III. PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Práctica No. 1
ALGUNAS PROPIEDADES FÍSICAS DE LAS PROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN Fecha:
Las proteínas son macromoléculas complejas compuestas en mayor proporción por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno, y en menor proporción por azufre, fósforo, yodo, hierro, calcio y magnesio. Estas son las macromoléculas biológicas más abundantes y están presentes en todas las células y en todas las partes de las mismas (Branden & Tooze, 2001).
Debido a su heterogeneidad estructural, las proteínas participan en diferentes procesos celulares; muchas son enzimas, otras tienen un papel estructural, otras son fundamentales en la comunicación celular, en la respuesta inmune, en el mantenimiento de la homeostasis y en el ciclo celular (Tortora, Funke & Case, 2007). Según sus funciones biológicas, las proteínas pueden clasificarse en:
- Proteínas estructurales: Forman parte de células y tejidos.
- Proteínas de transporte: Como su nombre lo indica transportan sustancias como el oxígeno en el caso de la hemoglobina.
- Proteínas de defensa: Protegen al organismo contra posibles ataques de agentes extraños. - Proteínas hormonales: Se sintetizan en un tipo particular de células pero su acción la ejercen en otro tipo.
- Proteínas como factores de crecimiento: Su función consiste en estimular la velocidad de crecimiento y la división celular.
- Proteínas catalíticas o enzimas: Permiten aumentar la velocidad de las reacciones metabólicas. - Proteínas contráctiles: Son proteínas capaces de modificar su forma, ya que son las encargadas del movimiento muscular.
Todas las proteínas están construidas a partir del mismo conjunto ubicuo de 20 aminoácidos, unidos de forma covalente por medio de enlaces peptídicos en secuencias lineales características. Cada proteína puede tener cientos de aminoácidos combinados en ciertas proporciones y orden por lo que a partir de esto, surgen una gran variedad de moléculas de proteína cuyas propiedades físicas y químicas están determinadas por el número y clase de aminoácidos presentes (Nelson & Cox, 2009).
desnaturalización, consiste en un descenso de la solubilidad, pues los grupos hidrofóbicos ubicados en el interior de la molécula quedan expuesto al solvente acuoso (Márquez, 1999).
Algunas proteínas desnaturalizadas pueden recuperar su estructura nativa y su actividad biológica, si son devueltas a condiciones en las que la conformación nativa es estable, proceso que se denomina renaturalización (Figura 2) (Branden & Tooze, 2001).
OBJETIVOS
Al finalizar la práctica, el estudiante deberá estar en capacidad de:
Determinar experimentalmente el punto isoeléctrico de la caseína.
Provocar la desnaturalización de la albúmina por medio de los agentes físicos.
Inducir la desnaturalización de la ovoalbúmina y la caseína utilizando diferentes agentes físicos.
Inducir la desnaturalización de la enzima α-amilasa y demostrar su consecuente pérdida de función.
Por medio de la reacción de Biuret demostrar que el proceso de desnaturalización no afecta a la estructura primaria de las proteínas.
MATERIAL Y EQUIPO Gradilla
Marcador para rotular
Mechero Bunsen o estufa eléctrica Pipetas volumétricas de 1, 2 y 5 mL Tubos de ensayo
Beakers Erlenmeyers
REACTIVOS
Sulfato de cobre al 2% Wolframato de sodio al 2%
Caseína al 0.5% en acetato de sodio al 0.4 N Ácido acético 0.04 N
Ácido acético 0.4 N Ácido acético 4 N Ovoalbúmina al 5 %.
Solución de almidón al 1% (p/v): Calentar 80 mL de buffer de fosfatos de sodio y cloruro de sodio, pH 6.8. Al estar en ebullición, agregar 1g de almidón soluble (suspendido en 20 mL del mismo buffer). Mantener en ebullición por un minuto y después enfriar a temperatura ambiente. Mantener en refrigeración.
Solución de α-amilasa al 1% (p/v): Macerar 0.1 g de amilasa en 10 mL del buffer de fosfato y cloruro de sodio, pH 6.8. Centrifugar la suspensión a 3,000 rpm durante 5 minutos y guardar el sobrante.
Solución de α-amilasa diluida: Diluir la solución de α amilasa al 1% (p/v), con el mismo buffer, hasta lograr una dilución 1:10.
Reactivo de Lugol: Mezclar bien 2 g de yoduro de potasio y 1g de yodo, disolver la mezcla en agua destilada, calentando si fuera necesario y completar a 100 mL Diluir antes de usarla, mantener en un lugar oscuro.
Ácido clorhídrico concentrado Hidróxido de sodio 6N
Solución saturada de cloruro de sodio Ácido acético al 1%
IMPORTANTE
Asegúrese de haber leído el manual de toxicidades de los reactivos a utilizarse en esta práctica (estructura, descripción, seguridad, toxicidad, descarte), así como saber cuál es el procedimiento adecuado para el manejo de biológicos y el procedimiento a seguir en casos de emergencia que pudieran surgir durante la práctica con estos reactivos. Para consultas por favor acceda a:
Documentos Electrónicos de consulta:
1. Manual Toxicidades - Depto. Bioquímica - USAC.pdf. Recuperado de: https://drive.google.com/file/d/0B6jPwByhE5KJcEYza1FHNWVYVmM/view 2. Guía de Respuesta en caso de Emergencia. (2017). Recuperado de: https://www.tc.gc.ca/media/documents/tmd-fra/SpanishERGPDF.pdf
PROCEDIMIENTO
1. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA CASEÍNA
Preparar 3 series (A, B y C) de 9 tubos cada una. Numerar cada una de las series de 1 a 9. 1.1 Serie A: Soluciones de caseína
1.1.1 Preparar la primera serie de tubos, siguiendo las indicaciones contenidas en el Cuadro No. 1, colocando primero la solución de caseína al 0.5 % en acetato de sodio 0.4 N, seguidamente el agua y mezclar inmediatamente. Posteriormente añadir a cada tubo la cantidad de ácido acético indicada en el cuadro No. 1 y mezclar rápidamente (SOLO CUANDO ESTÉ MEZCLADA EL AGUA CON LA CASEINA, AGREGAR EL ÁCIDO ACÉTICO). Observar los resultados.
CUADRO No. 1
Serie A: Soluciones de caseína a diferentes pH 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Caseína 0.5 % en acetato de sodio 0.4 N (mL)
1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Agua destilada (mL) 8.38 7.75 8.75 8.50 8.00 7.00 5.00 1.00 8.00 Ácido acético 0.04 N
(mL) 0.62 1.25 -- -- -- -- -- -- --
Ácido acético 0.4 N
(mL) -- -- 0.25 0.50 1.00 2.00 4.00 8.00 --
Ácido acético 4 N (mL) -- -- -- -- -- -- -- -- 1.00
1.2. Serie B: Soluciones de caseína + Sulfato de Cobre
1.2.1 En cada uno de los 9 tubos de esta serie, colocar 0.1 mL de sulfato de cobre al 2%.
1.2.2 Colocar 1.0 mL del tubo No. 1 de la serie A (caseína) al tubo No. 1 de la serie B (sulfato de cobre), y así sucesivamente con cada uno de los tubos de la misma serie. Mezclar bien y notar si existe cambio de color o precipitado.
1.3 Serie C: Soluciones de caseína + Wolframato de Sodio
1.3.1 En cada uno de los 9 tubos de esta serie, colocar 0.1 mL de wolframato de sodio al 2%. 1.3.2 Colocar 1.0 mL del tubo No. 1 de la serie A (caseína) al tubo No. 1 de la serie C (wolframato de sodio), y así sucesivamente con cada uno de los tubos de la misma serie. Mezclar bien y notar si existe cambio de color o precipitado.
1.4 Observación e Interpretación de Resultados
1.4.1 Luego de haber concluido la parte anterior examinar los tubos de las series B y C (caseína con sulfato y caseína con wolframato respectivamente) a los 10 y a los 20 minutos. Anotar sus observaciones. Observar si hay opalescencia o precipitado. Estimar la cantidad de precipitado por cruces, ya sea 0, +, ++, +++, ó ++++.
1.4.2 Calcular el pH teórico de cada tubo. Estimar el pH isoeléctrico de la caseína lo más cercano posible. Informar de acuerdo a los Cuadros No. 2, 3 y 4 (Resultados).
2. DESNATURALIZACIÓN DE LA OVOALBÚMINA
2.1 En un tubo de ensayo, calentar 2 mL de solución de ovoalbúmina de huevo al 5% sobre la llama del mechero (60-70°C).
2.2 Posteriormente añadir de 2 a 3 gotas de ácido acético al 1 %. 2.3 Observar y anotar los cambios.
2.4 Agregar 2 mL de NaOH 6 N y una gota de solución de sulfato de cobre al 0.5%, mezclar bien y agregar más sulfato de cobre gota a gota hasta distinguir un color rosado o violeta (reacción de Biuret positiva).
2.5 Anotar resultados.
3. DESNATURALIZACIÓN DE LA CASEÍNA
1.1 Numerar una serie de cuatro tubos con 2 mL de disolución de caseína. 1.2 Añadir al tubo número 1, dos mL de HCl concentrado
1.3 Añadir al tubo número 2, dos mL de disolución saturada de NaCl 1.4 Añadir al tubo número 3, dos mL de NaOH 6 N
1.5 Calentar suavemente el tubo número 4 hasta llegar a una temperatura de 80 °C, NO AÑADIR NADA.
1.6 Observar y anotar los cambios.
1.7 A cada tubo agregar 2 mL de NaOH 6 N y una gota de solución de sulfato de cobre al 0.5%, mezclar bien y agregar más sulfato de cobre gota a gota hasta distinguir un color rosado o violeta (reacción de Biuret positiva).
4. DESNATURALIZACIÓN DE LA α-AMILASA
1.1 Demostración de la función de la α-Amilasa mediante la hidrólisis del almidón. 1.1.1 Colocar 6 mL de la solución de almidón al 1 % en un erlenmeyer de 125 ml.
1.1.2 Agregar 1 mL de la solución de amilasa diluida, mezclar, inmediatamente después tomar 1 mL de la mezcla, colocando en un tubo de ensayo marcado como tiempo 0.
1.1.3 Introducir inmediatamente el tubo en un baño de agua hirviente y mantenerlo allí por dos minutos. Al cabo de ese tiempo, sacar el tubo y dejarlo enfriar.
1.1.4 5 min. después de haber agregado la amilasa, mezclar nuevamente y sacar otra alícuota de 1 mL colocándola en otro tubo de ensayo, marcar como tiempo 5. Repetir con este tubo el procedimiento indicado en el paso 3.
1.1.5 Obtener otra alícuota a los 20 minutos, en la misma forma indicada anteriormente. 1.1.6 Agregar a todos los tubos 0.1 mL de reactivo de lugol diluido.
1.1.7 Observar los cambios y anotar los resultados.
1.2 Desnaturalización de la α-amilasa: demostración de la pérdida de función biológica 1.2.1 Colocar 6 mL de la solución de almidón al 1% en un erlenmeyer de 125 mL.
1.2.2 Agregar a 1 mL de la solución de amilasa diluida 10 gotas de HCl concentrado, agitar y dejar reaccionar por 5 min.
1.2.3 Agregar la solución obtenida en el paso anterior al erlenmeyer con la solución de almidón del paso 4.2.1, mezclar e inmediatamente después tomar 1 mL de la mezcla, colocando en un tubo de ensayo marcado como tiempo 0.
1.2.4 Introducir inmediatamente el tubo en un baño de agua hirviente y mantenerlo allí por dos minutos. Al cabo de ese tiempo, sacar el tubo y dejarlo enfriar.
1.2.5 A los 5 minutos después de haber agregado la amilasa, mezclar nuevamente y sacar otra alícuota de 1 mL colocándola en otro tubo de ensayo, marcar como tiempo 5. Repetir con este tubo el procedimiento indicado en el paso 4.2.4.
1.2.6 Obtener otra alícuota a los 20 minutos, en la misma forma indicada anteriormente. 1.2.7 Agregar a todos los tubos 0.1 mL de reactivo de lugol diluido.
1.2.8 Observar los cambios y anotar los resultados. REFERENCIAS
Branden, C., & Tooze, J. (1998) Introduction to protein structure (2nd ed) New York: Garland Publishing.
Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2008). Lehninger´s Principles of Biochemistry. (5th ed). USA: W.H. Freeman & Co.
Schulz, G. & Schirmer, R. (1988). Principles of Protein Structure. New York: Springr-Verlag. Stryer, L. et al. (2003). Bioquímica. Barcelona: Editorial Reverté, S.A.
DIAGRAMA DE FLUJO
RESULTADOS
Cuadro 2. Precipitado estimado, serie 1 (Caseína + acetato + ác. Acético)
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 min
10 min
20 min
pH
calculado
Cuadro 3. Precipitado estimado, serie 2 (Sulfato de cobre + caseína + acetato + ác. acético)
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 min
10 min
20 min
pH
calculado
Cuadro 4. Precipitado estimado, serie 3 (Wolframato de sodio + caseína + acetato + ác.
acético)
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 min
10 min
20 min
pH
calculado
Desnaturalización de ovoalbúmina
Tratamiento de la muestra Observaciones
Calentamiento a 70°C
Ácido acético al 1%
RESULTADOS
Desnaturalización de la caseína
Tubo Observaciones al agregar el tratamiento Prueba de Biuret
(positiva o negativa)
1
2
3
4
Efecto de la desnaturalización de la amilasa
Tubo
Amilasa + almidón (Lugol positivo o
negativo)
Amilasa + HCl + almidón (Lugol positivo o
negativo)
0 min
10 min
CUESTIONARIO
1. ¿Cómo se define el punto isoeléctrico de una proteína?
2. ¿Cuáles son las fuerzas que mantienen unidas las diferentes estructuras de las proteínas?
3. ¿Qué cambios ocurren en la molécula de proteína durante el proceso de desnaturalización?
4. ¿Por qué razón es necesario bufferizar la solución de caseína?
6. ¿Cuál es el efecto del sulfato de cobre y el wolframato de sodio?
7. ¿Cuál es la razón de agregar ácido acético?
8. ¿Cuál es el principio de la reacción de Biuret y su interpretación?
9. ¿Cuál es el principio del Test de yodo (para polisacáridos) y su interpretación?
