UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES “UNIANDES”
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
TEMA:
EFECTO DE LOS COMPUESTOS FENOLICOS TOTALES DEL EXTRACTO ETANOLICO DE LA BACCHARIS GENISTELLOIDES SOBRE
STREPTOCOCCUS MUTANS
AUTOR: Q.F. GUZMAN VEA MANUEL IGNACIO
TUTORES: OÑA CISNEROS FABIAN DAVID, BME MSC PHD(C)
VITERI RODRIGUEZ JUAN ALBERTO MD MSc
APROBACIÓN DE LOS ASESORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
CERTIFICACIÓN:
Quien suscribe, legalmente CERTIFICA QUE: El presente Trabajo de Titulación realizado por el Q.F Guzmán Vea Manuel Ignacio, estudiante del Programa de Maestría en Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, con el tema “EFECTO DE LOS COMPUESTOS FENOLICOS TOTALES DEL EXTRACTO ETANOLICO DE LA BACCHARIS GENISTELLOIDES EN STREPTOCOCCUS MUTANS”, ha sido prolijamente revisado, y cumple con todos los requisitos establecidos en la normativa pertinente de la Universidad Regional Autónoma de los Andes -UNIANDES-, por lo que se aprueba su presentación.
Ambato, abril del 2018
Ing. Oña Cisneros Fabián David Dr. Viteri Rodríguez Juan Alberto
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Q.F Guzmán Vea Manuel Ignacio, estudiante del Programa de Maestría de Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, declaro que todos los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, previo a la obtención del grado académico de MAGÍSTER EN FARMACIA CLINICA Y HOSPITALARIA, son absolutamente originales, auténticos y personales; a excepción de las citas, por lo que son de mi exclusiva responsabilidad.
Ambato, abril 2018
______________________________ QF. Guzmán Vea Manuel Ignacio CI. 0926580002
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Q.F Guzmán Vea Manuel Ignacio, declaro que conozco y acepto la disposición constante en el literal d) del Art. 85 del Estatuto de la Universidad Regional Autónoma de los Andes, que en su parte pertinente dice: El patrimonio de la UNIANDES está constituido por”La propiedad intelectual sobre las Investigaciones, trabajos científicos o técnicos, proyectos profesionales y consultoría que se realicen en la Universidad o por cuenta de ella;
Ambato, abril 2018
QF. Guzmán Vea Manuel Ignacio CI. 0926580002
RESUMEN
Las propiedades demostradas por especies del género Baccharis se deben a su composición química, basada principalmente en flavonoides, diterpenos y triterpenos. Éste género ha sido objeto de numerosos estudios fitoquímicos y de actividad biológica. El presente trabajo evaluó la actividad antimicrobiana in vitro del extracto etanólico de Baccharis genistelloides sobre Streptococcus mutans mediante la técnica de difusión de disco en agar Mueller Hinton-Sangre. Se evaluaron tres concentraciones del extracto etanólico al 25%, 50% y 75%; Clorhexidina al 0.12% como control positivo y agua bidestilada estéril como control negativo. Se realizó la lectura de los halos de inhibición a las 18 horas de incubada la muestra. Como resultado se encontró que los extractos etanólicos de Baccharis genistelloides presentaron actividad antimicrobiana contra Streptococcus mutans (25%, HI promedio= 6.07 mm; 50% HI promedio= 7.15 mm: 75% HI promedio= 14.69 mm; AD HI promedio= 1.12 mm) de forma proporcional a la concentración del extracto. En relación al control positivo (Amoxicilina), se evidencio que el porcentaje del efecto inhibitorio se estableció en 94.89%. Todos los efectos inhibitorios fueron menores al mostrado por el control positivo. En conclusión, existe un efecto bactericida mostrado por el extracto bruto etanólico de Baccharis genistelloides sobre Streptococcus mutans que es proporcional a su concentración, pero inferior al antibiótico usado como control positivo.
ABSTRACT
The properties shown by Baccharis species are attributed by its chemical composition, based mainly in flavonoids, diterpenes and triterpenes. This genre has been object of numerous phytochemical and biological activity studies. The following work evaluated in vitro antimicrobial activity of ethanolic extract of Baccharis genistelloides against Streptococcus mutans by the diffusion disc method, on Mueller Hinton-Blood agar. Three concentrations of ethanolic extract were evaluated: 4%, 5% and 15%; from which three dilutions were made 25%, 50% and 75%; using Clorhexidine 0.12% as positive control and distilled water as negative control. The lecture of inhibition halos was made at 18 hours after incubation of the samples and it was found that Bachharis genistelloides´s ethanolic extracts shown antimicrobial activity against Streptococcus mutans with a null to limit sensitivity. The obtained diameters in the inhibition halos covered a range from 5.59 mm to 12.07 mm; being the last one the correspondent to ethanolic extract at 15% concentration and dilution at 75%. There was evidenced that the inhibitory effect was directly proportional to the concentration because of extracted polyphenolic compound´s amount increasing.
ÍNDICE GENERAL
1.1 Antecedentes de la investigación... 1
1.2 Situación Problémica ... 2
1.3 Formulación del Problema ... 3
1.4 Objeto de Investigación ... 3
1.5 Campo de Acción ... 4
1.6 Línea de Investigación ... 4
1.7 Objetivo General ... 4
1.8 Objetivos Específicos ... 4
1.9 Idea a Defender ... 4
1.10 Variables de la Investigación ... 4
1.11 Epígrafes de Contenido... 5
1.12 Breve Descripción de la Metodología ... 5
1.13 Recolección de la Muestra ... 5
1.14 Criterios de inclusión y exclusión ... 6
1.15 Pruebas analíticas ... 6
1.15.1 Humedad... 6
1.15.2 Pureza ... 6
1.15.3 Cenizas totales ... 7
1.15.4 Cenizas Totales en Agua ... 8
1.15.5 Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico. ... 8
1.16 Preparación y Obtención de extractos. ... 8
1.16.1 Extracto Etéreo. ... 9
1.16.2 Extracto Etanòlico ... 9
1.17 Procedimiento Microbiológico ... 9
1.18 Evaluación de la actividad bacteriana del extracto etanólico preparado con la técnica de difusión en disco. ... 9
1.19 Aporte Teórico ... 9
1.20 Significación Práctica ... 10
1.21 Novedad Científica ... 10
2 CAPITULO I. MARCO TEÓRICO ... 11
2.1 Medicina Tradicional ... 11
2.2 Distribución Geográfica de Asteraceae ... 12
2.3 Características Morfológicas de Asteraceae ... 14
2.3.1 Baccharis genistelloides ... 15
2.3.2 Clasificación Taxonómica ... 16
2.3.3 Metabolitos secundarios de las plantas ... 17
2.3.4 Fitoquímica de baccharis ... 18
2.3.5 Usos Medicinales de Baccharis ... 20
2.4 Métodos De Extraccion ... 26
2.4.2 Extracción sólido-líquido ... 27
2.4.3 Maceración ... 27
2.4.4 Percolación o lixiviación ... 28
2.4.5 Extracción líquido-líquido ... 28
2.4.6 Extracto alcohólico ... 28
2.4.7 Extracto acuoso ... 29
2.4.8 Compuestos fenólicos ... 29
2.4.9 Análisis de fenoles totales. ... 30
2.5 Streptococcus Mutans ... 31
2.5.1 Streptococcus mutans ... 31
2.6 Actividad Antimicrobiana ... 34
2.6.1 Como bactericidas ... 35
2.6.2 Como bacteriostáticos ... 35
2.6.3 Mecanismo de acción ... 37
2.6.4 Resistencia de microorganismos ... 38
2.6.5 Mecanismos generales de resistencia a antibióticos ... 39
2.7 CONCLUSIONES PARCIALES ... 40
3 CAPITULO II. MARCO METODOLÓGICO Y PLANTEAMIENTO DE LA PROPUESTA ... 41
3.1 Caracterización ... 41
3.2 Preparación de extractos ... 41
3.3 Determinación del contenido de fenoles totales ... 41
3.4 Material vegetal y obtención de los extractos. ... 42
3.4.1 Extracto Etéreo. ... 42
3.4.2 Extracto Etanòlico... 42
3.5 PROPUESTA ... 42
3.5.1 Pruebas microbiológicas. ... 42
3.5.2 Evaluación de la actividad de los extractos. ... 43
3.5.3 Concentración ... 44
3.5.4 Análisis Estadístico... 45
3.6 CONCLUSIONES PARCIALES ... 45
3.7 DESARROLLO DE LA PROPUESTA ... 46
3.8 Evaluación de la actividad antibacteriana. ... 46
3.10 Análisis de los Resultados ... 48
3.11 Discusión de los Resultados Obtenidos. ... 53
4 CONCLUSIONES ... 56
1 INTRODUCCIÓN
1.1 Antecedentes de la investigación.
La estrategia de la Organización Mundial de la Salud, OMS, sobre Medicina Tradicional Complementaria (MTC) 2014-2023, está concebida para ayudar a los países a determinar la mejor manera de promover la salud y proteger a los usuarios que desean recurrir a esos productos, prácticas y profesionales. La MTC no solo se utiliza para tratar enfermedades, en particular enfermedades crónicas, sino también para prevenir enfermedades, mejorar la salud y mantenerla, y para algunos gobiernos ha demostrado tener una buena relación costo-eficacia(1).
Con la finalidad de buscar alternativas para el control del crecimiento de microorganismos patógenos, se investigó la actividad anti fúngica de plantas del género Baccharis, utilizando extractos no polares y polares, de las especies Baccharis latifolia, Baccharis genistelloides, Baccharis obtusifolia, Baccharis papillosa, Baccharis santelicis, sobre cepas de Cándida albicans; de las cuales se observó actividad inhibitoria en los extractos de Baccharis latifolia (2). El lugar de colecta interviene en la expresión de los metabolitos de las Baccharis. Los extractos provenientes de las hojas presentaron un mayor contenido y capacidad antioxidante debido a que los fenoles y flavonoides se encuentran preferentemente en la epidermis de las hojas (3).
Una revisión de la literatura sobre la evaluación de extractos de plantas del
género Baccharis y los metabolitos secundarios aislados de ellos, revela que
muchos estudios sobre sus actividades se han llevado a cabo en los últimos
años(4). Como es el caso del análisis fitoquímico preliminar de las hojas de Baccharis decusata, el cual mostró la presencia de alcaloides, taninos, saponinas, esteroles y triterpenos; donde se encontró que el extracto metanólico crudo y las fracciones de éter de petróleo mostraban actividad antiinflamatoria (5).
El propóleo es un producto natural que puede prevenir la caries dental
provocada por Streptococcus mutans. La B. dracunculifolia, una planta nativa
de Brasil, es la principal fuente de origen botánico para la producción de
2
se sabe si B. dracunculifolia tiene un efecto anticariogénico como el propóleo
verde. Los extractos metanólicos y etanólicos produjeron un efecto
bacteriostático en cultivos de Streptococcus mutans a una concentración de
0.40 mg/ml, estos resultados demostraron que el aclarado de hoja de B.
dracunculifolia y los extractos de propóleo verde tienen efectos inhibidores
similares sobre los factores cariogénicos de Streptococcus mutans evaluados,
y sugieren que las hojas de B. dracunculifolia pueden ser una fuente potencial
de productos farmacéuticos utilizados para este fin (4,5).
El Streptococcus mutans actúa tomando la sacarosa y otros carbohidratos produciéndose ácido, y en consecuencia, un ataque al esmalte, que dura entre 20 y 30 minutos; al inicio no se puede observar la caries, conforme avanza, se ve una mancha blanca en el esmalte del diente. Cuando la lesión cariosa todavía no ha roto el esmalte, el daño puede ser reversible; si continúa la desmineralización, el esmalte se rompe y aparece una cavidad (6).
1.2 Situación Problémica
El más importante microorganismo en el desarrollo de la caries se llama Streptococus mutans, esta bacteria se trasmite de una persona a otra, y se adhiere a los dientes formando una película pegajosa e incolora que se llama placa dento-bacteriana. La placa se acumula entre los dientes, alrededor de ellos y en la unión de los dientes y las encías. Las bacterias fermentan los hidratos de carbono de los alimentos que se ingieren y producen ácidos que, poco a poco, desmineralizan el esmalte de los dientes (7).
Cuando se investigó la asociación de Streptococcus mutans y Lactobacillus con la caries dental de niños, el mayor porcentaje (62%) de niños de piel blanca estaba afectados por caries, el 91.3 % y el 40 % de los niños pertenecientes al grupo de casos, tenían un alto grado de infección por Streptococcus mutans y lactobacilos, respectivamente, lo que demuestra una asociación positiva entre la caries dental y estas variables (6,7).
3
por lo cual caracterizar sus metabolitos secundarios así como los fenoles totales y ácido gálico resulta un proceso necesario, en aras de aportar al estudio completo de esta.
La OMS, estima que gran parte de la población de países en desarrollo, con bajo acceso a medicina moderna, dependen exclusivamente de plantas medicinales y prácticas tradicionales en los cuidados básicos de la salud. El levantamiento de información etnobotánica en Ecuador es un proceso en desarrollo. Es así que en Quevedo se encontró que 43 especies de plantas tuvieron uso medicinal. Las hojas fueron las estructuras más utilizadas (76.7%), la forma de preparación principal fue la infusión (83.7%), y la vía de administración más empleada fue la bebida (86.0%). La categoría de uso medicinal mejor representada está relacionada con el sistema gastrointestinal (44,2%) (5).
El recinto Los Monos-El Triunfo es una zona rural del cantón Milagro, la situación económica y la poca accesibilidad a la atención médica provoca que los habitantes atiendan sus dolencias a través de la medicina tradicional, consumiendo plantas que ancestralmente se conocen por sus propiedades curativas. Por ello, realizar una valoración completa tanto en la determinación de polifenoles totales, así como su actividad antimicrobiana de la Baccharis genistelloides que crece de manera silvestre en el sector de estudio, será un gran aporte no solo a la comunidad, sino también al acervo etnobotánico del Ecuador.
1.3 Formulación del Problema
¿Cuál será el efecto antimicrobiano del extracto etanólico de la Baccharis genostelloides sobre Streptococcu mutans?
1.4 Objeto de Investigación
4 1.5 Campo de Acción
Actividad antimicrobiana de Baccharis genistelloides frente a Streptococcus mutans
1.6 Línea de Investigación Estudios microbiológicos
1.7 Objetivo General
Caracterizar el efecto antimicrobiano de los compuestos polifenólicos en el extracto etanólico de la Baccharis genistelloides, a través de un ensayo in vitro, contra Streptococcus mutans,
1.8 Objetivos Específicos
• Aislar los principios activos Polifenoles totales de la planta Tres Filos (Baccharis genistelloides) mediante una extracción con Etanol al 75%. • Medir los halos de inhibición producidos por el extracto etanólico de
Baccharis genisteloides en concentraciones del 75%, 50% y 25%, sobre el cultivo de Streptococcus mutans.
• Comparar la susceptibilidad del Streptococcus mutans frente al extracto etanólico al 75%, 50% y 50%, al control positivo clorhexidina al 0.12% y el control negativo agua destilada estéril.
1.9 Idea a Defender
El extracto etanólico de la Baccharis genistelloides tiene efecto antimicrobiano frente a Streptococcus mutans.
1.10 Variables de la Investigación
5 1.11 Epígrafes de Contenido
EPIGRAFE I Baccharis genistelloides 1.1 Medicina tradicional
1.2 Distribución Astericaea 1.3 Características morfológicas
1.4 Baccharis genistelloides.- taxonomía 1.5 Fitoquímica de Baccharis
1.6 Usos medicinales
EPIGRAFE II Streptococcus mutans 2.1 Streptococcus mutans
2.2. Características Morfológicas 2.3 Metabolismo
2.4 Reproducción
2.5 Patologías asociadas al S. mutans EPIGRAFE II
3.1 Potencia o actividad antimicrobiana 3.2 Resistencia de microorganismos
1.12 Breve Descripción de la Metodología
1.13 Recolección de la Muestra
6
La recolección de Baccharis genistelloides se realizó en el Recinto Los Monos-El Triunfo, La Parroquia Mariscal Sucre, Cantón Milagro, durante los meses de septiembre a diciembre del 2017, período de pocas lluvias.
1.14 Criterios de inclusión y exclusión
a) Inclusión: Hojas frescas, adultas, con un tamaño promedio de 5.5 cm de largo, 3 cm de ancho.
b) Exclusión: Hojas pequeñas que no han llegado a la adultez y menores al tamaño hojas atacadas por insectos, ennegrecidas, hojas viejas o quemadas por el sol.
1.15 Pruebas analíticas
Para todas las pruebas analíticas se trabajó las muestras por triplicado.
1.15.1 Humedad
Llevar al horno secador las hojas para extraer la humedad de las mismas a 60 ºC durante 4 horas.
Porcentaje de humedad de la muestra: % H = (p – p”)/ p x 100
p = peso inicial de la muestra
(Ecuación 1)
p”= peso final de la muestra
1.15.2 Pureza
a) Peso total de la droga (pt): Pesar toda la droga, eliminar el peso del envase.
7
c) Determinación de partes no apropiadas de la propia planta (Pp): Se procede a separar manualmente partes no apropiadas de la propia planta, que se estime no están en buenas condiciones o que no intervienen como principio medicinal (tallos, hojas, flores, raíces), se pesa y se anota su valor.
d) Determinación de materia orgánica extraña (Mo): Se procede a separar hojas, tallos, semillas, etc., que no pertenecen a la droga cruda analizada, se pesa y se registra su valor (6).
e) Determinación de materia inorgánica extraña (Mi): Procedemos a separar las partículas de tierra, arena y piedrecillas presentes en muestra, pesar y registrar su valor (6)
f) Determinación de la pureza de la droga cruda (P): El peso total de la droga (pt) corresponde al 100%
(Ecuación 2)
% P= (He + Pp + Mo + Mi)/PT x 100
1.15.3 Cenizas totales
Con la ayuda de 2 crisoles previamente tarado, pesamos 2 gr. de muestra vegetal seca y molida en cada crisol, y llevamos a la mufla por el lapso de 3 horas a 750ºC, pasado este tiempo dejar en secador y pesa (6).
(Ecuación 3) C=𝑀2−𝑀𝑀1−𝑀𝑋100
M2 = Masa de crisol con cenizas
8 1.15.4 Cenizas Totales en Agua
Pesar 2 g de muestra vegetal seca y molida en dos crisoles respectivamente, llevar a la estufa por 3 horas a 750ºC, pasado este tiempo dejar en secador y pesar (6).
M2 = Masa de crisol con cenizas
M1 = Masa de crisol con muestra de ensayo M = Masa de crisol vacío
(Ecuación 4) C=𝑀2−𝑀𝑀1−𝑀𝑋100
1.15.5 Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico.
En el crisol con ceniza colocar 2 ml de HCl al 10 %, tapar el crisol con papel aluminio, poner agua a hervir previamente en un vaso de precipitación, posteriormente procedemos a filtrar el contenido del crisol con papel filtro tarado, con la ayuda del agua caliente realizamos varios enjuagues al papel filtro con residuo descartando el líquido del filtrado, en el último enjuague, tomamos una muestra del líquido y le adicionamos 1 gota de HNO3 y de 1-2
gotas de AgNO3, si se obtuviese un color blanco en el líquido se procederá a
seguir los enjuagues del papel filtro con agua caliente hasta que el líquido al adicionarle las gotas de reactivo no tomasen ningún color, es decir quede transparente. Luego de esto, poner el papel filtro con residuo en el crisol correspondiente para llevarlo a la mufla por 2 horas. A 750 ºC.
1.16 Preparación y Obtención de extractos.
9 1.16.1 Extracto Etéreo.
Pesar 25 g. de droga seca y molida y extraerlos con 200 ml de éter etílico por maceración durante 48 horas. Se obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y pesar).
1.16.2 Extracto Etanòlico
A la droga agotada con el éter etílico, extraer por maceración con etanol al 75% (tres veces el peso del residuo en volumen) durante 48 horas se obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y pesar).
1.17 Procedimiento Microbiológico
Cultivos bacterianos de Streptococcus mutans en medio de crecimiento Agar sangre a los cuales se les colocaron discos de papel filtro embebidos con las diferentes soluciones, divididos en 7 grupos: G1: Extracto hidroalcohólico al 4%, G2: Extracto hidroalcohólico al 5%, G3: Extracto hidroalcohólico al 15%.
1.18 Evaluación de la actividad bacteriana del extracto etanólico preparado con la técnica de difusión en disco.
Una vez conocidas las concentraciones para cada extracto, se preparó inóculos bacterianos de Streptococcus mutans con criterios de sensibilidad: difusión 12mm. y se sembró en cajas Petri con agar Muller-Hinton sangre. Se rotuló las placas indicando el número de ensayo y la posición de los discos, así como también el control positivo.
1.19 Aporte Teórico
10
polifenólicos y flavonoides que las Baccharis manifiestan, los cuales pueden ser utilizados para la Investigación y Desarrollo en la industria farmacéutica con uso razonable y sustentable de este recurso.
1.20 Significación Práctica
La presente investigación pretende aportar al estudio fitoquímico de la Baccharis genistelloides y comportamiento microbiológico de esta en cepas de Streptococcus mutans, principal agente cariogénico, con la finalidad de contribuir a las bases que permitan el desarrollo de fitofármacos con potencial uso en el tratamiento de enfermedades bucofaríngeas, que son tratadas tradicionalmente con antibióticos.
1.21 Novedad Científica
11 2 CAPITULO I. MARCO TEÓRICO 2.1 Medicina Tradicional
Desde tiempos inmemoriales el hombre ha hecho uso de plantas medicinales, así consta en numerosos testimonios escritos pertenecientes a distintas civilizaciones y culturas. En un proceso de ensayo error, el hombre obtuvo y almacenó el acervo de conocimiento de la utilidad no solo alimenticia de las plantas, sino también su utilidad medicinal. Los saberes ancestrales que incluyen a la medicina tradicional y la herbolaria, han sido practicados por la humanidad por muchos siglos de modo tal, que esos saberes fueron transmitidos de generación en generación, indicando como se utilizaban las plantas, tanto en prevención y diagnóstico; así como en la presencia de enfermedades y su consecuente cura o eliminación. La información histórico-botánica era obtenida casi exclusivamente de manera empírica, sobre la experiencia práctica y observación.
La Estrategia sobre Medicina Tradicional de la OMS 2014-2023 se desarrolló y lanzó en respuesta a la resolución de la Asamblea Mundial de la Salud, sobre medicina tradicional. La estrategia apunta a apoyar a los Estados Miembros en el desarrollo de políticas proactivas y la implementación de planes de acción que fortalecerán el papel de la medicina tradicional, para mantener saludables a las poblaciones (1). Para abordar los desafíos, responder a las necesidades identificadas por los Estados Miembros y aprovechar el trabajo realizado bajo la estrategia de la OMS de medicina tradicional: 2002-2005, la estrategia actualizada para el período 2014-2023 dedica más atención que su predecesora a priorizar los servicios y sistemas de salud, incluidos los productos, las prácticas y los profesionales de la medicina tradicional y complementaria.
12
Siendo las plantas organismos fabricantes de miles de compuestos, eficientes, sostenibles y no contaminantes, es lógico el gran interés científico en el estudio de la composición química del material vegetal (10).
2.2 Distribución Geográfica de Asteraceae
La familia Asteraceae de las compuestas, es la más grande de las plantas con flores, consta de más de 1100 géneros y unas 20.000 especies y tiene una distribución cosmopolita. En el Ecuador están representados unos 160 géneros. En los bosques andinos y páramos se ha registrado 44 géneros nativos con representantes arbustivos o arbóreos y son un componente importante de la vegetación andina (9).
La familia de las compuestas (Asteraceae) es reconocida por el hombre como plantas alimenticias y/o medicinales, esta es la más numerosa de todas las fanerógamas con aproximadamente 23.000 especies y más de 1.500 géneros distribuidas por todo el mundo, excepto en la Antártida, incluyendo desde pequeñas hierbas de 1 cm de altura hasta arboles de más de 30 m (10). Su distribución se da por todo el mundo, excepto en la Antártida (11).
Ilustración 2. Distribución geográfica de la familia Asteraceae
13
un notable ajuste ecológico, lo cual permite encontrar algunas en desiertos, otras en paramos o en manglares, así como en las cordilleras o en las sabanas e incluso en la selva amazónica (12).
La diversidad de la familia puede atribuirse, entre otros factores, a su plasticidad genética, sus excelentes mecanismos de dispersión y su capacidad de adaptarse a diferentes condiciones ecológicas (13). Esta habilidad permite su amplia distribución en todo el continente, e incluso su crecimiento silvestre en zonas más cálidas, como la región Costa ecuatoriana.
Tabla 1. Géneros más importantes de asteraceae ASTERACEAE
GENEROS MAS IMPORTANTES CANTIDAD
SENECIO 1250
VERMONIA 1000
COUSINIA 650
EUPATORIUM 600
CENTAUREA 600
ARTEMISIA 550
14
Ilustración 3. Revisión Taxonómica de las Especies Endémica de Astreaceae en Ecuador (Fuente Jardín Botánico de Missouri- USA)
2.3 Características Morfológicas de Asteraceae
Las Asteraceae forman parte de un grupo muy heterogéneo en cuanto a morfología del sistema vegetativo, puede encontrase casi todos los tipos de hojas (simples, compuestas, alternas, opuestas, arrosetadas, etc) y en muy diversas formas, muy homogéneas en cuanto amorfología de la inflorescencia (14). La familia de Asteraceae es particularmente rica en sesquiterpenos, que poseen propiedades biológicas y farmacológicas, por ejemplo aquellos sesquiterpenos que han presentado actividad antitumoral (15).
15
modificado (13,15). El cáliz en forma de vilano (conjunto de pelos simples, cerdas, escamas, que rodean las diminutas flores). Corola gamopétala 5 (2-4- dentada) con cuatro formas: la primera, corola tubular 4-5 lobulada, con limbo comúnmente corto y tubo inconspicuo, característico en flores bisexuales o funcionalmente masculinas; la segunda, corola filiforme, similar a la tubular pero más angosta, se presenta generalmente en flores femeninas; la tercera forma es corola bilabiada, comúnmente en flores bisexuales, constan de un labio superior 3-lobulado o 3 dentado y 2 labios inferiores delgados y recurvados (14). En muchas especies de la familia Asteraceae es común la presencia de estructuras secretoras como conductos, cavidades y tricomas de diferentes tipos. Sus secreciones pueden contener diferentes compuestos químicos, lo que les confiere un gran valor desde el punto de vista fitoquímico (15).
2.3.1 Baccharis genistelloides
El género Baccharis L. es el más rico en especies dentro de la tribu Asteraceae, comprende entre 340 y 400 especies de distribución exclusivamente americana y se extiende desde el Sur de Estados Unidos hasta Tierra del Fuego. Los miembros de Baccharis se caracterizan generalmente por la presencia de indumento en tallos y hojas y por la ocurrencia de plantas dioicas (16). En el Ecuador se encuentran unas 35 especies, pocas se encuentran bajo los 1000 m de altitud. Sobre los 2400 m se ha registrado 32 especies: Baccharisa laternoides., B. arbutifolia (Lam.), B. brachylaenoides ., B. buddleioides ., B. buxifolia (Lam.) Pers., B. caespitosa Pers., B. cayambense Cuatrec., B. chilco , B. cutervensis .,B. gniidifolia ., B. granadina., B. grandicapitulata ., B.grandiflora ., B. hambatensis ., B. hieronymi , B. huairacajensis ., B. jelskii Hieron., B. klatti iBenoist, B. latifolia Pers., B. lehmanii Klatt, B. lloensis Hieron., B. macrantha., B. marcetifolia Benth., B. oblongifolia Pers., B. obtusifolia.,B. odorata H.B.K., B. padifolia., B. pedunculata B.prunifolia ., B. quitensis , B. teindalensis y B. tricuneata Pers., muchas de ellas ampliamente distribuidas en la zona andina(19). Es una especie andina
16
confusa, debido a la gran cantidad de especies publicadas y sus distintas y variadas formas, además de la falta de estudios formalmente rigurosos(18). Las especies del género Baccharis generalmente son arbustos, que miden en promedio 0.5 a 4.0 m de altura, aunque se extiende también a plantas perennes herbáceas y subarbustos. La mayoría de las plantas de Baccharis se
pueden distinguir por su hoja o tallo alado. Las hojas son morfológicamente
diferentes y ayudan a la identificación. Además todas las hojas de la especie se
caracterizan por ser pubescentes (solo unas pocas como B. dracunculifolia y B. trinervis son subglabro en la madurez) (10,16).
2.3.2 Clasificación Taxonómica Reino: Vegetal
Subreino: Fanerógamas
Clase: Metaclamides o simpétalas Orden: Campanuladas
Familia: Asteraceae
Nombre científico: Baccharis genistelloides
Nombres comunes: Tres filos, callua callua, carqueja, karkeja, cuchu cuchu, kimsa cuchu, ischutullma.
17
Imagen 2. Plata Baccharis genistelloides en el campo. Fuente: Autor del estudio
2.3.3 Metabolitos secundarios de las plantas
Las plantas destinan una cantidad significativa del carbono asimilado y de la energía en la síntesis de una amplia variedad de moléculas orgánicas, que no parecen tener una función directa en procesos fotosintéticos, respiratorios, de asimilación de nutrientes, de transporte de solutos o de síntesis de proteínas, carbohidratos o lípidos, y que se denominan metabolitos secundarios (19), que constan de reacciones de biosíntesis que son propias para cada especie y pueden variar de acuerdo a las condiciones ambientales en las que se desarrolle cada planta, dichas reacciones son las que conducen a la formación de un producto natural (20).
18
purificados o mediante la utilización de extractos particulares de algún tipo de planta, en este caso del género Baccharis (19).
2.3.4 Fitoquímica de baccharis
Una marcha fitoquímica preliminar realizada en el extracto etanólico inicial de las hojas de B. boyacensis Cuatr, B. lehmannii Klatt, B. macrantha Kunth, B. bogotensis Kunth, B. mutisiana Cuatrec, señaló resultados similares entre sí, indicando la presencia principalmente de metabolitos de naturaleza terpénica y esteroidal, cumarinas y glicósidos, y en menor proporción los compuestos de tipo flavonoide, saponinas, sesquiterpenlactonas y quinonas (20). Las propiedades que han demostrado especies del género Baccharis se deben por supuesto a su composición química, basada principalmente en flavonoides, diterpenos y triterpenos, donde los flavonoides se distinguen por conferir protección y resistencia frente al ataque de microorganismos. También se han obtenido, aunque en menor proporción, cumarinas y aceites esenciales. El género Baccharis ha sido objeto de gran cantidad de estudios fitoquímicos y de actividad biológica. Desde principios de 1900 se inició su estudio y hoy en día, hay más de 150 compuestos aislados e identificados de este género(4). Entre los compuestos reportados se encuentran principalmente flavonoides, diterpenos y triterpenos. También se han obtenido cumarinas y aceites esenciales (19,20).
2.3.4.1 Flavonoides
19
pseudotenuifolia se aislaron los flavonoides hispidulina, naringenin, 3´- metoxiluteolina, apigenina, kaempferol, eriodictiol, quercetina (21).
En el caso de las flavanonas y los dihidroflavonoles, sus moléculas se caracterizan por la ausencia de un doble enlace en 2,3 y por la presencia de centros de asimetría. Estos flavonoides parece que son un poco menos frecuentes que sus homólogos insaturados y se observa que algunas familias acumulan especialmente sus derivados C-alquilados (Asteraceae, Fabaceae) (22).
2.3.4.2 Terpenos
Los Monoterpenos son los constituyentes principales de los aceites esenciales, con estructura irregular participan en la formación de las piretrinas, y en la composición de algunos aceites esenciales de las Asteraceae. Los diterpenos especialmente abundantes en las Asteraceae. Se han descrito más de 1200 productos repartidos en un centenar de esqueletos, se encuentra más disperso en las Gentianales, Gerianales y Fabales. Los diterpenos característicos del género Baccharis son los de tipo neoclerodano, además se han aislado derivados de kaurano y labdano. De B. gaudichaidiana se aisló dos nuevos diterpenos clerodano, denominados gaudichanolides A y B y otro llamado bacchariol (23).
2.3.4.3 Terpenoides
20 2.3.4.4 Cumarinas
Las cumarinas son 2H-1-benzopiran-2-onas que se pueden considerar, en primera aproximación, como las lactonas de los ácidos 2-hodroxi-Zcinámicos. Se han descrito más de un millar de cumarinas y las más sencillas se encuentran distribuidas en todo el reino vegetal. Algunas familias de Angiospermas elaboran estructuras muy variadas Fabaceae, Asteraceae y sobre todo Apiaceae y Ruteaceae que poseen estructuras más complejas (25).
2.3.4.5 Taninos
Son metabolitos polifenólicos ampliamente distribuidos en el reino vegetal. Se localizan en todas las partes de las plantas y su concentración es variable a lo largo del ciclo vegetativo. En la medicina tradicional se usan externamente, los preparados a base de drogas ricas en taninos, como las decocciones, se emplean para detener pequeñas hemorragias locales, en inflamaciones de la cavidad bucal, catarros, bronquitis, quemaduras, hemorroides, poder antiséptico para prevenir germinación de hongos y crecimiento de parásitos. La cuantificación de la concentración para Taninos en el extracto etanólico fue (+++), en el extracto metanólico (++), en el extracto acuoso (+) (26).
2.3.5 Usos Medicinales de Baccharis
21
cardiovasculares. Las propiedades terapéuticas se deben a su composición química, basada principalmente en flavonoides, diterpenos y triterpenos, incluídos los compuestos polifenólicos y los flavonoides cuya actividad antimicrobiana; así como la presencia de Taninos y cumarinas (28).
Sin embargo, hasta el momento no se ha establecido un marcador químico para caracterizar a las especies de Baccharis. La Baccharis genistelloides en Perú, crece en la región del Amazonas, es consumida en forma de Tónico para tratar enfermedades del hígado, reumatismo, diabetes, resfriados y dolores (28,29). El uso como medicina tradicional de la Baccharis genistelloides en el Recinto Los Monos, Cantón Milagro, región Costa de Ecuador es diverso. Para dolencias gastrointestinales, como dolores por espasmos, dolores reumáticos, diabetes, dolencias hepáticas y renales se consume como una infusión y/o decocción de 10 a 20 minutos de las hojas de la planta, conocida en el sector como “Tres filos”. En el caso de heridas, como lesiones causadas por caídas o cortes poco profundos se utiliza como cataplasma de hojas lavadas previamente y colocado directamente para controlar el sangrado (29). Las especies más representativas del género Baccharis se representan en la Tabla 2, acerca de la etnobotánica denotando uso en dolencias, parte utilizada y ubicación geográfica de las plantas.
Tabla 2. Etnobotánica de B. genistelloides COMPENDIO DE TRABAJOS DE (27–30)
Especie Ubicación Forma de Aplicación
Uso
Tradicional
Parte Usada
Fitoquímica Preliminar
Baccharis articulata
Sur de
Brasil, Uruguay, Paraguay, Argentina.
Decocción e infusiones
Diabetes Partes aéreas
22 Baccharis
alamani
México
inflamaciones Planta entera - Baccharis alamani México Bebida, laxante, Te de hojas
Dolor de
estómago, Estimular micción,
Pérdida de peso
Hojas -
Baccharis coridifolia
Sur de
Brasil, Uruguay, Paraguay, Argentina. Decocción Vapores mezclados con azufre Antiinflamatori o Moquillo de caballo y parásitos externos de los caballos. Hierba entera Posee tricotecenos como principios tóxicos Baccharis serraefolia DC
México Infusión Diarrea
enfermedades y
gastrointestina les.
Hojas -
Baccharis crispa DC Brasil, Uruguay, Paraguay, Argentina. Decocción e infusiones
23 Baccharis
dracunculifol ia DC
Brasil Extracto Afecciones al hígado y desordenes digestivos
Hojas terpinen-4-ol, γ
-gurjuneno
- Infusión Problemas
hepáticos, disfunciones estomacales y antiinflamatori o.
Hojas -
Argentina Decocción Cólicos y anemia por pérdida de sangre.
-
Baccharis douglassi
Oeste de América Decocción Vapores mezclados con azufre Desinfectantes riñón y piel
- Baccharis floribunda Perú, Venezuela Decoccione
s o
infusiones
Cortes y heridas,
diabetes y reumatismo. Hojas y tallos - Baccharis gaudichaudia na Paraguay, Argentina
Tónico Diabetes dolencias gastrointestina les
-
24
glutinosa antipirético -
México Infusión Trastornos ginecológicos y digestivos y enfermedades de la piel
Hoja - Baccharis genistelloide s Perú, Amazonas
Tónico Enfermedades del hígado, reumatismo, diabetes Polifenoles, Taninos Cumarinas Baccharis sarothroides
México Decocción Resfriados, dolores de cabeza sinusal y dolencias generales Rama s - Baccharis uncinella DC
Brasil Sedante Hojas
- Baccharis
illinita DC
Brasil Té Propiedades antiinflamatorias de piel, mucosa, anti infecciones,
ulcera de
estomago
Hojas y tallos
-
Polvo Cicatrización de heridas de piel
Hojas acerada
s y
25 Baccharis
incarum wedd
Argentina Cataplasma s Infusiones
Heridas Hojas
y/o tallos - Baccharis heterophyll a
México Infusiones o decoccione s Trastornos gastrointestinale s Partes aéreas - Baccharis latifolia Pers América del Sur Decoccione s Reumatismo, hígado, heridas y ulceras
Hojas y tallos α terpenos, esteroides-felandreno, canfeno (40) y óxido de cario- leno - Baccharis multiflora doblado
México Infusiones Gripe,
inflamación y problemas urinarios Hojas - Baccharis obtusifolia H.B.K.
Colombia Decocción Reumatismo, enfermedades del hígado, herida y ulceras.
Partes aéreas - Baccharis pentlandii
Bolivia Inflamación y
reumatismo
26 DC Baccharis rubricaulis rubby Bolivia (utilizado por indígenas) Infusiones o decoccione s
Dolencia de mucosas
Hojas y tallos
-
Baccharis salicifolia
Desde los Estados Unidos hasta Chile y Argentina
Infusión Inflamación Hojas - Decocción Agente de
higiene femenina
Hojas y tallos - Baccharis teindalensi s L
Ecuador Infusiones o
decoccione s
Antiinflamatoria, analgésico y remedios antimicrobianos Partes aéreas - Baccharis tricuneata
Venezuela Decoccione
s o
infusiones
Infecciones de piel y diabetes
Hojas y tallos - Baccharis uncinella DC
México Infusiones o decoccione s Trastornos gastrointestinale s
Toda la planta
-
2.4 Métodos De Extraccion
2.4.1 Métodos De Extracción En Fitoquímica
27
extracto, ya que de estos factores depende el método de extracción que se debe utilizar para el material vegetal. En la mayoría de los estudios se hace la extracción del material vegetal seco y pulverizado para que se logre mayor permeabilidad del solvente y por lo tanto mayor rendimiento en la extracción y porque en la mayoría de los casos los compuestos a estudiar son parte del metabolismo secundario, permanecen sin descomponerse en la estructura de la planta y no se volatilizan fácilmente, no obstante en algunos estudios como en los que tienen que ver con aromas es absolutamente necesario la utilización del material vegetal fresco. La polaridad de los compuestos a extraer es un factor determinante en el tipo de solvente que se debe emplear, por ende, si se quieren extraer mayoritariamente compuestos como 45 esteroles, se debe utilizar un solvente como éter de petróleo, cumarinas uno como hexano y alcaloides con uno como etanol y posteriormente con un ácido diluido. La extracción con etanol es muy común ya que con este se extraen sustancias de todas las polaridades, además este es un solvente estable (poco reactivo) y económico, también se puede evaporar fácilmente (31)
2.4.2 Extracción sólido-líquido
La extracción sólido líquido permite la extracción de un componente de interés soluble de un sólido con el contacto con un disolvente, en fitoquímica la fase portadora sólida sería el material vegetal, el soluto sería el extracto obtenido a través del disolvente (32).
2.4.3 Maceración
28
es conveniente la protección del recipiente de extracción de la luz solar, ya que esta puede llegar a descomponer sustancias fotolábiles. Después de la realización del extracto por medio de un filtrado es necesario lavar el material vegetal restante con más solvente para la obtención del extracto total (33).
2.4.4 Percolación o lixiviación
Consiste en el paso del disolvente a temperatura ambiente sin la aplicación de presión (solo por la acción de la gravedad), a través del material vegetal finamente molido, el 46 hecho de que el solvente pase detenidamente por las partículas del sólido hace que disuelva la mayor cantidad de metabolitos que le es posible y debido a que es continua la adición de solvente se logra una extracción muy efectiva utilizando esta técnica (31,34)
2.4.5 Extracción líquido-líquido
La extracción líquido-líquido, es un proceso de transferencia de una o varias sustancias desde una fase líquida a otra líquida que es inmiscible con la primera. Esto se debe al reparto que ocurre entre las dos fases de compuestos de diversas polaridades. Generalmente una de las fases es acuosa, y la otra es orgánica, esta última se denomina extractante ya que es el responsable de la transferencia de compuestos de una fase acuosa (35).
2.4.6 Extracto alcohólico
29
inmediatamente. Calcular el contenido, en mg por g, de materia extraíble en alcohol en la muestra empleada (36).
Método II (método de extracción fría) - Transferir a un erlenmeyer con tapón de vidrio aproximadamente 4 g, exactamente pesados, de material en polvo grueso y secado al aire. Agregar 100 ml de alcohol, tapar el erlenmeyer y macerar durante 24 horas, agitando frecuentemente durante las primeras 8 horas y luego dejar reposar. Filtrar rápidamente, tomando precauciones para evitar la pérdida de alcohol. Evaporar 25 ml del filtrado hasta sequedad en un cristalizador previamente pesado y secar a 105 °C hasta peso constante. Calcular el contenido, en mg por g, de la materia extraíble en alcohol en la muestra empleada (37).
2.4.7 Extracto acuoso
Método I (método de extracción caliente) - Proceder según se indica para el Método I en Extracto alcohólico, excepto que se debe emplear agua en lugar de alcohol (37).
Método II (método de extracción fría) - Proceder según se indica para el Método II en Extracto alcohólico, excepto que se debe emplear agua en lugar de alcohol (37).
2.4.8 Compuestos fenólicos
30
Los flavonoides, uno de los dos grandes grupos de compuestos fenólicos junto con los ácidos fenólicos, son un grupo extenso de compuestos derivados del benzo-γ-pirano. Dependiendo del grado de oxidación y de sustitución del anillo pirano central pueden subdividirse en flavonas, flavonoles, flavononas, isoflavonas, flavanos y antocianinas. Está comprobado que los flavonoides son importantes para el desarrollo y buen funcionamiento de las plantas al protegerlas contra agentes agresores externos, como la radiación UV, microorganismos, animales herbívoros y del medio ambiente (38).
2.4.9 Análisis de fenoles totales.
31 2.5 Streptococcus Mutans
2.5.1 Streptococcus mutans
Bacteria Gram positiva, anaerobia facultativa que se encuentra normalmente en la cavidad bucal humana, formando parte de la placa dental o biofilm dental. Se asocia al inicio y desarrollo de la caries dental. Es neutrofilo porque vive en medio con pH neutro, acidogénico por metabolizar los azúcares a ácidos y acidúrico por sintetizar ácidos a pesar de encontrarse en un medio de tales condiciones. Streptococcus mutans es un habitante de la microbiota oral que constituye la primera causa de caries dental y de infecciones graves por estreptococos del grupo viridans, tales como bacteriemia y endocarditis (40)
Imagen 3. Streptococcus mutans (41).
Tabla 3. Taxonomía de Streptococcus mutans
Taxonomía
32
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilli
Orden: Lactobacillales
Familia: Streptococcaceae
Género: Streptococcus
Especie: S. mutans
CLARKE 1924
2.5.1.1 Características
Streptococcus mutans es un estreptococo a-hemolítico o no hemolítico, que se visualiza como bacilo cuando se aísla de un medio con pH ácido y como cocácea cuando se sub-cultiva en un medio neutro o alcalino. Esta bacteria fue descrita por Clarke en 1924, quien notó la variación en la morfología con el pH del medio (41).
33 2.5.1.2 Metabolismo
Metaboliza la sacarosa para producir polisacáridos extracelulares (sustancia laxa que facilita su adhesión a las caras libres de las piezas dentarias) e intracelulares (metabolismo energético). En estado de salud, un recuento de estas bacterias en boca será de menos de 100.000 UFC.
Es un anaerobio facultativo - catalasa negativo. Requiere de una fuente de carbohidratos, en el caso del tipo Monosacáridos utiliza glucosa, fructosa, manosa, galactosa. En el tipo de Disacáridos: sacarosa, lactosa. Por ello es un Sacarolítico que utiliza la Fermentación de azúcares simples por ruptura homo o heteroláctica lo que lo hace Acidogénico Acidúrico – Acidófilo (43)
Tabla 4. Metabolismo bacteriano (S. mutans)
Fuente. (40)
2.5.1.3 Factores de cariogenicidad de los Streptococcus del grupo mutans
34
2.5.1.4 Transmisión, Colonización y estabilidad de Streptococcus mutans en cavidad oral
La caries dental es una enfermedad dental transmisible en la cual los estreptococos del grupo mutans juegan un papel principal. Como en muchas enfermedades infecciosas, se requiere la colonización de un patógeno antes de que ocurra la infección. Hay un rango de factores de virulencia importante para el establecimiento de Streptococcus mutans en la compleja comunidad microbiana de la biopelícula dental. Estudiar los factores de virulencia de S. mutans y su correlación con la biodiversidad de especies es fundamental para entender el papel que juega en la colonización por los diferentes genotipos en el mismo individuo, y la expresión de las características que puedan o no influenciar su capacidad de virulencia y su habilidad para sobrevivir bajo diferentes condiciones ambientales (42,43). El papel de los estreptococos del grupo mutans, especialmente Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus, en la etiología de la caries dental ha sido extensamente investigado y claramente demostrado. La evidencia indica que una forma importante de transmisión de S. mutans durante los primeros años de vida es la que se produce de madre a hijo por contacto directo (transmisión vertical), mientras que el contacto con otros familiares, incluidos el padre, los hermanos y demás posibles cuidadores constituye otra vía de transmisión (transmisión horizontal) que cobra importancia durante edades posteriores. Una característica importante de Streptococcus mutans es la persistencia de sus genotipos en la cavidad oral de adultos, adolescentes y niños mayores de cinco años. Este fenómeno es conocido como persistencia “intraindividual” y revela la relativa estabilidad que estos alcanzan en un hospedador y la relación con la expresión de características fenotípicas que les pueden dar ventajas para la supervivencia, como la capacidad de formar biopelículas, de adherirse y soportar fluctuaciones del pH (41,43).
2.6 Actividad Antimicrobiana
35
mismas condiciones de trabajo. Una reducción en la actividad microbiana puede revelar cambios no demostrables por métodos químicos. En ese sentido, la potencia de una sustancia antimicrobiana se define como la #habilidad específica o capacidad de un producto de lograr su efecto planeado”, y se basa en la medición de algún atributo del producto, por ejemplo, su efecto inhibitorio frente a un determinado microorganismo (halo inhibición), se determina por el método analítico más adecuado normalmente métodos de análisis microbiológicos (44). Esta potencia debe ser un atributo definible y medible para un producto biológico o sintético (48). En los análisis de potencia, se
compara cuantitativamente el efecto de una muestra sobre un sistema biológico con el efecto producido por una preparación estándar en las mismas condiciones y para lo cual ya se ha determinado exactamente su actividad, obteniendo así, un valor de potencia relativo al del estándar de referencia. Si se prueban las muestras en diferentes concentraciones se puede determinar una concentración inhibitoria mínima del antibiótico o producto hacia el microorganismo (45). Los agentes antimicrobianos se comportan de diversas maneras: como bactericidas y como bacteriostáticos.
2.6.1 Como bactericidas
Producen la muerte de los microorganismos responsables del proceso infeccioso. Pertenecen a este grupo los antibióticos β-lactámicos, aminoglucósidos, rifampicina, vancomicina, polimixinas, fosfomicina, quinolonas y nitrofurantoínas (45)
2.6.2 Como bacteriostáticos
Inhiben el crecimiento bacteriano, aunque el microorganismo permanece viable, de forma que, cuando se suspende el tratamiento, puede volver a recuperarse y multiplicarse. El hecho de que un agente sea bactericida o bacteriostático depende de su mecanismo de acción, y por tanto, de su estructura, pero también contribuyen paralelamente otros factores:
36 • Tipo de germen.
• Tamaño del inóculo. • Tiempo de acción.
• Fase de crecimiento de la bacteria
Así, los β-lactámicos sólo son bactericidas en la fase de crecimiento activo de la bacteria, mientras que las polimixinas son bactericidas en cualquier fase. Un antibiótico bacteriostático puede comportarse como bactericida en determinadas condiciones favorables. Esto ocurre con los macrólidos (46) Actualmente, existen tres categorías de antimicrobianos:
• Los que producen una acción bactericida poco relacionada con la concentración, como es el caso de los β-lactámicos y los aminoglucósidos, con los que se obtiene la máxima acción bactericida cuando se alcanzan concentraciones de 5 a 10 veces superiores que las CMI. El aumento en la concentración por encima de esto no se acompaña de mayor actividad ni de mayor duración del efecto postantibiótico.
• Los que poseen actividad bactericida concentración dependiente, como los aminoglucósidos y las fluorquinolonas.
• Los que se comportan como bacteriostáticos: macrólidos, tetraciclinas y cloranfenicol, entre otros.
La actividad antibacteriana exige una normalización o cuantificación, que se consigue mediante los métodos utilizados in vitro para comprobar la susceptibilidad del microorganismo en relación con el antibiótico. Con estos métodos se define:
• La concentración mínima inhibitoria (CMI). Es la menor concentración de antibiótico capaz de inhibir el crecimiento de 105 bacterias en 1 ml de medio de cultivo, tras 18-24 horas de incubación.
37
• El punto de corte de sensibilidad. Es la concentración de antibiótico por debajo de la cual se considera sensible una determinada especie bacteriana.
2.6.3 Mecanismo de acción
38
se fijan a los ribosomas de los mamíferos. El cloranfenicol, la clindamicina y la eritromicina se fijan a la subunidad 30 S. El primero inhibe una peptidil-transferasa, la segunda, la iniciación, y los macrólidos, la translocación (44,47). Interferencia en la síntesis y/o metabolismo de los ácidos nucleicos Rifampicina (ARN-polimerasa ADN-dependiente), quinolonas (ADN-girasas), metronidazol y antivirales. Existen tres posibles mecanismos por los que los antimicrobianos pueden modificar la síntesis de los ácidos nucleico:
• Interfiriendo la replicación del ADN. • Impidiendo la transcripción.
• Inhibiendo la síntesis de metabolitos esenciales
A través del primero, actúan las quinolonas, ya que inhiben la enzima ADN-girasa. Esta enzima corta la doble hélice del ADN cromosómico en fragmentos a los que superenrrolla en sentido negativo, para proceder al sellado de los extremos de ADN que fueron cortados. Las quinolonas impiden el cierre de los puntos de rotura. Los fármacos que inhiben la trascripción, como es el caso de la rifampicina y la actinomicina, actúan en la ARN-polimerasa. La rifampicina se fija en la subunidad B de esta enzima e impide su formación y la del complejo que inicia la trascripción, mientras que la actinomicina D bloquea la progresión de la ARN polimerasa en cualquier fase (46,47). Antimetabolitos que bloquean la síntesis de ácido fólico Sulfamidas, sulfonas, pirimetamina y trimetoprima: Las sulfamidas inhiben la incorporación del PABA para la formación del ácido fólico, de aquí su efecto antibacteriano selectivo. Las diaminopirimidinas inhiben la dihidrofólicoreductasa e impiden el paso de ácido fólico a folínico (paso necesario para la síntesis de bases púricas y pirimidínicas). La utilización terapéutica de trimetoprima depende de la afinidad selectiva por la dihidrofólico-reductasa de gérmenes sensibles (47).
2.6.4 Resistencia de microorganismos
39
bacterias, y no los seres humanos ni los animales, las que se vuelven resistentes a los antibióticos. Estas bacterias farmacorresistentes pueden causar infecciones en el ser humano y en los animales, y esas infecciones son más difíciles de tratar que las no resistentes. La resistencia a los antibióticos hace que se incrementen los costos médicos, que se prolonguen las estancias hospitalarias y que aumente la mortalidad (47,48). Es necesario que se cambie urgentemente la forma de prescribir y utilizar los antibióticos. Aunque se desarrollen nuevos medicamentos, si no se modifican los comportamientos actuales, la resistencia a los antibióticos seguirá representando una grave amenaza. Los cambios de comportamiento también deben incluir medidas destinadas a reducir la propagación de las infecciones, a través de la vacunación, el lavado de las manos, la seguridad de las relaciones sexuales y una buena higiene alimentaria. La Resistencia a los antimicrobianos (RAM) se produce cuando los microorganismos (bacterias, hongos, virus y parásitos) sufren cambios al verse expuestos a los antimicrobianos (antibióticos, antifúngicos, antivíricos, antipalúdicos o antihelmínticos, por ejemplo). Los microorganismos resistentes a la mayoría de los antimicrobianos se conocen como ultrarresistentes. Como resultado, los medicamentos se vuelven ineficaces y las infecciones persisten en el organismo, lo que incrementa el riesgo de propagación a otras personas (49).
2.6.5 Mecanismos generales de resistencia a antibióticos
Los mecanismos por los que se producen resistencias se pueden agrupar en los siguientes:
• Bloqueo del transporte de antibióticos. De esta forma, se consigue resistencia a la fosfomicina por pérdida del sistema de transporte del glicerol-fosfato.
40
• Producción de una enzima alternativa, que evita el efecto inhibitorio (bypass). La resistencia a trimetoprima se consigue al producir una dihidrofolatoreductasa diferente, que deja sin efecto la inhibición de la dihidrofolato-reductasa normal de la bacteria.
• Expulsión del antibiótico por un mecanismo activo de bombeo. La tetraciclina se expulsa de forma activa del interior de bacterias resistentes.
• Modificación del sitio de acción del antibiótico. La metilación del ARN 23S en una posición determinada da lugar a resistencia a los macrólidos, que no pueden fijarse en el ribosoma y producir así su efecto inhibitorio (48,49).
2.7 CONCLUSIONES PARCIALES
1. La Baccharis genistelloides es una planta poco estudiada en cuanto a su actividad antimicrobiana, que presentan compuestos polifenólicos como metabolito secundario.
2. La actividad antimicrobiana de la planta se debe a la presencia de polifenoles totales y flavonoides
3. El extracto etanolico es un excelente solvente pues los compuestos polifenólicos y flavonoides son polares.
4. El S. mutans es una bacteria Gram positiva que habita en la boca y está vinculada a la génesis de la caries dental.
5. La actividad antibacteriana implica una normalización o cuantificación, que se consigue mediante los métodos utilizados in vitro para comprobar la susceptibilidad del microorganismo en relación con el compuesto de prueba
41
3 CAPITULO II. MARCO METODOLÓGICO Y PLANTEAMIENTO DE LA PROPUESTA
3.1 Caracterización
El presente trabajo de investigación se desarrolló en Modalidad Cualitativa y Cuantitativa, con diseño cuasi experimental. Por su alcance es una investigación Correlacional.
En el presente estudio, se evaluó la actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos de B. genistelloides, localizadas de manera silvestre en el recinto Los Monos- El Triunfo cantón Milagro, frente a cepa de Streptococcus mutanas ATCC 25175
La recolección del material vegetal se realizó en el Recinto Los Monos El Triunfo localizada 12 msnm, a 2°08´05´Sur y 79°35´14´Oeste y presenta una temperatura promedio de 25°C y humedad relativa de 66%. A esta ciudad converge todo el comercio de la provincia del Guayas, y es el centro de gran demanda de frutas cítricas.
3.2 Preparación de extractos
Se dejaron secar las muestras vegetales. Se molió las hojas secas y se pusieron en contacto con etanol al 75%. Se utilizó etanol porque los compuestos alcohólicos rompen la membrana celular, y así se logra extraer grandes cantidades de material endocelular, además de ser un disolvente que puede solubilizar un amplio rango de metabolitos.
3.3 Determinación del contenido de fenoles totales
42
Los resultados se expresaron como mg equivalentes de ácido gálico por 100 g de extracto seco (mg GAE / 100 g ES), utilizando una curva de calibración de ácido gálico.
La investigación de desarrolló en dos etapas:
• Primera. - Preparación de Extracto Hidroalcohólico de la muestra vegetal • Segunda. - Aplicación de las pruebas microbiológicas
3.4 Material vegetal y obtención de los extractos.
Una vez colectadas las plantas, se separaron las hojas con criterio de inclusión y se secaron a 40°c luego se trituraron manualmente, logrando una cantidad de 50g.
3.4.1 Extracto Etéreo.
Pesar 25 g. de droga seca y molida, y extraerlos con 200 ml de éter etílico por maceración durante 48 horas. Se obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y pesar).
3.4.2 Extracto Etanòlico
A la droga agotada con el éter etílico, extraer por maceración con etanol al 75% (tres veces el peso del residuo en volumen), durante 48 horas se obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y pesar)
3.5 PROPUESTA
3.5.1 Pruebas microbiológicas.
Se trabajó con cepa bacteriana de Streptococcus mutans ATCC
43
A partir de las bacterias cultivadas en el agar nutritivo fueron seleccionadas cuatro o cinco colonias de cada una y se diluyeron en solución salina, hasta alcanzar una turbidez igual a la del tubo 0,5, de la escala de MacFarland. Luego, se efectuó una siembra masiva sobre agar Mueller Hinton, se colocaron los sensidiscos con las respectivas diluciones y se procedió a la incubación, a 37°C por 24 horas, para observar la presencia de halos de inhibición. Se trabajó como control positivo Extracto etanolico al 75% y control negativo agua destilada.
3.5.2 Evaluación de la actividad de los extractos.
La actividad antimicrobiana de cada dilución de extracto, se determinó por difusión en disco (método disco-placa-cultivo). En el medio Mueller Hinton sangre, ya solidificado, se hicieron cinco perforaciones de 11mm de diámetro, con un sacabocados y se sellaron con 0,1mL del mismo agar, para evitar la dispersión del extracto.
Las cepas diluidas de la misma forma que en el antibiograma, se sembraron masivamente y, una vez realizado esto, a cada pozo se le adicionó 0,2mL de cada extracto puro y 0,2mL de agua destilada, como control negativo y se incubó a 37°C, por 24 horas.
44 (Ecuación 5)
% 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑜𝑟𝑖𝑜 =𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 × 100
Una vez realizada la prueba in vitro se realiza la medición de los halos de inhibición producidos por el extracto etanólico de Baccharis genistelloides en concentraciones del 75%, 50% y 25%, sobre el cultivo de Streptococcus mutans.
Por cada dilución bacteriana de Streptococcus mutans se utilizaron 3 placas de a agar sangre (Mueller Hinton), las placas se utilizaron como repeticiones para comprobar si los datos obtenidos son confiables y se colocaron en cada placa 4 discos de papel impregnados con los extractos etanólico de Baccharis genistelloides.
Realizando lecturas de halos de inhibición a las 20 horas, se comprobó el nivel de inhibición de la cepa de Streptococcus mutans con el extracto etanólico de Baccharis genistelloides al 4, 5, 15%
Se utilizó la escala de Duraffourd para determinar las escalas de mm de los halos de inhibición, esta escala demuestra si existe sensibilidad de la cepa Streptococcus mutans frente al extracto etanólico.
3.5.3 Concentración
45 3.5.4 Análisis Estadístico
El diseño experimental de esta investigación conlleva observar el efecto del extracto bruto etanólico de B. genistelloides sobre S. mutans en diluciones prestablecidas de 25%, 50%, 75% y 100%. Para realizar el análisis estadístico de los datos, se aplicó ANOVA de una sola vía con ajuste de Bonferroni para establecer la diferencia entre el tratamiento control y las distintas diluciones del extracto. Un análisis de ANOVA de dos vías se aplicó para establecer las diferencias entre tratamientos con un ajuste de prueba de Tukey. La significancia, se reportó con un intervalo de confianza del 95% y significancia estadística menor o igual a 0.05. Para realizar estos cálculos, se empleó los programas estadísticos SPSS 13.0 y Graphpad Prism 7 con software bajo licencia institucional.
3.6 CONCLUSIONES PARCIALES
1. El extracto etanóilico es tan efectivo como el metanólico, por su gran polaridad que permite extraer las mismas sustancias.
2. La técnica de difusión de disco es efectiva ya que permite cuali-cuantificar el comportamiento del S mutans.
3. La medición de los halos de inhibición permite ubicar la sensibilidad del microorganismo.
