type Culture Collection) ATCC (10231) Candida glabrata ATCC 2001, adquiridas en medio de transporte sembrado por el método de punción o profundidad. Después de varios repiques se seleccionaron colonias aisladas para preparar suspensiones de levaduras al 1 % Mc. Farland equivalente a 3.0 x 108 UFC/mL (27).
Determinación de la actividad bacteriostática y bactericida
Se utilizó la técnica de macrodilución en tubo adaptada por Gil y cols en (2008) (24) citado por Gil cols en (2012) (25). Con una pequeña modificación donde se sustituyó el caldo y el agar Infusión cerebro corazón por caldo y agar Sabouraud en función del microorganismo a utilizar.
Por cada levadura, se preparó una batería de once tubos de 150 x 20 correspondientes a 10 diluciones puntuales y al control de crecimiento, quedando así una concentración del Extracto etanólico de propóleos desde el tubo 1 al 11 de 4, 8 , 11, 15, 19, 23, 26, 30, 34, 37 % y 0 % respectivamente. Se inoculó 100 μL de la suspensión de levadura a cada tubo y se mezcló en varias ocasiones durante su incubación a 25ºC por 24 horas. Cumplido el tiempo de exposición se procedió a inocular 10 μL de cada tubo a placas de Agar Sabouraud, utilizando la técnica de siembra en superficie con espátula de Drigalski, así mismo de cada tubo de dilución se tomó con asa calibrada 10 μL y se inoculó en caldo Sabouraud. Ambos procedimientos se incubaron a 25ºC. Posteriormente, se observó si hubo o no crecimiento del microorganismo a las 24 horas, observándose nuevamente a las 48 horas de
incubación (24,25). Cabe destacar, que en cada ensayo se utilizó un control de viabilidad, el cual garantiza que el microorganismo es capaz de reproducirse en el agar y en el caldo Sabouraud. Adicionalmente los caldos y las placas donde se observó crecimiento se realizó tinción de Gram y las pruebas bioquímicas convencionales para su identificación.
Resultados
La concentración mínima inhibitoria o fungistático (CMI) de propóleos se registró como el valor de la menor dilución que inhibió completamente o parcialmente el desarrollo de las levaduras sobre el agar sabouraud y la concentración mínima fungicida (CMF) se registró como el valor de la menor dilución en la que hubo inhibición total de la reproducción del microorganismo en caldo sabouraud (24,25). En la Tabla 1 se presenta el comportamiento de las diferentes concentraciones del extracto etanólico de propóleos sobre el crecimiento de las cepas de Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Complejo Candida albicans y Candida glabrata, con sus respectivos controles de viabilidad los cuales crecieron en su totalidad lo que valida los resultados obtenidos.
[Tabla 1]
En la Tabla 2 se resumen las CMI y CMF en las distintas especies de Candidas a las 24 y 48 horas. El propóleos demostró efecto fungistático total sólo sobre C. parapsilosis a las 24 horas y Complejo C. albicans a las 48 horas ambas a 15%. Mientras que en el resto de las cepas el efecto fungistático fue parcial en ambos tiempos. También, puede visualizarse que la CMI y CMF varían según el tiempo de incubación del cultivo post exposición.
[Tabla 2] Discusión
El efecto fungistático y fungicida observado en el presente estudio coinciden con algunos trabajos que reportan efectividad contra estas especies, aunque lo hagan a concentraciones diferentes, tal es el caso de Quintero y cols (2008) estudiaron el efecto de extractos de propóleos mexicanos de Apis mellifera sobre el crecimiento in
vitro de Complejo Candida albicans obteniendo que el extracto obtenido en Cuautitlán Izcalli, Estado de México presentó la mayor actividad biológica, inhibiendo el 94,4% de los aislamientos clínicos a una concentración de 0,8 mg/mL; la cepa de referencia fue inhibida a una concentración de 0,6 mg/mL. El efecto fue fungistático a bajas concentraciones y fungicida a concentraciones superiores a la CMI. También Herrera y cols (2010) evaluaron el efecto antifúngico de seis extractos comerciales de propóleos chilenos sobre Candida spp todas las cepas de Candida spp fueron inhibidas por los seis extractos líquidos de propóleos, cuya CMI para Complejo C. albicans varió entre 197 µg/mL y 441 µg/ mL. Por su parte, Otta y cols estudiaron la Actividad antifúngica del propóleos sobre diferentes especies de Candida y obtuvieron una sensibilidad en el siguiente orden: Complejo C. albicans > C. tropicalis > C. krusei > C. guilliermondii ((17, 18, 28,). Sin embargo existen trabajos donde la efectividad fue disímil, tal es el caso de Alves y cols (2011) y Dantas y cols en (2012) ambos trabajos reportan que los propóleos tuvieron actividad antifúngica nula sobre Complejo Candida albicans (19,22). Entre los factores que pueden influir para obtener resultados tan variables entre los propóleos obtenidos de diferentes países está la composición química del propóleos lo que está íntimamente relacionado con el origen botánico utilizado por las abejas para la fabricación del propóleos y a su vez relacionado con el área geográfica y con las condiciones climáticas del mismo. Otros factores son las especies de las abejas productoras y finalmente el método utilizado para evaluar la concentración mínima inhibitoria, la cual en la mayoría de los estudios puede observarse que utilizaron el método de difusión en agar, mientras que hay autores que señalan que este método no es conveniente para la determinación de la CMI ya que la difusión del propóleos es irregular (29).
Conclusión
El presente trabajo demostró que el extracto etanólico de propóleos proveniente del Estado Cojedes de Venezuela, tiene actividad fungistática y fungicida in Vitro sobre todas las cepas estudiadas a concentraciones relativamente bajas. Los resultados obtenidos revelan que la calidad del propóleos es alta, lo que hace suponer que en su
composición química posee elevado contenido de ácido benzoico, sacranetina, perostibeno, estalibdenos bisabolol y la pinocembrina, todos ellos de probada acción antifúngica (16,19,30), sin embargo es necesario realizar estudios cromatográficos para comprobar esta aseveración. También se evidencia que para determinar la CMI y CMF en estas especies de levaduras el tiempo de incubación del cultivo post exposición ideal es 48 horas. Interpretándose que a 24 horas solo hay inhibición temporal obteniéndose falsas CMI y CMF cuya única excepción fue dada con Candida parapsilosis. Así mismo, se destaca que según la CMF las cepas más resistente al extracto etanólico de propóleos fueron C. glabrata, seguida de C. parapsilosis y las más sensibles fueron C. guilliermondii seguida por Complejo C. albicans.
Finalmente, es importante resaltar que Complejo C. albicans que es una de las especies más frecuentes en patologías oportunistas y que ha adquirido resistencia a los antimicóticos comunes (6) resultó tener alta sensibilidad a este producto. Es por ello que, hoy en día es invaluable conocer que el propóleos sea capaz de eliminar a especies de importancia clínica, teniendo además en cuenta que es un producto natural y de muy bajo costo; siendo la única limitante descrita hasta ahora que el paciente sea alérgico a los productos apícolas (13). Por tanto, el propóleos, con sus escasas contraindicaciones, la ausencia de efectos colaterales y su gran eficacia contra estas levaduras se impone como una alternativa terapéutica o al menos como coadyuvante en el tratamiento de la candidiasis. Para ello se deben realizar investigaciones in vivo, como lo han hecho otros países (9,10, 21, 23).
Agradecimientos
Los Autores agradecemos a la Prof. Nayralith Ramos Jefe del Departamento de Microbiología de la Universidad de Carabobo, a la Lcda. Greysy Ochoa, al TSU Héctor Pérez y a la Br. Andris Briceño por el apoyo brindado a esta investigación.
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Tabla Nº 1 Efecto Fungistático y Fungicida del Propóleos Agar Sabouraud Placa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 4% 8% 11% 15% 19% 23% 26% 30% 34% 37% 0% C. parapsilosis 24 Horas +++ ++ ++ - - - +++ C. parapsilosis 48 horas +++ +++ +++ ++ - - - +++ C. guilliermondii 24 Horas +++ + - - - +++ C. guilliermondii 48 Horas +++ +++ + - - - +++ Complejo C. albicans 24 Horas ++ + - - - +++ Complejo C. albicans 48 Horas +++ ++ + - - - +++ C. glabrata 24 Horas ++ + - - - +++ C. glabrata 48 Horas +++ +++ ++ ++ + - - - +++ Caldos Sabouraud Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Concentración 4% 8% 11% 15% 19% 23% 26% 30% 34% 37% 0% C. parapsilosis 24 Horas + + + + - - - + C. parapsilosis 48 Horas + + + + - - - + C. guilliermondii 24 Horas + + - - - + C. guilliermondii 48 Horas + + + - - - + Complejo C. albicans 24 Horas + + - - - + Complejo C. albicans 48 Horas + + + + - - - + C. glabrata 24 Horas + + - - - + C. glabrata 48 Horas + + + + + - - - +
Placas : +++:(> 100.000 UFC/mL); ++: (50.000 – 100.000 UFC/mL); +: (< 50.000 UFC/mL); - : (0 UFC/mL)
Caldos: (+) Turbidez en el caldo por el desarrollo de la levadura
Tabla Nº 2 Concentración mínima inhibitoria y mínima fungicida. Cepas CMI 24 horas CMI 48 horas CMF 24 horas CMF 48 horas C. parapsilosis 15% total 15% parcial 19% 19% C. guilliermondii 8% parcial* 11% parcial 11%* 15% Complejo C. albicans 8% parcial* 15% total 11%* 19% C. glabrata 8% parcial* 19% parcial 11%* 23%
* Falsas CMI y CMF
Datos propios de la investigación
