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Obtención de anticuerpos monoclonales contra Inmunoglobulinas humanas

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Número3 • Mayo-Junio de 1985

Obtención de anticuerpos monoclonales

contra Inmunoglobulinas humanas

OR. LUIS FAVILA CASTILLO'

QBP PATRICIA VELÁZQUEZ GARCfA2 QBP GUSTAVO MIRANDA CONTRERAS2 M EN C MILDRED FOSTER CUEVAS3

Favila Castillo L. Velázquez García P. Miranda Contreras G, Foster Cuevas M: Obtención de anticuerpos monoe/onales contra inmunoglobulinas humanas. Salud Pública Méx., 1985; 27:

194-198.

Resumen:Seobtuvieron anticuerpos monoclonales con-tra inmunoglobulinas humanas fusionando células de bazo de ratones BALB/c, inmunizados con una fracción cruda de inmunoglobulinas, con la Unea de mieloma X63-Ag 8.653. Se realizaron pruebas de ELISA con IgM.

IgG e IgA humana purificadas y se obtuvieron los si·

E

l empleo de anticuerpos contra inrnuno-globulinas humanas ha tenido una gran importancia tanto para la determinación de anticuerpos contra diferentes microorganis-mos patógenos, como en la cuantificación de los niveles de inmunoglobulinas séricas en dife-rentes padecimientos.

El descubrimiento de las distintas clases de

1 Del Departamento de Inmunologfa de la Escuela

Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. México, y becario de la Comisión de Opera-ción y Fomentode Actividades Académicas, del mismo Instituto.

2 Del Departamento de Inmunologfa de la Escuela

Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, México.

) Del Departamento de Inmunologfa de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, México, y becaria del Consejo Nacional de Ciencias y Tecnologías, México.

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guientes resultados: 34 cultivos positivos contra IgM e IgG; 21 cultivos positivos contra IgG; 8 cultivos positivos contra IgM; 5 cultivos positivos contra IgM, IgG e IgA; un cultivo positivo contra IgG e IgA; un cultivo positivo contra IgM e IgA y un cultivo positivo contra IgA.

inmunoglobulinas humanas (lgM, IgG, IgA, IgE e IgD), así como sus subclases (IgG 1, 2, 3 y 4; IgA 1 y 2) y sus diferentes propiedades biológicas ha despertado el interés de analizar por separado la respuesta de anticuerpos, a nivel de clase e incluso subclase. Esto nos per-mitiría comprender con mayor profundidad qué papel juega la respuesta inmune humoral en diferentes situaciones clínicas.

El obtener antisueros convencionales contra las inmunoglobulinas humanas es un proceso relativamente fácil y barato, lo cual ha permiti-do el uso generalizapermiti-do de estos reactivos. Sin embargo, la obtención de antisueros

específi-cos contra clases y más aún contra subclases de inmunoglobulinas es un proceso laborioso, lo cual hace que estos reactivos sean difíciles de obtener y más costosos.

Otra desventaja del uso de antisueros poli-clonales es que el titulo y características varia SALUD PUBLICA DE MEXICQ

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Obtención de anticuerpos monoclonales

de lote a lote, debido a la variación natural que hay entre diferentes animales. Por otra parte, los antisueros convencionales contra una clase de inmunoglobulinas llevan siempre una canti-dad variable de lote a lote, de anticuerpos con-tra alotipos y, si la clase de inmunoglobulinas tiene subclases, no todas ellas son reconocidas con la misma intensidad.t'"

A pesar de la gran utilidad y aplicación que tienen los antisueros convencionales contra in-munoglobulinas humanas, los problemas ante-riormente expuestos, y algunos otros, hacen deseable el contar con reactivos más constan-tes y mejor definidos.

La obtención de anticuerpos monoclonales contra inmunoglobulinas humanas, darla lu-gar a reactivos que pueden ser usados para varias pruebas, en substitución de los antisue-ros convencionales, debido a sus característi-cas de reconocer un sólo determinante

antigé-nico y la posibilidad de obtener cantidades prácticamente ilimitadas de un anticuerpo in-variable.

La finalidad de este trabajo es comenzar a obtener una colección de clonas de hibridomas productoras de anticuerpos monoclonales contra inmunoglobulinas humanas. Posterior-mente, se caracterizará la especificidad fina y las propiedades bioquimicas de los diferentes anticuerpos para su uso futuro en la determi-nación y/ o purificación de las diferentes clases y subclases de inmunoglobulinas humanas.

MATERIAL Y METO DOS

ANTIGENOS

Inmunoglobulina cruda. Una mezcla de va-rios sueros humanos normales se trató con un volumen de sulfato de amonio saturado, agre-gado gota a gota en baño de hielo. Se agitó durante 30 minutos y se centrifugó a 600 g, durante 20 minutos. El precipitado se resuspcn-dió en amortiguador de fosfatos 0.1 M en solu-ción de cloruro de sodio al 0.85% y se dializó contra el mismo amortiguador. La prepara-ción se analizó por inmunoelectroforesis en-contrándose IgM, IgG, IgA Yalgunas proteín-nas séricas contaminantes (principalmente al-búmina).

IgG. Se usó la fracción II obtenida por el método de precipitación con alcohol, descrito

MAYO-JUNIO DE 1985

por Cohn.

19M. Obtenida a partir de un suero con ma-croglobulinemia por medio de la precipitación de euglobulinas.

IgA. Obtenida a partir de calostro humano por cromatografia de tamices moleculares. Inmunización de animales. Se inmunizaron ratones adultos BALB/ e (criados en condicio-nes convencionales limpias) con 500 "g de in-munoglobulina cruda precipitada con alum-bre, por vía intraperitoneal. Entre las 3 u 8 semanas se reinmunizaron con 100"g de inrnu-noglobulina cruda en solución salina, por via intraperitoneal. La fusión se realizó cuatro días después.

Fusión. Esta se realizó apegándose a las reco-mendaciones de Fazekas y Scheidigger.í!' En resumen: se obtuvieron las células de los bazos de tres ratones y se lavaron por centrifugación dos veces en solución de Hanks. Por otra parte, se obtuvieron células del mieloma P3-X63-Ag8.653(2)a partir de cultivos en crecimiento logarítmico y se lavaron una vez en solución de Hanks. Se mezclaron las células de bazo y las de mieloma en proporción 1:1 ó 2:I y se lava-ron una vez más con medio RPMI sin suero fetal. Las células se fusionaron con polietilen-glicol a 50% (P.M. 4000) Y se resuspendieron en medio selectivo HA T. Se sembraron 2 X 10' células en cada pozo de micro placas de 96 pozos a las cuales previamente se les había agregado, por pozo, entre lO' y 10' células de exudado peritoneal de ratones normales. Los cultivos se alimentaron tres veces por semana con medio HAT y a las 3 ó 4 semanas se buscó en el sobrenadante de cada pozo la presencia de anticuerpos contra la inmunoglobulina cruda.

Determinación de anticuerpos por la técnica de ELlSA. Se realizó de acuerdo a los linea-mientos básicos descritos por Yoller.t" Como anticuerpo para revelar la reacción se usó anti-cuerpo de cabra anti-inmunoglobulinas de ra-tón (anti IgM, IgG e IgA) purificado por afini-dad y conjugado a peroxidasa en nuestro labo-ratorio. Como antígeno se usó la primera vez la inmunoglobulina cruda y las clonas positivas se confirmaron realizando la prueba con la IgM, IgG e IgA por separado.

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CUADRO 1

RESULTADOS DE CUATRO FUSIONES A LAS CUATRO SEMANAS DE CULTIVO

Pozos Pozos

Pozos Pozos con clonas Pozos positivos"

Fusión sembrados con clonas % positivos- %

1 960 505 53 50 10

2 672 121 18 10 8

3 768 560 73 28' 11

4 480 480 100 169 35

• Pozos con lecturas en ELISA mayores de 0.2 de densidad óptica. Se usó como antígeno la preparación cruda de inmunoglobulinas.

b Por ciento del número de pozos con clonas.

eSe perdieron varios pozos por contaminación, quedando 240 pozos que seproba ron por ELISA.

RESULTADOS

Se han realizado cuatro fusiones exitosas, cuyos resultados se muestran en el cuadro J. En él observamos que hubo variación en las fusio-nes, tanto en el porciento de pozos que tienen híbridos creciendo, el cual va de 18% a 100%, como en el porciento de pozos con híbridos que produzcan anticuerpos contra la fracción cruda de inmunoglobulinas (de 8% a 35%). En las tres primeras fusiones los híbridos se per-dieron por dos razones principales: contami-nación y/ o pérdida de la capacidad de produ-cir anticuerpo.

La cuarta fusión se realizó después de resol-ver el problema de las contaminaciones y de optimizar los parámetros pertinentes para ob-tener un máximo de hibridomas. De hecho, fue la fusión más exitosa, tanto en el porciento de pozos con hibridos (100%) como en el porcien-to de pozos con híbridos producporcien-tores de anti-cuerpos contra la fracción cruda de inmuno-globulinas (35%).

De esta última fusión se seleccionaron 92 pozos que dieron altos valores de ELISA (ma-yores de 0.6 de densidad óptica) y se prob6 su patrón de reacción con IgM, IgG e IgA. En el cuadro II observamos que la mayoría de los hibridos reaccionaron, ya sea con IgM e IgG o con IgG sola(34 y 21 pozos, respectivamente). Una cantidad apreciable de clonas (21) no re-accionaron con alguna de las inmunoglobuli-nas puras (probablemente reaccionan con uno de los contaminantes de las inmunoglobulinas

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crudas). Se obtuvieron además OChO pozos es-pecificos contra IgM, cinco que reaccionaron con todas las inmunoglobulinas (probable-mente reconocen cadenas ligeras); un pozo que reaccionó con IgG e IgA; uno que reaccionó con IgM e IgA y uno que reaccionó sólo con IgA.

DISCUSION

Ya se han publicado varios trabajos sobre la obtención de anticuerpos monoclonales contra inmunoglobulinas humanas. Se han descrito anticuerpos monoclonales que reconocen cla-ses;(4.'lotros, subclases'< 'ly otros más, cade-nas ligeras.(4.6. 7)

CUADRO 11

ESPECIFICIDAD DE ALGUNOS' POZOS QUE REACCIONARON CON LA FRACCION CRUDA

DE INMUNOGLOBt:!.!NAS

Reacción con:

No. de

clonas" IgG IgM

34 + + 21 + 21 8 + 5 + + 1 + 1 + 1 IgA

+

+

+

+

• Se seleccionaron 92 clonas de la fusión cuatro, cuadro I que dieron valoresde ELlSA contra el antígeno crudo

mayores de 0.60 de densidad óptica.

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Obtención de anticuerpos monoclonales

Estos anticuerpos se han empleado para de-terminar y cuantificar las inmunoglobulinas respectivas por métodos turbidimétricoss' o por inmunodifusión radial, utilizando el anti-cuerpo monoclonal en presencia de polietilen-glicol.(S)Esto indica que los anticuerpos mono-clonales pueden ser usados para cuantificar inmunoglobulinas, empleando las mismas téc-nicas que actualmente se utilizan con los anti-sueros convencionales.

El problema principal para usar un anticuer-po monoclonal con los fines descritos anterior-mente es el de definir el tipo de determinante antigénico que están reconociendo. Por ejem-plo, si se quiere utilizar el anticuerpo monoclo-nal para la determinación de IgG, se debe tener la certeza de que el determinante antigénico reconocido está presente en las cuatro subcla-ses de IgG y que no se encuentre en las otras clases de inmunoglobulinas.w Por otra parte, aún teniendo un anticuerpo con estas caracte-rísticas, es necesario asegurarse de que el deter-minante reconocido no sea alotípico, pues se han descrito anticuerpos monoclonales que re-conocen alotipos ya descritos.w o inclusive, no descritos.

En conclusión, para poder utilizar los anti-cuerpos monoclonales descritos en este traba-jo, será necesario el definir la distribución del determinante antigénico reconocido por cada anticuerpo entre las diferentes clases y subcla-ses de inmunoglobulinas humanas.

Empleando las clases de inmunoglobulinas purificadas como un primer método de

carac-terización de patrón de reacción de los anti-cuerpos obtenidos en la fusión (cuadro I), con-cluirnos que, usando la fracción cruda de in-munoglobulinas como inmunógeno, es fácil obtener anticuerpos monoclonales contra IgG, IgM Ycadenas ligeras (Cuadro 11).Dado que la fusión fue muy exitosa, es probable que algu-nos de los pozos que dieron reacción con dos clases de inmunoglobulinas [por Ej. IgM e IgG (Cuadro 11)] tengan en realidad dos clonas, una contra IgM y otra contra IgG. De ser así, estas clonas serían separadas al clonar las célu-las del pozo, lo cual aumentaría el número de clonas obtenidas.

Por otra parte, el número de pozos anti-IgA fue muy bajo (uno anti IgA y otro anti IgG e IgA), por lo que es probable que para obtener varias clonas anti-IgA sea mejor inmunizar a los ratones con IgA purificada.

Los cultivos positivos actualmente están en proceso de clonación y expansión para obtener grandes cantidades del anticuerpo y definir el determinante antigénico reconocido.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se realizó con apoyo del CONACYT. pro-yecto PCSABNA 02'{)364. Agradecernos al Dr. RME Parkhouse, del National Institute for Medical Research, de Londres, su donativo de IgM e IgG purificada, así como al Dr. G. Acosta, de la Unidad de Investigación Biomédica del Centro Médico Nacional, del Instituto Mexicano del Seguro Social, su .donatlvc de 19A puri-ficada.

Favila Castillo L. Velázquez García P. Miranda Contreras G. Foster Cuevas M: Production 0/

monoclonal antibodies against human immunoglobnlins. Salud Pública Méx., 1985; 27: 194-198.

Summary: We have produced monoclonal antibodies against human immunoglobulins by fusing spleen celJs from BALBJc mice, which were immunized with a crude preparation of immunoglobulins, with the myeloma cell line X63-Ag8.653. Using the EL1SA assay with human purified IgM, IgG and IgA we obtained the following

MA YO-JUNIO DE 1985

results: 34 positive cultures against IgM and IgG; 21 positive cultures against IgG; 8 positive cultures against IgM; 5 positive cultures against IgM, IgG and IgA, one positive culture against IgG and IgA, one positive culture against IgM and IgA and one positive culture against IgA.

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REFERENCIAS

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