Mecanismos Moleculares De Las
Estatinas Sobre El Cáncer
María Claudia Sandoval Usme
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química Bogotá, Colombia
Mecanismos Moleculares De Las
Estatinas Sobre El Cáncer
María Claudia Sandoval Usme
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Doctora en Ciencias Química
Directora:
MSc. Myriam Sánchez de Gómez
Directora Grupo de Investigación en Hormonas Departamento de Química
Codirector:
Dr. Leandro Fernández Pérez
Director del Grupo De Investigación En Oncología-Endocrinología Molecular Y Traslacional
Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, España Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química Bogotá, Colombia
Si oyes una voz dentro de ti
diciéndote “no sabes pintar”,
pinta, faltaría más, y la voz se
callará.
Agradecimientos
A la profesora Myriam Sánchez de Gómez por dirigir este trabajo hasta su exitosa culminación, por su paciencia y ayuda incondicionales en el desarrollo de esta tesis, así como por permitirme ser parte de este proyecto que me ha dado tantas satisfacciones. Sus consejos y apoyo profesional, personal y económico fueron fundamentales para el desarrollo experimental, así como para la escritura de este documento e indudablemente para mi formación como doctora, científica, líder y persona.
Al Dr. Leandro Fernández Pérez por recibirme en su laboratorio en Las Palmas de Gran Canaria y la cálida acogida que me dio en su grupo de investigación, además de la colaboración incondicional y la confianza que depositó en mí para el desarrollo de este proyecto.
A Adriana Umaña, quien me ayudó durante el curso de mi doctorado para desarrollarme como mejor científica, líder y me enseñó a trabajar en equipo. Por su valioso tiempo, sus aportes a la parte experimental y todas las sugerencias para el desarrollo de este trabajo. Además, por las innumerables experiencias compartidas en los múltiples viajes que realizamos juntas. Me diste un nuevo significado para la palabra “amistad”.
A mis compañeros del Grupo de Investigación en Hormonas, por hacer mi estadía en el grupo tolerable en los momentos más difíciles, por su apoyo y complicidad a cada una de mis ideas, por su confianza y sobre todo por ofrecerme su amistad y compartir conmigo su experiencia personal y científica. A Susana, Sofía, Mónica, Martha Lucía, Sergio, Carolina,
María Isabel, Mariela y Claudia Patricia. Además a Felipe por sus aportes en el estudio de las estatinas en el cáncer. A Juan Carlos por ser mi confidente y a Ruth por su compañía y confianza en mí. A todos mil gracias.
A mis compañeros del Grupo de Endocrinología Molecular y Traslacional en la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria en España. A Ruymán, Raquel, Cristina, Mercedes, Patricia, Carlos, Yeray, Dioni, Laura, Julia, Ainara, Ricardo, Juan Carlos, Nicolás, y Pilar quienes me acogieron durante mi estadía en el extranjero y me dieron la comodidad de sentirme en casa a miles de kilómetros, además de brindarme su asesoría y apoyo en el desarrollo de este trabajo. Siempre recordaré mi tiempo en su laboratorio con mucha gratitud y cariño.
A la Universidad Nacional de Colombia por su apoyo financiero no sólo en la realización experimental de este trabajo, sino también por el apoyo que se me otorgó para los viajes que realicé a congresos y pasantías, así como por la beca de Estudiantes sobresalientes de posgrado de la cual fui beneficiaria por casi 4 años.
Al Dr. Leopold Ilag por su recibimiento en la corta estadía en su laboratorio en el Departamento de Química Analítica de la Universidad de Estocolmo, así como a Gianluca y a Zdenek por hacer muy agradable y acogedor un invierno muy frío. A Erik y Diego del Karolinska Institutet por su constante soporte personal y profesional.
A los vecinos de laboratorio en Bogotá, Harold, Katherine, Patricia, Nury, Edwin, y Nohora y en Las Palmas de Gran Canaria a Noe, Cristina, Susana, Sara, Nico y Merci con quienes compartí muchas mañanas y muchos cafés. A Edgar por su compañía y amistad, además de enseñarme a enseñar.
A mis amigos Melissa, Elizabeth, Camila, Francy, Hebelin, Giovanny, Andrés, Adriana, Liliana, Abby, Jorge, Laura y Laurita, quienes aún en la distancia me ofrecieron un soporte personal indispensable a lo largo de la realización de este trabajo.
A Carina, Sarah, Mónica, Jesús, María Luisa y Orlando quienes en el último año me ayudaron en el arduo camino del autoconocimiento, necesario para culminar este trabajo. Más importante que todos, a mi familia, en especial a mi hermano Carlos por su guía, sus consejos, su ayuda y su inspiración en la finalización de esta tesis y a mis padres, sin cuya entrega, dedicación, amor, consejos, apoyo moral y generosidad incondicionales me habría imposible realizar este trabajo.
Resumen
Las estatinas son inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa, enzima involucrada en el paso limitante de velocidad de la síntesis del colesterol, al reducir la 3-hidroxi-3-metilgluatril coenzima A a mevalonato. Desde su descubrimiento como metabolitos de varias especies de hongos, las estatinas se han empleado en el tratamiento de la hipercolesterolemia y otras enfermedades cardiovasculares. En años recientes, se recopiló abundante información en la investigación acerca de la acción molecular de las estatinas, sugiriendo que tienen un efecto en células de cáncer in vitro e in vivo. La frecuencia de uso de estos medicamentos ha hecho que múltiples estudios alrededor del mundo exploren su potencial en el tratamiento contra el cáncer. A pesar del creciente número de publicaciones al respecto, el mecanismo molecular de las estatinas en el cáncer no está del todo elucidado y cada vez se encuentran más genes y proteínas involucradas.
En este trabajo se exploró el efecto de la simvastatina en la viabilidad, migración, e invasión de las células de osteosarcoma de rata UMR-106. Los hallazgos aquí consignados muestran que la simvastatina disminuye la viabilidad celular de las líneas celulares MCF-7 de cáncer de mama, LNCaP de cáncer de próstata, UMR-106 de osteosarcoma de rata y BRL-4 de hepatocitos de rata de una forma dependiente de la dosis. Adicionalmente, se determinó que la simvastatina también disminuye la proliferación, migración e invasión celular de forma dependiente de la dosis en las células UMR-106.
Asimismo, la vía de señalización JAK/STAT se ha reportado como una de las vías que frecuentemente se encuentra desregulada en el cáncer, razón por la que se evaluaron los efectos de la simvastatina en su activación y regulación. Se encontró que la simvastatina induce la expresión de SOCS-2, SOCS-3 y CIS, reguladores negativos de la vía JAK/STAT, además de disminuir la actividad transcripcional de STAT1 y STAT5 inducida por suero fetal bovino (SFB) y hormona de crecimiento (GH).
Estos resultados muestran el potencial de la simvastatina como medicamento en el tratamiento del cáncer y su selectividad lo hace un fuerte candidato como terapia contra el osteosarcoma.
Abstract
Statins are inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, which is involved in the rate-limiting step of cholesterol synthesis, when reducing 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A to mevalonato. Since their discovery as metabolites in several fungi species, statins have been used in the treatment of hypercholesterolemia and other cardiovascular diseases. In recent years, overflowing information in the research of molecular action of statins, suggesting that they have an effect in cancer cells both in vitro and in vivo. Recurrent use of these medications has caused that multiple studies around the world have explored their potential as anti-cancer agents. Despite the increasing number of publications on the subject, the molecular mechanisms of statins on cancer are not entirely elucidated and more proteins and genes are found to be involved.
In this work we investigated the effect of simvastatin on cell viability, proliferation, migration and invasion in rat osteosarcoma cell line UMR-106. We found that simvastatin decreases cell viability in breast cancer cell line MCF-7, prostate cancer cell line LNCaP, rat osteosarcoma cell line UMR-106 and buffalo rat liver cell line BRL-4 in a dose-dependent manner. In addition, we determined that simvastatin also decreases cell proliferation, migration and invasion in a dose-dependent manner in UMR-106 cells.
Furthermore, JAK/STAT signaling pathway has been reported as one of the pathways frequently deregulated in cancer, which is why we evaluated the effects of simvastatin in its
activation and regulation. We found that simvastatin induces JAK/STAT negative regulators SOCS-2, SOCS-3 and CIS expression. Moreover, it decreases STAT1 and STAT5 fetal bovine serum and growth hormone-induced transcriptional activity.
These results show the potential of simvastatin as a medication in cancer treatment and its selectivity makes it a strong candidate in osteosarcoma therapy.
Contenido
Resumen ... VI Abstract ... VIII Contenido ... X Lista de figuras ... XIII Lista de tablas ... XV Lista de abreviaturas ... XVI
1. Introducción ... 1 1.1. Justificación ... 3 1.2. Hipótesis ... 4 1.3. Marco Teórico ... 5 1.3.1. Estatinas ... 5 Estudios clínicos ... 22 1.3.2. Osteosarcoma ... 24 1.3.3. Vía JAK/STAT ... 28 1.4. Objetivos ... 38 1.4.1. Objetivo General ... 38 1.4.2. Objetivos Específicos ... 38 2. Materiales Y Métodos ... 39 2.1. Materiales ... 39 2.2. Cultivo Celular ... 39
2.3. Ensayos de viabilidad celular ... 40
2.4. Ensayos de proliferación... 41
2.6. Ensayos de migración e invasión celular ... 42
2.7. Ensayo de wound healing (curación de herida) ... 43
2.8. Extracción de RNA, transcripción reversa (RT-PCR) y PCR en tiempo real (qPCR) ... 44
2.9. Medición de la actividad transcripcional ... 45
2.10. Nucleofección de células ... 46
2.11. Extracción de proteína y western blot ... 47
2.12. Análisis Proteómico ... 48
2.13. Análisis estadístico ... 49
3. Resultados ... 51
3.1. La simvastatina disminuye la viabilidad y la proliferación celular ... 51
3.2. La migración e invasión celular disminuyen de forma dependiente de la dosis de simvastatina ... 59
3.3. La simvastatina tiene un efecto citotóxico en las células de osteosarcoma UMR-106 63 3.4. Efecto de la simvastatina en la señalización de GH ... 65
3.5. Efecto de la simvastatina en la actividad transcripcional de las proteínas STAT inducida por GH y SFB ... 68
3.6. Efecto de la simvastatina y la GH en la expresión de genes de la familia SOCS 73 3.7. Efecto de la simvastatina y GH en la inducción de MMP-9 ... 78
3.8. La proteína RhoA no tiene un papel fundamental en la proliferación de las células UMR-106 ... 80
3.9. La simvastatina afecta el perfil proteómico de las células UMR-106 ... 83
4. Discusión ... 88
4.1. La simvastatina disminuye la proliferación, viabilidad, migración e invasión celular de las células de cáncer ... 88
4.2. La señalización por la vía JAK/STAT se ve disminuida por la simvastatina ... 96
4.3. La MMP-9 es inducida por GH e inhibida por la simvastatina en UMR-106 .... 100
4.4. La inducción de c-Fos no se disminuye al inhibir la proteína Rho en las células UMR-106 ... 103
5. Conclusiones ... 106
6. Bibliografia ... 108
7. Apéndice ... 126
7.1. Publicaciones ... 126
Lista de figuras
Figura 1Estructuras De Algunas Estatinas. ... 6
Figura 2 Vías De Señalización Del Mevalonato ... 9
Figura 3 Activación De Ras. ... 13
Figura 4 Interacción De La Vía De Señalización De Ras Con Otras Vías.. ... 14
Figura 5 Vía de señalización JAK/STAT. ... 32
Figura 6 Efecto del tratamiento de las células UMR-106 con diferentes dosis de simvastatina en la viabilidad celular. . ... 52
Figura 7 Efecto de la simvastatina en la viabilidad celular en la línea celular de cáncer de próstata LNCaP. ... 53
Figura 8 Efecto de la simvastatina en la viabilidad celular de la línea celular MCF-7. ... 55
Figura 9 Efecto de la simvastatina en la línea celular BRL-4. ... 56
Figura 10 Comparación del efecto de la simvastatina en la viabilidad celular de diferentes líneas celulares. ... 57
Figura 11 Efecto de la simvastatina en la Proliferación de las células UMR-106. ) ... 58
Figura 12 Ensayo de wound healing en la monocapa de células UMR-106 a dosis crecientes de simvastatina. . ... 60
Figura 13 La simvastatina disminuye los niveles de migración e invasión en las células de
osteosarcoma de rata UMR-106.) ... 62
Figura 14 Efecto de la simvastatina en la citotoxicidad de las células UMR-106. ... 64
Figura 15 Efecto de la simvastatina en la Proliferación inducida por rbGH. ... 66
Figura 16 Análisis de la activación de la vía JAK/STAT/SOCS inducida por rbGH. ... 67
Figura 17 Efecto de la simvastatina en la actividad transcripcional de STAT1/STAt3. .... 70
Figura 18 Efecto de la simvastatina en la actividad transcripcional de STAT5 y STAT3 inducida por rbGH o SFB.. ... 71
Figura 19 Efecto de la simvastatina en la actividad transcripcional de STAT5 inducida por rbGH ... 72
Figura 20 Expresión relativa del mRNA de las proteínas SOCS en las células UMR-106 bajo estímulo con rbGH y simvastatina . ... 74
Figura 21 Efecto del pretratamiento con simvastatina en la expresión génica inducida por rbGH en las células UMR-106.. ... 76
Figura 22 Efecto de la simvastatina en la expresión de SOCS-1, SOCS-2 y SOCS-3. ... 77
Figura 23 Efecto de la simvastatina y la GH en la expresión génica de MMP-9 en las células UMR-106.. ... 79
Figura 24 Efecto de transfección de un plásmido de RhoA constitutivamente activo (RhoA QL) en la viabilidad celular de las células UMR-106. ... 81
Figura 25 Efecto de la simvastatina en la activación de c-Fos inducida por rbGH y SFB. . 82 Figura 26 Efecto de la simvastatina en la expresión de proteínas. . ... 85
Lista de tablas
TABLA 1RESULTADOS IN VITRO DE LAS ESTATINAS EN DIFERENTES CÉLULAS DE CÁNCER ... 21
Lista de abreviaturas
2DE Electroforesis Bidimensional (2-Dimension Electrophoresis)
ADM Adriamicina
BrdU Bromodeoxiuridina
CDKI Inhibidor de quinasa dependiente de ciclina
cDNA Ácido Deoxirribonucleico complementario (complementary Deoxyribonucleic Acid)
CDP Cisplatino
CIS Proteína SH2 Inducida por Citoquinas (Cytokine-inducible SH2-containing protein)
DMAPP Dimetilalil pirofosfato
DNA Ácido Desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic Acid) DTT 1,4-ditiotreitol
EPO Eritropoyetina
FGF Factor de crecimiento fibroblástico (Fibroblast growth factor) FPP Farnesil pirofosfato
FPTasa Farnesil prenil transferasa FTI Inhibidor de farnesil transferasa GGPP Geranilgeranil pirofosfato GGPTasa Geranilgeranilprenil transferasa
GGTI Inhibidor de geranilgeranil transferasa GH Hormona de crecimiento (Growth Hormone)
GHR Receptor de Hormona de Crecimiento (Growth Hormone Receptor) GPP Geranil pirofosfato
HDMTX Metotrexato
HMG-CoA 3-hidroxymetil-3-glutarilcoenzima A
IF Ifosfamida
IL Interleuquina
IPP Isopentil pirofosfato
JAK Quinasa de la familia Janus (Janus kinases)
LAR Reactivo de ensayo de luciferasa (Luciferase Assay Reagent) LDL Lipoproteína de Baja Densidad
LFA1 Antígeno asociado a la función de linfocitos 1 LMA Leucemia mieloide aguda
MMP Metaloproteasa de matriz (matrix metalloprotease)
mRNA Ácido Ribonucleico mensajero (messenger Ribonucleic Acid) PBS Buffer fosfato salino (Phosphate buffered saline)
PLB Buffer de lisis pasivo (Passive Lysis Buffer)
PMA Forbol 12 miristato 13 acetato (phorbol 12-myristate 13-acetate) QPCR Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
rbGH Hormona de crecimiento recombinante bovina (Recombinant Bovine Growth Hormone)
RNA Acido Ribonucleico (Ribonucleic Acid)
Electronic Sensing)
SDS-PAGE Electroforesis denaturante en gel de poliacrilamida (SDS Polyacrilamide Gel Electrophoresis)
SFB Suero Fetal Bovino
SH2 Homología Src-2
SIM Simvastatina
SOCS Supresor de señalización de citoquinas (Suppressor Of Cytokine Signaling)
STAT Transductor de señales y activador de transcripción (Signal Transducer and Activator of Transcription)
TBS Buffer Tris Salino (Tris buffered saline)
TGF-β Factor de Crecimiento Transformante β (Transforming Growth Factor
β)
TIMP Inhibidor de metaloproteasa de tejido uPA Activador de plasminógeno de uroquinasa
1.
Introducción
Las estatinas se han empleado en los últimos años como medicamentos para el tratamiento de hipercolesterolemia, al inhibir la enzima 3-hidroxi-3-metilglutarilcoenzima A reductasa, la cual cataliza el paso limitante de velocidad de la biosíntesis del colesterol. El bloqueo de esta enzima, a su vez, inhibe la síntesis de isoprenoides, corriente abajo, los cuales son fundamentales en las modificaciones postraduccionales como la farnesilación y la geranilgeranilación de proteínas. Entre éstas sobresalen las proteínas de la superfamilia Ras GTPasa y su subfamilia Rho, las cuales requieren anclarse a la membrana celular para su activación y se ha demostrado su importancia en procesos como la proliferación, crecimiento, migración, invasión y progresión de ciclo celular [1]. Asimismo, en varios trabajos se ha encontrado que las estatinas inducen apoptosis, arresto de ciclo celular, entre otros efectos que las vinculan a diversas vías de señalización y hace que su efecto en las células de cáncer sea de particular interés. Así, se han llevado a cabo varios estudios clínicos en diferentes tipos de cáncer y tumores, en donde muchos resultados son contradictorios y en donde se sugiere que el tipo de cáncer y la clase de estatina influyen en el resultado. Los trabajos in vitro en numerosas líneas celulares y con diferentes estatinas arrojan resultados similares, y el fenotipo de las células determina la respuesta frente a las estatinas. El mecanismo de las estatinas en las células de cáncer no ha sido elucidado por completo y en diferentes investigaciones se han estudiado los efectos de las estatinas en diferentes vías de señalización. En el cáncer, varias vías de señalización se encuentran desreguladas, en
particular aquellas que tienen que ver con crecimiento, proliferación, apoptosis y ciclo celular.
La vía de señalización JAK/STAT se activa con el estimulo de factores de crecimiento y citoquinas y su regulación depende de las proteínas SOCS, produciendo una retroalimentación negativa, al ser inducidas por las proteínas STAT. La desregulación de esta vía se ha implicado en el cáncer y la activación descontrolada de la vía se ha asociado con el crecimiento y proliferación de células de cáncer [2]. Adicionalmente esta vía de señalización activa corriente abajo otras vías de señalización relacionadas con crecimiento, proliferación y apoptosis, razón por la que su investigación de sus efectos de las estatinas en la vía, pueden proveer información fundamental acerca del mecanismo de las estatinas en células de cáncer.
Trabajos previos llevaron a concluir que la simvastatina tuvo efecto en diferentes tipos celulares, y que la viabilidad de la línea celular de osteosarcoma UMR-106 disminuye con dosis crecientes de simvastatina. Adicionalmente también se encontró que la simvastatina inhibió la actividad transcripcional de STAT1, vinculando así, los efectos de la simvastatina a la modulación de la vía de señalización JAK/STAT [3].
En este trabajo se estudiaron los efectos de la simvastatina en 4 líneas celulares (3 cancerosas y 1 no cancerosa) en la viabilidad celular. El estudio se enfocó en la línea celular de osteosarcoma de rata UMR-106 y los efectos de la simvastatina en la proliferación, migración e invasión. Adicionalmente, se estudiaron los cambios en la activación y expresión de miembros de la vía JAK/STAT inducidos por hormona de crecimiento (GH) y suero fetal bovino (SFB) en esta línea celular.
1.1.
Justificación
El tratamiento de cáncer en el mundo ha ido progresando lentamente hacia medicamentos cada vez más específicos, y cuyo mecanismo de acción sea selectivo hacia las células cancerosas. La complejidad del cáncer ha generado numerosas aproximaciones y dado pie para que la investigación tenga diversos enfoques. Las terapias en estudio son innumerables, y la búsqueda por medicamentos que sean bien tolerados a largo plazo hace que las estatinas sean un interesante blanco. Los inhibidores de la HMG-CoA reductasa se han involucrado repetidamente en estudios clínicos y de líneas celulares de cáncer, obteniéndose resultados a veces confusos y en varios casos contradictorios. Aunque se conocen algunos de los efectos en varias vías de señalización, el mecanismo no está del todo elucidado y evidencia creciente indica que las estatinas tienen diversos blancos de acción. La frecuencia con la que se prescriben estos medicamentos hace necesario que se profundice en su mecanismo, que explique los diversos resultados encontrados.
Por otra parte, también se buscan blancos moleculares de proteínas y vías de señalización desreguladas, que puedan ser mitigadas específicamente con el tratamiento. Este es el caso de la vía JAK/STAT, cuyo papel en la proliferación, crecimiento y viabilidad de las células esta ampliamente documentado, así como también su desregulación en las células cancerosas y su papel en la oncogénesis.
Este trabajo aporta información novedosa, mostrando que la simvastatina tiene un efecto dependiente de la dosis y del tipo celular, además de encontrar una relación entre la simvastatina y la vía JAK/STAT.
1.2.
Hipótesis
En este trabajo se plantea estudiar si la simvastatina regula la vía de señalización JAK/STAT, activada por la hormona de crecimiento (GH), al inducir la expresión de las proteínas SOCS en la línea de osteosarcoma de rata UMR-106 y si la simvastatina es un candidato potencial como agente terapéutico anti-cáncer.
La vía de señalización JAK/STAT/SOCS podría ser una de las implicadas en todos los procesos de apoptosis y disminución de proliferación y crecimiento que sufren las células de cáncer, enfocándose en osteosarcoma de rata.
1.3.
Marco Teórico
1.3.1.
Estatinas
Las estatinas son inhibidores de la reductasa de 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) que se emplean comúnmente como tratamiento de hipercolesterolemia, arterosclerosis, enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares [4]. La familia de las estatinas comprende la lovastatina, simvastatina, atorvastatina, fluvastatina, pravastatina, cerivastatina, rosuvastatina y pitavasatina (Figura 1). La característica estructural de todas las estatinas es una cadena lateral que existe ya sea como una lactona en su forma inactiva o como un ácido en su forma activa. La lactona es activada in vivo por carboxiesterasas en el hígado y en el plasma sanguíneo [5].
Se ha demostrado que las estatinas disminuyen la incidencia de incidentes cardiovasculares entre los que se incluye la muerte, infarto de miocardio, apoplejía y disfunción renal entre otros [6]. Aún en pacientes con niveles normales de colesterol y LDL, las estatinas se asocian con una disminución en casos de mortalidad cardiovascular [6-8] . Esto sugiere efectos pleiotrópicos de las estatinas que no siempre dependen de sus efectos en el colesterol. Las estatinas se han relacionado con reducción de lesiones de tejido en modelos de isquemia y reperfusión en varios órganos, incluyendo corazón, pulmón, cerebro, riñón e intestinos. Adicionalmente, se ha demostrado que las estatinas atenúan la vasoconstricción incrementando la actividad del óxido nítrico (NO) endotelial, un beneficio que se observó
después de 6 semanas de tratamiento. Las estatinas tienen efectos pleiotrópicos independientes de la reducción de colesterol, que tienen impacto antiarterosclerótico, antitrombótico y antinflamatorio directo [9-12].
Estos inhibidores son competitivos y su unión a la HMGCoA reductasa es aproximadamente 1000 veces más efectiva que la del sustrato natural, interfiriendo con la biosíntesis del mevalonato, un precursor de colesterol [13].
Figura 1Estructuras De Algunas Estatinas. A) Pravastatina B) Lovastatina C) Simvastatina D) Atorvastatina E) Cerivastatina F) Fluvastatina
H H O O OH COOH H O O A H O O O H O O B H O O H O O O C N O N H F OH O OH OH D H O O OH OH N O F E N F OH H O COOH F
Aunque las estatinas se han aprobado para el tratamiento de desórdenes lipídicos, se ha acumulado evidencia de su utilidad en el tratamiento de otras enfermedades como Alzheimer y osteoporosis, además de cáncer, cuya investigación ha sido bastante extensa en los últimos diez años. En ella se han encontrado indicios de que las estatinas podrían funcionar como medicamentos en la terapia contra el cáncer. Sin embargo, diversos estudios en las estatinas y su relación con el cáncer, parecen revelar información contradictoria. Un estudio realizado en mas de 12488 hombres y mujeres mostró una asociación inversa entre los niveles de colesterol y la incidencia de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón, vejiga, colorrectal, pancreático, y leucemia [14]. En un estudio separado, se encontró que en pacientes tratados con pravastatina la incidencia de cáncer de mama es de un 5.5%, comparado con 0.3% del grupo control [15]. Sin embargo, estudios epidemiológicos muestran que las estatinas pueden prevenir otros tipos de cáncer como el cáncer de próstata [16], colorrectal [17], melanoma [18] y en algunos casos, de mama [19]. Por ejemplo, en el estudio escandinavo de supervivencia de simvastatina se reportó una mortalidad por cáncer mas baja en pacientes tratados con simvastatina [20]. También en el Estudio Epidemiológico Molecular de Cáncer Colorrectal se encontró un 47% menor riesgo para pacientes que usan las estatinas, además de la conclusión de que la terapia con estatinas a largo plazo tiene un efecto protector contra el cáncer de colon en pacientes de alto riesgo [17].
Apoyando esto, otros estudios demostraron que la simvastatina administrada en una dosis 250 veces más alta que la dosis normalmente usada para tratar hipercolesterolemia causa hipertrofia tiroidea y adenomas foliculares celulares en cepas de ratas. Similarmente, la administración de lovastatina a niveles muy altos (500 mg/kg al día) fue asociada con una mayor evidencia de canceres hepatocelular y pulmonar. Interesantemente, la carcinogenicidad asociada a estatinas en la mayoría de los estudios fueron limitados a dosis
mucho mayores que la común para tratar hipercolesterolemia en humanos. Por ejemplo, estudios de toxicidad en ratas, perros y monos, con lovastatina a dosis hasta de 180 mg.kg al día demostraron no tener efecto carcinogénico [21].
1.3.1.1.
Vía del mevalonato y síntesis de colesterol
La biosíntesis del colesterol se lleva a cabo por medio de una vía de señalización que se inicia con la síntesis del mevalonato a partir de la reducción de la HMG-CoA, y siendo así, precursor de intermediarios isoprenoides, los cuales son incorporados en varios productos, entre los cuales están el colesterol, las proteínas farnesiladas y las geranilgeraniladas. A partir del mevalonato se origina el isopentil pirofosfato (IPP), el cual se une con el dimetilalil pirofosfato (DMAPP) para producir el geranil pirofosfato (GPP), un compuesto de diez átomos de carbono. La producción del farnesil pirofosfato (FPP) a partir del GPP y el IPP es catalizada por la FPP sintetasa. El FPP puede ser metabolizado a escualeno y posteriormente a colesterol o puede unirse a una molécula de IPP para producir geranilgeranil pirofosfato (GGPP) (Figura 2)[22]. Todos los productos de la vía son requeridos para la lipidación postraduccional asociada a la localización en membrana y actividad de pequeñas GTPasas y por tanto esenciales para el funcionamiento celular [23]. La regulación de esta vía es realizada a través de una retroalimentación muy compleja que va a nivel transcripcional, traduccional y postraduccional, en el que se involucran compuestos esteroles y no esteroles, productos de la misma vía del mevalonato. Esto ocurre en células normales, a diferencia de las tumorales que son resistentes a la retroalimentación mediada por esteroles y son más sensibles a la supresión llevada a cabo por isoprenoides [13].
Figura 2 Vías De Señalización Del Mevalonato La vía de señalización del mevalonato conduce a la biosíntesis del colesterol, proteínas farnesiladas y geranilgeraniladas. HMG-CoA: 3-hidroxymetil-3-glutarilcoenzima A, -IPP: Isopentil pirofosfato, DMAPP: Dimetilalil pirofosfato, GPP: Geranil pirofosfato, FPP: Farnesil pirofosfato, FPTasa: Farnesil prenil transferasa, GGPP: Geranilgeranil pirofosfato, GGPTasa: Geranilgeranil prenil transferasa. Figura modificada de [4]
La farnesilación es un proceso llevado a cabo por la farnesil transferasa (FPTasa), al catalizar la adición de un grupo farnesil de 15 carbonos. La actividad enzimática requiere zinc, el cual activa el tiolato de la cisteína en el sustrato peptídico para el ataque nucleofílico del grupo farnesil [4, 24]. Ras, RhoB, HDJ2 y las lamininas A y B son algunas de las proteínas que sufren esta modificación postraduccional [4, 24]. La unión del sustrato a
la FPTasa es ordenada, primero uniéndose a FPP, seguida de la unión del péptido de CAAX. El paso de reacción de prenilación es relativamente rápido, seguido por la liberación limitante de velocidad del producto proteico farnesilado [24]. Por su parte, la geranilgeranilación es realizada por la geranilgeranil transferasa (GGPTasa) I o II, añadiendo uno o dos grupos de 20 carbonos, respectivamente. Entre las proteínas geranilgeraniladas se encuentran Rab, Rap1A, RhoA, Rac1 y CDC42 [4].
Ambos tipos de modificaciones requieren que las proteínas tengan un motivo CAAX en el extremo carboxi-terminal, siendo C un residuo de cisteína, A un aminoácido alifático y X una serina o metionina para la FPTasa o una leucina para la GGPTasa I. La GGPTasa II, en cambio, requiere un motivo CXC. Algunas proteínas requieren modificaciones adicionales para su correcto funcionamiento tales como H-Ras, N-Ras o K-Ras4A, las cuales también son palmitoiladas, permitiendo una asociación más estable de las mismas a la membrana. Las investigaciones recientes se enfocan en encontrar las diferencias en modificaciones postraduccionales y asociación a membrana de las isoformas de Ras, con el fin de explicar las diferencias funcionales entre ellas. K-Ras y N-Ras pueden ser preniladas alternativamente por la GGTPasa cuando la farnesilación es inhibida, mientras que la H-Ras es farnesilada exclusivamente [4]. A su vez, una tercera enzima preniltransferasa GGTPasa II cataliza la adición del isopreno geranilgeranil en el C terminal de la familia Rab de pequeñas GTPasas. Las proteínas Rab regulan trafico intravesicular y contienen 2 residuos de cisteína en su C terminal (XXCC, XCXC o CCXX) [24].
En estudios realizados a modelos animales, se han hecho descubrimientos interesantes acerca de la vía del mevalonato, en donde se concluye que ratones deficientes de la HMG-CoA reductasa se desarrollan solo a la etapa de blastocitos [25]. Por su parte, en un modelo deficiente en la enzima escualeno sintetasa muestran un retardo en el crecimiento
y defectos en tubo neural. Asimismo, ratones deficientes de la GGTPasa II, a pesar de crecer y desarrollarse normalmente, muestran defectos en las plaquetas, trombocitopenia y sangrado prolongado [4].
1.3.1.2.
Relación de la vía del mevalonato con otras
vías
La vía del mevalonato está involucrada en varias cascadas de señalización, particularmente las relacionadas con la activación de las proteínas de la superfamilia de Ras.
Ras es una proteína pequeña de unión a GTP que transduce señales mitogénicas que provienen que factores de crecimiento y citoquinas, así como de la activación de otros oncogenes. La proteínas Ras tiene tres formas identificadas: H-Ras, N-Ras y K-Ras y están con frecuencia mutadas en diversos tipos de cáncer, lo que puede estar directamente relacionado con su capacidad para localizarse en la membrana y para hidrolizar GTP. Estas mutaciones se han visto en el 90% de los casos de adenocarcinoma de páncreas, 50% de cáncer de tiroides, 47% de cáncer de colon, 36% de melanoma y 44% de leucemia aguda mieloide [4].
La activación de Ras requiere su translocación a la membrana plasmática, razón por la que con la interrupción de la biosíntesis del mevalonato, las estatinas inhiben la activación de Ras y sus cascadas de señalización corriente abajo, incluyendo Raf/MEK/ERK y PI3K/Akt, las cuales juegan un papel fundamental en los procesos de supervivencia celular y proliferación y la regulación de la apoptosis y el ciclo celular [1] (Figura 4). La ubicación de Ras en la membrana celular varía dependiendo del subtipo. K-Ras y N-Ras no se encuentran en los dominios ricos en colesterol conocidos como balsas lipídicas.
H-Ras se asocia con las balsas lipídicas en su forma inactiva de GDP, pero no en su forma activa de GTP [26].
La proteína Ras en particular, sólo puede interactuar con los receptores de membrana, resultando en la activación de las cascadas de señalización corriente abajo. Por eso, la activación de Ras solamente ocurre después de su farnesilación (Figura 3). Varios trabajos han descrito previamente a Ras como un buen candidato para la terapia anti-cáncer [27-29].
En la familia de las proteínas Ras también se encuentran las proteínas Rho, comprendidas por lo menos por 10 miembros, entre los que se destacan RhoA, B, C, D y E [1]. Se conoce que RhoB tiene un papel importante en supervivencia, crecimiento celular, adhesión, organización celular y trafico de citoquinas[4]. La RhoB puede ser farnesilada o geranilgeranilada. Una vez activada, Ras tiene un número de blancos involucrados corriente abajo en diversas funciones celulares como las vías de señalización PI3K/Akt y Raf/MEK/MAPK/ERK, involucrada con apoptosis y progresión del ciclo celular. Otros blancos incluyen los inhibidores de quinasa dependiente de ciclina (CDKI) p21[30].
RhoA y RhoC están ampliamente expresadas en melanoma humano y están implicados en la metástasis. La inhibición de la geranilgeranilación de las proteínas de la familia Rho es un importante mecanismo que induce la apoptosis in vitro e inhibe la invasión y metástasis de células de melanoma humano in vivo. RhoC es importante para la migración de células de melanoma y la atorvastatina puede inhibir la transcripción aumentada de RhoC [31, 32].
En general, las proteínas de la familia Rho constitutivamente activas o una sobrexpresión de la quinasa de Rho, previene la diferenciación. La inhibición corriente abajo de la quinasa de Rho tiene un efecto anti-invasivo en las células de melanoma B16 y antimetastásico en ratones inyectados con células B16. La lovastatina reduce las proteínas Rho asociadas a membrana y la metástasis en el modelo de ratones B16F10 de melanoma [33, 34].
Figura 3 Activación De Ras. Después de su síntesis, las proteínas de la familia Ras requieren
la farnesilación para su anclaje a la membrana como modificación postraduccional para su activación corriente abajo. Una vez anclada, su forma inactiva unida a GDP puede activarse al unirse a GTP y señalizar corriente abajo [35]
Figura 4 Interacción De La Vía De Señalización De Ras Con Otras Vías. La activación de Ras induce la activación de varias proteínas corriente abajo, activando señales de proliferación y progresión del ciclo celular [35].
1.3.1.3.
Mecanismos moleculares de las estatinas en
el cáncer
Las estatinas tienen unos efectos pleiotrópicos muy diversos en procesos como la inflamación y la angiogénesis, al afectar un buen numero de blancos terapéuticos y varias vías de señalización, comunes y especificas de enfermedades crónicas como la neurodegeneración, osteoporosis, enfermedades cardiovasculares y el cáncer [13].
El interés de las estatinas en el cáncer se inicio después de un estudio clínico en donde se empezó a revelar el efecto de las estatinas, no solo al disminuir los niveles de colesterol en la sangre, sino también en el número de muertes no relacionadas con enfermedades cardiovasculares y la reducción del colesterol tales como el cáncer [36]. En este estudio también se encontró que los niveles de colesterol se relacionaban inversamente con el riesgo de padecer cáncer y de muerte causada por cáncer. Así, por varias décadas, y en particular, en los últimos diez años, se han publicado un gran número de estudios, que, aún con objetivos diferentes, buscan explicar los muy documentados efectos de las estatinas, y mas allá de eso, quieren conocer a fondo, los mecanismos moleculares alterados y regulados por las estatinas en el tratamiento a líneas celulares, modelos animales y pacientes.
Entre la evidencia conocida de los mecanismos de las estatinas, se conoce que cuando se encuentran en forma de lactona, no pueden inhibir la HMG-CoA reductasa, pero se ha demostrado que pueden inhibir el proteosoma, lo cual explicaría algunos de los efectos de las estatinas en los inhibidores de quinasa dependientes de ciclinas (CDKI) p21 y p27 [37, 38].
Numerosos estudios muestran que las estatinas pueden regular fenómenos como la apoptosis. Por ejemplo, en las células AML-3 de leucemia mieloide aguda, la lovastatina induce la apoptosis de forma dependiente del tiempo y de la dosis, al bloquear la vía de señalización Raf-MEK-Erk (Figura 4), importante en la proliferación y supervivencia celular [39]. También se demostró que en células NIH3T3 la lovastatina induce arresto del ciclo celular en G1, así como también el desensamblaje de las fibras de actina, redondeamiento de las células y una disminución en el RhoA activo en la fracción
membranal de proteínas, efectos que desaparecen cuando las células sobrexpresan la ciclina E [40].
Adicionalmente, las estatinas pueden inhibir la proliferación al regular negativamente la actividad de CDK2 y aumentar la expresión de p21 y p27, fenómenos que conducen al arresto del ciclo celular en las fases G1/S y/o G2/M, siendo eventos dependientes o independientes de HMG-CoA en diferentes sistemas[41-43]. La evidencia muestra que las estatinas inducen la condensación de la cromatina y fragmentación del DNA, así como la activación de caspasas, asociadas a la apoptosis inducida por estatinas [44-46]. Parece que los efectos de las estatinas en proliferación y apoptosis son independientes, aunque ambos ocurren en la misma línea celular a diferentes concentraciones. Las estatinas parecen inducir apoptosis e inhibir proliferación en mayor grado en células malignas que en no malignas, posiblemente debido al aumento en la expresión de HMG-CoA reductasa y un mayor requerimiento de los isoprenoides derivados de mevalonato en tumores, contrario a las células normales. Sin embargo, en experimentos previos se encontró que las estatinas inhiben crecimiento e inducen apoptosis en líneas celulares de cáncer colorrectal sin importar la presencia de la mutación en Ras [37].
Diversos estudios incluyen la adición de compuestos de la vía del mevalonato, como el GGPP, el FPP y hasta el mismo mevalonato, con el fin de conocer la especificidad del efecto y si los efectos solo se deben a la supresión de isoprenoides. Así, en varias líneas de cáncer de colorrectal se encontró que la adición de GGPP puede revertir la apoptosis inducida por estatinas, mientras que el FPP no, indicando que probablemente proteínas de la familia Rho están involucradas en estos fenómenos[37]
En otras líneas celulares se encontraron resultados similares. Un número de estatinas (especialmente las hidrofóbicas) inhiben la proliferación in vitro de células de cáncer de
mama (incluyendo aquellas negativas para el receptor de estrógeno y células con vías de señalización con Ras o ERBB2 activadas)[13].
Otros estudios en líneas celulares de cáncer de mama y neuroblastoma indican que la inhibición del proteosoma puede ser una actividad de las estatinas, independiente de la HMG-CoA reductasa. Estudios in vivo en modelos de ratones con tumor demostraron que la lovastatina y la simvastatina pueden disminuir la formación de tumor e inhibir la metástasis [38, 47]. En estudios realizados por Tomiyama en la línea celular de leucemia, HL-60, mostraron que entre las estatinas empleadas, simvastatina resultó ser la de mayor toxicidad, seguida por la atorvastatina, la cerivastatina, y por último la fluvastatina. Este resultado se repite en la línea celular HL-60-R2 resistente a todos los ácidos retinoicos. Asimismo, la cascada de Ras GTPasas, puede causar apoptosis en la línea de linfocitos IM-9 [48].
Zhuang y colaboradores demostraron que la simvastatina, al disminuir la síntesis de colesterol, inhibe la vía de señalización de supervivencia PI3K/Akt, en la línea celular de cáncer de próstata LNCaP. La disminución en la fosforilación de Akt dependiente de la dosis de simvastatina, es reversible con el restablecimiento de los niveles de colesterol normales [49] . En un estudio similar, Li et al mostraron que la depleción de colesterol indujo una regulación negativa de Bcl-xL, así como la inactivación de Akt en células de cáncer de mama y cáncer de próstata, en comparación a líneas celulares no cancerosas. En este mismo estudio se observó una activación del receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR), de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) y de la proteína Src después de la supresión de colesterol [50].
En cáncer de pulmón de células pequeñas, la simvastatina indujo apoptosis después de un estímulo con factores de crecimiento, así como también inhibió el crecimiento del tumor in vivo. Asimismo, la activación constitutiva de la vía MAPK fue suficiente para rescatar a las células de los efectos de la simvastatina, y aunque no alteró la activación de c-Kit ni su localización en las balsas lipídicas, sí disminuyó los niveles de proteína de Ras y su localización en la membrana [51]. Se demostró con anterioridad que RhoA es uno de los blancos intracelulares de las estatinas, lo cual explicaría el efecto del medicamento en el ciclo celular y motilidad [52].
La simvastatina es capaz de reducir los niveles de proliferación, arresto en el ciclo celular así como la inhibición de localización en la membrana plasmática de RhoA, efectos que puede revertirse con Geranilgeranil pirofosfato (GGPP), lo cual indica que la simvastatina interviene en el mecanismo de supervivencia de células linfoblastoides resistentes a apoptosis[13].
En células de cáncer pancreático, las estatinas logran disminuir la invasión inducida por EGF. A su vez, se determinó que además de la reducción en la invasión, las estatinas tienen un efecto en la localización de RhoA; disminuyen la translocación inducida por EGF, de la fracción citosólica a la membrana de RhoA, efecto reversible con la adición de trans-geranilgeranioles [53] .
En este mismo tipo de cáncer, Gbelcova et al mostraron en un estudio reciente el efecto de las estatinas en la viabilidad de las células, así como en otros modelos in vivo de ratones xenotransplantados con células de adenocarcinoma pancreático CAPAN-2, encontrando que entre las estatinas empleadas, la simvastatina tiene el mayor efecto supresor de tumor. Asimismo también se observó que todas las estatinas estudiadas (pravastatina,
atorvastatina, simvastatina, lovastatina, cerivastatina, rosuvastatina y fluvastatina) inhiben la translocación de la proteína Ras [54] .
En cuanto a las propiedades antimestastásicas de las estatinas, se han realizado también estudios que muestran que se reduce la expresión y la actividad enzimática de la metaloproteasa-9 (MMP-9) después del tratamiento con lovastatina en células NIH-3T3. Además de estos trabajos, varios autores reportan que las estatinas disminuyen la habilidad de las células para adherirse a la matriz extracelular [55].
En la Tabla 1 se encuentran algunos de los estudios realizados en la materia y resumidos algunos de los hallazgos encontrados.
Las estatinas también pueden modular la diferenciación de linfocitos T in vivo e in vitro, produciendo un cambio de un perfil pro-inflamatorio de TH1a anti-inflamatorio TH2. La atorvastatina puede inducir la fosforilación del transductor de señales y activador de transcripción 6 (STAT6), y la secreción de citoquinas de TH2, al mismo tiempo que inhibe la fosforilación de STAT4 y la secreción de citoquinas de TH1. La activación de
NF-κB promueve el desarrollo de TH1, y puede también ser inhibido por la atorvastatina. En ensayos in vitro, altas concentraciones de estatinas también interfieren con las funciones de los linfocitos, al disminuir la membrana de colesterol y romper la integridad de las balsas lipídicas[13].
Entre las evidencias moleculares se ha encontrado también que las estatinas pueden actuar de forma directa o indirecta, ya sea inhibiendo la HMGCoA reductasa y corriente abajo, la geranilgeranilación de proteínas, o uniéndose directamente a proteínas como el antígeno asociado a la función de linfocitos 1 (LFA1). Al unirse a esta integrina, la
lovastatina modifica la conformación de la proteína haciendo imposible su interacción con la molécula de adhesión intracelular 1(ICAM1), lo cual se repite para la simvastatina y la mevastatina [56].
En un estudio independiente se demostró que las estatinas interfieren con la formación de vasos sanguíneos en modelos in vivo e in vitro de angiogénesis, éste último con una matriz 3D de colágeno, en el que la formación de tubos, dependiente de RhoA se ve inhibida tanto por simvastatina como por mevastatina, al interferir con la geranilgeranilación y localización de membrana de RhoA, afectando las vías de señalización dependientes de esta proteína [57].
También se han reportado efectos sinergísticos en el tratamiento con estatinas y otros agentes quimioterapéuticos como cisplatino, 5-fluorouacil y doxorrubicina en experimentos in vitro en líneas de cáncer de colon, en donde el pretratamiento con lovastatina incremente la apoptosis inducida por estos agentes [58]. Así, varios autores concluyen que las estatinas solas no son agentes anticancerígenos efectivos, sino en combinación con otros medicamentos citotóxicos, aumentando la efectividad de los mismos [59].
Tabla 1 Resultados In Vitro De Las Estatinas En Diferentes Células De Cáncer Tipo de cáncer/
tumor Línea celular Resultados obtenidos Referencia
Próstata LNCaP
Lovastatina (30µM) indujo apoptosis, por medio de la caspasa 7 y no de caspasa 3, efecto evidente después de las 48 horas, efecto que fue bloqueado con la adición de mevalonato
[44]
Mama
MCF-7 y MDA-MB 231
Todas las estatinas empleadas (atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, y simvastatina) excepto la pravastatina inhibieron significativamente la proliferación de ambas líneas celulares de forma dependiente de la dosis y la potencia fue mayor en el caso de las células sin receptor de estrógeno. En MCF-7, en presencia de estradiol, las estatinas tuvieron efectos antiproliferativos hasta un 25% con 10µM
[60]
MCF-7 y MDA-MB 231
La cerivastatina disminuye la proliferación e invasividad de células MDA-MB-231, con un efecto mucho menor en las MCF-7, relacionado con RhoA mientras que Ras tuvo un papel secundario [61] Páncreas ASPC-1, PANC-1 y MIA PaCa-2
La fluvastatina y la lovastatina disminuyen los niveles de invasión inducida por EGF de las células de cáncer de páncreas, así como el efecto de EGF en la proliferación, a pesar de no tener efecto por si solo en dosis de 0-15µM
[62]
Pulmón A549
Simvastatina disminuye la proliferación de células de forma dependiente de la dosis (5µM-100µM). También se encontró que la simvastatina induce apoptosis, al inducir el rompimiento de PARP, caspasa-8 y -3, pero no de la caspasa-9, al tratar las células con simvastatina 20µM por 48 horas. Esto demuestra que el receptor de Muerte (Death receptor) juega un papel importante en la apoptosis inducida por simvastatina
Estudios clínicos
Alrededor del mundo se han realizado estudios clínicos a diferentes poblaciones, tratando de encontrar la relación entre el cáncer y el consumo de estatinas, de acuerdo al tipo de pacientes y al tipo de cáncer.
La frecuencia incrementada del cáncer en pacientes tratados con estatinas fue incidentalmente notado en las fases tempranas de ensayos clínicos, sugiriendo que las estatinas podrían ser carcinogénicas. Estos estudios estaban diseñados para evaluar la reducción en el riesgo cardiovascular y en la mayoría de los casos, la incidencia del cáncer no fue estadísticamente significativa. En otro estudio se encontró que los usuarios de estatinas eran un 28% menos propensos a ser diagnosticados con cáncer que los usuarios de resinas se unión a ácidos biliares [4].
En varios estudios epidemiológicos con bases de datos muestran que las estatinas reducen significativamente la incidencia general del cáncer (14-28%). También se encontró en estos estudios
riesgos de cáncer reducidos en el desarrollo de cáncer colorrectal, de mama, piel y próstata, en cuyo caso, se encontró una reducción aun mayoría para el riesgo de enfermedad metastásica y fatal[13].
En un estudio conducido por el sistema de Asuntos de Veteranos mostro que el uso de las estatinas está significativamente asociado inversamente con el cáncer de próstata de alto grado y la reducción aumentó con el uso prolongado de las estatinas. El estudio epidemiológico del cáncer colorrectal realizado en Israel demostró una reducción significativa del 47% con respecto a los controles en el riesgo de desarrollo de cáncer
colorrectal. Asimismo, la exposición corta a estatinas no se asocio con el riesgo de adenoma colorrectal [64].
Estudios observatorios indican que las estatinas no incrementan el riesgo de cáncer de mama, pero los resultados son algo confusos. En un estudio realizado en Canadá entre 1989 y 1997 en donde mujeres tomaron estatinas por 4 años o mas mostraron una reducción significativa del 74% de desarrollar cáncer de mama, mientras que en un estudio realizado en Estado Unidos mostro que las usuarias de estatinas tenían un riesgo reducido significativo del 72% de desarrollar cáncer de mama [19, 65]. Otro estudio recogido entre pacientes de hospital encontró un incremento de 1.2 veces en el riesgo de pacientes de desarrollar cáncer de mama invasivo entre las usuarias de estatinas[66] .
Graaf et al encontraron en un estudio realizado a 3129 pacientes, comparados con 16976 casos control, que el riesgo de cáncer se reduce en un 20%, cuando el paciente ha tenido tratamiento con estatinas por lo menos por 4 años [67]. En otros reportes también se asociaron las estatinas a una reducción en el riesgo de cáncer de pulmón, páncreas y esófago, así como también de linfoma de no Hodgkin[4].
El estudio de estatinas en animales incluye muchos modelos en ratones, en los cuales se encontró una reducción en una incidencia de tumor en un 30-67%. La lovastatina inhibió la propagación de células de cáncer de colon trasplantadas a ratón, indicando que las estatinas también tienen efectos antimetastásicos [13].
Las estatinas se han combinado exitosamente con otros medicamentos convencionales para la quimioterapia como dexametasona, lo que ocasionó una inhibición de crecimiento en líneas celulares de mieloma RPMI-8226 y U266, efecto potenciado por la lovastatina [68]. También en las líneas celulares de leucemia K-562 y HL-60 se observó un aumento en apoptosis al tratar las células con lovastatina y paclitaxel [69]. Cuando se trataron las HL-60 con compactina (mevastatina) y ácido trans-retinoico el porcentaje de células diferenciadas incremento del 34.9% a 73%. Este efecto se revertió con GGPP y parcialmente con mevalonato [70]. Una línea celular de rabdomiosarcoma, RD, mostró cambios morfológicos y una disminución en la viabilidad después del tratamiento con lovastatina o simvastatina, y cuando se trataron con simvastatina y doxorrubicina se observo un incremento sinergístico en la apoptosis[71].
1.3.2.
Osteosarcoma
El osteosarcoma es el tumor primario más común y la segunda causa relacionada con cáncer en jóvenes y niños [72]. Es un tumor del esqueleto caracterizado por la formación directa de hueso inmaduro [73]. Es histológicamente diverso y proviene de células de linaje osteoblástico con muchas variaciones. Dependiendo de sus características, puede clasificarse como osteoblástico, condroblástico y fibroblástico [74]. El osteosarcoma puede ser similar a los osteoblastos en todas sus etapas de maduración, desde la muy primitiva célula mesenquimal similar a las células madre hasta los osteocitos bien diferenciados. La característica principal del osteosarcoma es la producción de osteoide de parte de las células tumorales y presenta con frecuencia metástasis a distancia, típicamente a pulmón [75].
La etiología del osteosarcoma es desconocida y aunque se sugirió un origen viral, debido a que en algunos animales se pudo inducir por la inyección de extractos de osteosarcoma libres de células, el único agente conocido que causa osteosarcoma es la radiación ionizante, implicada en 2% de los casos de osteosarcoma [73].
En general, el 80 al 90% de los casos de osteosarcoma ocurre en huesos tubulares largos, en particular en el fémur y la tibia. El esqueleto axial es raramente afectado, pero ocurre con más frecuencia en adultos jóvenes que en niños o adolescentes. El 75% de los pacientes se encuentran entre los 15 y los 25 años, siendo la segunda causa de muerte relacionada con cáncer en jóvenes y niños. Representa el 15% de todos los tumores primarios en hueso y el 0,2% de los tumores malignos en niños [73].
La incidencia del osteosarcoma ha aumentado en un 1,4% por año en los últimos 25 años y en Colombia, hasta el año 2002 se reportó que el 74% de los casos de tumores óseos en pacientes mayores de 10 años fue de osteosarcoma [76, 77]. La edad media de un paciente de osteosarcoma es 16 años, con predominancia masculina, durante la etapa de mayor crecimiento[73]. La mayor incidencia del osteosarcoma se da en la segunda década de vida, con un máximo más pequeño en personas mayores de 50 años. En Europa el 0.3% de todos los casos de cáncer ocurren en adolescentes entre 15-19 años, de los cuales los tipos de tumores más frecuentes son sarcomas, carcinomas y linfomas [78]. Casi todos los casos de osteosarcoma de alto grado tienen un pronóstico pobre, siendo del 10-20% de los casos de metástasis detectable y sólo el 10% de los pacientes con osteosarcoma logran un intervalo de vida largo libre de enfermedad [72].
A pesar de las mejoras en el tratamiento del osteosarcoma, que incluyen cirugía antes y después de la quimioterapia, aún uno de cada tres pacientes desarrolla metástasis a pulmón, siendo ésta la mayor causa de muerte por esta enfermedad [72]. El tratamiento de la enfermedad se realiza dependiendo del grado de desarrollo. La cirugía sin ayuda de quimioterapia en el caso de pacientes con osteosarcoma localizado falla en un 85-90% de los casos y se ha reportado que la tasa de supervivencia de 5 años sin enfermedad, después de cirugía es del 12%[74].
Las mejoras en este procedimiento se obtienen al realizar un tratamiento de quimioterapia pre y post operativo. Esta clase de tumores es resistente a la radiación a las dosis estándar, razón por la que la radioterapia solamente se emplea en casos donde la cirugía no puede realizarse[73].
Algunos de los medicamentos que se usan más ampliamente en el tratamiento del osteosarcoma son Metotrexato (HDMTX), Cisplatino (CDP), Adriamicina (ADM) e ifosfamida (IF), generalmente usados en combinaciones [73]. La resección completa del tumor por medio de cirugía es indispensable para el éxito del tratamiento. Hoy en día el 80-90% de los casos con cirugía no requieren amputación [73]. El osteosarcoma hace metástasis local a otros sitios dentro del hueso, aunque es mas común la metástasis a pulmón, por lo que es el órgano que más se analiza para verificar la metástasis del tumor .Una vez ésta ha ocurrido, la cirugía es indispensable [73, 79]. Los mayores retos para el tratamiento de osteosarcoma hoy son proveer terapias alternativas, que sean efectivas incluso para pacientes en estado metastásico desde el diagnóstico inicial [75].
Hasta ahora se han encontrado algunas predisposiciones genéticas, siendo el retinoblastoma hereditario la más fuerte. En pacientes con retinoblastoma, el osteosarcoma ocurre 500 veces más frecuentemente que en la población general. Estudios
en niños con osteosarcoma reveló que del 3-4% tienen una mutación germinal en p53 [73]. El gen de esta proteína es uno de los más importantes en la tumorogénesis del osteosarcoma, también involucrada en el arresto del ciclo celular en caso de daño al DNA, e iniciación de la apoptosis, pero se ha mostrado que el estado funcional de p53 no es un factor pronóstico para la respuesta a la quimioterapia en el osteosarcoma [75].
Otras proteínas que se han encontrado expresadas de forma creciente en tumores de osteosarcoma comparadas con osteoblastos normales humanos, son RECQL4, SPP1, RUNX2, y IBSP y decreciente de DOCK5, CDKN1A, RB1, P53, y LSAMP. La expresión incrementada de Runx2 se asoció con una baja respuesta a quimioterapia. Una alta expresión del inhibidor del ciclo celular p21/WAF también se ha propuesto como indicativo de peor pronóstico [79].
Hasta el momento, el mecanismo de la regulación de la invasión y la metástasis en osteosarcoma es limitado. Aun así, hay reportes que demuestran que el incremento en la expresión de la metaloproteasa de matriz 9 (MMP-9) se ha correlacionado con un fenotipo metastásico de osteosarcoma, así como también un pronóstico débil se ha relacionado con la expresión de MMP-1. Asimismo, los niveles de los inhibidores de MMPs, como el inhibidor de metaloproteasa de tejido 1 (TIMP-1) y RECK han demostrado que se correlacionan inversamente con los niveles de invasión de las células de osteosarcoma. El activador de plasminógeno de uroquinasa, uPA regula incrementando la expresión de MMP, mostrando una relación inversa entre la expresión de uPA y la metástasis en un modelo animal y puede ser un candidato pronóstico en osteosarcoma humano [75]. Ezrina y Fas también se han vinculado a la metástasis de osteosarcoma. La señalización
deficiente de Fas puede permitir a las células de osteosarcoma evadir la resistencia del huésped en el pulmón [80]. Adicionalmente, la sobrexpresión del ligando de Notch y receptores, limita la diferenciación celular osteoblástica y osteoclástica de sus células precursoras. La presencia del receptor de Notch se ha reportado en osteosarcoma, aunque la función de esta vía de señalización en osteosarcoma no esta del todo esclarecida [80].
1.3.3.
Vía JAK/STAT
La vía de señalización JAK/STAT se caracteriza por ser una de las que con muy pocos miembros, logra transmitir señales desde el exterior de la célula al núcleo, activando la transcripción de genes[55].
Un gran número de poli péptidos que señalizan extracelularmente interactúa con receptores celulares, activando esta vía de señalización. Entre los ligandos están Interferón (IFN)-α, β y γ las Interleuquina 2 a la 7, 10, 13, 15, la eritropoyetina, hormona de crecimiento, prolactina, trombopoyetina, entre otros[81]. Éstos emplean la vía de señalización para controlar una gran variedad de respuestas biológicas como el desarrollo, la diferenciación, proliferación y supervivencia celulares[82]
Los ligandos externos son reconocidos por miembros de la familia de receptores transmembranales que tienen un dominio extracelular de unión a ligando y un dominio citoplasmático que en algunos casos tiene actividad tirosina quinasa. . Las citoquinas son importantes reguladores de varios procesos biológicos entre ellos la proliferación, diferenciación, migración celular y apoptosis. También están involucradas en funciones del
sistema inmune y de células del sistema circulatorio, en procesos inflamatorios así como en el desarrollo hematopoyético y embrional del organismo[83].
Los receptores activados por ligandos que catalizan la fosforilación incluyen receptores con actividad tirosina quinasa intrínseca, como el EGFR, así como también receptores que carecen de actividad tirosina quinasa intrínseca y que tienen asociadas las proteínas JAK (Janus quinasas) de forma no covalente. Los receptores son entonces fosforilados en residuos de tirosina en su dominio intracelular, lo que crea sitios de reconocimiento para señalización de proteínas con homología a Src 2 (SH2) [84].
La familia de proteínas JAK en mamíferos incluyen 4 proteínas tirosina quinasa de aproximadamente 1200 aminoácidos (JAK1, JAK2, JAK3 y Tyk2) caracterizadas por dominio catalítico de tirosina quinasa, en el extremo C-terminal junto al dominio pseudoquinasa. La fosforilación de la quinasa es la primera de las tres fosforilaciones que culminan en la activación de STAT (Figura 5)[81]. Su activación produce el reclutamiento de las proteínas transductoras de la señal y activadoras de transcripción (STATs). Estas proteínas cuentan con un sitio de fosforilación en tirosina, así como un dominio SH2 de unión a fosfotirosina, un dominio de unión al DNA y varios dominios de interacción proteína-proteína [85, 86] . Las JAKs no parecen tener especificidad de sustrato de STAT. Diferentes receptores pueden activar la misma STAT al fosforilar la misma tirosina, pero por medio de la activación de diferentes JAKs; esta especificidad parece estar dada por la interacción específica entre la STAT y el receptor [85].
Las diferencias en los dominios SH2 de las diferentes STATs determinan la selectividad de unión de STAT a varios receptores de citoquinas[86] . Se conocen 7 proteínas de esta familia, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b y STAT6. Las proteínas de
esta familia tienen un residuo de tirosina conservado cerca del extremo C-terminal que es fosforilado por JAK. Las primeras proteínas STAT que se describieron, están asociadas a la transducción vía IFN-γ [85].
Una vez se han fosforilado, las STATs se dimerizan y se trastocan al núcleo donde regulan la transcripción génica, razón por la que las estas proteínas son consideradas como factores de transcripción citoplasmáticos latentes. En el caso de IFN-α/β, se forman heterodímeros de STAT1/STAT2 que se unen a elementos de repuesta estimulados por IFN (ISRE). Asimismo, los dímeros de STAT se unen a secuencias activadas por IFN-γ (GAS). De esta forma la vía JAK/STAT proporciona un mecanismo que transduce una señal extracelular en una respuesta transcripcional [87]. Hay suficiente variedad en las secuencias de aminoácidos y su distribución especifica en tejidos que explica la diversidad de roles que juegan las proteínas STAT en la señalización extracelular[85].
STAT1 juega un papel muy importante en arresto del ciclo celular, promoción de apoptosis y está implicado como supresor de tumor, mientras que STAT3 y 5 promueven la progresión del ciclo celular, transformación celular y previenen la apoptosis. De hecho, en trabajos realizados anteriormente, se demostró que una proteína STAT3 modificada (cisteínas insertadas en la región 7SH2) puede dimerizarse espontáneamente, generando células transformadas que a su vez pueden generar tumores en ratones [88].
Una de los ligandos mas importantes que emplean esta vía de señalización es la hormona de crecimiento. Es un polipéptido de 22kDa producido primariamente en la glándula pituitaria. Estructuralmente comprende 4 módulos helicoidales con bucles de diferentes longitudes, estructura que en general comparte con un grupo grande de citoquinas[89]. Su receptor, GHR, es una glicoproteína con un único dominio transmembranal, uno
extracelular de unión al ligando, y un dominio citoplasmático de 350 residuos. La iniciación de la señalización de GH requiere la unión del ligando a dos monómeros del receptor, causando un cambio en la conformación del dímero del receptor, una relación estequiométrica de 1:2 [89, 90]. Una vez se forma el complejo de ligando receptor, las tirosina quinasas JAK2, unidas a cada monómero del receptor en su dominio citoplasmático, se unen transactivándose y activando el receptor, haciendo posible la señalización corriente abajo. Los residuos de tirosina fosforilados del receptor actúan como puntos de reclutamiento para proteínas con dominios SH2, como la STAT5, fosforilada también por JAK2 al unirse al receptor en respuesta a GH[89] .
1.3.3.1.
Proteínas SOCS
La regulación de la vía JAK/STAT se realiza por proteínas inducidas por las proteínas STAT y se conocen 3 mecanismos de regulación. . El primero es por medio de fosfatasas, las cuales contienen un dominio homología Src-1, y que revierten la fosforilación llevada a cabo por las quinasas de esta vía de señalización. La segunda es a través de la familia de proteínas inhibidoras de STAT activadas (PIAS), cuya asociación a STATs impide su unión al DNA y por lo tanto su actividad transcripcional. De hecho, el proceso de sumoilación se ha relacionado con la represión de la actividad de STAT mediada por PIAS. Por último, las proteínas supresoras de la señalización inducida por citoquinas (SOCS) se unen por su dominio SH2 a los residuos de fosfotirosina de los receptores de citoquinas o a las JAKs, suprimiendo la señalización de citoquinas ya sea por unión e inhibición de la actividad de JAK, por competencia con STAT por el sitio de unión en el receptor, o marcando las proteínas de la vía de señalización para degradación proteosomal. La expresión de los genes SOCS puede estimularse por las mismas citoquinas que aumentan la activación de STAT, de manera que las SOCS actúan en un sistema de retroalimentación negativo .[92]
La familia de las proteínas SOCS contiene 8 miembros: SOCS 1-7 y CIS (proteína SH2 inducida por citoquinas). Todas ellas contienen 3 dominios: un dominio N-terminal de longitud variable que no está muy conservado entre los miembros, un dominio SH2, requerido para la interacción con los residuos de fosfotirosina, mientras que en el extremo C-terminal está el dominio altamente conservado de la caja SOCS [86].
La regulación de SOCS en la vía JAK/STAT se lleva a cabo con la inhibición de los efectores de la vía JAK/STAT, ya sea por medio de la unión de SOCS al receptor o a
JAK, bloqueando el reclutamiento de proteínas y la actividad quinasa de JAK. Las SOCS también pueden interactuar con el complejo de elonguina BC y con culina 2, facilitando la ubiquitinación de JAKs y también probablemente del receptor. Esta interacción parece estar mediada por la caja SOCS, la cual se ha visto que se asocia a las elonguinas B y C, lo que sugiere que las SOCS pueden inhibir la señalización al actuar como adaptores para el complejo E3 Ubiquitina ligasa. Se ha demostrado que SOCS-1 marca para degradación la proteína TEL-JAK, una proteína de fusión con actividad JAK2 constitutiva, así como JAK2 de tipo silvestre [86].
CIS fue el primer miembro identificado se esta familia. Se ha visto que CIS y SOCS-2 se unen a residuos fosforilados del receptor de citoquina. Esto genera una competencia por los sitios de unión en donde se reclutan las proteínas STAT. En el caso de SOCS-1 y SOCS-3 pueden inhibir la actividad de JAK ya que constan de un dominio en el N-terminal que funciona como pseudosustrato al actuar como inhibidor de quinasas. Se ha propuesto que SOCS-1 se une directamente al sitio de activación de JAK por medio de su dominio SH2, SOCS-3 se une al receptor de citoquina por medio de su dominio SH2. CIS se ha encontrado consistentemente como regulador de la respuesta de citoquinas mediada en particular por STAT5 y se conoce que es un importante regulador de factores de crecimiento hematopoyéticos, IL-3 y trombopoyetina, mientras que SOCS-2 se une al receptor de GH, inhibiendo la actividad de STAT5 inducida por GH. Ratones deficientes en SOCS-3 mueren durante el desarrollo embrionario, mostrando el papel esencial que juega en el desarrollo placentario [92].
Adicionalmente, se ha encontrado que estas proteínas y su desregulación están implicadas en enfermedades como el cáncer. Se ha visto que una reducción de la metilación de DNA
