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Variación espacial y temporal de la abundancia viral y su relación con la clorofila a en el Embalse del Neusa

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Academic year: 2020

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(1)INTRODUCCIÓN. En las últimas décadas se ha desarrollado un creciente interés por entender el papel que cumple el virioplancton en diversos cuerpos de agua alrededor del mundo (Bettarel et al., 2003; Corinaldesi et al., 2003; Culley y Welschemeyer, 2002; Höffer y Saramuga, 2001; Alonso et al., 2001; Wilhelm y Smith, 2000; Tapper y Hicks, 1998; Hennes y Simon, 1995; Wommack et al., 1992). Hasta el momento se sabe que los virus son las entidades biológicas mas abundantes en aguas marinas y continentales (Bettarel et al., 2003),. que son importantes miembros activos de las. cadenas tróficas acuáticas, que infectan un amplio espectro de hospederos, no solo bacterias sino productores primarios eucariotas (Brussaard, 2003;. Casteberg et al. 2001; Suttle et al.,. 1990) y. aparentemente, regulan la biomasa y diversidad genética de las poblaciones microbianas (Bratbak y Heldal, 1995). El fitoplancton, constituido por microorganismos fotoautótrofos que permanecen suspendidos en el agua, pertenece al primer nivel de organización (productores) del ecosistema acuático (Wetzel, 1981). Esta comunidad se ve afectada por algunos factores ambientales que interactúan para regular su distribución espacial y su abundancia. Adicionalmente, la estructura vertical de la columna de agua en los sistemas lénticos ejerce una considerable influencia sobre las adaptaciones fisiológicas de éstos organismos (Reynolds, 1992). En las aguas oceánicas, los virus son un factor regulador importante de la biomasa fitoplanctónica, incluso llegando a reducir a través de la lisis celular, la producción primaria en un 78%. Esto afecta la diversidad de especies, la dinámica de.

(2) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. poblaciones, los flujos de nutrientes y la. posible transferencia genética. entre sus hospedadores (Suttle et al., 1990; Brussaard, 2004). En la actualidad se dispone de información sobre el efecto de los bacteriófagos en el control de la abundancia y diversidad bacteriana, pero poco se sabe sobre la distribución geográfica o la diversidad genética. de. los. virus. que. infectan. fitoplancton. (microalgas. y. cianobacterias), debido principalmente a limitaciones técnicas (Boehme et al., 1993; Cottrel y Suttle, 1991). Dada la importancia potencial de los virus como agentes de mortalidad del fitoplancton y las bacterias, y como vectores de información genética, es necesario tener conocimiento de su distribución espacial en relación con la distribución de sus hospederos (Cochlan et al., 1993). El conocimiento de estas interacciones permitirá entender el papel que desempeñan. los virus dentro de los flujos de. nutrientes, así como adquirir una mejor comprensión del componente microbiano de las cadenas tróficas; esto permitirá en el futuro realizar estudios que posibiliten predecir la productividad y el estado ambiental de los ecosistemas limnéticos colombianos. En los ecosistemas lénticos de las regiones andinas estudiado muy. del trópico, se ha. poco la distribución y abundancia de las poblaciones. virales y por consiguiente el conocimiento sobre las interacciones con otros organismos es exiguo. En el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Jorge Tadeo Lozano se han realizado varias investigaciones acerca de los microorganismos acuáticos. Canosa y Pinilla (1999) determinaron la abundancia de algunas especies bacterianas y su posible uso como indicadoras del estado trófico. 2.

(3) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. En el 2001 los mismos autores estudiaron la abundancia total del bacterioplancton en varios embalses colombianos; los resultados mostraron densidades relativamente constantes en cuerpos de agua con diferente localización geográfica y estado trófico, lo que sugiere que, además de las condiciones ambientales y los nutrientes, deben existir otros mecanismos de control sobre la comunidad bacteriana (Canosa, 2003;, Canosa y Pinilla, 2001; Canosa et al., 2000) Canosa (2005) encontró altas densidades de virioplancton en diferentes sistemas acuáticos, donde se destacaron aquellas del embalse del Neusa, que fueron las más abundantes con respecto a los otros cuerpos de agua. Los hallazgos permitieron suponer que las comunidades virales son importantes en este ecosistema, ayudando en la regulación de la abundancia. tanto. del. bacterioplancton,. como. del. fitoplancton,. justificando la realización de investigaciones que profundicen en el tema. Durante el desarrollo de esos trabajos se implementaron técnicas para el estudio de los microorganismos en los sistemas acuáticos continentales, dentro de las que se incluyen la microscopía de epifluorescencia para estimar la abundancia del bacterioplancton (Canosa y Pinilla, 2001) y el análisis de imágenes para obtener datos de biovolumen y abundancia en un lago Amazónico (Canosa et al. 2000). Ambos procedimientos permitieron investigar, entre otras cosas, el acople entre el fitoplancton y el bacterioplancton (Pinilla et al., 1998). Para el estudio del virioplancton se estandarizó un método directo con epifluorescencia y el fluorocromo YoPro 1 (Canosa, 2005). En el presente trabajo de tesis se implemento el uso del fluorocromo Sybr Gold para el recuento de virus en aguas naturales;. 3.

(4) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. este método es más sencillo y requiere de menos tiempo con respecto a los recuentos con Yo-Pro 1. En este estudio además de determinar la variación espacial y temporal de la. abundancia. virioplanctónica. expresada como clorofila a;. y. de. la. biomasa. fitoplanctónica,. se exploró la relación entre esas. comunidades en un período de siete meses en el embalse del Neusa. Este trabajo de grado está enmarcado dentro del proyecto de investigación “Estructura y variación espacio - temporal de la comunidad bacteriana en el embalse del Neusa, un ecosistema acuático alto andino” (Canosa y Niño, 2003) financiado por Colciencias y la Universidad Jorge Tadeo Lozano. Se presenta como requisito para optar al título de Bióloga Marina.. 4.

(5) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. 2. MARCO TEÓRICO 2.1 Comunidades microbianas en las cadenas tróficas acuáticas La idea clásica de las cadenas tróficas en los sistemas acuáticos asume que las bacterias solamente tienen la función de degradar materia orgánica y remineralizar nutrientes y que existe un flujo unidireccional de carbón desde el fitoplancton hacia los consumidores de último orden. Sin embargo, desde hace tres décadas se estableció que el bacterioplancton es un componente central de las redes tróficas acuáticas, ya que participa en el reciclaje del carbono orgánico disuelto (COD) proveniente de los exudados de algas, de los desechos del zooplancton y de la lisis celular (Azam et al., 1983; Pomeroy, 1974). El COD, es asimilado como biomasa bacteriana y por lo tanto, gran parte de la producción acuática queda secuestrada en células procariotas disponibles en la columna de agua para otros organismos como los protozoos nanoplanctónicos (Strom, 2000); durante el proceso, la actividad bacteriana también libera compuestos inorgánicos que estimulan el desarrollo del fitoplancton. El acople de estas dos comunidades se ha estudiado ampliamente (Larsen et al, 2001;Yager et al. 2001; Fuhrman, 2000; Guixa-Boixereu et al., 1999; Cochlan, 1993). La reincorporación. de. COD. a. la. cadena. trófica. acuática. por. el. bacterioplancton, se ha denominado bucle microbiano (Azam et al., 1983). En sistemas acuáticos, el 50% de la producción fotosintética es liberada como COD, lo cual contribuye al aumento de las tasas de crecimiento de bacterias heterótrofas (Nagata, 2000). Sin embargo, la relativa constancia 5.

(6) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. de los recuentos bacterianos en sistemas con características tróficas y geográficas diferentes sugieren un mecanismo de regulación (Fuhrman, 2000). A raíz del descubrimiento de que los virus eran muy abundantes en ecosistemas marinos y continentales, algunos autores propusieron una actividad reguladora de las poblaciones microbianas por parte del virioplancton (Bettarel et al. 2004; Weinbauer, 2003; Wilhelm y Suttle, 1999; Suttle, 1992; Fuhrman, 1990). Estudios experimentales mostraron que ciertas poblaciones de cianobacterias eran lisadas por tipos específicos de virus, lo que comprobó que existe cierta regulación sobre las poblaciones del fitoplancton (Castberg et al., 2001; Brussard et al., 1999;. Bratbak et al.,. 1998; Bratbak et al., 1995; Bratbak et al., 1993; Cottrell y Suttle, 1991). En 1999 se propuso una extensión al bucle microbiano denominado el “corto circuito viral” en el cual se propone que existe regulación de las comunidades de bacterias, fitoplancton y zooplancton por parte de virus (Wilhelm y Suttle, 1999). En la Figura 1 se muestra cómo los virus fueron incorporados en los modelos de circulación de materia y energía dentro del bucle microbiano. 2.2 Fitoplancton El fitoplancton es el nombre que agrupa a los organismos fotoautótrofos que habitan en aguas abiertas o en la zona pelágica de los mares, lagos y ríos. (Reynolds,. 1997).. Está. representado. principalmente. por. algas. unicelulares y cianobacterias con escaso o nulo poder de desplazamiento. Estos organismos son productores primaros, que actúan como fuente de carbono orgánico particulado constituyendo el primer eslabón de la cadena trófica de los cuerpos de agua (Fogg y Thake, 1987).. 6.

(7) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. La producción primaria en los cuerpos de agua representa la producción de carbono orgánico disponible para los niveles tróficos superiores. En los lagos oligotróficos, del 50 al 70% de la fijación de carbono se atribuye al fitoplancton que constituye un importante recurso de energía en las cadenas tróficas acuáticas (Callieri y Stockner, 2002).. Figura 1. Bucle microbiano donde se incluye la participación de los virus. Las flechas mas gruesas representan la transferencia de materia y energía a través del pastoreo. Las flechas delgadas representan el impacto de los virus sobre las poblaciones y la subsiguiente liberación de carbono orgánico disuelto (COD) reciclado por las bacterias.. 7.

(8) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. Debido a que el fitoplancton es la base de las cadenas tróficas acuáticas, se han realizado un gran número de investigaciones sobre los factores que afectan su presencia, abundancia y biodiversidad. Tradicionalmente estos estudios se basaron en la habilidad de las especies para sobrevivir bajo condiciones limitantes de crecimiento (especialmente de nutrientes); y en la. influencia del ambiente físico sobre éstas ya que se sabe que las. microalgas responden a los gradientes térmicos y de salinidad, a los efectos del viento, a la frecuencia de los procesos de mezcla y a la profundidad, así como a las características tróficas del ambiente en el que se desarrollan (Seip y Reinolds, 1995). Adicionalmente, el fitoplancton tiene una estructura dinámica que cambia dependiendo de la presencia y actividad de algunos agentes biológicos; aparentemente es pastoreado por protozoos o muere debido a la lisis celular inducida por virus. Todo esto tiene importantes implicaciones en los ciclos de materia y energía en las cadenas tróficas acuáticas (Brussaard, 2003). Últimamente. los estudios han mostrado que la lisis celular es un. factor significativo comparado con otros factores de pérdida del fitoplancton (Zhong et al., 2002; Castberg et al., 2001; Guixa-Boixereu et al., 1999; Cottrell y Suttle, 1991). 2.3 Virus en los ecosistemas acuáticos Los virus son los miembros más numerosos de las comunidades microbianas en el ecosistema acuático, sobrepasan las abundancias bacterianas hasta en tres órdenes de magnitud (Noble et al.2003). Se definen como agentes infecciosos de una gran variedad de organismos vivos y carecen de. 8.

(9) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. metabolismo propio. Son parásitos intracelulares obligados y poseen un tamaño sub-microscopico (Furhman, 2000). Inicialmente los virus fueron estudiados en el campo de la medicina, debido a su acción como agentes infecciosos (Oldstone y Levine, 2000), pero en las últimas décadas, la microbiología se ha interesado por las propiedades y el rol ecológico que éstos desempeñan en los ambientes naturales, incluyendo los ecosistemas acuáticos (Wommack y Colwell, 2000).. Figura 2. Esquema de un virus con las diferentes partes que lo componen.. El tamaño de las partículas virales está entre los 20 y los 200 nm. Se caracterizan por que solo tienen un tipo de ácido nucleico, ADN o ARN, de una cadena o de doble cadena y están revestidos por una cubierta proteica: la cápside (Figura 2). Cómo se mencionó, los virus no tienen metabolismo propio, por lo que realizan la síntesis de sus compuestos para la replicación utilizando la maquinaria celular de sus hospederos, con los cuales se contactan a través de difusión pasiva, ya que no poseen sistema de movimiento (Cann, 1997). 9.

(10) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. Replicación viral. Se han descrito muchos mecanismos de infección viral, cuyo resultado final es la producción de un gran número de copias del virión, que varía dependiendo del tipo de virus. Las etapas de replicación o producción de copias, son múltiples y variadas. Los mecanismos líticos y lisogénicos son los más estudiados (Figura 3) y se han comprobado tanto en bacteriófagos (virus que infectan bacterias) como en los virus que infectan células eucariotas (Furhman, 2000). Infección lítica: En el ciclo de replicación lítico los virus inyectan su ácido nucleico a la célula hospedadora. La información viral permite que dentro del huesped se produzcan numerosos nuevos virus; luego se presenta un rompimiento celular que libera la progenie al medio (Cann, 1997).. Figura 3. Principales ciclos de replicación viral. En la parte superior se observa el ciclo lítico que implica la lisis celular, en la región inferior se muestra el ciclo lisogénico, en el cual la información genética del virus se une al ácido nucleico del hospedero hasta cuando se induce el ciclo lítico para la liberación de las partículas virales al medio.. Ciclo lisogénico: En este caso, después de la infección el genoma viral se integra al genoma del hospedero y se reproduce como material genético propio. Bajo ciertas circunstancias este ciclo puede pasar a lítico con la consecuente producción de copias del virus y su liberación por rompimiento de la célula hospedadora (Cann, 1997). 10.

(11) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. Participación de los virus en las cadenas tróficas. Por su alta abundancia en el ambiente acuático se ha sugerido que los virus son un componente activo de las redes tróficas. A pesar de que los datos son limitados, la actividad viral parece variar de acuerdo con factores como la profundidad y concentración de oxígeno (Weinbauer y Höffle, 1998), el estado trófico del sistema (Weinbauer y Peduzzi, 1995), la temperatura (Mathias et al., 1995), la luz (especialmente la ultravioleta) (Weinbauer et al. 1997; Wommack et al., 1996), la materia orgánica particulada suspendida (Danovaro et al., 2001) y la actividad bacterívora de protozoos. Además, se ven afectados por los mismos factores que perturban a sus hospedadores, en el caso del ecosistema acuático bacterioplancton y fitoplancton (Wommack y Colwell, 2000). El efecto de los virus en las cadenas tróficas se ha evaluado con el uso de modelos matemáticos. Se supone que el 26% del carbono orgánico del ecosistema acuático fluye a través del corto circuito viral lo que aumenta la productividad y la respiración bacteriana en un 33% (Fuhrman, 1999; Wilhelm y Suttle, 1999). Debido a que los virus son parásitos obligados específicos, influencian también la abundancia y la composición de especies dentro de la comunidad microbiana acuática. La lisis celular de bacterias, algas, y protozoos disminuye las densidades de las poblaciones susceptibles y resulta en la liberación de carbono orgánico disuelto (COD). El COD liberado estimula el crecimiento de aquellas poblaciones resistentes a la infección viral, cambiando la estructura y composición de la comunidad. La situación anterior afecta directamente la regeneración de los nutrientes y el ciclo de carbono (Noble et al., 2003).. 11.

(12) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. Las consecuencias de la infección viral pueden estudiarse en un amplio rango de escalas temporales y espaciales (Noble et al., 2003). Sin embargo, el entendimiento y consecuencias de la complejidad de estas interacciones es aún limitado, particularmente por que se requiere de un mejoramiento en las metodologías para obtener datos de abundancia y producción viral y así determinar entre otros las tasas de. mortalidad. mediada por virus en diferentes microorganismos. 2.4 Efecto de los virus sobre el fitoplancton A pesar de que varios estudios en sistemas marinos y continentales indican que el virioplancton tiene una mayor incidencia sobre células bacterianas (Wommack y Colwell, 2000; Fuhrman, 2000), también afectan una gran variedad. de. organismos. algales.. En. ambientes. marinos,. infectan. naturalmente a productores primarios como diatomeas, criptófitas, prasinófitas y crocoidales (Suttle, 1990) y se ha determinado que en aguas continentales la clorofila a puede ser un buen predictor de las concentraciones virales (Vrede et al., 2003; Maranger y Bird, 1995). De hecho, hace una década se propuso una nueva familia de virus. que. infectan específicamente algas eucariotas denominada Phycodnavirudae (Van Etten, 1995). Los virus pertenecientes a este grupo se caracterizan por una gran variedad de formas y modos de infectar a los hospederos pero en general poseen cápsides en forma de poliedro con un diámetro entre 100 y 220 nm además carecen de envoltura y cola y poseen cadenas largas de ADN de cadena doble. Los datos obtenidos muestran que la lisis viral parece ser esencial en la estimulación óptima de la dinámica algal, la sucesión de especies y la regeneración de nutrientes inorgánicos (Brussaard,. 2003; Cottrell y Suttle, 1991). El COD presente en el medio 12.

(13) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. acuático es transformado a biomasa bacteriana o remineralizado a compuestos inorgánicos de C y de N. que favorecen el desarrollo del. fitoplancton. Este COD es resultado entre otros, de procesos de excreción, exudación, muerte y lisis viral (Cole et al, 1982). Utilizando técnicas moleculares se ha observado que la estructura de las comunidades fitoplanctónicas varía en forma similar a los virus y que como el rango de hospederos es restringido, la infección por un virus particular no actúa en toda la población fitoplanctónica, limitando solo determinadas especies de algas lo que estimula el crecimiento de otras especies (Suttle, 1992). Se ha establecido que el impacto de los virus sobre las microalgas varía de acuerdo al estado trófico. Parece ser, que los virus ejercen un control más fuerte en sistemas eutróficos y que la infección por virus líticos es mas prominente en ambientes con mayor abundancia de algas (hospederos), debido al incremento en la probabilidad de encuentro. Así mismo, en los ambientes oligotróficos, predomina el ciclo lisogénico, lo que se considera una estrategia de supervivencia para los virus específicos de especies algales con bajas abundancias (Weinbauer, 2003). Durante los afloramientos fitoplanctónicos, cuando la alta concentración de células de algas facilita el contacto virus-hospedero, los virus pueden tener un impacto en su control. En los florecimientos de algas se almacenan una gran cantidad de carbono orgánico particulado (COP) y nutrientes, la lisis viral de una sola especie dominante además tiene un efecto significativo en la transferencia y ciclo de energía en la red trófica; los rangos más altos de lisis en el fitoplancton (más de 30%/día) se han 13.

(14) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. reportado durante el descenso de estos florecimientos. La lisis de los organismos en el “bloom” afecta las interacciones poblacionales y pueden crear una distorsión de la estructura clásica de los ecosistemas (Brussard, 2003). 2.5. Metodologías. para. la. determinación. de. la. abundancia. del. virioplancton y de la biomasa fitoplanctónica 2.5.1 Recuento viral La determinación de la abundancia viral es una herramienta útil para valorar el papel del virioplancton en el agua. El método más antiguo y frecuentemente usado es la microscopia electrónica de transmisión (TEM) (Fuhrman, 1999; Weinbauer et al, 1995; Bratbak et al, 1990), que además de costoso, consume mucho tiempo. También se utiliza la citometría de flujo con coloraciones específicas para ácidos nucleicos (Chen et al., 2001) pero no ha tenido tanta acogida como el método que emplea la microscopía. de. epifluorescencia. con. ultrafiltración. y. colorantes. fluorescentes (Noble y Fuhrman, 1998; Hennes et al., 1995; Maranger y Bird, 1995; Hara et al., 1991). La determinación de la abundancia viral con epifluorescencia puede utilizarse de forma confiable, ya que tiene una gran eficiencia incluso si se compara con los métodos de. microscopía electrónica de transmisión. (Weinbauer y Suttle, 1997). Otras ventajas de esta técnica son la relativa accesibilidad de los equipos y reactivos y la posibilidad de procesar un gran número de muestras de agua de forma rápida y sencilla.. 14.

(15) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. La técnica de epifluorescencia se basa en la afinidad que tienen ciertas sustancias fluorescentes para unirse de una manera altamente específica a los ácidos nucleicos de los virus presentes en un volumen determinado de una muestra de agua. Cuando un fluorocromo se excita con una longitud de onda adecuada emite en una menor longitud de onda fenómeno conocido como fluorescencia lo cual permite observar los organismos o los virus como partículas brillantes aumentando el tamaño real de éstas bajo el microscopio facilitando el conteo. En el procedimiento para el conteo de virus en muestras de agua se han utilizado varios fluorocromos como el DAPI, el Yo-Pro 1, el SYBR Green I y el SYBR Gold (Chen et al., 2001; Noble y Fuhrman, 1998; Hennes et al., 1995). La técnica se realiza en varios pasos e incluye un procedimiento inicial de concentración de las partículas virales. Para lo anterior se utilizan filtros de óxido de aluminio (Al2O3) con un diámetro de poro de 0,02 µm. Los virus retenidos en el filtro se tiñen con el fluorocromo elegido y se incuban por un período determinado de tiempo. Posteriormente se realiza el montaje del filtro sobre láminas portaobjeto para finalmente hacer el recuento en el microscopio.. Los. virus. se. visualizan. como. partículas. puntiformes. intensamente brillantes que se pueden contar con la ayuda de una rejilla incorporada en el ocular del microscopio de epifluorescencia. En este trabajo se utilizó como fluorocromo el SYBR - Gold debido a que es uno de los más sensibles, da una mejor señal (brillo más fuerte) y es más estable que el DAPI, el Yo-Pro I y el SYBR-Green I y II (Chen et al., 2001). El procedimiento es corto, sencillo y disminuye confusiones durante el conteo ya que permite distinguir las bacterias pequeñas de los virus grandes y la materia orgánica de las partículas similares a virus (psv); la materia 15.

(16) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. orgánica disuelta fluoresce en tonalidades naranjas o rojizas mientras que las psv lo hacen en verde manzana intenso. El SYBR Gold, a pesar de que es especifico para DNA se considera la mejor alternativa para utilizarse en varios tipos de muestras de agua ya que en estos ecosistemas predominan virus con este ácido nucléico. 2.5.2 Biomasa fitoplanctónica La concentración de pigmentos fotosintéticos se usa para estimar la biomasa de las poblaciones fitoplanctónicas. La metodología para medirlos es relativamente directa y segura, y puede realizarse tanto en extractos como in vivo (Arar y Collins, 1997; Wetzel y Likens, 1979). La clorofila a es el pigmento predominante en los organismos autótrofos del fitoplancton, tanto procariotas (cianobacterias. y procloroficeas) como. eucariotas. Químicamente el pigmento posee un anillo de porfirina asociado a una larga cadena de fitol, que posee un átomo de magnesio en el centro. Las moléculas de clorofila poseen una enorme cantidad de electrones en torno a todo el anillo porfirínico, capaces de absorber la luz y saltar a orbitales excitados. Los múltiples electrones en sus orbitas absorben luz de diferente energía cuántica, ampliando así el rango de longitudes de onda absorbidas y produciendo un espectro de absorción con múltiples picos a 420 y 675 nm en soluciones acetónicas (Wetzel y Likens, 1979), por lo tanto, este pigmento absorbe más intensamente longitudes de onda correspondientes a los rangos del rojo y el azul y transmite en el del verde. Se. han. utilizado. métodos. de. espectrofotometría,. fluorometría. y. cromatografía líquida de alta precisión (HPLC) para la medición de los pigmentos fotosintéticos. Este último se desarrolló hace relativamente poco 16.

(17) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. tiempo, pero el alto costo de los equipos que se requieren para su implementación y la gran cantidad de tiempo que debe invertirse en el proceso, lo hacen poco práctico e inaccesible para el uso rutinario en los laboratorios (Dos Santos et al., 2003). La espectrofotometría y la fluorometria se empezaron a usar en el análisis de pigmentos fotosintéticos hace alrededor de cuarenta años por Strickland y Parsons, (1968),. Lorenzen, (1967) y Yenrsh y Menzel, (1963).. Ambos métodos están basados en los principios de absorción en los cuales la cantidad de energía absorbida o emitida es proporcional a la cantidad de material en solución. Sin embargo, el método fluorométrico, que se usó en este trabajo,. es más sensible, económico y permite el rápido. procesamiento de las muestras (Dos Santos et al., 2003; Arar y Collins, 1997).. 17.

(18) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Área de estudio El Embalse del Neusa (Figura 4) está ubicado en el Departamento de Cundinamarca, 80 Km. al norte de Bogotá, a una altura de 2960 msnm sobre la Cordillera Oriental de Colombia, entre las coordenadas geográficas 5º 8´30´´ de latitud N y 73º 58´28´´ de longitud W (Uchima, 1988). Debido a su altitud y temperatura anual, puede considerarse que el embalse se encuentra en la zona de transición de tierras frías a las tierras de páramo. El clima se caracteriza por ligeros cambios de temperatura relacionados con la variación bimodal de las lluvias. Los meses más secos son diciembre-enero y junio-agosto y los picos máximos de precipitación se presentan en octubre-noviembre y abril-mayo (Márquez y Guillot, 1988). La cuenca tributaria del embalse incluye los ríos Cubillos y Las Juntas, principales afluentes; y varias quebradas como Guanquica, Llano Chiquito, El Chocha, Chapinero, Piscicultura, Mogotes entre otras. Los ríos Cubillos y las Juntas (Siguatoque) corresponden a cerca del 70 % del área total de la cuenca de drenaje. El río Cubillos aporta en promedio un caudal de 0.56 m3/s al Embalse del Neusa que representan cerca del 70% de las afluencias totales anuales (CAR, 2003). El embalse del Neusa es administrado por. la Corporación Autónoma. Regional de Cundinamarca, CAR. Además de surtir de agua algunos 18.

(19) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. acueductos regionales, regula los caudales del río Neusa, cuenta con una estación piscícola y sirve como lugar de recreación.. Figura 4. Mapa del embalse del Neusa con la ubicación aproximada de las estaciones de muestreo.. 3.2 Fase de campo Periodicidad de muestreo. Los muestreos se llevaron a cabo con una intensidad mensual por un periodo de 10 meses entre julio de 2004 y abril de 2005. Los muestreos se realizaron en las siguientes fechas: 19.

(20) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. Muestreo 1. 27 julio de 2004. Muestreo 2. 26 agosto de 2004. Muestreo 3. 16 septiembre de 2004. Muestreo 4. 5 octubre de 2004. Muestreo 5. 9 noviembre de 2004. Muestreo 6. 9 diciembre de 2004. Muestreo 7. 1 febrero de 2005. Muestreo 8. 22 febrero de 2005. Muestreo 9. 15 marzo de 2005. Muestreo 10 12 abril de 2005 Estaciones de muestreo. Se seleccionaron 4 sitios contrastantes en sus características morfométricas, físicas y químicas. Los lugares seleccionados fueron la presa, el centro del embalse,. la entrada del río Las Juntas y. afuera del embalse, en el río Cubillos (Figura 4) (Canosa y Niño, 2003). Con el fin de estudiar la variación vertical, en la presa y el centro del embalse se definieron tres estaciones de acuerdo con la profundidad de penetración de la luz medida en campo con el disco Secchi y una constante de 2,7 que permite definir aproximadamente el punto de compensación de la luz (Cole, 1979),. Estas estaciones corresponden con. la superficie, la zona fótica, la zona de compensación de la luz y el fondo del embalse.. Se establecieron entonces ocho estaciones definidas a. continuación: Estación 1: Superficie, entrada del río Las Juntas Estación 2: Superficie, centro del embalse (Chapinero) Estación 3: Zona fótica centro del embalse (Chapinero) 20.

(21) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. Estación 4: Punto de compensación, centro del embalse (Chapinero) Estación 5: Superficie, presa Estación 6: Punto de compensación, presa Estación 7: Fondo, presa Estación 8: Superficie, Río Cubillos Análisis en campo. En campo se llevaron a cabo perfiles verticales de oxígeno, temperatura y pH utilizando una sonda multiparámetros Hydrolab (Figura 5).. Figura 5. Sonda multiparámetros Hydrolab Data Sonda 4. Utilizada para obtener los perfiles verticales de los parámetros físicos y químicos.. Toma de muestras. Las muestras de superficie se tomaron manualmente a aproximadamente 0.5 m de profundidad. Las muestras de virioplancton de la zona fótica, punto de compensación y fondo se recolectaron con ayuda de un muestreador Zobell y con una botella de Van Dorn horizontal para la clorofila (figura 6). Las muestras para la determinación viral se recolectaron en frascos estériles de 250 ml, en condiciones asépticas 21.

(22) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. mientras que las de clorofila se filtraron en campo utilizando una bomba manual y un equipo de filtración Millipore a través de filtros Whatman GF/F de fibra de vidrio con porosidad de 0,75 µm. El volumen filtrado fue de 100 ml. De cada muestra se tomaron tres réplicas que se protegieron de la luz y se transportaron refrigeradas al laboratorio en un tiempo menor a 4 horas. Para el recuento viral, las muestras se procesaron inmediatamente se llegó al laboratorio. Los filtros con las muestras de clorofila se conservaron en oscuridad y a – 20ºC hasta su procesamiento.. Figura 6. Botellas muestreadoras. Botella de Zobell (izquierda) y de Van Dorn alfa horizontal (derecha).. 3.3 Fase de laboratorio Análisis biológicos. Los análisis biológicos se realizaron en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Jorge Tadeo Lozano. Recuento total de virus. Se siguió el método de recuento total por epifluorescencia con el fluorocromo SYBR Gold según las sugerencias de Noble y Fuhrman, 1998. Filtración. Siempre se filtró un ml de la muestra 22.

(23) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. través de un filtro Anodisc® de oxido de aluminio con diámetro de poro de 0.02 µm (Anodisc 25, Whatman International Ltd, Maidstone, England). Para lograr una filtración uniforme se usaron filtros de soporte de acetato de celulosa de 0.45 µm (diámetro de poro). Inicialmente, se usó la muestra directa, pero debido a que el número de psv era alto y se dificultaba el conteo, se diluyó en una proporción 4/10 con agua desionizada estéril filtrada. Inmediatamente después de la filtración los filtros se secaron cuidadosamente y se dejaron sobre un kleenex y protegidos de la luz. Coloración. Los filtros se colocaron sobre 100 µl. de una solución del. fluorocromo colocada en una caja de Petri plástica. El colorante se preparó con 90 µl de agua desionizada estéril filtrada y 10 µl de solución de trabajo de SYBR Gold (Molecular Probes S-11494) para una concentración final de 2.5X. Incubación. Los filtros con las muestras se colorearon por 15 minutos, a temperatura ambiente y protegido de la luz. Montaje. Esta parte del procedimiento estuvo sujeta a varias modificaciones debido a que en muchos. casos. el. brillo. del. fluorocromo. dificultando el recuento de las psv.. desaparecía. muy. rápido. Los mejores resultados se obtuvieron. cuando los filtros bien secos se congelaron a -20ºC y se montaron el día del conteo. Para ello se colocaron en láminas portaobjetos, se cubrieron con una gota de un líquido de montaje. Se ensayaron los líquidos de montaje p-fenilendimina (Sigma) y Citifluor AF1 (Electron Microscopy Sciences). Recuento. Se utilizó un microscopio de epifluorescencia Olympus B-Max-60 (Olympus Corporation, Lake Success, New York, USA), con un filtro de excitación de banda azul (BP 450-480), un filtro barrera (BA515) y un espejo de hendidura dicromático (DM 500). Para el conteo se usó una retícula ocular de 10/100 (modelo 240CM - Olympus Corporation) y un objetivo 100X Fluorite Plan. Se contaron todos los puntos que fluorescian verdes y se diferenciaron de las bacterias por la forma, tamaño y brillo 23.

(24) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. excesivo de éstas. Siempre se contaron 10 campos del filtro elegidos al azar, el número mínimo de virus por filtro fue de 200. La abundancia viral se expresó como psv.ml-1 que se calculó utilizando la siguiente fórmula: psv.ml-1 = n*31416*D/Vf Donde, n = Promedio de psv contadas en los 10 campos del filtro. 31416 = Número de veces que cabe la retícula ocular del microscopio en el filtro D = Inverso de la dilución Vf = Volumen filtrado Determinación de clorofila a. Los filtros con las muestras fueron macerados utilizando una solución de acetona al 90%. Se pasaron a tubos de centrífuga, completando el volumen a 10 ml con la solución de acetona. Los tubos se mantuvieron en la oscuridad a 10ºC por un periodo de 3 horas agitándolos eventualmente. Posteriormente se centrifugaron dos veces por un tiempo de 15 minutos para su determinación fluorométrica (Arar y Collins, 1997; Wetzel y Likens, 1979). Las lecturas se realizaron usando un fluorómetro Turner Designs 10AU – 072 (PMT Rojo 185 – 870 nm) con una lámpara de vapor de mercurio azul, filtro de excitación de 340 - 500 nm (azul) y filtro de emisión >665 nm (rojo). El contenido de clorofila a se determinó utilizando la siguiente fórmula: Clorofila a (µg. L-1) = L X Ve X D / Vm (Arar y Collins, 1997) Donde, 24.

(25) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. L = Valor obtenido en la lectura (µg/l) Ve = Volumen del extracto (l) D = Factor de dilución Vm = Volumen de la muestra (l) Previo a los análisis se realizó una calibración del flourómetro. A partir de un stock de 10mg/l de clorofila a se prepararon soluciones patrón de 5 mg/l, 500 µg/l, 80µg/l, 60µg/l, 40µg/l, 20µg/l y 10µg/l.. Con estas soluciones se calibró el detector del flourómetro en los rangos bajo (0 - 10µg/l), medio (10µg/l -100µg/l) y alto (100µg/l -1000µg/l), utilizando la utilidad de autocalibración del equipo.. Adicionalmente en cada fecha de muestreo antes de las lecturas se hacia una verificación de esta calibración utilizando dichos patrones. 3.4 Fase de gabinete Datos: Los datos de temperatura, oxígeno disuelto, pH nitrógeno y fósforo junto con los datos de abundancia viral y clorofila a se registraron en matrices usando el software Microsoft Excel de Office XP para facilitar su manejo. Análisis estadísticos: Con el fin de analizar el comportamiento temporal y espacial de las variables se utilizaron medidas de tendencia central, gráficos de barras y de líneas. Para determinar el tipo de relación entre las variables se utilizaron gráficos de dispersión y análisis de correlación simple para lo cual se utilizó el índice no paramétrico de Spearman.. 25.

(26) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. 4. RESULTADOS 4.1 Precipitación y nivel del embalse Los datos de precipitación y volumen promedio en el embalse, fueron suministrados por la CAR (CAR, 2005) y señalan tres periodos claros en cuanto al régimen pluvial. En la época lluviosa, entre septiembre y noviembre de 2004, se presentaron los valores más altos de precipitación (>100 mm3/mes), en tanto que el periodo más seco ocurrió a finales de 2004 y principios de 2005 (< 45 mm3/mes). En julio, agosto, marzo y abril se encontraron valores intermedios (45-100 mm3/mes) (Figura 7). El volumen del embalse mostró sus niveles más bajos durante julio y septiembre y los más altos entre diciembre y enero.. 180. 8,5. 150. 8. Meses de muetreo. em b ic re ie m br e En er o Fe br er o M ar zo A br il. e. re. D. Se. ct ub. A. b. O. Ju. to. lio. 6 go s. br il A. br e ct u N b r ov e ie m br D e ic ie m br e En er o Fe br er o M ar zo O. m. to Se. a. pt ie. go s A. Ju. lio. 0. 6,5. ov i. 30. 7. N. 60. 7,5. br. 90. m. 120. pt ie. volum en p rom ed io (10 M m /m es). 9. LLuvia tota l (m m /m es). 210. Meses de muestreo. Figura 7. (a) Precipitación mensual y (b) nivel promedio del embalse del Neusa durante el periodo de muestreo.. 26.

(27) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. 4.2 Parámetros físicos y químicos Transparencia. La profundidad del disco Secchi, aumentó gradualmente en el embalse a partir del primer muestreo en todas las estaciones, por lo que la profundidad de compensación de la luz se fue acrecentando a medida que transcurrieron los muestreos (Figura 8).. Meses de muestreo. 0. Profundidad (m). 2 4 6 8 10 12. Prof. Secchi Prof. penetración de la luz. Figura 8. Valores promedio de la profundidad Secchi y del punto de compensación de la luz en el embalse del Neusa durante el período de muestreo.. Temperatura. Se observó un aumento gradual de la temperatura promedio en el agua del embalse conforme transcurrieron los muestreos. Se pudo evidenciar una leve estratificación térmica en el perfil vertical; este comportamiento se acentuó desde noviembre hasta el final de los muestreos, cuando se detectó un cambio de 3ºC entre la superficie y el fondo (Figura 9a). La temperatura en el embalse osciló entre 13.3 y 18.2°C con un promedio de 15 ± 1.3ºC, (Tabla 1). Las temperatura más alta se presentó en febrero de 2005 y las menores en octubre de 2004. La mayor variación en éste parámetro se observó en el río 27.

(28) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. Cubillos, donde los valores estuvieron entre 10.6 y 20.1°C con un pico máximo en febrero y un mínimo en octubre. pH. En promedio el pH mostró una variación muy baja durante todo el periodo de muestreo. Estos valores oscilaron entre 6.6 y 7.2. Sin embargo, se observó una acidificación gradual de la zona afótica después del 5 muestreo, con valores que alcanzaron un pH 5,3 (Figura 9b). En el río, la variación fue mucho mayor con valores que oscilaron entre 6,3 y 9.6, con un promedio de 7.3 (Tabla 1).. a. b. c. Figura 9. Isoclinas de temperatura (a), pH (b) y oxigeno disuelto (c) dentro del embalse del Neusa durante el periodo de muestreo (julio 2004 – abril 2005).. Oxígeno disuelto. Los valores de oxigeno disuelto dentro del embalse estuvieron entre 0.03 y 10.22 mg/l con un promedio de 4.5 ± 2.9 mg/l (Tabla 28.

(29) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. 1).. Los mayores registros para todas las estaciones se encontraron en. enero de 2005. Las aguas en la entrada del río Las Juntas y del río Cubillos se mantuvieron oxigenadas durante todo el periodo de muestreo,. en. tanto que las de las estaciones de Chapinero y la Presa mostraron una marcada estratificación vertical, con valores de oxígeno muy bajos por debajo de los 7 metros; esta tendencia fue más evidente después del mes de diciembre (Figura 9c). Los porcentajes de saturación de oxigeno presentaron un comportamiento espacial y temporal similar con. la. variación del oxígeno en el agua. Análisis químicos. Los datos de las variables químicas que se muestran a continuación, fueron tomados de los resultados del estudio “Estructura y variación espacio - temporal de la comunidad bacteriana en el embalse del Neusa, un ecosistema acuático alto andino” (Canosa y Niño, 2003) proyecto marco en el que se desarrolló este trabajo de tesis.. Tabla 1. Valores promedio, mínimos y máximos de los parámetros físicos y químicos medidos en el embalse del Neusa y en el río Cubillos durante el periodo de muestreo.. Embalse Neusa. Promedio Mín-Máx. Temperatura ºC 15 (1.3) 13.3 – 18.2. Río Cubillos. Promedio Mín-Máx. 15 (2.9) 10.6 – 20.1. Oxígeno disuelto mg/l 4.5 (2.9) 0.03 – 10,22. Saturación de O2 % 65.6 (44) 0.7 – 136.7. 6.8 (0.77) 5.3 – 9.6. 7,6 (1.8) 2.7 – 9.6. 101.5 (36.1) 11.3 – 141.5. 7.3 (1.13) 6.3 – 9.6. pH. Los valores de desviación estándar se muestran entre paréntesis.. Fósforo. Los cambios en las concentraciones de fósforo total y soluble en el embalse mostraron un patrón similar; los valores más bajos se presentaron en los meses de menor precipitación, mientras que los lluviosos se caracterizaron por concentraciones que superaron los 0,19 y 0,12 mg/l 29.

(30) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. respectivamente, situación similar a la encontrada en los meses de lluvias moderadas (Figura 10a). Los valores de fósforo soluble (P-PO4) oscilaron entre 0.01 y 0.195 mg/l con un promedio de 0.028 mg/l. Los datos mas altos se observaron en marzo y los más bajos en febrero. El valor promedio del fósforo total fue de 0.08 mg/l. En el río Cubillos se registraron los valores más altos de estos compuestos, particularmente en los meses con mayor precipitación (Figura. ,09. ,10. ,08. ,09 mg.l P.Total. mg.l P Total. 10b).. ,07. ,08. ,07. ,06. ,06. ,05 Lluvias. a. Juntas. Intermedia EPOCA. Seca. Chapinero. Presa. Cubillos. ESTACIONES. b. Figura 10. Concentración promedio de fósforo total en el embalse del Neusa y en el río Cubillos (a) en las diferentes épocas (b) en las zonas de muestreo.. Nitrógeno: Los valores de nitrógeno total oscilaron entre 0.28 y 3.36 mg/l con un promedio de 1,14 ± 0.57 mg/l. Los más altos se encontraron en las Juntas y los menores en Chapinero (Figura 11b). En la época con una pluviosidad moderada se presentaron las concentraciones más altas de nitrógeno con valores bajos y similares en los periodos lluvioso y seco (Figura 11a). Los valores de nitratos y nitritos se encontraron la mayor parte del 30.

(31) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. tiempo por debajo del límite de detección de las técnicas usadas, sin embargo los valores promedio fueron de 0,002 mg/l y 0.2 mg/l respectivamente. El amonio varió en un rango de 0.02 y 0.8 mg/L con un promedio de 0.15 ± 0.12 mg/l. Se observó una marcada tendencia hacia valores altos en la zona profunda de la Presa, particularmente a finales del periodo de muestreo lo que probablemente se reflejó en un aumento en la concentración promedio del embalse.. 1,50. 1,6. 1,48. mg/ l. N.Total. mg/L N.Total. 1,46 1,44 1,42. 1,5. 1,4. 1,40 1,38 1,3. 1,36 Lluvias. a. Juntas Intermedia. EPOCA. Chapinero. Presa. Cubillos. Seca. b. ESTACIONES. Figura 11. Concentración promedio del nitrógeno total en el embalse del Neusa y en el río Cubillos (a) en las diferentes épocas (b) en las zonas de muestreo.. 4.3 Variables biológicas Recuentos virales. Durante los tres primeros muestreos se usó como líquido de montaje una solución de p-fenilendiamina, buffer fosfato salino (PBS) pH 7,2. y glicerol (Noble y Fuhrman, 1998). Los filtros con las muestras. coloreadas y filtradas, almacenados a -20ºC, empezaron a presentar una serie de problemas que impedían el conteo. Se detectó una gran pérdida 31.

(32) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. de brillo y la formación de una especie de nata que no permitía el recuento confiable de las psv. Después de varios ensayos se encontró que el Citifluor® utilizado como líquido de montaje, era capaz de mantener la fluorescencia por mucho tiempo, garantizando que los conteos en los días sucesivos a la preparación del filtro, reflejaran la situación del momento del muestreo. Como los primeros conteos pueden estar sesgados hacia una aparente subestimación de la abundancia viral, para el análisis estadístico de los datos en este trabajo, solo se tuvieron en cuenta los obtenidos a partir del cuarto muestreo. Abundancia viral. El promedio de la abundancia viral en el embalse fue de 6.13X107 psv/ml y en el río Cubillos de 4.89X107 (Tabla 2). Los valores más altos se registraron en la estación del río Las Juntas y los más bajos en la superficie de la Presa (Figura 12). En el embalse se encontraron los valores más altos entre enero y abril del 2005 y los más bajos entre octubre y noviembre (Figura 13). Se observó un descenso de la abundancia viral con la profundidad (Figura 15). En la Figura 14 se observa una variación mayor en la cantidad de virus encontrados en el río, con respecto al embalse. Tabla 2. Valores promedio, mínimos y máximos de virus y clorofila a encontrados en el embalse del Neusa y el río Cubillos durante el período de muestreo. Cuerpo de agua Embalse del Neusa Promedio Min. – Max. Río Cubillos. Promedio Min. – Max.. Virus (107 psv.ml-1) 6.13 (1.43 ) 3.07 – 12.8. Clorofila (µg.l-1) 4.5 (3.4) 0.41 – 21.2. 4.89 (2.73) 2.04 – 8.54. 5.06 (3.4) 0.62 – 10.2. Los valores de desviación estándar se muestran entre paréntesis.. 32.

(33) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. Se observó un comportamiento particular en los meses de. febrero y. diciembre en Chapinero y en la Presa, cuando las mayores densidades virales se presentaron en la estaciones más profundas. Biomasa fitoplanctónica (clorofila a). Los mayores promedios generales se observaron en el centro del embalse y los menores en Cubillos (Figura 12). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la clorofila mostró una fuerte variación vertical en la presa y Chapinero, con valores máximos en la zona fótica y más bajos en el fondo (Figura 15).. Clorofila a µg. l -1. 107psv.ml -1. 9. Abundancia v iral Clorofila a. 8 7 6 5 4 3 JUNTAS. CENTRO. PRESA. CUBILLOS. Estaciones. Figura 12. Abundancia viral y de clorofila a promedio para cada lugar de muestreo en el embalse del Neusa.. Respecto a la variación temporal, los valores más altos de clorofila se registraron en julio y agosto de 2004 con un posterior descenso que coincidió con los meses de lluvia. A partir del inicio del período seco, la concentración de clorofila empezó a aumentar nuevamente, sin embargo, nunca se alcanzaron valores similares a los iniciales (Figura 13).. 33.

(34) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. 7,5 14 7. 6. 8. 2. Abundancia viral Clorofila a. A. o. M. br er. Fe. En e. go s. pt ie m. A. Se. br il. 4,5 ar zo. 4. ro. 5. br e O ct ub re N ov ie m br e D ic ie m br e. 6. to. 5,5. Ju lio. 10 psv.ml. 10. Clorofila a µg. l. 12. 6,5. Meses de muestreo. Figura 13. Abundancia viral y de clorofila a promedio durante el periodo de muestreo en el embalse del Neusa.. En el río Cubillos se presentaron dos picos de clorofila en octubre y diciembre. A partir de diciembre se detectó un descenso continuo hasta el final de los muestreos (Figura 14). No se determinó el valor clorofila a en esta estación en Julio debido a un error durante el proceso de extrtacción.. 10. 8. 9 8 7. 6. 6 5. 5. 4 4. 3 2. 3. 1. L A BR I. O M A RZ O. RE R. O. EN ER. FE B. SE PT. IE M BR E O C TU BR N E O VI EM BR D E IC IE M BR E. 0. O ST O. 2. A G. µg. l-1. 107psv.ml-1. 7. Abundancia viral Clorofila a. Meses de muest reo. Figura 14. Abundancia viral y de clorofila a promedio durante el periodo de muestreo en el río Cubillos. 34.

(35) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. 4.4 Relaciones entre virus y clorofila a La abundancia viral y la clorofila a en el embalse variaron de forma similar desde octubre hasta febrero. En ambos parámetros se observó un claro patrón de descenso de octubre a noviembre y un posterior. aumento. hasta febrero (Figura 13). Sin embargo, solo los valores de la biomasa fitoplanctónica descendieron bruscamente en los meses de marzo y abril.. 107psv.ml-1 4,2. 4,4. 4,6. Clrofila a Ug . l 4,8. 5. 0. SUP. 10. 15. SUP. ZF. ZF. ZC. ZC. FON. a. 5. FON. b. Figura 15. Variación vertical de la abundancia viral promedio (a) y de la clorofila a promedio (b) en el embalse del Neusa. SUP: Superficie, ZF: Zona fótica, ZC: Zona de compensación, FON: Fondo.. En el río la variación temporal de los dos parámetros fue diferente al del embalse (Figura 14), las mayores concentraciones de clorofila coincidieron con la mayor cantidad de virus (diciembre a marzo) y cuando la clorofila 35.

(36) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. fue escasa los virus también (noviembre y abril), excepto en febrero cuando los virus aumentaron y la clorofila disminuyó (Figura 14). En la Figura 16a se muestra el gráfico de dispersión. de los datos de. abundancia viral y clorofila a en el embalse. Se aprecia una relación débil entre marzo. ambas variables (Spearman R: 0,132, P: 0.099). la. abundancia. viral. y. la. clorofila. a. Como en abril y parecieron. variar. independientemente (Figura 13), los resultados del análisis de correlación sin tener en cuenta estos dos meses, mostraron una mayor relación entre los virus y la clorofila durante los primeros meses del muestreo (Spearman R:. 14. 14. 12. 12. 10. 10. 8. 8. 10 p sv.m l. 10 p sv.m l. 0. 302, P: 0.001) (Figura 16b).. 6 4. 4. 2. 2. 0. a. 6. 0 0. 5. 10. µg. l-1. 15. 20. 25. b. 0. 5. 10. µg. l-1. 15. 20. 25. Figura 16. Gráfica de dispersión de los datos de abundancia viral y de biomasa fitoplanctónica encontrados en el embalse del Neusa durante (a) todo el periodo de muestreo y (b) desde octubre a febrero.. 36.

(37) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. 5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS Los rangos de los valores de abundancia viral encontrados en este estudio son similares a los reportados para otros sistemas acuáticos con diferente estado trófico (Tabla 5). Los datos registrados previamente para el Neusa (Canosa, 2005) coinciden con los de este trabajo. Sin embargo,. la. variación de los valores en el estudio anterior es mayor, probablemente porque el flourocromo utilizado y las escalas temporales y espaciales de muestreo en ambos trabajos fueron diferentes. Otros estudios han mostrado una relación entre la abundancia viral y el estado trófico del sistema (Weinbauer, 2003; Steward et al., 1996; Cochlan et al, 1993; Weinbauer et al.1993). El incremento en los nutrientes dentro de los ecosistemas acuáticos puede resultar en un aumento de la biomasa en todos los niveles de la red trófica, lo que podría favorecer el desarrollo del virioplancton (Samuelsson, 2003). Los datos aquí encontrados parecen confirmar lo anterior ya que el embalse del Neusa es un sistema oligomesotrófico (Canosa y Pinilla, 1999) en el que. la abundancia viral. promedio encontrada fue similar a las reportadas en otros ecosistemas con el mismo estado trófico (Bettarel et al., 2003; Hennes y Simon, 1995). En la entrada del río Las Juntas al embalse, los nutrientes parecieron afectar al virioplancton. Aunque no se encontraron unas claras relaciones estadísticas, los mayores valores de fósforo y nitrógeno coincidieron con las mayores. abundancias. de. virus.. Esta. estación. se. caracteriza. por. crecimiento de constante de macrófitas que, además de actuar como trampa de los nutrientes provenientes de las descargas del río, aportan 37.

(38) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. materia orgánica, a través de la liberación de necromasa (Niño, 2003; Barko y James, 1998) lo que estimula la generación de una cantidad substancial de nitrógeno y fósforo disponible para el desarrollo de microorganismos, hospederos potenciales de virus.. Tabla 3. Reportes de abundancia viral en cuerpos de agua con diferente estado trófico. Autores. Abundancia Viral (107 psv/ml). Lugar. Corinaldesi et al., 2003 Bettarel et al., 2003. Mar Adriatico Lago Aydat. Canosa, A., 2003. Fúquene. Weinbauer y Hofle, 1998 Lago Plußsee Epilimnio-Lago Vrede, et al., 2003 Gäddtjärn Hipo-Lago Vrede, et al., 2003 Gäddtjärn Culley y Welschemeyer, Océano Pacífico 2002. Método. Promedio. Rango. 15 1.8. 2 – 2300 2.5 – 9.9. EP/SGR EP/YPRO. Estado trófico. 1.9. 1.2 – 19. EP/YPRO. N/R. 0.2 – 0,25. TEM. Eutrófico Eutrófico Eutrófico. 2.19. 0.84 – 4.72. EP/SGR. Lago húmico. 2.35. 1.05 – 4.25. EP/SGR. Lago húmico. N/R. 0.15 – 1.5. EP/YPRO. Canosa, A., 2003. San Rafael. 3.3. 0.85 – 8.8. EP/YPRO. Canosa, A., 2003 Wilhelm y Smith, 2000 Bettarel, et al., 2003. 6.6 37.4 2.9. 1.7 – 22 37 – 37.9 1 – 5.4. EP/YPRO Oligo-mesotrófico EP/YPRO. Mesotrófico Oligotrófico. Vrede, et al., 2003. Embalse del Neusa Lago Erie Lago Pavin Hipolimnio-Lago Fisklösen. 2.9. 1.73 – 4.43. EP/SGR. Oligotrófico. Vrede, et al., 2003 Tapper y Hicks, 1998. Epilimnio-Lago Fisklösen Lago Superior. 3.04 0.055. 0.91 – 5.44 0.02 – 0.09. EP/SGR TEM. Boheme et al., 1993. Golfo de México. 0.055. Oligotrófico. 0.085 – 0.038. TEM. Tampa bay Lago de Höffer y Saramuga, 2001 Gössenköllesee. N/R. 0.46 – 2.7. TEM. Oligotrófico Oligotrófico Oligotrófico Oligotrófico. 0.04. <0.002 – 0.46. TEM. Oligotrófico. Canosa, A, 2003 Wommack et al., 1992 Hennes y Simon, 1995 Alonso et al., 2001. 1.9 2.5 5 N/R. Boheme et al., 1993. Río Teusaca Chesapeake Bay Lago Constanza Mar de Alboran. 0.54 – 3.5 EP/YPRO 0.26 – 14 TEM 0.01 – 0.25 TEM 0.0014 - 0.0072 EP/DAPI. Alonso et al., 2001. Mar de Alboran. N/R. 0.022 – 0.18. TEM. Mathias et al., 1995. Rio Danubio. N/R. 1.2 – 6.1. TEM. ESTE ESTUDIO ESTE ESTUDIO. Embalse del Neusa Rio Cubillos. 6.1 4.9. 3.07 – 12.8 2.04 – 8.54. EP: Epifluorescencia, SGR: Sybr Green I, Transmisión, N/R: No reportado.. YPRO: Yo Pro I,. Mesotrófico. EP/SGO Oligo - mesotrófico EP/SGO. SGO: Sybr Gold; TEM: Microscopía electrónica de. 38.

(39) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. El plancton de los sistemas limnéticos tiene una proporción importante de algas y cianobacterias, por lo cual sería de esperar que los cambios en la biomasa de estas comunidades estuvieran relacionados de alguna manera con las densidades de los virus que las infectan. De hecho, se ha observado una relación significativa entre la variación de la abundancia viral y de la concentración de clorofila a en diferentes ambientes acuáticos (Brussard, 2003; Maranger y Bird, 1995; Boheme et al., 1993). Esta relación puede darse de una forma directa, cuando los virus causan mortalidad en las poblaciones algales que infectan o indirectamente, cuando los productos de la lisis viral son remineralizados por las bacterias lo que a su vez estimula el desarrollo de las poblaciones autótrofas (Fhurman, 2000; Maranger y Bird, 1995). Se encontró una dependencia de la abundancia viral y de la biomasa del fitoplancton medida como clorofila a en el comportamiento temporal de ambas variables en el río Cubillos. Probablemente, el. aumento en las. densidades virales encontrado en el río a partir de noviembre, se relacionó con un estancamiento de las aguas y el subsiguiente incremento en los valores de clorofila a. Lo anterior estaría reflejando una situación en la cual a mayor número de hospederos mayor número de partículas virales (Weinbauer, 2003). Además, Brussard (2003) y Hannen et al., (1999) mostraron que la relación entre virus y clorofila se vuelve más importante durante los periodos de florecimiento algal. Durante estos eventos, se observa un aumento sustancial de la biomasa del fitoplancton con una disminución de la diversidad como consecuencia de la dominancia de unas pocas especies. Esta situación favorece el encuentro entre virus y hospederos con el control 39.

(40) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. de virus específicos sobre un grupo fitoplanctónico. Por lo tanto, los virus influyen no solo sobre la abundancia sino también sobre la diversidad de las poblaciones hospederas, a través del control de especies dominantes, favoreciendo a las menos abundantes (Hannen et al., 1999; Bratbak et al., 1993). Las altas concentraciones de clorofila encontradas durante los meses de julio a septiembre podrían indicar la ocurrencia de un florecimiento algal. De hecho, Rivera (1997) había reportado un florecimiento con un fuerte descenso en la diversidad del fitoplancton en el mes de julio, periodo de aguas poco estratificadas, en el mismo embalse. Por lo tanto se esperaría que en este periodo las relaciones entre ambas comunidades fueran significativas pero los datos teóricos no pudieron corroborarse de una manera empírica, a pesar de que los conteos virales de estos meses se descartaron. por. problemas. con. la. técnica. ya. mencionados,. el. comportamiento de los virus a partir de octubre podrían ser un indicio de las relaciones entre virus y fitoplancton que se ven fortalecidas durante los periodos de afloramiento algal. Adicionalmente,. la correlación encontrada entre virus y fitoplancton. cuando se analizaron todos los datos fue poco significativa (R: 0,132, P: 0.099). Es factible que las relaciones entre los virus y las algas, se vean obscurecidas porque los recuentos totales de virus, con la técnica de epifluorescencia, no permiten diferenciar entre los virus que infectan al fitoplancton de los que infectan a las bacterias (bacteriofagos) (Noble y Fuhrman, 1998). Sin embargo cuando se eliminaron los meses de marzo y abril cuando comportamiento de la abundancia viral y la clorofila comienzan a discrepar (Figuras 13 y 14) se presentó una correlación 40.

(41) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. altamente significativa ente las variables (R: 0,302, P: 0.001) lo que confirma que en el embalse los virus y el fitoplancton están relacionándose por lo menos durante ciertas épocas. Hay factores ambientales que afectan las densidades de las comunidades en el agua. El descenso en la clorofila y los virus encontrado entre octubre a noviembre en el embalse, coincidió con el periodo de mayor precipitación (Figura 7a). Esto indica que el ciclo hidro-climático puede tener una influencia directa sobre el virioplancton y el fitoplancton a través del efecto de dilución. Este evento afecta tanto a los organismos como a la. disponibilidad. de. nutrientes. necesarios. para. la. biosíntesis. del. fitoplancton. Debe considerarse que con la colmatación del embalse por la lluvia (Figura 7b), se haya producido liberación de carbono orgánico disuelto por la acción de bacterias heterótrofas sobre la materia arrasada en la inundación y los residuos de organismos fitoplanctónicos muertos (Reynolds, 1997), lo que llevaría a un aumento de las densidades de bacterias en el cuerpo de agua. En marzo y abril se presentó un segundo pico de precipitación y un rompimiento en la semejanza en el comportamiento observado entre el virioplancton y el fitoplancton en el embalse (Figura 13 ). Al parecer, el efecto de la dilución solo afectó a la biomasa fitoplanctónica; probablemente por que las bacterias se volvieron hospederos más importantes en este periodo. Este último efecto se vio reflejado en el aumento de la abundancia bacteriana en la misma época detectado durante el desarrollo del proyecto marco de este trabajo de tesis (com. pers., Canosa y Niño, 2005). Antes se mencionó que entre septiembre y noviembre los niveles de virus y clorofila disminuyeron en este periodo pero 41.

(42) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. aumentaron. los. recuentos. bacterianos. a. pesar. de. la. dilución.. Aparentemente la abundancia viral fue en esa época más dependiente del fitoplancton e independiente del bacterioplancton posiblemente por la alta biomasa del fitoplancton encontrada, lo que favorecería la infección viral. Además del efecto de los nutrientes, la presencia de hospederos y la precipitación existen variables físicas y químicas como la luz, la temperatura, el oxígeno disuelto y el pH que afectan tanto la abundancia viral como la biomasa fitoplanctónica (Weinbauer y Höffle, 1998; Weinbauer et al. 1997; Wommack et al., 1996; Mathias et al., 1995). Algunos autores reportan la disminución de la abundancia viral con la profundidad (Corinaldesi et al, 2003; Cochlan et al, 1993). Se sabe que la infectividad de los virus es extremadamente sensible a la radiación solar y el daño en el ácido nucleico viral es proporcional a la radiación recibida (Weinbauer et al, 1997; Kapuscinski et al., 1980). En este trabajo se encontraron mayores abundancias virales en la zona fótica,. estación. intermedia entre la superficie y la zona de compensación. Se ha sugerido que las lesiones causadas en el ADN viral pueden ser reparadas eventualmente (Weinbauer et al, 1997) y que el ciclo lisogénico tiende a predominar, lo que representa un balance en las pérdidas de infectividad (Heldal y Bratbak, 1991). Por lo tanto, es probable que los virus en el embalse desarrollen mecanismos que permitan contrarrestar el efecto de la radiación y mantener niveles altos de abundancia en la zona fótica. Además, a pesar de que los virus son afectados por la irradiación perdiendo su infectividad, no son removidos (Suttle y Chen, 1992); es probable entonces que en los conteos de las zonas superficiales y fótica se 42.

(43) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. hayan incluido virus no infecciosos cuya abundancia es detectada independientemente de esa característica. Por otra parte, la luz se considera el factor regulador más importante de la biomasa fitoplanctónica en la columna de agua, ya que los organismos autótrofos dependen de ésta para la realización de sus funciones vitales (Reynolds, 1997). En el embalse, la clorofila presentó sus valores más altos en la zona fótica, mostrando que las células fitoplanctónicas buscan un nivel de radiación óptima ya que están sujetas a su continua variación. Si esta radiación es muy alta, lo que sucede en la superficie, puede presentarse foto inhibición (Kirk, 1994). Como respuesta a los cambios en la radiación solar los organismos fotoautótrofos migran hacia la zona de radiación óptima o incluso cambian la composición de sus pigmentos de acuerdo con la longitud de onda prevaleciente (Kirk, 1994; Cochlan et al, 1993). En este trabajo se observó un aumento de la temperatura del agua desde el primero al último muestreo y un claro descenso de ésta con la profundidad, la clorofila mostró un comportamiento independiente con respecto a esta variable en tanto que la abundancia viral pareció tener relación con la variación de la temperatura, en ningún caso se encontraron correlaciones significativas con esta variable. Se sabe que valores de temperatura mayores a 15°C afectan negativamente la infectividad de los fagos y por consiguiente sus tasas de producción (Brussard, 2004; Nagasaki y Yamaguchi, 1998; Cottrel y Suttle, 1991; Mathias et al., 1995).. Teniendo en cuenta que las temperaturas en el embalse. estuvieron por debajo de los 18 ºC, no parece que esta variable afecte directamente los recuentos de virus.. Sin embargo, en el embalse del 43.

(44) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. Neusa se han encontrado correlaciones positivas entre la temperatura y la abundancia de bacterias (Canosa, 2003) lo cual podría indicar que la aparente relación temporal entre la temperatura con los virus puede deberse a un efecto indirecto en la medida en que la temperatura afecta a sus huéspedes. Con respecto al oxígeno y el pH se observó una aparente relación entre el descenso coincidente de las abundancias virales con estas variables en el eje vertical de la columna de agua. Sin embargo, los estudios hasta ahora realizados no han demostrado mecanismos mediante los cuales estas variables podrían afectar a las partículas virales. Aunque se ha mostrado una tendencia hacia menores valores de abundancia viral con el descenso del oxígeno, algunos trabajos han reportado altas abundancias virales cerca del sedimento anóxico (Weinbauer, 2003; Wommack et al., 1992; Taylor et al., 2003). Por lo tanto, no es posible decir nada concluyente sobre el efecto de estas variables en el Embalse del Neusa lo que insinúa que la variación de los virus esta determinada por sus hospederos y de forma indirecta por los factores físicos, químicos y ambientales que afectan a éstos últimos. En síntesis, hay una relación entre las abundancias de los virus y del fitoplancton y no fue posible determinar que variables físicas y químicas puedan brindar una explicación irrefutable sobre su variación en una escala espacial y temporal. El comportamiento temporal de la clorofila y la abundancia viral. en el río y en el embalse, así como el descenso. simultáneo de las dos variables en el perfil vertical del embalse, indican que el régimen pluvial y la disponibilidad de hospederos son los factores que explican mejor los cambios en la abundancia de los virus. 44.

(45) _______________________________________________________Virus y biomasa fitoplanctónica. Aparentemente el efecto de dilución, y por tanto la periodicidad hidroclimática, pueden explicar el comportamiento de las dos variables estudiadas. La relación positiva encontrada entre las abundancias de los virus y la clorofila a esta relacionada con una posible dependencia de los virus por sus hospederos. Sin embargo, sería de esperar una relación negativa entre las variables estudiadas, como consecuencia del control natural propuesto para la gran cantidad de virus encontrados en aguas naturales.. Estos. procesos, si ocurren, lo hacen en una escala temporal corta y por lo tanto pueden verse enmascarados por fenómenos de mayor escala, como la dinámica hidro-climática, que no permitirían establecer esta interacción con claridad (Corinaldesi et al., 2003). En consecuencia, a pesar de que la relación encontrada entre virus y clorofila a fue poco significativa, los análisis demuestran que existe una relación entre la abundancia viral y el fitoplancton y esta relación puede deberse a que los virus estén ejerciendo un control sobre la comunidad fitoplanctónica en el embalse del Neusa a través de la lisis viral o estimulando su crecimiento de una manera indirecta a través del bacterioplancton. Las evidencias encontradas en este trabajo sugieren que de existir una relación entre el fitoplancton y los virus, ésta se daría en los periodos en los cuales la clorofila a fuera más alta. Lo anterior indica que la dinámica temporal de la biomasa autotrófica tiene una incidencia importante sobre la variación de los virus en el embalse y por lo tanto en el impacto que estos pueden tener sobre la productividad primaria en el sistema.. 45.

Referencias

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