INSTITUTO DE NEUROETOLOGÍA
DOCTORADO EN NEUROETOLOGÍA
Efecto de la aplicación sistémica de haloperidol y lesión
electrolítica del estriado ventrolateral sobre la actividad de las
neuronas del cerebelo
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORA EN NEUROETOLOGÍA
PRESENTA:
MTRA. EN PSIC. GRECIA HERRERA MEZA
Directora: Dra. Marta Miquel Salgado-Araujo Codirector: Dr. Luis Isauro García Hernández
Xalapa-Enríquez, Ver. Enero 2014
Agradecimientos
A mi directora de tesis, Dra. Marta Miquel salgado-Araujo y mi codirector, Dr. Luis Isauro Hernández García, por su apoyo y confianza en la toma de decisiones.
Al comité evaluador, Dra. Ma. Rebeca Toledo Cárdenas, Dr. Jorge Manzo Denes, Dr. Genaro Coria Dávila y Dr. Juan Fco. Rodríguez Landa.
Al Dr. Juan Fco. Rodríguez Landa y Dra. Leonor López Meráz por las aportaciones a esta investigación y sobretodo a Armando por el total apoyo en mi formación
profesional y personal.
A todos quienes me apoyaron y acompañaron a lo largo del doctorado, gracias por enseñarme lo que sé, y a quienes continúan en amistad.
Dedicatoria
A Valeria y Silvana,
por haber completado mi vida y enseñarme que todo mañana es hoy.
A mi madre,
por su total respaldo y su siempre amor, pues soy sólo lo que sembró.
A mi padre,
Por mostrarme la nobleza del trabajo.
A mis hermanos,
Resumen
La presente tesis se enmarca en una línea de investigación sobre la implicación del cerebelo ante alteraciones de los ganglios basales. La propuesta de una relación anatómica y funcional entre los ganglios basales y el cerebelo es reciente, tradicionalmente habían sido conceptualizadas como dos estructuras que trabajaban por separado para organizar y controlar los movimientos dirigidos hacia un objetivo. Sin embargo estudios en roedores y primates has descrito interacciones anatómicas y funcionales entre las redes cortico-basales y cortico-cerebelares, que no solo se restringen funciones motora sino cognitivas.
Concretamente en este trabajo se estudian dos manipulaciones estriatales, una farmacológica y otra anatómica, con el fin de afectar la función en estriado de los ganglios basales.
En relación con la alteración farmacológica estriatal, se exploró cómo el tratamiento crónico (IP) de haloperidol modifica la actividad cerebelar en la rata. Para ello, en el primer experimento se replicó un modelo de parkinsonismo de temblor mandibular (Salamone et al.,1998) inducido por un tratamiento subcrónico con administración sistémica de haloperidol, neuroléptico de selectividad alta como antagonista dopaminérgico del receptor D2. En el cerebelo se analizó el patrón de expresión de c-Fos en las células granulares y de Purkinje del vermis y del hemisferio derecho, así
como en los tres núcleos profundos. Se encontró una regionalización funcional que
distingue entre vermis y hemisferios cerebelares con un patrón de expresión de c-Fos opuesto, menor en el vermis y mayor en los lóbulos SIM b y crus II de los
hemisferios. Interpretamos los resultados como una hipoactivación del vermis e
hiperactivación de los hemisferios y el núcleo dentado derivadas de la manipulación dopaminérgica. El patrón de hiperactividad descrito coincide con el observado en pacientes con la enfermedad de Parkinson.
En relación con la alteración anatómica, se exploró sí la lesión electrolítica en región ventrolateral del estriado genera temblores mandibulares, y si así fuera, cuáles serían sus características conductuales y electromiográficas. Para describir electromiográficamente el temblor mandibular generado por la lesión electrolítica bilateral del EVL y compararlo con el inducido por el tratamiento subcrónico (IP) con haloperidol, se les registró a ratas con manipulación experimental y control la actividad electromiografía del músculo temporal en condiciones basales y durante los temblores mandibulares. Se encontró que la zona ventrolateral del estriado, principal entrada de la red dopaminérgicas proveniente de la SNc, es la región que, por efecto de la lesión electrolítica, induce temblores mandibulares. Además que, la amplitud de la actividad muscular en condiciones basales varía entre los distintos grupos y que los TMs asociados a la lesión electrolítica del EVL son de mayor amplitud y frecuencia a los generados por haloperidol. Atribuimos que esta variación puede estar relacionada con el tipo de afectación estriatal.
Lista de abreviaturas
6-OHDA= 6-hidroxi-Dopamina
3-NP= ácido 3-Nitropropionico
ACh= Acetilcolina
APF= amperometría de potencial fijo
AMS=área motora suplementaria
AMS=área motora pre-suplementaria
CM1=corteza motora primaria
ATV= Área tegmental ventral,
CPfm= corteza prefrontal
Crus II= lóbulo ansiforme 2 D1=receptores a dopamina D1
D2=receptores a dopamina D2
DA= Dopamina
EMG= Electromiografía
EP= Enfermedad de Parkinson EVL= Estriado ventrolateral
GPe= Globo Pálido externo Gpi= Globo Pálido interno
H=Haloperidol HZ= Hertz
MPTP=1-metil-4-fenil- 1,2,3,6 tetrahidropiridina
mV=mili volts
ND= Núcleo dentado
NF= núcleo facial
NP= núcleos pontinos
NRpc= Núcleo rojo parvocelular
NST=Núcleo subtalámico
NT=núcleo del trigémino
Sim b =lóbulo simple b
SNc= Sustancia Negra compacta
SNr= Sustancia Negra reticulada
ÍNDICE GENERAL
CAPITULO I
Antecedentes………... 12
CAPÍTULO II
Artículo: c-Fos expression in the cerebellum in response to subchronic
dopaminergic alterations………...…….…………. 38
CAPÍTULO III
Artículo: Inducción del temblor mandibular por lesión electrolítica del estriado
ventrolateral y por el tratamiento subcrónico con haloperidol en rata
macho: un contraste electromiográfico... 73
CAPITULO IV
Lista de pie de figuras
Capitulo II
Figura 1. Valores promedio (±EE) del número de células IR-Fos en la capa granular-región apical- en los lóbulos I, II, IV, V del vermis cerebelar en ratas control y tratadas con haloperidol. La cuantificación celular se realizó en un área
de 20,000 µm2………62
Figura 2. Valores promedio (± EE) del número de células IR-Fos en la capa granular-región apical- de los lóbulos Sim b (VIb) y Crus II (VIII), del hemisferio derecho del cerebelo en ratas tratadas con haloperidol y el grupo control. La
cuantificación celular consideró un área de 20,000µm2..………62
Figura 3. Valores promedio (±EE) del número de células IR-Fos en la capa de purkinje -región apical-en los lóbulos I, III, IV y V del vermis cerebelar en ratas control y tratadas con haloperidol. La cuantificación celular consideró un área de
40,000 µm2. ………63
Figura 4. Valores promedio (±EE) del número de células IR-Fos en la capa de purkinje -región apical-en los lóbulos Sim b (VIb) y Crus II (VIII) del hemisferio derecho del cerebelo en ratas tratadas con haloperidol y el grupo control. La
cuantificación celular consideró un área de 40,000 µm2. ………..64
Figura 5. Valores promedio (± EE) del número de células IR-Fos en los núcleos profundos Fastigiado, Interpósito y Dentado- del cerebelo en ratas que fueron tratadas con haloperidol y el grupo control. El área de conteo de células fue en
40,000 µm2. ………65
Capitulo IIl
músculo temporal en un grupo de ratas control (C), con haloperidol (H), con lesión
electrolítica en el EVL (L). ………..93
Figura 2. Valor promedio (± EE) de la amplitud (mV) de la actividad EMG del músculo temporal en estado basal en ratas control, con haloperidol y con lesión
electrolítica en el EVL. ………93
Figura 3. A) Frecuencia (ráfagas/seg) de la actividad EMG del músculo temporal durante el temblor mandibular en ratas con haloperidol (H) y con lesión electrolítica del EVL (L). B) Amplitud (mV) de la actividad EMG del músculo temporal durante el temblor mandibular en ratas con haloperidol y con lesión electrolítica en el EVL. C) Trazos de actividad EMG de un segundo, obtenidos durante los movimientos mandibulares en un grupo de ratas tratadas con haloperidol (H) y con lesión del
EVL (L). Calibración horizontal: 200 ms. Calibración vertical: 1 mV. ………..94
Figura 4. Valor promedio (± EE) de la amplitud (mV) y frecuencia (ráfagas/seg) de la actividad EMG del músculo temporal durante el temblor mandibular en ratas con
haloperidol y con lesión electrolítica en el EVL..……….95
Capitulo IV
Figura 1. Neurocircuito afectado tras el antagonismo dopaminérgico con un tratamiento IP subcrónico de haloperidol. GPe=Globo Pálido externo, Gpi= Globo Pálido interno, NST=Núcleo subtalámico, SNr=Sustancia Negra reticulada, SNc=Sustancia Negra compacta, Tálamo NVM/NVL= tálamo ventromedial/ ventrolateral ATV= Área Tegmental Ventral, NP= núcleos pontinos, ND = Núcleo Dentado, D2= receptores a dopamina D2, D1= receptores a dopamina D1.………..107
Figura 2. Aproximación hipotética del neurocircuito implicado en la generación de temblores mandibulares. El circuito (Gpi-zona incerta/field forel-núcleo rojo) describe una proyección del GPi a áreas de control motor que no dependen del tálamo y en la que la actividad de los ganglios basales y del cerebelo puede
CAPITULO I
ANTECEDENTES
Índice
1. Sistema motor, ganglios basales y cerebelo……….…...12
1.1 Visión separada de los ganglios basales y el cerebelo………12
1.2 Función motora de los ganglios basales y el cerebelo………....14
1.3 Relación anatómica y funcional………...14
2. Dopamina en el cerebelo ……….………...15
3. Estudios sobre la contribución funciona de los ganglios basales y el cerebelo ………..17
4. Modelos de manipulación dopaminérgica estriatal para el estudio de la EP………20
6. Temblor mandibular en rata: un modelo de parkinsonismo………...22
7. Esquema de la tesis ……….23
8. Contribuciones ………..25
1. Sistema motor: ganglios basales y cerebelo
Los sistemas motores planifican, coordinan y ejecutan el movimiento voluntario en
función a las representaciones internas que el cerebro hace de la información
proveniente de los sistemas sensitivos. Las conductas motoras voluntarias y su
intencionalidad están direccionadas por las acciones de los diversos sistemas
motores organizados y controlados jerárquicamente desde las cortezas cerebrales
implicadas (Purves, 2004). Las áreas motoras corticales son reguladas por las
aferencias sensitivas periféricas, las áreas de asociación prefrontales y por los
ganglios basales y el cerebelo (Carlson, 2005). Ambos sistemas eran
considerados como módulos independientes de la corteza conectados con la
áreas motoras y asociativas corticales a través circuitos funcionales que a
participan en la planificación y ejecución de los movimientos voluntarios.
1.1 Visión separada de los ganglios basales y el cerebelo
Si bien se conocía la partición de los ganglios basales en el control del movimiento
debido a las deficiencias motoras evidentes asociadas al daño motor, los aspectos
precisos de control motor en condiciones normales no ha sido aún del todo clara.
Tradicionalmente, se hipotetizaba que los ganglios basales estaban implicados en
la selección y la inhibición de comandos de acción (Alexander y Crutcher, 1990)
mientras que el cerebelo estaba involucrado en la regulación fina en tiempo real
de movimiento (Ito,1984). Por lo que los ganglios basales como el cerebelo se
conceptualizaban como estructuras que trabajaban por separado para organizar y
ejecutar movimientos dirigidos a un objetivo. Sin embargo, estas diferencias no
Un numero considerable de estudios apoyados en técnicas imagenológicas han
mostrado que los ganglios basales y el cerebelo están involucrados en tareas no
solo motoras sino cognitivas, tales como las imágenes mentales (Parsons et al.,
1995; Lotze et al., 1999), el procesamiento sensorial (Gao et al., 1996; Parsons, et
al., 2000), la planificación (Kim et al., 1994; Dagher et al., 1999) , la atención
(Allen et al., 1997) y el lenguaje (Leiner et al., 1993).
Al respecto, estudios anatómicos con el uso de marcadores
transneuronales (Hoover y Strick,1999; Middleton y Strick, 2000) mostraron que
los ganglios basales y el cerebelo tienen conexiones recurrentes con la corteza
cerebral a través del tálamo, formando múltiples canales “paralelos”. Además que
las eferencias a áreas corticales no se restringían a las cortezas motora y
premotora, sino también se dirigían a las cortezas prefrontal (Middleton y Strick,
1994), temporal (Middleton y Strick, 1996) y parietal (Middleton y Strick,1998) por
lo que estas evidencias correlacionan con la participación de ambas estructuras en
diversas funciones (Doya, 2000).
Debido a la participación de los ganglios basales y el cerebelo en funciones
cognitivas se sugirió una especialización de funciones en el cerebelo, los ganglios
basales y la corteza cerebral para diferentes tipos de aprendizaje. Esta idea de
especialización, orientada al aprendizaje, permitió la comprensión de las funciones
complementarias de los ganglios basales y el cerebelo en el control motor y en
1.2 Función motora de los ganglios basales y el cerebelo
En relación con la planificación y ejecución del movimiento, se concebía que los
ganglios basales y el cerebelo formaban circuitos de retroalimentación con
diferentes áreas de la corteza través de áreas separadas del tálamo, esto con el
fin de regular las áreas motoras corticales y del tronco encefálico. Asimismo que,
las aferencias provenientes de la corteza eran independientes (Delgado-García,
2001). Sin embargo, estudios como los de Percheron et al. (1996) proponían que
las interacciones importantes entre estos circuitos ocurrían en gran medida a nivel
cortical.
1.3 Relación anatómica y funcional
Actualmente la propuesta de una relación anatómica y funcional entre las redes
cortico-basales y cortico-cerebelares con interacciones no solo a nivel cortical está
actualizándose. Estudios en primates y roedores aportan información contundente
sobre la relación anátomo-funcional entre los ganglios basales y el cerebelo.
Estudios como los de Bostan et al. (2010a) con el uso de trazadores
transneuronales en monos muestran la conexión anatómica entre ambas
estructuras, específicamente una conexión disináptica entre el núcleo dentado
(ND) en el cerebelo y el estriado, con una implicación funcional del cerebelo sobre
los ganglios basales (Hoshi et al., 2005). Así mismo, un segundo estudio en
monos (Bostan et al., 2010b) mostró que el núcleo subtalámico (NST) de los
funcional y está topográficamente organizada (Bostan et al., 2010b). Además que,
el funcionamiento del NST puede tener un impacto en la función motora y no
motora del cerebelo (Bostan et al., 2010b).
La implicación del cerebelo en el control e integración de procesos motrices
(Ito, 1984), así como en funciones cognitivas (Schmahmann, 1991; Kim et al.,
1994; Ryding et al.,1993) en las que al parecer están involucrados a los
hemisferios y el núcleo dentado (Schmahmann, 1991; Kim et al., 1994), hace que
las interrupciones en el enlace de circuitos del cerebelo con el tálamo y la corteza
pre-frontal generen una serie de anormalidades en la cognición, afectando la
planeación, la fluidez verbal, el pensamiento abstracto y la memoria funcional
(Andreasen et al., 1996).
4. Dopamina en el cerebelo
Aunada a la propuesta de una relación anatómica entre los ganglios basales y el
cerebelo con implicaciones funcionales se cuenta con una serie de investigaciones
relacionadas con la presencia de dopamina en el cerebelo. Si bien, la presencia de
la DA en el cerebelo había sido considerada exclusivamente como un precursor
para la noradrenalina. Actualmente, estudios bioquímicos han demostrado la
liberación de DA y sus enlaces (Panagopoulos et al., 1991) y la presencia de los
receptores de DA (Díaz et al., 1995; Khan et al., 1998) en el cerebelo de los
roedores (Hurley et al., 2003). Un estudio en monos (Pilf et al., 1991) utilizando un
mostró una reducción en la concentración de dopamina en el caudado-putamen,
sustancia negra y en áreas extracorticales como el cerebelo. Asimismo, en
diversas Investigaciones, a través de radioligandos e inmunoreactividad, se han
identificado diferentes subtipos de receptores a dopamina en la corteza cerebelar
de roedores (Panagopoulos et al., 1993; Díaz et al., 1995; Barili et al., 2000),
primates y humanos (receptores D1, D2, y D3) (Khan et al.; 1998; Hurley et al.,
2003) .
Estudios en rata (Panagopoulos et al., 1991; Glaser et al., 2006) apoyan la
presencia de un sistema dopaminérgico en el cerebelo de la rata al mostrar una
inervación de fibras dopaminérgicas tanto en los núcleos profundos como en las
capas del cerebelo, con una mayor inervación en la capa granular. Por otra parte,
un estudio en ratones (Rogers et al., 2011) con el uso amperometría de potencial
fijo (APF), ha mostrado que la estimulación en el núcleo dentado (ND) es capaz de
evocar la liberación de dopamina en la corteza pre-frontal media y que la
dopamina de la corteza pre-frontal media es dependiente de las células de
Purkinje en el cerebelo (Rogers et al., 2011). Así, estudios sugieren que la
dopamina, mediada por regiones como la corteza pre-frontal, regula funciones
motrices y cognitivas tanto en estructuras corticales y subcorticales
(Goldman-Rakic, 1999). Por tanto, la propuesta que éstas dos redes sub-corticales
(cortico-basal y cortico-cerebelar) están conectadas y forman una macrored funcional
A pesar de la creciente evidencia sobre la implicación anatómica y funcional
de los ganglios basales y el cerebelo, aun falta por investigar cómo es su
interacción y la contribución de éstas ante una alteración.
5. Estudios sobre la contribución funciona de los ganglios basales y el cerebelo.
Una relación anatomo-funcional entre estructuras puede verse de manera clara en
condiciones de alteración. Concretamente la alteración en los ganglios basales o
en el cerebelo que tienen efectos clínicos importantes, tales como las
enfermedades neurodegenerativas en los ganglios basales (enfermedad de
Parkinson o la corea de Huntington), que ocasionan movimientos involuntarios,
alteraciones de la postura, en procesamiento cognitivo, entre otros. O bien,
alteración del cerebelo por procesos degenerativos hereditarios o por lesiones
vasculares que producen ataxia cerebelosa, pérdida característica de la
coordinación y precisión del movimiento de las extremidades (Carlson, 2005), por
citar algunas.
Al respecto, se han sugerido que las alteraciones en la actividad del
cerebelo pueden contribuir a los síntomas motores tanto en la enfermedad de
Parkinson y como en la distonía (Breakfield et al., 2008; Payoux et al., 2004). Así
como también que, la estimulación cerebral del NST mejora los signos motores en
la EP y se normaliza consecuentemente la activación del cerebelo (Payoux et al.,
reposo característico de la EP se suprime mediante la estimulación o la lesión del
núcleo ventral intermedio del tálamo, uno de los sitios de eferencias del cerebelo
(Benabid et al., 1994).
Datos como los anteriores apoyan la idea de un sistema integrado entre los
GB y el cerebelo a través de diferentes vías de comunicación. Estos
planteamientos tienen sustento en estudios de neuroimagen (Rascol et al., 1997;
Yu et al., 2007) que muestran un patrón de hiperactividad en el cerebelo de
pacientes con EP durante las tareas motoras y sustentan que dicha
sobreactivación cerebelar tiene una función compensatoria ante la falla del circuito
de los ganglios basales (Cerasa et al., 2006).
Los datos de hiperactivación cerebelar observados en pacientes con la EP
(Rascol et al., 1997; Yu et al., 2007) y estudios neuroanatómicos en primates
(Hoshi et al., 2005) y ratas (Ichinohe et al., 2000) han generado propuestas sobre
los posibles sitios en los que este mecanismo se lleve a cabo: a) a nivel de la
corteza cerebral en el AMS, pre-AMS y CM1, sitios a donde el núcleo dentado del
cerebelo y el GPi de los ganglios basales se dirigen (Hoover y Strick, 1999; Akkal
et al., 2007), b) por una conexión del cerebelo, concretamente del núcleo dentado,
hacia los ganglios basales (estriado y GPe) mediada por el tálamo (Hoshi et al.,
2005). Lo cual supone un sistema estructurado para la comunicación entre estas
dos zonas cerebrales que interviene no sólo el movimiento, sino también en la
Asimismo, el planteamiento de una conexión dopaminérgica desde el ATV a
la corteza cerebelar de primates y roedores, distribuidos principalmente en los
lóbulos Crus I y Crus ll (Ikai et al., 1992) y la presencia de elementos neuronales
indicativos de una neurotransmisión dopaminérgicas en el cerebelo (Melchitzky y
Lewis, 2000), sustentan la propuesta de una relación anatómica y funcional entre
las redes córtico-basales y córtico-cerebelares con implicaciones dopaminérgicas.
Si bien no se ha descrito una proyección dopaminérgica en el cerebelo
desde la SNc (primera vía dopaminérgica degenerada en la EP). La hipótesis de la
implicación dopaminérgica en el cerebelo está basada en el patrón de
hiperactivación cerebelar observado en pacientes con la EP sin tratamiento y bajo
medicación con L-DOPA, durante la ejecución de movimientos automáticos
(Rascol et al., 1997; Rowe et al., 2008), dan cuenta de la implicación
dopaminérgica en el cerebelo.
Al respecto, investigaciones con modelos de parkinsonismo en animales
están explorando la relación entre la alteración dopaminérgica estriatal y la
función cerebelar. Recientemente un estudio en primates no humanos con MPTP
para inducir degeneración nigroestriatal (Heman et al., 2012) mostró correlación
entre la activación persistente de las neuronas de Purkinje con la perdida
dopaminérgica. Así pues, demostrar que la pérdida de neuronas dopaminérgicas
puede tener un efecto sobre la actividad de las neuronas del cerebelo tiene
implicaciones en la conceptualización de patologías relacionadas con alguna de
la esquizofrenia e incluso las adicciones en las que se ven involucrados los
circuitos cortico-estriatales y cortico-cerebelares.
A pesar de la serie de investigaciones que a la fecha se han desarrollado,
aun no quedan del todo claro cómo es la participación del cerebelo ante
alteraciones en los ganglios basales, ni cuáles son las alteraciones adicionales en
el cerebro ante la manipulación de circuitos implicados en el parkinsonismo.
La reducción de la transmisión dopaminérgica en dos regiones de los
ganglios basales, la sustancia negra y el cuerpo estriado, originan la mayoría de
las formas de parkinsonismo en humanos) que se caracterizan por una
combinación síntomas tales como temblor, rigidez, bradicinesia, pérdida de
reflejos posturales, postura flexionada y bloqueos motores (Hardman y Limbrid,
2003). Al respecto, la manipulación dopaminérgica, bajo ciertas condiciones,
permiten comprender los efectos motores de inicio temprano, tales como el
temblor y ayudan a aclarar los mecanismos implicados en los ganglios basales y
otras estructuras al inducir síntomas parkinsonianos (Ishiwari et al., 2004).
6. Modelos de manipulación dopaminérgica estriatal para el estudio de la EP
Diversos modelos de manipulación dopaminérgica en rata permiten una
aproximación a la alteraciones en los ganglios basales, tales como el
parkinsonismo en humanos. Los modelos por neurotoxicidad a través de agentes
químicos neurotóxicos específicos para las neuronas DA y catecolaminérgicas
como el inducido por 6-hidroxi-Dopamina (6-OHDA) (Jeon,1995) o bien por MPTP
et al., 1994; Sthepans et al., 1998) el ácido 3-Nitropropionico (3-NP), el ácido
malónico (MA) y la retonona (González, 2005). En tanto que el modelo de Sauer:
usa la degeneración retrógrada de la vía nigroestriatal como un modelo de
denervación aguda y neurodegeneración progresiva y gradual, que semeja la EP
(Cadet y Lohr 1989; Sauer y Oertel, 1994).
Cabe mencionar que los modelos basados en el uso de antagonistas de DA
presentan ventajas frente a las neurotoxinas, por la reversibilidad del daño en el
animal. Estos modelos tienen la posibilidad de la administración de antipsicóticos
de eficiencia clínica para intervenir con la función transmisora de la dopamina y
producir efectos neurológicos motores. Tal es el caso de el uso de butirofenonas y
sus congéneres, como el haloperidol y pimozida, con afinidad selectiva a recetores
de dopamina D2 (Bahena-Trujillo, 2000).
El haloperidol es considerado uno de los prototipos para fármacos tipo
neuroléptico estándar que tienen perfiles similares en términos de sus efectos
motores a los observados en los enfermos con la EP (Freedman et al., 1994;
Sultana y McMonagle, 2000) tales como acinesia, bradicinesia, rigidez, temblor,
alteraciones en la marcha y postura anormal (Campos-Romo, 2008; Hardman y
Limbrid, 2003). Su administración oral o intraperitoneal (IP) estimula movimientos
mandibulares (Glenthoj y Hemmingsen, 1989; Rupniak et al., 1985; Trevitt et al.,
1998; Wisniecki et al., 2003) que correlacionan con el temblor en el parkinsonismo.
Al respecto, el modelo de parkinsonismo de temblor mandibular (TM) propuesto
por Salamone et al. (1998) es un modelo que cumple con los criterios de
bajo los planteamientos anteriores.
7. Temblor mandibular en rata: un modelo de parkinsonismo
El modelo de parkinsonismo (Salamone et al., 1998) induce en la rata un temblor
mandibular rápido y no dirigido a algún estimulo en particular, que se genera en
repetitivas oscilaciones verticales de la mandíbula (Salomone et al., 1986, 1998,
1990) en una escala de frecuencia entre 3-7 Hz (Ishiwari, 2004; Finn et al., 1995;
Salamone y Baskin, 1996; Collins–Praino et al., 2011). Las características
neuroquímicas, anatómicas y electromiográficas del temblor mandibular se
homologan con lo registrado en el temblor de pacientes parkinsonianos (Salamone
et al., 1998; Cousins et al., 1998; Cenci et al., 2002).
La inducción de los temblores mandibulares (TMs) en rata está asociada con
alteraciones en los mecanismos estriatales (Mayorga et al., 1997; Salamone et al.,
1990a). La mayoría de TMs son inducidos por una alteración en la
neurotransmisión dopaminérgica estriatal, que puede ser ocasionada por
antagonismo dopaminérgico (Salamone y Baskin, 1996; Ishiwari et al., 2005;
Collins-Praino et al., 2011) o por el efecto de la depleción de dopamina en el
estriado ventrolateral (EVL) con 6-OHDA (Jicha y Salamone, 1991; Finn et al.,
1997). Si bien se sabe que la región ventrolateral del estriado7es una área que
recibe proyecciones dopaminérgicas provenientes de la Sustancia Negra
compacta (Berke y Hyman, 2000; Hyman y Malenka, 2001), aun no queda claro
cómo la DA en subregiones estriatales específicas está envuelta en diferentes
los mecanismos que desencadenan el temblor en el parkinsonismo.
Nuestro estudio explora la alteración adicional de la actividad cerebelar ante
la manipulación dopaminérgica de circuitos implicados en el parkinsonismo. Para
ello, nos apoyamos en el modelo de temblor mandibular (Salamone, et al., 1998)
inducido por antagonismo dopaminérgico sistémico con haloperidol para emular
caracteristicas de temblor en el parkinsonismo. Posteriormente, explora los efectos
de lesionar la región ventrolateral del estriado, principal entrada dopaminérgica
proveniente de la SNc, en la inducción de temblores mandibulares. Da a conocer
además las características electromigráficas de los TMs inducido por ambas
condiciones.
8. Esquema de la tesis
La idea de un sistema integrado entre los ganglios basales y el cerebelo,
implicados no sólo en el movimiento, sino también en la cognición y el afecto
(Bostan et al., 2010b), permite plantear que, bajo determinadas condiciones estas
dos estructuras pueden actuar como una red funcional. Bajo estos supuestos, es
que esta tesis se enmarca en una línea de investigación sobre la implicación del
cerebelo en situaciones de alteración de los ganglios basales.
En la siguiente tesis se experimenta con tipos de alteración estriatal, una
farmacológica y otra anatómica. En el capitulo II se muestra el primer experimento
que se apoyó en un modelo de parkinsonismo de temblor mandibular (Salamone
del receptor D2, en la actividad de las neuronas cerebelares. Para ello se comparó
el número de células inmunoreactivas a Fos, en la capa granular, de Purkinje y en
los núcleos profundos del cerebelo, en un grupo de ratas tratadas con haloperidol
IP durante 14 días que presentaron temblor mandibular por efecto del tratamiento,
otro grupo de ratas tratadas con y un grupo control salino. Esta aproximación
permitió identificar los efectos del antagonismo dopaminérgico sistémico en la
inmureactividad a Fos de células cerebelares.
En el capitulo III, se describe el segundo experimento que implicó la
afectación anatómica del estriado mediante la lesión electrolítica bilateral en la
región ventrolateral del mismo. Dicha zona está involucrada en el control motor
oral y de extremidades (Kelley et al., 1989; Salamone et al., 1990a) y en la
generación de los TMs. Si bien hipotetizamos que la lesión en el estriado
ventrolateral generaría temblores mandibulares, se desconocían las
características electromiográficas de éstos, así que se caracterizó el TM inducido
por lesión electrolítica y se comparó electromiográficamente con el derivado del
tratamiento subcrónico con haloperidol.
Para ello a un grupo de ratas tratadas con haloperidol durante 14 días por
vía IP, otro grupo administrado con solución salina por el mismo periodo de tiempo
y vía y a un tercer grupo con lesión electrolítica bilateral en el EVL les fue
implantado electrodos bipolares en el músculo temporal derecho con el fin de
Un análisis posterior con inmunoreactividad a Fos en células cerebelares en
los animales con lesión electrolítica bilateral de EVL mostrará si la afectación
específica en esta región del estriado tiene implicaciones en actividad de la
neuronas cerebelares.
9. Contribuciones
En lo inmediato, los resultados derivados de la presente tesis aportan información
sobre la expresión de c-Fos en el cerebelo en respuesta a una alteración
dopaminérgica sistémica con un tratamiento subcrónico de haloperidol.
Muestran las características EMG y conductuales que tiene los temblores
generados por la lesión electrolítica en el estriado ventrolateral en comparación
con los temblores inducidos por antagonismo dopaminérgico.
En lo general, contribuye a la información sobre causas de hiperactivación
cerebelar en pacientes con la Enfermedad de Parkinson. Puede apoyar a la
comprensión de otras patologías córtico-basales como la adicción. O bien a
entender la participación del cerebelo en condiciones de alteración dopaminérgica,
Referencias
Akkal D, Dum RP, Strick PL. Supplementary motor area and presupplementary
motor area. targets of basal ganglia and cerebellar output. J. Neurosci. 2007;
40:10659-10673.
Alexander GE, Crutcher MD.Functional architecture of basal ganglia circuits:
neural substrates of parallel processing. Trends Neurosci.1990;13:266-271.
Allen G, Buxton RB, Wong EC, Courchesne E. Attentional activation of the
cerebellum independent of motor involvement. Science. 1997; 275:1940-1943.
Andreasen, NC, O’Leary DS, Cizadlo T, Arndt S, Rezai K, Ponto LL. Schizophrenia
and cognitive dysmetria: A positron-emission tomography study of dysfunctional
prefrontal-thalamic-cerebellar circuitry. Sciences. 1996;93(18), 9985–9990.
Bahena-Trujillo R, Flores G, Arias-Montaño JA. Dopamina: síntesis, liberación y
receptores en el Sistema Nervioso Central. Rev Biold. 2000;11:39-60.
Barili P, Bronzetti E, Ricci A, Zaccheo D, Amenta F., Microana-tomical localization
of dopamine receptor protein immunoreactivity in the rat cerebellar cortex. Brain
Benabid AL, Pollak P, Gross C, Hoffmann D, Benazzouz A, Gao DM, Laurent A,
Gentil M and Perret J. Acute and long-term effects of subthalamic nucleus
stimulation in Parkinson’s disease. Stereotact. Funct. Neurosurg. 1994;62, 76–84.
Bennett MR. Monoaminergic synapses and schizophrenia: 45 years of
neuroleptics. J Psychopharmacol.1998;12:289–304.
Berke JD, Hyman SE. Addiction, dopamine, and the molecular mechanisms of
memory. Neuron. 2000;25(3):515-32.
Bostan AC, Strick PL. The Cerebellum and Basal Ganglia are Interconnected. Neuropsychol Rev. 2010b;20:261–270.
Breakefield XO, Blood AJ, Li Y, Hallett M, Hanson PI and Standaert DG. The
pathophysiological basis of dystonias. Nat Rev Neurosis. 2008;9:222–234.
Cadet, JL, and Lohr JB. Possible involvement of free radicals in
neuroleptic-induced movement disorders: Evidence from treatment of tardive dyskinesia with
vitamin E. Annals of the New York Academy of Sciences.1989;570:176-185.
Campos-Romo A. Evaluación de alteraciones motoras en modelos animales de
enfermedad de Parkinson. Rev Neurol. 2008;46:167-174.
Cenci MA, Whishaw IQ, Schallert T. Animal models of neurological deficits: how
relevant is the rat? Nat. Rev. Neurosci. 2002;3:574-579.
Collins-Praino LE, Paul NE, Rychalsky KL, Hinman JR, Chrobak JJ, Senatus
PB, Salamone JD. Pharmacological and physiological characterization of the
tremulous jaw movement model of parkinsonian tremor: potential insights into
the pathophysiology of tremor. Front. Syst. Neurosci. 2011;46(5):1-14.
Dagher A, Owen AM, Boecker H, Brooks DJ. Mapping the network for
planning: a correlational PET activation study with the Towerof London task.
Brain. 1999;122:1973-1987.
Delgado-García JM. Estructura y función del cerebelo. Rev Neurol. 2001;33:
635‐642.
Díaz J, Lévesque D, Lammers CH, Griffon N, Martres M-P, Schwartz J-C,
Sokoloff P: Phenotypical character- ization of neurons expressing the dopamine
D3 receptor in the rat brain. Neuroscience.1995;65:731–745.
Doya K. Complementary roles of basal ganglia and cerebellum in learning and
Finn M, Jassen A, Baskin P, Salamone JD. Tremulous characteristic of vacuous
jaw movements induced by pilocarpine and ventrolateral striatal dopamine
depletions. Pharmacol Biochem Behav.1997;57:243-249.
Finn M., Jassen A., Baskin P, Chesler E, Cousins M, Salamone J. Animal models
of parkinsonism: Further characterization of tremulous jaw movements in rats. Soc.
Neurosci. Abstr. Macology.1995;88:467–471.
Freedman SB, Patel S, Marwood R, Emms F, Seabrook GR, Knowles MR, et al.
Expression and pharmacological characterization of the human D3 dopamine
receptor. J Pharmacol Exp Ther.1994;268:417–26.
Gao JH, Parsons LM, Bower JM, Xiong J, Li J, Fox PT. Cerebellum implicated in
sensory acquisition and discrimination rather than motor control. Science.
1996;272:545-547.
German D, Manaye K, Sonsalla P, Brooks B. Midbrain dopaminergic cell loss in
Parkinson’s disease and MPTP-induced parkinsonism: sparing of calbindin
D28k-containing cells. Ann N Y Acad Sci. 1992;648(11):42-62.
Glaser PE, Surgener SP, Grondin R, Gash CR, Palmer M, Castellanos FX,
Gerhardt GA. Cerebellar neurotransmission in attention-deficit/hyperactivity
disorder: does dopamine neurotransmission occur in the cerebellar vermis? J.
Glenthoj B, Hemmingsen R. Intermittent neuroleptic treatment induces
long-lasting abnormal mouthing in the rat. Eur J Pharmacol, 1989;164:393-6.
Goldman-Rakic PS, Bergson C, Krimer LS, Lidow MS, Williams SM, Williams
GV. The primate mesocortical dopamine system. In: Bloom FE. Handbook of
Chemical Neuroanatomy, Science.1999;15.
González B. Transferencia del gen humano para el factor neurotrófico derivado
de la glia (hGDNF) a neuronas dopaminérgicas utilizando el vector de
neurotensina. IPN, Biofísica y Neurociencias. 2005.
Hardman JG, Limbrid LE. Goodman y Gilman. Las bases farmacológicas de la
terapéutica. 10ª ed. McGraw-Hill., 2003.
Grafton TS, Turner RS, Desmurget M, Bakay R., Delong M, Vitek, J. and
Crutcher, M. Normalizing motor-related brain activity: Subthalamic nucleus
stimulation in Parkinson disease. Neurology. 2006;66:1192–1199.
Heman P, Barcia C, Gómez A, Ros CM, Ros-Bernal F, Yuste JE, De Pablos V,
Fernandez-Villalba E, Toledo-Cárdenas MR, Herrero MT. Nigral degeneration
correlates with persistent activation of cerebellar Purkinje cells in MPTP-treated
Hoover JE, Strick PL. The organization of cerebellar and basal ganglia outputs to
primary motor cortex as revealed by retrograde transneuronal transport of herpes
simplex virus type 1. J. Neurosci. 1999;19:1446-1463.
Hoshi E, Tremblay L, Féger J, Carras PL, Strick PL. The cerebellum communicates
with the basal ganglia. Nat. Neurosci. 2005;8:1491-1493.
Hurley MJ, Mash DC, Jenner P, Markers for dopaminergic neurotransmission in
the cerebellum in normal individuals and patients with Parkinson's disease
examined by RT-PCR. short communication. European Journal of Neuroscience,
2003; 18:2668-2672.
Hyman SE, Malenka RC. Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion
and its persistence. Nat Rev Neurosci. 2001;10:695-703.
Ichinohe N, Mori F, Shoumura K. A di-synaptic projection from the lateral cerebellar
nucleus to the laterodorsal part of the striatum via the central lateral nucleus of the
thalamus in the rat. Brain Res. 2000;880,191-197.
Ikai Y, Takada M, Shinonaga Y, Mizuno N. Dopaminergic and non-dopaminergic
neurons in the ventral tegmental area of the rat project, respectively, to the
cerebellar cortex and deep cerebellar nuclei. Neuroscience.1992;51:719-728.
jaw movement model for assessment of the motor effects of typical and atypical
antipychotics: effects of pimozide (Orap) in rats. Pharmacol Biochem Behav.
2005;80: 351-362.
Ishiwari K, Mingote S, Correa M, Trevitt JT, Carlson BB, Salamone JD, The GABA
uptake inhibitor beta-alanine reduces pilocarpine-induced tremor and increases
extracellular GABA in substantia nigra pars reticulata as measured by
microdialysis. J. Neurosci. Methods. 2004;140,39-46.
Ito M. The Cerebellum and Neural Control. Raven Press; 1984.
Jicha GA, Salamone JD. Vacuous jaw movements and feeding deficits in rats with
ventrolateral striatal dopamine depletion: possible relation to parkinsonian
symptoms. J. Neurosci. 1991;11:3822-3829.
Kelley AE, Bakshi VP, Delfs JM, Lang CG. Cholinergic stimulation of the
ventrolateral striatum elicits mouth movements in rats: pharmacological and
regional specificity. Psychopharmacology (Berl.) 1989;99:542-549.
Khan ZU, Gutiérrez A, Martín R, Peñafiel A, Rivera A, de la Calle A. Differential
regional and cellular distri- bution of dopamine D2-like receptors: An immunocy-
tochemical study of subtype-specific antibodies in rat and human brain. J Comp
Kim S-G, Ugurbil K, Strick PL. Activation of a cerebellar output nucleus during
cognitive processing. Science.1994; 265:949-951.
Lotze M, Montoya P, Erb M, Hulsmann E, Flor H, Klose U, Birbaumer N, Grodd W.
Activation of cortical and cerebellar motor areas during executed and imagined
hand movements: an fMRI study. J Cogn Neurosci.1999;11:491-501.
Mayorga AJ, Carriero DL, Cousins MS, Gianutsos G, Salamone JD. Tremulous jaw
movements produced by acute tacrine administration: Possible relation to
parkinsonian side effects. Pharmacol Biochem Behav. 1997;56:273-279.
Melchitzky DS, Lewis DA. Tyrosine Hydroxylase- and Dopamine
Transporter-Immunoreactive Axons in the Primate Cerebellum. Evidence for a Lobular- and
Laminar-Specific Dopamine Innervation. Neuropsychopharmacology
2000;22(5):466–472.
Middlenton FA, Strick PL.Basal ganglia and cerebellar loops: motor and cognitive
circuits. Brain Res. Rev. 2000;31:236-250.
Middleton FA, Strick PL. Anatomical evidence for cerebellar and basal ganglia
involvement in higher cognitive function. Science 1994;266:458-461.
Middleton FA, Strick PL. Cerebellar output: motor and cognitive channels. Trends
Panagopoulos NT, Panagopoulos GC, Matsokis NA. Dopaminergic innervation and
binding in the rat cerebellum. Neurosci. Lett. 1991;130:208-212.
Panagopoulos NT, Papadopoulos GC, Matsokis NA. Dopaminergic innervation and
binding in the rat cerebellum. Neurosci Res 1993; 35:499-506.
Parsons LM, Denton D, Egan G, McKinley M, Shade R, Lancaster J, Fox PT.
Neuroimaging evidence implicating cerebellum in support of sensory/cognitive
processes associated with thirst. Proc Natl Acad Sci. 2000;97:2332-2336.
Parsons LM, Fox PT, Downs JH, Glass T, Hirsch TB, Martin CC, Jerabek PA,
Lancaster JL. Use of implicit motor imagery for visual shape discrimination as
revealed by PET. Nature.1995;375:54-58.
Payoux P, Remy P, Damier P, Miloudi M, Loubinoux I, Pidoux B, et al. Subthalamic
nucleus stimulation reduces abnormal motor cortical overactivity in Parkinson
disease. Arch Neurol. 2004;61:1307-1313.
Percheron G, Francois C, Talbi B, Yelnik J, Fénelon G. The primate motor
thalamus. Brain Res Rev.1996;22:93–181.
Pifl C, Schingnitz G, Hornykiewicz O. Effect of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-
tetrahydropyridine on the regional distribution of brain monoamines in the rhesus
Purves D, Augustine GJ, Hall WC, Lamantia AS, McNamara JO, Williams SM.
Neuroscience. Sinauer Associates. 2004;(3ª): 435 452
Rascol O, Sabatini U, Fabre N, Brefel C, Loubinoux I, Celsis P, Senard JM,
Montastruc JL, Chollet F.The ipsilateral cerebellar hemisphere is overactive during
hand movements in akinetic parkinsonian patients. Brain. 1997120, 103-110.
Rogers TD, Dickson PE, Heck DH, Goldowitz D, Mittleman G, And Blaha CD.
Connecting the Dots of the Cerebro-Cerebellar Role in Cognitive Function:
Neuronal Pathways for Cerebellar Modulation of Dopamine Release in the
Prefrontal Cortex. SYNAPSE. 2011;00:1–9.
Rupniak N, Jenner P, Marsden C. Pharmacological characterization of
spontaneous or drug-induced purposeless chewing movements in rats.
Psychopharmacology. 1985;85:71-79.
Ryding E, Decety J, Sjoholm H, Sternberg G, Ingvar DH. Motor imagery activates
the cerebellum regionally. Cogn Brain Res. 1993;1:94-9.
Salamone J, Lalies M, Channel S, Iversen S. Behavioral and pharmacological
characterization of the mouth movements induced by muscarinic agonists in the
rat. Psychopharmacology.1986;88:467-471.
low-dose apomorphine: possible model of parkinsonian tremor. Pharmacol.
Biochem. Behav.1996; 53:179-183.
Salamone JD, Johnson CJ, McCullough LD, Steinpreis RE. Lateral striatal
cholinergic mechanisms involved in oral motor activities in the rat.
Psychopharmacology (Berl). 1990a;102: 529-534.
Salamone JD, Johnson CJ, McCullough LD, Steinpreis RE. Lateral striatal
cholinergic mechanisms involved in oral motor activities in the rat.
Psychopharmacology (Berl). 1990a;102: 529-534.
Salamone JD, Mayorga AJ, Trevitt JT, Cousins MS, Conlan A, Nawab A,
Tremulous jaw movements in rats: a model of parkinsonian tremor. Prog.
Neurobiol.1998;56:591-611.
Salamone JD, Zigmond MJ, Stricker EM. Characterization of the impaired feeding
behavior in rats given haloperidol or dopamine-depleting brain lesions.
Neuroscience.1990;39:17-24.
Sauer H, Oertel WH. Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine: a combined
retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat.
Schmahmann JD. An emerging concept. The cerebellar contribution to higher
function. Arch Neurol.1991; 48:1178–1187
Stephans S, Whittingham T, Douglas A, Lust W, Yamamoto B. Substrates of
energy metabolism attenuate methamphetamineinduced neurotoxicity in striatum. J
Neurochem.1998;71(2):613-21.
Sultana A, McMonagle T. Pimozide for schizophrenia and related psychoses.
Cochrane Database Syst Rev. 2000;3:CD001949.
Thach WT, Mink JW, Goodkin HP, Keating JG: Combining versus gating motor
programs: differential roles for cerebellum and basal ganglia? In Roles of
Cerebellum and Basal Ganglia in Voluntary Movement. Elsevier.1993:235-245.
Trevitt JT, Atherton LA, Aberman J, Salamone JD. Effects of subchronic
administration of clozapine, thioridazine and haloperidol on tests related to
extrapyramidal motor function. Psychopharmacology (Berl). 1998;137:61-6.
Wisniecki A, Correa M, Arizzi MN, Ishiwari K, Salamone JD. Motor effects of GABA
antagonism in globus pallidus: studies of locomotion and tremulous jaw
movements in rats. Psychopharmacology.2003;170: 140–9.
Yu H, Sternad D, Corcos DM, Vaillancourt DE. Role of Hyperactive Cerebellum
CAPÍTULO II
The Basal Ganglia: c-Fos expression in the cerebellum in response to subchronic dopaminergic alterations
(datos aceptados para publicación)
Datos de este estudio se consideraron
para envío a Neurocience Journal
6 de noviembre de 2013.
Grecia Herrera-Meza3; Luisa Aguirre-Manzo3; Genaro A. Coria-Avila1; Leonor
Lopez-Meraz1, Rebeca Toledo1; Jorge Manzo1, Luis I. Garcia1; Marta Miquel2.
1 Centro de Investigaciones Cerebrales, Universidad Veracruzana, Xalapa, Ver., Mexico 2 Área de Psicobiología, Universidad Jaume I, Castellón, Spain
3 Postgrado en Neuroetología. Instituto de Neuroetología. Universidad Veracruzana,
II Índice
1. Abstract...40
2. Introducción...41
3. Materiales y Método ...45
4. Resultados ... 48
5. Discusión... 51
1. Abstract
Cortical motor areas are influenced not only by peripheral sensory input and prefrontal association areas, but also by the basal ganglia and cerebellum. Both conceptualized as two separate structures working to execute movements. However, an anatomical and functional relationship between cortico-basal networks and cortico-cerebellar has been registered. So in pathological conditions of the basal ganglia, the cerebellum probably acts as an integrated system to compensate the functional deficit. In this context the objective of this study was to analyze the activity of the cerebellum with the expression of c-Fos in the model of Parkinsonism induced tremor jaw movements. This model characterized the tremulous jaw movements in male rats to which we chronically administered dopamine antagonist haloperidol and then we quantified the expression of c-Fos in the cerebellum. Our results indicate that the alteration of the basal ganglia produces an increment in the activity of the granular cell layer of the hemispheres and in the interpositus and dentate deep nuclei. The vermis and the hemispheres appear to be regulated in opposite ways. There were also fewer Fos IR cells in the lobules I, III, IV and V of the vermis in contrast to the control group and an increased expression in the lobules Crus II and Sim b of the cerebellar hemispheres. This suggests a hypoactivation and hyperactivation of the vermis of the hemispheres in animals associated with the effect of dopamine antagonism.
2. Introduction
Sensory systems send information to the brain to construct internal representations
of the external environment that are the context in which motor systems plan,
coordinate and execute voluntary movement. Therefore, different voluntary motor
conducts and intentionality are routed by the actions of various motor systems
hierarchically organized and controlled from the cortexes involved (Purves, 2004).
Apart from being regulated by the peripheral sensory afferents and prefrontal
association cortex, the cortical motor areas are regulated by the basal ganglia and
the cerebellum (Carlson, 2005). Both systems are considered as independent
modules in the cortex, although they form functional circuits with motor and
associative areas of the cortex thus participating in the planning and execution of
voluntary movements.
The proposal of a functional relationship between structures may be evident
in situations of injury or alteration. Such is the case of the degeneration of the
nigrostriatal dopaminergic pathway that occurs in Parkinson's disease (PD). During
such disease hyperactivation of the cerebellum has been observed, perhaps as a
mechanism that apparently compensates for the dysfunction of the cortico-basal
circuits, this aspect is inferred in neuroimaging studies in PD patients (Rascol et
al., 1997; Cerasa et al., 2006).
The possible compensation that the cerebellum carries out before this
SMA and CM1, places where the dentate nucleus of the cerebellum and basal
ganglia GPi target (Hoover and Strick, 1999; Akkal et al., 2007). On the other hand,
it may be a connection from the cerebellum, particularly the dentate nucleus to the
striatum in the basal ganglia via the thalamus (Hoshi et al., 2005, Yu et al., 2007),
a hypothesis that is supported by Hoshi et al. (2005) in their studies with rats and
Ichinohe et al. (2000) with data in primates.
In this regard, data from cerebellar hyperactivation in PD have led to
develop neuroanatomical studies as those of Yu et al. (2007), who describe a
connection between the basal ganglia and the cerebellum through two pathways:
from the dentate nucleu (DN) to the striatum and subthalamic nucleu (STN) to the
cerebellar cortex. This implies a structured system for communication between
these two brain areas which intervenes not only in movement but also in cognition
and affection (Bostan et al., 2010b). Also, the approach of a communication
between the two structures through dopaminergic connection from the VTA to the
cerebellar cortex of primates and rodents, mainly distributed in the lobules Crus I
and Crus II (Ikai et al., 1992) and the presence of neural elements indicative of
dopaminergic neurotransmission in the cerebellum (Melchitzky and Lewis, 2000),
support the proposed relationship between anatomical and functional cortical-basal
and cortico-cerebellar, hypothesis which states that under certain conditions the
basal ganglia and cerebellum act as a functional network (Bostan et al., 2010).
The cerebellum is related to the control and integration of motor processes,
posture (Ito, 1984). Although it is known that the cerebellum may be involved in
cognitive functions (Schmahmann, 1991; Kim et al., 1994), as shown by imaging
studies in humans during word association activities (Petersen and Fiez, 1993) and
mental arithmetic ( Ryding et al., 1993). Processes that appear to involve lateral
hemispheres and dentate nucleus (Schmahmann, 1991; Kim et al., 1994). As said
before, interruptions in the circuits of the cerebellum, thalamus and prefrontal
cortex contribute to many of the abnormalities in cognition, affecting planning,
verbal fluency, abstract thinking and working memory (Andreasen et al., 1996),
circuits that involve the cerebellar hemispheres and dentate nucleus (Melchitzky
and Lewis, 2000). Unlike the cerebellar vermis which is involved in certain
functions such as motor control of trunk and head (Ito, 1984).
Just as the cerebellum appears to be involved in most motor and cognitive
functions, the data suggest that dopamine, mediated by other brain regions such
as prefrontal cortex regulates such functions both in cortical and in subcortical
structures (Goldman–Rakic, 1999). DA has been implicated in the pathophysiology
in some cognitive disorders such as schizophrenia, autism, among others, typically
associated with a pathology of prefrontal cortex (Andreasen and Pierson, 2008)
and in which the cerebellum is recently being involved. Although the presence of
DA in the cerebellum was considered only as a precursor to norepinephrine,
studies suggest it as a neurotransmitter (Melchitzky and Lewis, 2000).
In this regard, using the model of Parkinson’s disease in monkeys which
reduction in dopamine concentration was obtained in the caudate, putamen ,
substantia nigra and extracortical areas such as the cerebellum (Pilf et al., 1991).
Through radioligand and immunoreactivity for the types of dopamine receptors,
different subtypes have been identified in the cerebellar cortex of rodents
(Panagopoulos et al., 1993, Diaz et al., 1995; Barili et al., 2000) in primates, and in
human beings dopamine receptors D1, D2, and D3 (Khan et al., 1998) and
specifically the D2, D3 and D4 in Purkinje cells (Khan et al., 1998). Moreover, the
mRNA for D3 receptors (lobules IX and X) in these cells in the cerebellum of
rodents (Diaz et al.,1995). Also it has been described the presence of membrane
transporter DAT-dopamine-lobes in II, III, IV, VIIIA, VlllB, IX and X of the granular
layer of the vermis in primates, as well as axons containing tyrosine hydroxylase in
the vermis and the hemispheres of the cerebellum.
The objectives this paper are based in the context of an anatomical and
functional relationship between cortical-basal and cortical-cerebellar networks,
which under certain situations the basal ganglia and cerebellum would act as an
integrated system; it is aimed at analyzing in depth the effect of alteration of the
basal ganglia as a model of Parkinson’s disease in the activity of cerebellar
neurons. For such aim the first and second phase of the experiment were
developed, that involved, on the one hand, to characterize the model of
Parkinson´s and to determine the lobes to be analyzed and, on the other hand, to
induce tremulous jaw movement with haloperidol as a model of Parkinson’s and to
analyze the expression pattern of c Fos in the cerebellum. By
detect a specific epitope. This epitope is then visualized using a detection system
and a chromogen.
3. Materials and Method
Study Subjects
In a group of 25 male Wistar rats with a body weight of 250 -300 g, 8 animals were
randomly selected as control group and 17 were experimentally treated with
haloperidol. The rats were housed in collective, clear acrylic boxes, under reverse
cycle under light-dark conditions during 12 × 12 h periods and fed with food and
water on demand.
Drug, dosage and administration time
Haloperidol was manufactured by RBI Research Biochemicals International
(Natick, MA 01760 USA), dissolved in warm distilled water and added 0.3%
DL-tartático acid 99% (Germany ALDICH 49-7329970). To establish the tremulous jaw
movements model described by Salamone (1996) a DA antagonist effective
dosage of 1.5 mg / kg was used, at a concentration of 1 ml in relation to body
weight and animals that formed the control group were treated with 0.3%
DL-tartático acid 99% dissolved in saline. It was observed scarcity and slowness of
movement in all animals (bradykinesia) and in 50% of them chin tremor behavior
occurred. To verify the phenomenon described by Salamone et al. (1998) , the
local frequency of tremulous jaw movements was recorded by electromyography in
Perfusion
After treatment with the antangonist, the rats were transcardially perfused for brain
removal and cryoprotection in an ascending series of sucrose (10, 20 and 30%)
and 0.1M phosphate buffer (0.1 M PB). Coronal and sagittal cuttings of the brain
and cerebellum were made, with a thickness of 40 µm and at a temperature of -24
° C.
Quantitative analysis of Fos-IR cells
To observe Fos immunoreactive cells, digital images were obtained with the
ImagenPro Plus program, coupled to a light microscope (OLIMPUS, Provis) and
Image J program to count. With which previous count was performed in 10 lobes
(proximal, medial and apical) of the granular layer of two experimental and two
control animals (15 slides per rat) for the expression pattern of Fos-IR throughout
the cerebellum. Subsequently the lobes were considered significant with a marking
for counting cells granular and Purkinje, in deep nuclei and in the ventrolateral
striatum (VLS) of the basal ganglia in all of the rats.
Statistical Analysis
The response variable number of cells immunoreactive to c-Fos (Fos-IR) in the
granular layer of the cerebellumwas processed by applying a multivariate analysis
of variance (MANOVA), in which each lobe was considered as a variable response
which were a group of rats treated with a chronical intraperitoneal for 14 days of
haloperidol plus tartaric acid and a control group of animals with saline plus tartaric
acid. After the multivariate analysis and to obtain the value of Wilks' lambda, the
univariate analysis was performed for each lobe with its multiple comparisons. Also
the assumptions of homogeneity of variance and normality were verified to comply
with the guidelines of the statistical test.
While the response variable cell number IR-Fos in Purkinje layer was
analyzed using a one-way ANOVA to compare the experimental vs control group
with the adjustment of the variable response to Poisson distribution because it did
not meet the assumptions of homogeneity of variance and normality. For the
number of cells in the deep cerebellar nuclei and the ventrolateral striatum of the
basal ganglia, this was also analyzed with one-way ANOVA but with adjustment to
normal distribution.
4. Results
Ventrolateral striatum (EVL) of the basal ganglia
The average values of the number of Fos-IR cells in the striatum showed that
ventrolateral animals with dopamine antagonism (=42.00±4.11) show greater
cellular immunoreactivity to saline-treated rats (=4.85±6.22) (F1,21=39.4,
Granular layer vermis
Multivariate analysis for the lobes (I, III, IV, V) in the cerebellar vermis shows that
there are significant differences between treatments (Wilks' λ = 4.02, P <0.01),
since the lobes show different immunoreactivity in animals treated haloperidol in
contrast to the control group.
In the lobe I, there were significant differences between treatments in the
number of Fos-IR cells (F1,25=4.7, P<0.03), since the group of rats with haloperidol
treatment had a number of cells expressing IR Fos on average lower than the
control group (Fig. 1). The average number of cells expressed in the lobe III did not
differ between treatments (F1,25=3.4, P<0.07), being equal the average value in the
group of rats with dopamine antagonism (Fig. 1). Additionally, registration of cells
in the lobule IV differed significantly (F1,25=12.04, P<0.001) and the response was
similar in lobe V (F1,25=7.9, P<0.01), as rats treated with haloperidol had lower
average number of cells with IR-Fos expression than those who did not have
antidopaminergic treatment (Fig. 1).
Granular layer in the right hemisphere
Multivariate analysis for comparison of the number of granule cells showed
significant differences between rats with haloperidol treatment and control group in
Univariate analyzes of the mean values of the number of Fos-IR cells that
were quantified in the SIM by CRUS II lobes of the right hemisphere of the
cerebellum were different between animals treated with haloperidol and the group
with saline administration. On the one hand, in the SIM b lobe average number of
Fos immunoreactive cells Fos (IR-Fos) was observed ,higher in the experimental
group than in the control group (F1,25=9, P<0.004, Fig. 2). On the other hand, in the
CRUS II lobe, the group of rats treated with haloperidol showed again a higher
average number of Fos-IR cells in contrast to that recorded in the saline group
(F1,25=27.4, P<0.00001, Fig. 2).
Vermis Purkinje layer
The nonparametric analysis of variance for a Poisson distribution of the variable
number of Fos immunoreactive cells in the lobule I of the Purkinje layer shows no
significant differences between treatments (χ2= 0.18, P=0.6), since the average
values were similar between the saline and the haloperidol groups (haloperidol
=0.93±0.25 y saline =1.1±0.33). In contrast, in the lobe III there were significant
differences (χ2=3.8, P=0.04), the same as in the fourth lobe (
χ2= 6.5, P=0.01,
Fig.3), since the group of rats treated with haloperidol had lower average number
of cells expressing Fos-IR with respect to the group with saline application (Fig. 3).
However in the lobule V, the observed differences follow a different pattern as rats
with haloperidol showed greater number of cells immunoreactive for c-Fos (χ2= 8.4,
Purkinje layer in the hemisphere
The average values of the number of Fos-IR cells quantified in the SIM b lobe of
the right hemisphere did not differ (χ2= 2, P<0.15, Fig. 4) between the animals that
were given haloperidol (χ2= 4.4 ± 0.11) and those treated with saline (
χ2=3.2 ±
0.19). the same as in the lobe CRUS II where there were no differences, since the
average number of Fos-IR cells in each lobe (haloperidol χ2 = 3.7 ± 0.12 and saline
χ2 = 3.0 ± 0.20) was similar between groups (χ2= 0.9, P=0.33, Fig. 4)
Deep nuclei
The average values of the number of Fos-IR cells quantified in the deep cerebellar
nuclei showed differences between the animals subjected to treatment with
haloperidol and those administered saline. Specifically, the haloperidol group
showed less Fos IR neurons although this trend was not statistically significant
(F1,23= 3.3, P=0.08) [experimental group (=73.8 ± 6.4) and control (= 94.3 ± 9.1)
(Fig. 5). However, it was observed that in the interpositus nucleus that treatment of
rats with haloperidol had an average value significantly higher than the control
group (F1,23= 11.3, P=0.003, Fig. 5). The same differences were obtained for the
5. Discussion
As part of the research on the involvement of the cerebellum in cases of alteration
of the basal ganglia, the experiment suggested as a way to alter the basal ganglia
model of Parkinson´s Disease (Salamone, et al.,1998) based on the use of
dopamine antagonists such as haloperidol, neuroleptic that under specific
conditions generates tremulous jaw movements in rats with similar characteristics
to resting tremor in PD patients (Ishiwari, 2004; Finn et al., 1995; Salamone and
Baskin, 1996).
Studies in rats indicate that the chin tremors are induced by dopaminergic
manipulation (Steinpreis et al., 1993; Steinpreis and Salamone, 1993; Trevitt et al.,
1998) and that its induction is accompanied by an increase in c-Fos inmunorectivity
of c-Fos in the ventrolateral striatum (Lee et al., 2007; Salamone et al., 2008b;
Betz et al., 2009), direct target of SNcompacta dopaminergic projections. The
increase in Fos cell immunoreactivity observed in the ventrolateral striatum of the
rats treated with haloperidol is associated with reduced inhibition of gabaergic
striatal neurons expressing D2 receptors (via indirectly) and which results in
increased activity of striato-nigral neurons, as indicated by Salamone et al. (2009).
These data are also reported in patients with PD (Obeso et al., 2002).
The premises to discuss the immunoreactive pattern of Fos observed in the
cerebellum, are based on the hypothesis of an anatomical and functional
