Nueva malla de polipropileno/poliuretano para la reparación de defectos de la pared abdominal

Revista

Hispanoamericana

de

Hernia

w w w . e l s e v i e r . e s / r e h a h

Original

Nueva

malla

de

polipropileno/poliuretano

para

la

reparación

de

defectos

de

la

pared

abdominal

Salvatore

Cuccomarino

a,∗

_,

_{Garbi ˜ne}

_{Atorrasagasti}

_Goyalde

b

_,

_Ana

_Ayerdi

_Izquierdo

b

_y

Fabrice

O.

Morin

c

a_{ServiciodeCirugíaGeneralydelAparatoDigestivo,HospitalComarcaldeChivasso-ASLTO4,Chivasso,Turín,Italia} b_{HealthDivision,Tecnalia(CIBER-BBN),ParqueCientíficoyTecnológicodeGuipúzcoa,SanSebastián,Guipúzcoa,Espa ˜na} c_{HealthDivision,Tecnalia,ParqueCientíficoyTecnológicodeGuipúzcoa,SanSebastián,Guipúzcoa,Espa ˜na}

i n f o r m a c i ó n

d e l

a r t í c u l o

Historiadelartículo:

Recibidoel7deoctubrede2013 Aceptadoel11defebrerode2014 On-lineel4deabrilde2014 Palabrasclave: Polipropileno Poliuretano Eventración Reparaciónherniaria Laparoscopia

r

e

s

u

m

e

n

Introducción:Losmaterialesprotésicosdestinadosalareparacióndegrandesdefectos her-niariosdelaparedabdominaltienenquequedarenmuchasocasionescolocadosencontacto conelcontenidodelacavidadperitoneal.Paraevitarlaaparicióndecomplicacioneses nece-sarioemplearprótesistipocompuestoquemuestrenunbuencomportamientoentodaslas interfaces.Elobjetivodelpresentetrabajofuellevaracabolaelaboracióndeuna próte-siscompuestaformadaporpolipropilenoypoliuretano,conelfindeobtenerunabuena integracióntisularyunóptimocomportamientoenlainterfazperitoneal.

Materialymétodos:Serecubrieronporinmersiónmallasdepolipropilenocon poliuretano-acrilato hidrofílico(PH) o poliuretanobiorresistente terapéutico, y seprobaron in vitro

medianteensayosdecitotoxicidad,adhesiónyproliferacióncelular.Losimplantesinvivo

fueronefectuadosen30conejosblancosdeNuevaZelanda.Alos15,45y90díasdespués delimplanteseanalizólaintegracióndelamallaylaformaciónadherencial,empleando microscopiaópticaymicroscopiaelectrónicadebarrido.Elestudioestadísticoserealizócon lostestdedistribución␹2_{dePearsonyANOVA.}

Resultados: Elensayodecitotoxicidadrevelólaviabilidadcelularenpresenciadelasprótesis recubiertasconPHopoliuretanobiorresistenteterapéutico.Sinembargo,losensayosde adhesiónyproliferacióncelularmostraronunamayoreficaciaenpresenciadelasprótesis de PH.Enelestudioinvivo,laformaciónadherencialsesituómayoritariamenteenlos bordesdelimplantedelasprótesis.Alos15díasexistíaunamesotelizacióncasicompleta, ylaintegraciónenlavertienteparietalfuecorrecta.

Conclusiones:Tantoinvitrocomoinvivo,laprótesisdePHmuestraunexcelente comporta-miento,conescasaformaciónadherencialenlavertienteperitoneal.Además,sucostede producciónesrealmentebajo,loquepermitequeestaprótesisseamuycompetitivadesde elpuntodevistadelaproducciónindustrial.

©2013SociedadHispanoamericanadeHernia.PublicadoporElsevierEspaña,S.L.Todos losderechosreservados.

∗ _{Autorparacorrespondencia:CirugíaGeneralydelAparadoDigestivo,HospitalComarcaldeChivasso-ASLTO4,Chivasso,Turín,Italia.}

Tel.:+393922932832,fax:+3902700413868.

Correoelectrónico:scuccom@tiscali.it(S.Cuccomarino).

2255-2677/$–seefrontmatter©2013SociedadHispanoamericanadeHernia.PublicadoporElsevierEspaña,S.L.Todoslosderechosreservados.

A

new

polypropylene/polyurethane

mesh

for

the

intraperitoneal

repair

of

abdominal

wall

defects

Keywords: Polypropylene Polyurethane Incisionalhernia Herniarepair Laparoscopy

a

b

s

t

r

a

c

t

Introduction:Prostheticmaterialsusedinabdominalherniarepairfrequentlymustbe pla-cedincontactwiththeabdominalcavitycontent.Toavoidpostoperativecomplications,it ismandatorytousecompositemeshes,withanadequatebehaviorbothatthevisceraland theparietalinterfaces.Thisstudywasaimedtoelaborateacompositepolypropylene/ pol-yurethanemesh,inordertoobtainagoodtissularintegrationandasatisfactorybehavior attheperitonealinterface.

Materialsandmethods:Samplesofastandardpolypropylenemeshwerecoatedwithathin layerofhydrophilicpolyurethane(PH)orbioresistanttherapeuticpolyurethane(PBR),and weretestedinvitrobycytotoxicity,cellularadhesionandproliferationassays.Thenthey wereimplantedin30NewZealandwhiterabbits.Meshtissularintegrationandadhesion formationweretestedat15,45and90daysaftertheimplant,usingopticandscanning electronmicroscopy.StatisticalstudywasperformedusingPearson’schi-squaretestand ANOVA.

Results:Cytotoxicityassayrevealedthecellularviabilityoftheextractsobtainedfromthe meshcoatedwithPHandPBR.Adhesionandproliferationstudiesdemonstratedamost relevantantiproliferativecapacityinPH-coatedmeshes.Intheinvivostudy,theadhesions werelocalizedprevalentlyonthemeshedges.After15days,theneoperitonizationwas almostcomplete,andtheintegrationwiththeabdominalwalladequate.Bothinvitroand invivo,PH-coatedmeshesexhibitanexcellentbehavior,withscarceadhesionformation onthevisceralside.Furthermore,theirproductioncostisverylow.

©2013SociedadHispanoamericanadeHernia.PublishedbyElsevierEspaña,S.L.Allrights reserved.

Introducción

El uso en la práctica clínica de las técnicas quirúrgicas laparoscópicascon el finde reparardefectos herniariosde pared abdominal ha estimulado los debates y las inves-tigaciones sobre los materiales protésicos que se pueden utilizar en estos procedimientos quirúrgicos. El implante intraperitoneal, enunporcentaje decasos quevaría según eltipo deprótesisutilizada,generaformación de adheren-ciasvíscero-protésicas1_{,cuyaconsistenciavaríasegúneltipo} de malla utilizada2–4_{. También la formación de} neoperito-neoesimportante enlainterfazperitoneal, ydepende del tipodeprótesisusada5.Sonbienconocidaslas complicacio-nesdeobstrucciónintestinalyfístulasenterocutáneasenla morbilidadposoperatoriadeimplantes intraperitonealesde prótesis6–11_.

Portodoello,laprótesisidealdeberíaprevenirla forma-cióndeadherenciaseintegrarsebienenlaparedabdominal12_. También debería ir provista de una barrera en la ver-tiente visceral que no provoque erosiones, que resista a las infeccionesy sea antiadhesiva, y que mantenga todas estas características por lo menos durante una semana (periodo crítico para la génesis de adherencias que, como se ha demostrado, comienzan a formarse ya en las pri-meras 48h tras haberse realizado un implante13–16_{). Una} solucióndeseableseríaquelamismaprótesisqueactúacomo reparadora de la pared posea, al mismo tiempo, actividad antiadhesiogénica.

Nuestroestudiopartedelahipótesisdequerecubriendo unaprótesisdepolipropilenoconunestratomuyfinode

mate-rial antiadhesiogénicolaprobabilidaddequeseformenlas adherenciasquenormalmentedichomaterialprovoca dismi-nuyadeformasensible,yquealmismotiemposemantengan lascaracterísticasderesistenciamecánicadelasprótesisde polipropileno4,17–21_.

Tras un análisis de las necesidadesantes precisadas, y tras la revisión de la literatura, hemos elegido el poliure-tano,porsuscaracterísticasfísico-químicasybiomédicas.No sonmuchos,perosímuyinteresantes,losdatospublicados hastalafechaenrelaciónconestebiomaterial,conelfinde emplearsecomoprótesisparalareparacióndedefectos her-niarios.

En un trabajo de 2005, Bellón et al.22 _{estudiaron el} comportamiento de diferentes prótesis compuestas en cuanto a la formación de adherencias, implantando intraperitonealmente 4 tipos diferentes de biomateriales (polipropileno-ePTFE; polipropileno-poliuretano, poliéster-glicolpolietilénico-glicerolypolipropileno-ácidohialurónico). Analizandolaformacióndeadherencias14díasdespuésdel implante, concluyeronqueel mejorcomportamientoera el delasprótesiscompuestasdepolipropilenoypoliuretano.

Enunestudioalargoplazo,Sodjietal.23 _{investigaronla} formacióndeadherenciasalos4,9y13mesestras implan-tarintraperitonealmenteunaprótesisdepolietilentereftalato ypoliuretanoenconejo.Laformacióndeadherencias,sin evi-denciadeobstrucciónintestinal,fuedel18%.

Con estos antecedentes sería correcto suponer queuna mallacompuestadepolipropilenoyunacapadepoliuretano biocompatiblepueda,porunlado,inducirunaescasa forma-ciónadherencial,yporotro,favorecerlaformacióndeunbuen neoperitoneo (porsuacción deandamiaje).Con elobjetivo

deminimizarlacantidad decuerpoextra ˜noqueimplantar, nuestrodise ˜nohaconsistidoenelrecubrimientodelos fila-mentosde polipropilenoempleando unatécnicadedipping oinmersióndelaprótesisenlacorrespondientesoluciónde poliuretano.

Material

y

métodos

Dise ˜nodelmaterialprotésico

Parael recubrimientodelamalla depolipropileno (Ataylar Medical,Ankara,Turquía;conunpesode70g/m2_)serecurrió

a la familia de los poliuretanos. Se seleccionaron 2 tipos diferentes:poliuretano-acrilatohidrofílico(PH)ypoliuretano biorresistenteterapéutico(PBR).

EnlaelaboracióndelPH,paraelprocesoderecubrimiento se utilizó una técnica de inmersión con una solución de recubrimientohidrófilode poliuretano-acrilato. Lasolución empleadaincluyóetanol comodisolventey polivinilpirroli-dona.Traselprocesodeinmersiónserealizóuntratamiento conradiaciónUV.Alfinaldelproceso,sobrelamallade poli-propilenoseobtuvounrecubrimientodepoliuretanodeun gramajemediode2.6g/m2_.

EnlaelaboracióndelPRB,lasprótesisdepolipropilenose recubrieronaplicandounasolucióndeunpolímerode poliu-retano biorresistente terapéutico.El agente terapéutico, en particular,esuncompuestoantiinflamatorioincluidoenlas cadenasdelpoliuretanobase.Enestecasoseobtuvosobrela malladepolipropilenounrecubrimientodeungramajemedio de1.5g/m2_.

Lacaracterización microestructural delasprótesis recu-biertasserealizómediantemicroscopiaelectrónicadebarrido (JEOL JSM-5910 LV field-emission scanning electron microscope) (fig.1).Lacapaobtenidadelrecubrimientodelamuestrade PHeradeaproximadamente2␮mdeespesor,mientrasquela delamuestraPBReramásfina,conunespesorde aproxima-damente0.7␮myque,además,parecíamásporosa.

Lacomposición finalde lasmallas secontroló a través delanálisisFourierTransformInfraredSpectroscopy(FTIR).Este ensayopermiteidentificaruncompuestoeinvestigarsu com-posición.SeutilizóunespectrómetroMagna-IR750deNicolet con una fuente de infrarrojo monocromática (Ever-Glotm mid.IR) situada enfrente deldetector. Secalibró utilizando patronesdepoliestirenode1.5y3mm.Enestecaso,dadoel tipodemuestraenformademalla,losespectrosserealizaban sobrelasmuestrasdirectamente,ydespuésseobteníauna finacapa(film)apartirdelasmuestrasmediantelatecnología «Hot-Press»(fig.2).

Ensayodecitotoxicidad

Para la valoración del carácter citotóxico de las muestras serealizó un ensayo de toxicidad celular in vitro según el procedimientooperativodeTecnalia(SanSebastián,Espa ˜na) «Citotoxicidadcelularinvitro35-0-102»,basadoenlanorma ISO10993-5:2000,paracomprobarqueelusodelproductono causaseefectostóxicosanivelcelular.

Paralaobtención delos extractossesiguieronlas reco-mendacionesdelanormaUNE-ENISO10993-12(Evaluación

Figura1–A)MicrofotografíaenseccióndelaprobetaPH (×200).B)MicrofotografíaenseccióndelaprobetaPBR (×200).

biológicadeproductossanitarios.Preparacióndemuestrasy materialesdereferencia).Estanormaestablecelas condicio-nesdeextracciónylasratiosdemasaosuperficiedelmaterial respectoalvolumendellíquidoextractor.Dadoquelas mues-tras PHyPBR noeran estériles,seirradiaronmedianteUV durante15minantesdelaextracción.

Comocontrolpositivodematerialesseutilizóelclorurode poliviniloconelementosorganoestánicosestabilizados (PVC-Sn),ycomocontrolnegativodecitotoxicidad,elpolietileno dealtadensidad.Comoblancodelensayoseutilizómediode cultivoEMEMcompleto(suplementadoconun10%deFBS).

Se utilizó la línea celular CCL-171 (ATCC) cultivada en medio de cultivo EMEM (Sigma, M5650, San Luis, Misuri, EE.UU.)suplementadaconun10%desuerofetalbovino(FBS, Sigma,F9665,SanLuis, Misuri,EE.UU.)yun1%de antibió-ticopenicilina/estreptomicina(Sigma,P4333,SanLuis,Misuri, EE.UU.),mantenidasa37±2◦Cyenatmósferade5%deCO2

hasta obtener unamonocapaconfluente. Eldía anterioral ensayosesembraron1×104_{célulasCCL-171enmedioEMEM}

completoporcadapocillonecesario,yseincubarona37◦Cy 5%deCO2.Posteriormente,seretiróelmediodelascélulas

98

A

B

PH3 PH3 PBR3 PBR3 3349.64 2723.10 1547.08 1644.20 1690.96 1746.80 1162.23 1219.03 1372.85 1456.37 2838.98 2875.47 2916.58 2954.80 3201.14 2839.55 1539.43 1163.49 1224.47 1255.78 1300.50 1374.82 1457.96 672.71 1647.77 1697.16 1742.17 2874.39 2914.77 2956.78 96 94 92 90 88 86 2000 Número de onda (cm-1) Número de onda (cm-1₎ Porcentaje de transmisión Porcentaje de transmisión 84 82 80 78 100 99 98 97 96 95 94 4000 2000 4000

Figura2–A)EspectroIRdelamuestraPH.B)EspectroIRdelamuestraPBR.

y25X)delamuestra,loscontrolesyblanco,yseincubarona 37◦Cy5%deCO2durante24h,traslascualesserealizóuna

evaluacióncualitativaycuantitativadelcultivocelular. Enlaevaluacióncualitativaseanalizaronloscambiosde lamorfologíageneral,lavacuolización,losdesprendimientos, lalisisylamembranacelular.Laevaluacióncuantitativase determinóvalorandolaviabilidadcelularmedianteelensayo WST-1(saleshidrosolublesdetetrazolio/formazán).Setratade unmétodocolorimétricoquedetectalaactividadmitocondrial delascélulas.Lassalesdetetrazolioserompenmediantelas enzimascelularesconformazán.Elincrementodelnúmero decélulasviablessuponeunaumentoenlaactividaddelas deshidrogenasasmitocondrialesdelamuestra,yportanto,un aumentoenlacantidaddeformazánformado,quees direc-tamenteproporcionalalnúmerodecélulasmetabólicamente activasdelcultivo.Lacuantificacióndelcoloranteformazán producidoporlascélulasmetabólicamenteactivasserealiza enunlectordeELISAmediantelalecturadelaabsorbanciaa unalongituddeondade450nm.

Ensayodeadhesiónyproliferacióncelular

Se realizaronsobrelasmallas tratadas conambos recubri-mientosconelobjetivodeseleccionarunodeellosparallevar acaboelimplantedelasprótesisenelanimalde experimen-tación.Elensayoteníacomoobjetoevaluarbiológicamentela capacidadantiproliferativadelosrecubrimientos desarrolla-dossobreunamallapolimérica.Labasedeestosexperimentos consistióendepositarunnúmeroconocidodecélulassobreel materialycontarelnúmerodecélulasadheridasalas24y 72hyalos7días.SeutilizólalíneacelularCCL-171(ATCC) cultivada enmedio decultivoEMEMsuplementado conun 10% de suero fetal bovino (FBS, Sigma F9665) y un 1% de antibióticopenicilina/estreptomicina(Sigma,P4333,SanLuis, Misuri,EE.UU.),mantenidasa37±2◦Cyenatmósferade5% de CO2 hastaobtenerunamonocapaconfluente.Seobtuvo

unasuspensióncelularysesembraron1×104_{célulassobre}

cada malla enlas muestrasa estudio y enlos pocillos de poliestirenocorrespondientesalcontroldelascélulas.Enel

ensayo,ypara cada tiempo,seempleóunade lasréplicas decadamuestracomo «blanco»(mediodecultivosin célu-las).Seincubaronlasplacasdurante24,72hy7díasa37◦C y5%CO2.Transcurridosesostiempos,serealizó lamedida delnúmerodecélulas/muestramedianteelensayoporMTT (ensayodereduccióndel bromuro[4,5 dimetil-2-tiazoil-2,5-difeniltetrazólico]). En aquellas placas, cuya incubación es superior a 24horas, el medio de cultivo de los pocillos se remplazócada2-3díashastasumedida.ElensayoMTTes unmétodocolorimétricoque detectalaactividad mitocon-drial de lascélulas vivas, del mismo modo que latécnica WST-1 descrita en el apartado anterior. En este caso, la medida de absorbancia se realizó a unalongitud de onda de570nm.

Estudioinvivo:implantedelasprótesis

Elmodeloexperimentalutilizadoeselmismoquesedescribe enlagranmayoríadelosestudiospublicadossobrela forma-cióndeadherencias4,24–31_{.Latécnicautilizadafuelamisma} queseusaenclínicaenlasreparacionesintraperitonealesde laseventracionesydelasherniasabdominales.

Animaldeexperimentación

Seutilizaron30conejosblancosdeNuevaZelanda,deunpeso comprendidoentre4y5kg,estabuladosantesydespuésde lascirugíasenelanimalariodelInstitutoBiodonostiadeSan Sebastián(Guipúzcoa,Espa ˜na),encondicionesestándarycon libreaccesoalíquidosyalimentos.

Los procedimientos quirúrgicos se realizaron en los quirófanos del animalario del Instituto Biodonostia. Para la analgesia se administró buprenorfina (0.01-0.05mg/kg) (Buprex®,Schering-PloughS.A.)porvíasubcutánea,media hora antes del procedimiento quirúrgico. La sedación se realizó con una mezcla de ketamina (35mg/kg) (Ketolar® 50, Parke-Davis, Espa ˜na), xilacina (5mg/kg) (Rompún® 2%, Bayer, Espa ˜na) y atropina (0.8-1mg/kg) (Braun, Espa ˜na). El mantenimientoanestésicoseefectuómediantela adminis-tracióninhalatoriadesevoflurano(Sevorane®250ml)al3% conunflujodeoxígenoal100%a2×200ml/kg/miny aspi-ración simultánea de gas sobrante para la protección del cirujano.

Traselrasuradoyellavadoconpovidonayodadajabonosa (Betadine®)yclorhexidina alcohólicaal5%, serealizó una laparotomíaxifopúbica.Lasprótesis(3×3cm),secolocaron enelflancoizquierdodelosanimales,encontactodirectocon elperitoneo,a1cmalmenosdelaincisióndepared, sutura-dascon4puntosdepoliglactina910de3-0.Parainduciruna reacciónmásintensaentrelasasasintestinalesylasmallas, serealizóunaligeraabrasiónsuperficialdelperitoneo visce-ralconunagasahúmeda32–34_{.Elcierredelaparedabdominal} seefectuóen2planos:1)seromuscular,conpoliglactina910 de2-0,y2)cutáneo, mediantesuturaintradérmicade poli-propileno3-0.Eltiempooperatorio,entodosloscasos,fuede 20-30min.

Larecuperaciónanestésicatuvolugarmediantela admi-nistracióninhalatoriadeoxígenoal100%a2×200ml/kg/min 2-3minutos,trasloscualessetrasladóalanimalalajaula deinducción-reanimaciónhastalarecuperacióndetodoslos reflejos.

Tabla1–Clasificaciónmacroscópicadelasadherencias segúnZühlkeetal.(grado,tipodeadherencia)

0 Ausenciadeadherencias

I Adherenciastransparentesybiendisecablespor disecciónroma

II Disecciónromaavecesposible.Esnecesarioaveces cortarlaadherencia,queempiezaamostraruna organizaciónvascular

III Adhesiolisisposiblesolocortandolasadherencias.Se evidenciaunaclaravascularizacióndeestas IV Adhesiolisisposiblesolocortandolasadherencias.

Víscerasabdominalesfirmementepegadasalas adherencias.Da ˜novisceraldifícilmenteprevenible Fuente:Zühlkeetal.32_.

Laanalgesiaposoperatoriaserealizómediantemeloxicam (Metacan®Esteve, Espa ˜na)0.3-0.6mg/kg durantelos 5días posterioresalacirugía.

ParalaeutanasiaseempleóT61®(MSD,Intervet).Trasla realizacióndeunalaparotomíamedia,seobservóeláreade colocación delamallaylasadherencias existentes,quese valoraronconlaescaladeZühlkeetal.32_{(tabla1).Porúltimo,} seprocedióalaextraccióndelamallaconbordesdepared abdominaldealmenos1cm.Cadamuestrasedividióen2 par-tes:unaparaanálisisconmicroscopiaelectrónicadebarrido yotraparahistologíaconvencional.

Sedise ˜naron3gruposdeestudio,cadaunodeloscuales comprendía10animales.Lostiemposdesacrificiofueronde 15,45y90días.

Análisisestadístico

EnelestudioinvitroseempleólatdeStudentparael aná-lisisdelosdatos.Paraelestudioinvivoseutilizaronlostest estadísticosdedistribución␹2_{dePearsonyANOVA.}

Resultados

Ensayodecitotoxicidad(fig.3)

-Evaluacióncualitativa.Lascélulasqueestuvieronencontacto conelextractoobtenidoapartirdelcontrolpositivode cito-toxicidad(PVC-Sn)presentaronanomalíasestructuralesmuy severas,ysuaspectoredondeadoimplicabamuertecelular. Sinembargo,lamorfologíadelascélulasencontactoconel extractoobtenidoapartirdelcontrolnegativode citotoxici-dad fuesimilar ala conseguida enel blanco,donde nose apreciaronalteracionesmorfológicas.Lascélulasencontacto conelextractodelamuestradePHnopresentaron diferen-ciasmorfológicasconrespectoalascélulasencontactoconel blanco.LascélulasCCL-171encontactoconlasdistintas con-centracionesdelextractoobtenidoapartirdelamalladePBR tampocomostrarondiferenciasmorfológicasconlascélulas encontactoconmediocompletoEMEM.Conestosdatos, el ensayodecitotoxicidadseconsideróapto.

-Evaluacióncuantitativa.Elcontrolpositivodecitotoxicidad (PVC-Sn)fueletalentodaslasconcentraciones,mientrasque el controlnegativodecitotoxicidad (polietileno)presentaba unaviabilidadsimilaralblanco(100%deviabilidad).Según

120

A

B

100 80 60 40 20 0 % Viabilidad 120 100 80 60 40 20 0 % Viabilidad 100X 75X 50X 25X 100X 75X 50X 25X PE PE PVC-Sn 100X 75X 50X 25X 100X 75X 50X 25X PE PE PVC-Sn Malla PH1 Malla PBR1

Figura3–Viabilidadcelulardelextractoobtenidoapartir delamallaPH(A)yPBR(B).

establecelanormaUNE-ENISO10993-5:2009,lamuestradel ensayotienepotencialcitotóxicosilaviabilidadsereducepor debajodel70% respectoalblanco,porloquelosextractos obtenidosapartirdelamalladePHydePBRnoresultaron citotóxicosenningunadesusdiluciones.

Ensayodeadhesiónyproliferacióncelular

Las célulasCCL-171 cultivadassobreel poliestirenoque se habíanadheridoalcabode24hproliferabantantoa72hcomo a7días.Sisecalculaeltiempoquetardanenduplicarlas célu-lasCCL-171,seobtienequeestalíneacelularcultivadasobre unsustratoadherenteduplicabasupoblacióncada54h.En lasmuestrasdePHydePBRrecortadasenformadediscoa los7díasladesviaciónestándarobtenidaparalacantidadde célulasadheridasenambasmuestraseramuyelevada,dato quesugierequelamanipulacióncontijerasafectaal recubri-mientoyqueestenoerahomogéneoenlosdiscosensayados. Sinembargo,aunqueinicialmenteseadheríanunporcentaje mínimorespectoaladensidadcelularsembrada,lascélulas adheridassíerancapacesdeproliferarsobreestasmuestras. Noobstante,existendiferenciassignificativasentreelnúmero decélulasquehanproliferadoalcabodeunasemanasobre PHyPBR,yelPHeselrecubrimientoconmáscapacidad anti-proliferativa.Enlosvaloresdelnúmerodecélulasadheridasa lasmuestrasdePHydePBRcortadasenformadecuadrado, tambiénladesviaciónestándara72hdePHya72hy7díasde PBReramuyalta,loquesugierequeelrecubrimientonoera deltodohomogéneoenlosdiscos.Noobstante,elnúmerode célulasobtenidasalcabodeunasemanadeincubaciónsobre

ambosrecubrimientoseramenorqueenlasmuestrasdePHy dePBRmanipuladasenformadedisco.Además,entreelvalor de72hy7días,lapoblacióncelularnoeracapazdeduplicarse sobrePHnisobrePBR.Enestesentido,aunqueunporcentaje mínimodecélulasCCL-171respectoalsembradoeracapazde adherirsealas24h,suproliferaciónseveíaralentizadaenel tiempo,yestapoblacióneraincapazdeproliferarapartirde los3díasdecultivoenambostratamientos.

Bajolascondicionesdescritasysegúnlaevaluación cuan-titativa:

1) LascélulasCCL-171queseadheríanalcabode24hsobre lasmuestrasdePHydePBR,recortadasenformadedisco, erancapacesdeproliferaralos3y7días.

2) LalíneacelularfibroblásticaCCL-171eracapazdeadherirse sobrelasmuestrasdePHydePBR,cortadassinexcesiva manipulaciónenformadecuadrado.Sinembargo,a par-tir deltercer día, latasa de proliferación de lascélulas seralentizabasignificativamente,loqueconseguíaquela líneacelularfueraincapazdeduplicarseyproliferar. Elpolímeroquedemostrómayorcapacidad antiprolifera-tivaeselrecubrimientodePH.Debidoaestecomportamiento

invitro,paraelrecubrimientodelasmallasdepolipropilenoy posteriorimplantedeestasenelanimaldeexperimentación, seeligióelPH.

Estudioinvivo:implantedelasprótesis

Todoslosanimalespresentaronuncomportamiento posope-ratorio normalyllegaronenbuenas condiciones aldíadel sacrificio.

Losresultadosmacroscópicosdelaformaciónadherencial enlos3gruposdeestudioestándetalladosenlatabla2.Casi latotalidaddelasadherenciasseencontraronsituadasenlos bordesdelamallay/ocercadelacicatrizlaparotómica(fig.4A). El estudio histológico con hematoxilina-eosina mostró, en las muestras extraídas a los 15 días y en la interfaz malla/paredabdominal,lapresenciadetejidofibrosolaxo,con considerable neovascularización ycon celularidadvariable, segúnloscamposobservados.Losprincipalestiposcelulares observadosfueronlinfocitos,polimorfonuclearesneutrófilosy eosinófilos.Alos3mesesseobservótejidofibrosodenso,con escasaneovascularizaciónypredominiodecélulas mononu-cleadas,peroenescasacantidad.Enlavertienteperitoneal,a los15díasdelimplante,pudoobservarserevestimiento meso-telial.

En elanálisis con microscopiaelectrónica debarridose observó unacompleta yuniforme reperitoneizaciónde las prótesisyaenlosanimalessacrificadosalos15días.La pre-senciadetejidofibrosoirregularydesordenadoseobservóen lavertienteparietaldelosimplantes,dondeestossehabían fijado(fig.4B).

Análisisestadístico

Para el análisisestadístico, primeramentesevaloróel por-centajedesuperficieocupadoporadherenciasencadamalla extraída.Alcompararlavariablegrupo(15,45y90días)con lavariableningunaadherencia(sí,no),eltest␹2dePearsonno

Tabla2–Resultadosmacroscópicosglobalesdelosdiferentesimplantes

Animal Sacrificio Clasificaciónadherencias(Zühlkeetal.32_)y

peritoneizacióndelamalla

Notas

1U 15días GradoIIenelbordeenproximidadconlacicatriz laparotómica,0enelrestodelamalla.Peritoneización parcial

Adherenciasdegradoivenlacicatrizdelaparotómica, quehandeterminadolalesióndelcolonenelmomento delaccesoalacavidadperitoneal.Lamallase

encontrabacercadelacicatrizlaparotomía.Nosehan evidenciadozonasderetraccióndelamalla

2U 15días GradoIIenelbordeenproximidadconlacicatriz laparotómica,0enelrestodelamalla.Peritoneización completa

Adherenciasdegradoivenlacicatrizlaparotómica.La mallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica. Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 3U 15días GradoIenelbordeenproximidadconlacicatriz

laparotómica,0enelresto.Peritoneizacióncompleta

Adherenciasdegradoienlacicatrizlaparotómica.La mallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica. Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 4U 15días Grado0.Peritoneizacióncompleta Lamallaseencontrabalejosdelacicatrizlaparotómica.

Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 5U 15días Grado0.Peritoneizacióncompleta Adherenciasdegradoiienlacicatrizlaparotómicayde

gradoientreasasyperitoneoparietal.Lamallase encontrabalejosdelacicatrizlaparotómica.Nosehan evidenciadozonasderetraccióndelamalla

6U 15días GradosIyII.Peritoneizaciónparcial Adherenciasdegradoientremallayperitoneovisceral ydegradoiientreperitoneovisceralylosbordesdela malla.Lamallaseencontrabacercadelacicatrizde laparotomía.Nosehanevidenciadozonasderetracción delamalla

7U 15días GradoIIenunborde.Grado0/Ienelrestodelamalla. Peritoneizaciónparcial

Adherenciasdegradoientreasasyperitoneoparietal. Lamallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica. Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 8U 15días Grado0.Peritoneizaciónparcial Adherenciasdegradoiienlacicatrizlaparotómica.La mallaseencontrabalejosdelacicatrizlaparotómica. Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 9U 15días Grado0.Peritoneizacióncompleta Lamallaseencontrabalejosdelacicatrizlaparotómica.

Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 10U 15días GradosIyIIconelbordedelamallaenproximidadcon

lacicatrizlaparotómica,0enelrestodelamalla. Peritoneizaciónparcial

Elbordesuperiordelamallaseencontrabaen proximidadconlacicatrizlaparotómica.Nosehan evidenciadozonasderetraccióndelamalla

1K 45días Grado0.Peritoneizacióncompleta Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 2K 45días GradosIyII.Peritoneizacióncompleta Lasadherenciasseconcentrabanenlazonadelos

bordesdelamalla.Nosehanevidenciadozonasde retracción

3K 45días Grado0.Peritoneizacióncompleta Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 4K 45días Grado0.Peritoneizacióncompleta Lamallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica.

Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 5K 45días Grado0.Peritoneizacióncompleta Lamallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica.

Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 6K 45días GradosIIyIII.Peritoneizacióncompleta Lasadherenciasestabanconcentradasenlazonadelos

bordesdelamalla.Lamallaseencontrabacercadela cicatrizlaparotómica.Nosehanevidenciadozonasde retraccióndelamalla

7K 45días Grado0.Peritoneizacióncompleta Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 8K 45días Grado0.Peritoneizacióncompleta Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 9K 45días Grado0,ienproximidaddelacicatrizlaparotómica.

Peritoneizacióncompleta

Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 10K 45días Grado0.Peritoneizacióncompleta Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 1W 90días Grado0.Peritoneizacióncompleta Lamallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica.

Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 2W 90días Grado0.Peritoneizacióncompleta Lamallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica.

Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 3W 90días Gradoienelbordeenproximidadconlacicatriz

laparotómica,0enelrestodelamalla.Peritoneización completa

Adherenciasdegradoiienlacicatrizlaparotómica.La mallaseencontrabalejosdelacicatrizlaparotómica. Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 4W 90días GradosIyIIenelbordedelamallaenproximidadcon

lacicatrizlaparotómica.Grado0enelrestodelamalla. Peritoneizacióncompleta

Adherenciasdegradoiienlacicatrizlaparotómica.La mallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica. Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla

–Tabla2(Continuación)

Animal Sacrificio Clasificaciónadherencias(Zühlkeetal.32_)y

peritoneizacióndelamalla

Notas

5W 90días GradoIenelbordeenproximidadconlacicatriz laparotómica,0enelrestodelamalla.Peritoneización completa

Lamallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica. Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 6W 90días GradoIenelbordeenproximidadconlacicatriz

laparotómica,0enelrestodelamalla.Peritoneización completa

Adherenciasdegradoienlacicatrizlaparotómica.La mallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica. Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 7W 90días GradosIyIIenelbordeenproximidadconlacicatriz

laparotómica.Grado0/Ienelrestodelamalla. Peritoneizacióncompleta

Adherenciasdegradoiienlacicatrizlaparotómica.La mallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica. Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 8W 90días GradosIyIIenelbordeenproximidadconlacicatriz

laparotómica.Grado0/Ienelrestodelamalla. Peritoneizacióncompleta

Adherenciasdegradoiienlacicatrizlaparotómica.La mallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica. Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 9W 90días Grado0.Peritoneizacióncompleta Lamallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica.

Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla 10W 90días Grado0.Peritoneizacióncompleta Lamallaseencontrabacercadelacicatrizlaparotómica.

Nosehanevidenciadozonasderetraccióndelamalla

90 días 45 días 45 días 45 días 15 días 45 días 15 días 45 días

A

C

E

G

F

H

B

D

Figura4–A)Resultadosmacroscópicosdelaformaciónadherencialendiferentestiemposdeestudio.B)Vertiente

peritonealeintegracióntisularenlamicroscopiaelectrónicadebarridoalos15y45díasdelimplante.C)Sacrificio45días. D)Sacrificio45días.E),G)yH)Imágenesdemicroscopiadebarridodemallasexplantadasenconejossacrificadosa45días. F)Imagendemallaexplantadaenconejosacrificadoa15días.

fuesignificativo(␹2_{=2.4;p>0.05),deformaqueelgradoyla} cantidaddeadherenciasnocambianenlosdistintosgrupos.

Para establecer aqué grupo sehabía asociado lamayor superficiedeadherencias(entérminosdeporcentaje)se uti-lizóunaANOVAaunavía(FANOVAdeFischer).Eltestnofue significativo(F=2.79;p>0.05),conloquesepuede conside-rarquenoexistendiferenciasestadísticamentesignificativas entrelospromediosdesuperficiedenoadherenciamedidos enlosdiferentesgruposestudiados.

Discusión

El incremento de los procedimientos laparoscópicos en la reparacióndelosdefectosdeparedabdominalylanecesidad dedisponerdemateriales protésicosquealmismotiempo puedan ser colocadosen contacto directocon lasvísceras abdominalesyposeancaracterísticasmecánicasadecuadas (bajopeso, memoria elástica, etc.)han impulsado notable-mentelasinvestigacionesenlasúltimosa ˜nossobrenuevos biomateriales.

Nuestrogrupohapolarizadosuatenciónenlacombinación polipropileno-poliuretanoporvariosmotivos:a)unaanterior experiencia con el poliuretano, en una forma biodegrada-ble,implantadointraperitonealcomoprótesisvascular,que habíademostradoclaramentesusfuncionesdeandamiajey laescasatendenciaainducirlaformacióndeadherencias24,25_; b)elanálisisdelaliteraturayenparticulardelosestudiosde Bellónetal.22_{ydeSodjietal.}23_{,quehabíandemostradocómo,} enprótesiscompuestasdepolipropileno-poliuretano,el com-portamientoenlainterfazperitoneo-poliuretanoseacercaba almodeloidealde prótesis(características mecánicas ade-cuadas,prevencióndeformacióndeadherencias,funciónde andamiajeenlaneoperitoneizacióndelaprótesis,ausenciade toxicidad,etc.).Enparticular,lostrabajosdeBellónetal.3,22,33 habíandemostradolamayoreficaciaantiadhesiogénicadela interfazpoliuretano-peritoneorespectoaotrasprótesis com-puestasdisponiblesenelmercado.

Nuestroobjetivoenelpresentetrabajohasidodesarrollar unaprótesisconlascaracterísticasdeunaconvencionalde polipropileno,peroalavezconpropiedades antiadhesiogé-nicasydeandamiajeparaconseguirconambaspropiedades unabuenamesotelizaciónyunbuenneoperitoneo.Otro obje-tivofueelaborarunaprótesisconsuficientememoriaelástica paraquealserintroducidaporlostrocaresdelaparoscopia pudierarecuperarsuformaoriginalunavezqueestuviera ubi-cadaenlacavidadperitoneal.Ellofacilitaríasumanipulación eneltranscursodelareparaciónquirúrgica.

Paraconseguirestosobjetivos,hemosrecubiertouna pró-tesisdepolipropilenoconunacapadepoliuretanodeespesor micrométrico,deformaqueelpesoyelespesortotalesdel poliuretanoutilizadoseanirrelevantesrespetoalamasafinal delaprótesis,perosuficientesparagarantizarlasfunciones antiadhesiogénicasydeandamiaje.

Sehapuestoespecialatenciónenelcontrolcuantitativo ycualitativode lacomposiciónde laprótesis.Los ensayos invitrodecitotoxicidad,deadhesiónydeproliferacióncelular noshandemostradoqueelrecubrimientoconPHposeelas mejorescapacidadesantiproliferativas,porloquehemos ele-gidoestavariantepararealizarelprototipo.Lacaracterización

microestructuraldelasprótesisrealizadaenlamicroscopia electrónicadebarridodemostróqueelrecubrimientoconPH deaproximadamente2␮mdeespesornospermitía conside-rarlacantidaddepoliuretanocomoinsignificanterespetoala composicióntotaldelaprótesis.Portanto,lacaracterización óptimadelaprótesisgenerada(PH)traslosestudiosinvitro nospermitieronabordarlosestudiosinvivo.

El implante de las mallas en los animales de experi-mentación mostróun buen comportamientoenlainterfaz peritoneal,puesexistíaunabuenamesotelizaciónalos15días delosimplantes.Deacuerdoconotrosautores34_, considera-mosquelosprimeros7díasdespuésdelimplantesonclaves enlaformaciónadherencial.Apartirdelasegundasemana, dicho procesoseestabiliza35_{. Ennuestromodelo,la} forma-ciónadherencial seobjetivóenlaszonas periféricasdelos implantes,ynoenlapartecentraldeestos.

Apartirdelosresultadosobtenidos,podemosafirmarque laprótesisquehemosensayado poseelasmismas caracte-rísticasdemanejabilidadqueunaprótesisdepolipropileno, peroconelvalora ˜nadidodequealposeerunrecubrimiento depoliuretanotienepropiedadesquelepermitensercolocada enunainterfazperitoneal.

Finalmente,otroapartadoqueconsideramosderelevancia sonloscostesdeelaboraciónyfabricacióndeestaprótesis, yaquesonsignificativamentemásreducidosquelosdeotras prótesistipocompuesto.

Enconclusión,podemosafirmarquedespuésdelos estu-diosrealizadostantoinvitrocomoinvivolaprótesisdise ˜nada muestrauncomportamientoóptimoencuantoa biocompa-tibilidad, manejabilidad y respuesta tisular,lo que lahace óptimaparaimplantarseensituaciónintraperitoneal.

Financiación

EstetrabajofuefinanciadobajoelProgramaReddeCiencia, TecnologíaeInnovacióndelaDiputaciónForaldeGuipúzcoa (Espa ˜na)paraelperiodo2009-2011.

EltrabajohatenidoelsoportefinancierodeCajaNavarra.

Conflicto

de

intereses

Losautoresdeclarannotenerningúnconflictodeintereses.

b

i

b

l

i

o

g

r

a

f

í

a

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