AVANCES EN LA CRIOPRESERVACIÓN DE OVOCITOS Emilia R. Lliteras y M. Chong
Centro de Investigaciones para el Mejoramiento Animal de la Ganadería Tropical
Ministerio de la Agricultura. Avenida 101 No. 6214 entre 100 y 62 Reparto Loma de Tierra. Cotorro, Ciudad de La Habana. Correo electrónico: [email protected]
RESUMEN
Aunque se ha logrado congelar y descongelar ovocitos y obtener nacimientos luego de la maduración, fertilización y cultivo in vitro, en la actualidad no alcanza un alto nivel de introducción en ganadería vacuna. La velocidad de congelación, el tipo de crioprotector, el estadio de maduración nuclear y la composición de la solución de vitrificación, constituyen los factores de mayor influencia en la supervivencia posdescongelación. Diversos métodos se han utilizado en la crioconservación de ovocitos, no obstante, la vitrificación es una alternativa viable para reducir los daños durante la congelación y la descongelación, al permitir obtener mayores tasas de sobrevivencia y viabilidad embrionaria.
Palabras clave: ovocito, crioconservación, vitrificación
ADVANCES IN OOCYTES CRYOPRESERVATION ABSTRACT
Although it has been feasible oocytes freezing and thawing and to obtain births after in vitro maturation, fertilization and culture, presently there is not a high level of introduction. The freezing rate, the type of cryopreserver, the nuclear maturing stage and the composition of the vitrification solution, are the factors of greater influence on post-freezing survival. Different models have been used for oocytes for cry preservation; however, vitrification is a viable alternative to reduce damages during freezing and thawing, allowing greater survival rates and embryonic viability.
Key words: oocytes, cryopreservation, vitrification
INTRODUCCIÓN
La crioconservación es una importante herramienta para la conservación in situ (Gustavo et al. 2007) y en la mayoría de las especies de
animales es un desafío, debido a su compleja estructura que puede ser dañada por la exposición durante varios minutos a temperaturas por debajo de 0 grados (Massip 2003). No obstante, desde los primeros años de la década de 1980, se establecieron las condiciones óptimas de maduración, fertilización y cultivo, para su posterior desarrollo embrionario (Galli y Lazzari 2008).
Debido a sus características biológicas específicas, diversas son las estrategias que se han utilizado para minimizar las lesiones celulares tras la congelación y descongelación de ovocitos (Coticchio et al. 2004). Así, desde que
Whittingham (1977) logró nacimientos de ratones vivos luego de la maduración y fertilización in vitro de ovocitos congelados, las investigaciones se centraron en los efectos de los crioprotectores (CP) (Tripodi et al. 2001), las
bajas temperaturas y la supervivencia posdescongelación. La pérdida de la integridad estructural y/o funcional (Hotamisligil et al.
1996), indican que los ovocitos son particularmente sensibles a las condiciones no fisiológicas.
El desarrollo de la criopreservación de ovocitos permitirá disponer de una fuente estable de los mismos para el desarrollo de la fertilización in vitro y otras biotecnologías relacionadas. Algunos resultados en esta temática se logran utilizando los protocolos de congelación de embriones (Martino et al. 1996),
problemas morales y éticos relacionados con los gametos y/o almacenamiento de embriones (Van der Elst 2003).
El presente trabajo pretende dar una visión general de los métodos de crioconservación y, en particular de la vitrificación de ovocitos, así como exponer los últimos avances y procedimientos en el tema.
Características biológicas de los ovocitos El ovocito es la célula más grande (~80-120 µ diámetro) del mamífero y está rodeada por la zona pelúcida (ZP) y por distintas capas de células de la granulosa formando el complejo cumulus ovocito (CCO). Las células de la granulosa inmediatamente adyacentes al ovocito, la corona radiata, tienen largas extensiones citoplasmáticas las que penetran la ZP y terminan en dilataciones bulbosas estrechamente asociadas con la membrana del ovocito (Massip 2003). La presencia de estos procesos y de las uniones gap desempeñan un papel importante en la cooperación metabólica entre el ovocito y las células del cúmulo durante la fase de crecimiento del mismo (Van Soom et al. 2002).
Después de la fecundación ocurre un aumento del calcio libre en el citoplasma, modificando la fuerza iónica y el potencial de membrana (Gook et al. 1993). Estas alteraciones
facilitan la penetración de los CP y el agua a los embriones, lo que promueve la deshidratación y reduce la formación intracelular de hielo, lo cual determina una mayor tasa de sobrevivencia. Estos factores explican por qué los embriones son más tolerantes a la congelación y descongelación que los ovocitos (Chen 2003).
Comparado con los embriones el volumen del ovocito es mucho mayor, por lo que la relación superficie/volumen celular es menor, dificultando así, su deshidratación (Fabbri 2000). Los ovocitos presentan un alto tenor de lípidos intracelulares que pueden inducir la formación de hielo intracelular, lo cual se asocia a la sensibilidad alta a la congelación.
El ovocito inmaduro presente en el folículo antral y arrestado en la profase (primera fase de la división meiótica), tiene un gran núcleo llamado vesícula germinal (VG). Bajo el efecto de las gonadotropinas la VG se rompe, se forma el plato metafásico y se inicia la segunda fase de la división meiótica o metafase II (MII)
caracterizada por la presencia del primer cuerpo polar. Los cambios fundamentales en la estructura y función de los ovocitos ocurren en su desarrollo, desde la VG donde los cromosomas están protegidos en su forma condensada hasta el estadio de MII cuando los cromosomas y el huso acromático están libremente en el citoplasma (Henao y Trujillo 2000).
Los ovocitos maduros presentan un sistema de husos formados por microtúbulos que están constituidos por la polimerización de dímeros de Tubulina α y β, cruciales en eventos como la fecundación, el fin de la meiosis, la formación de segundo cuerpo polar y la migración de los pronúcleos. La desorganización del huso provoca la dispersión de los cromosomas, imposibilita la fertilización (Chen 2000) e interrumpe el desarrollo embrionario (Rho et al. 2002, Chen et al. 2004), con alteraciones de la funcionalidad de
la ZP que traen consigo la poliespermia y activación partenogenética (Zhou et al. 2002).
Otros componentes importantes son el citoesqueleto formado por microtúbulos y microfilamentos y los gránulos corticales en el citoplasma. El mantenimiento de integridad estructural y funcional de la membrana plasmática, los gránulos corticales, el huso acromático, las mitocondrias, el aparato de golgi, el retículo endoplasmático) es crucial para la exitosa fertilización y la división celular. Aunque el exocitosis de los gránulos corticales es un paso crucial para prevenir la polispermia, la ruptura del huso acromático puede causar anormalidades cromosómicas en los embriones resultantes.
El citoplasma es químicamente similar a las células somáticas, compuesto por RNA, proteínas y sistemas enzimáticos (fosfatasas, deshidrogenasas, y amilasas); el núcleo contiene los cromosomas compuestos por DNA y proteínas (ribonucleoproteínas); la membrana vitelina tiene la misma estructura y propiedades de la membrana plasmática de las células somáticas (difusión y transporte activo); la zona pelúcida que envuelve el ovocito, de gran importancia en el estado inicial del proceso de fertilización. Esta membrana puede ser disuelta por enzimas proteolíticas tales como la tripsina y la quimotripsina.
Las membranas protegen el óvulo e intervienen en la absorción selectiva de iones inorgánicos y sustancias metabólicas y los
cambios físico-químicos que ocurren durante la ovulación, fertilización, división y expansión de los embriones. Algunos estudios demostraron la presencia de receptores específicos para los espermatozoides en la zona pelúcida. A este nivel ocurre el “bloqueo de la poliespermia” y se producen durante la ovogénesis, varias proteínas tales como la actina (relacionada con la división celular y motilidad de las células) y las glicoproteínas (5-10% del total de proteínas sintetizadas) cuyo número varía con la especie. Los crioprotectores
Los CP gobiernan el procedimiento de congelación lenta y limitan el transporte de agua a través de la membrana celular. Este proceso depende de la composición de la membrana (Ledda et al. 2001), características de la
permeabilidad en dependencia de la temperatura del agua y de los CP y la proporción superficie-volumen (Mazur y Schneider 1986). Estos parámetros permiten el cálculo de métodos eficientes para la adición y eliminación de los CP y la tasa de congelación y descongelación necesarias, para evitar la formación de hielo intracelular conocida como “efecto solución” (Karlsson et al. 1996).
Los CP se utilizan para provocar la deshidratación parcial de los ovocitos y evitar la formación de cristales que pueden provocar daños celulares (Núñez et al. 2000). Por su
grado de penetración en la célula pueden ser intracelulares o extracelulares. Los intracelulares (glicerol (G), dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2 propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes), son de bajo peso molecular y deshidratan la célula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma (Miyake et al.
1993).
Los extracelulares como el polivinil pirrolidon (PVP), polivinil alcohol (PVA) glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sucrosa, lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares, tienen un alto peso molecular (Kuleshova et al. 1999) y extraen el agua libre
intracelular utilizando la diferencia de presión osmótica sin penetrar a la célula y son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de las membranas (Sommerfeld y Nieman 1999). No obstante, se señalan daños del DNA
(Bouquet et al. 1993) y alteraciones de las
glicoproteínas de la ZP, sobre todo de la ZP2 (Moller y Wassarman, 1989) por el efecto tóxico de los CP.
Los cambios en el volumen celular afectan varios parámetros que desempeñan un importante papel en la supervivencia del ovocito; incluso la integridad de las organelas (McWilliams et al. 1991) y la membrana
plasmática (Hotamisligil et al. 1996), por lo que
deben conocerse los límites de tolerancia osmótica, para evitar la deshidratación e hidratación excesiva y predecir la adición y eliminación de los CP. Según Mazur et al.
(1984), altas concentraciones de soluto intracelular y extracelular durante la congelación lenta pueden provocar daños celulares debido al efecto soluto.
En estudios desarrollados por Isachenco y Nayudu (1999), para evaluar el efecto de la yema de huevo en la flexibilidad de la membrana de ovocitos de ratón inmaduros, se demostró que la misma induce el incremento de la supervivencia posdescongelación (80%), la maduración (84%) y la configuración normal en MII (45%). Resultados de Dinara et al. (2001) sugieren que
la adición de antioxidantes en el medio de congelación mejora la supervivencia posdescongelación y la tasa de fertilización de ovocitos de ratón criopreservados.
Los daños inducidos por los CP en los ovocitos y la reducción de la tasa de fertilización in vitro se deben a los cambios en la zona pelúcida y la exocitosis prematura de los gránulos corticales (Carroll et al. 1990). Más
tarde, Hotamisligil et al. (1996), demostraron
que era posible obtener embriones a partir de ovocitos de ratón en MII congelados con 6 molar de EG + 0.5 molar de sacarosa. La exposición al PG aumentó significativamente el Ca2+ intracelular, mientras que el DMSO, o el glicerol no provocaron ningún cambio perceptible. Estudios desarrollados por Asada y Fukui (2000), demostraron que la congelación de ovocitos de mamífero utilizando EG no afecta la proporción de ovocitos morfológicamente viables y que los mismos pueden reasumir la meiosis in vitro, a pesar de los daños inducidos por el procedimiento de congelación.
Estudios desarrollados durante los últimos años en humanos (Wininger y Kort 2002), y animales (Lane y Gardner 2001), se dirigieron a
estabilizar la membrana de los ovocitos agregando macromoléculas a la solución de vitrificación (SV) con buenos resultados. Liebermann et al. (2003), lograron que una
mezcla de EG y DMSO (con macromoléculas o sin ellas) es un método eficaz para la vitrificación de ovocitos humanos y que la adición de polivinil alcohol (PVA) al 0.1% como sustituto del suero en la SV de ovocitos bovinos, aumenta el porcentaje de embriones producidos
in vitro en estadio de mórula (Asada et al. 2002).
Horvath y Seidel (2008), señalaron que la adición de 2% de BSA y 20% de SFB por 10-30 minutos antes de la vitrificación, no mejora la tasa de desarrollo, pero la inclusión del SFB en el medio de manipulación resulta en una mayor producción de blastocitos (10.8%) al día 9 de cultivo que cuando se utiliza la BSA (5.3%).
En trabajos desarrollados por Checura y Seidel (2007), se utilizó el método Cryoloops y un protocolo de vitrificación con período de equilibrio corto (H-TCM-199+10% EG+10% DMSO+20% SFB por 30s, seguido de H-TCM-199+20% EG+20% DMSO+20% SFB+0.48M galactosa por 20s) para evaluar el efecto del reemplazo del SFB por diferentes macromoléculas en la solución de vitrificación. Acorde con sus resultados; 20% SFB, 1% y 2% BSA, 6% y 18% Ficoll, 6% y 20% PVP, 1% PVA, y la combinación de 18% Ficoll+1% BSA, y 6% PVP+1% BSA proveen similar protección durante la vitrificación de ovocitos. Valores altos (6%) y bajos (0.3%) de BSA, y 0.3% de PVA resultan en bajas tasas de producción de blastocitos (P<0.05) con respecto al control no vitrificado.
Trabajos publicados por Lim et al. (1999),
indican que ovocitos bovinos madurados in vitro hasta el estadio de MII y descongelados rápidamente son morfológicamente normales después de la congelación con dimetilsulfóxido DMSO (86%) o 1,2-propanodiol (PROH) (83%) que con glicerol (62%). Posterior a la inseminación in vitro se observó una mayor tasa
de penetración con DMSO (79%) o PROH (76%) que con glicerol (48%). El porcentaje de ovocitos que se desarrolló hasta el estadio de dos células a las 48 h postinseminación también fue significativamente superior (P<0.05) con DMSO (51%) y PROH (54%) que con glicerol (33%). Sin embargo, un incremento significativo de la cantidad de embriones de 8 células (46 vs. 21%)
a las 72 h postinseminación y mórulas (14 vs. 6-8%) resultaron de ovocitos congelados con PROH que con DMSO o glicerol, respectivamente.
Dificultades en el proceso de congelación La criopreservación es un procedimiento de varios pasos, que involucra una exposición inicial de las células y tejidos a los CP, la congelación a temperaturas por debajo de cero, el almacenamiento, la descongelación, y finalmente, la dilución y eliminación del CP, con el retorno a un ambiente fisiológico que permite el desarrollo. Las células o tejidos deben mantener su integridad estructural a lo largo de estos procedimientos.
Los principales daños durante la crioconservación de ovocitos de mamífero ocurren en la membrana plasmática, y son irreversibles durante la fase de transición de los lípidos de membrana, donde la misma se vuelve temporalmente porosa. Las membranas con un alto contenido de colesterol son más fluidas a bajas temperaturas y por consiguiente, menos sensibles a la congelación (Horvath y Seidel 2006). Los estudios de transición fásica han empleado la espectroscopia infrarroja transformada de Fourier, una técnica extremadamente sensible al orden conformacional lipídico (Mendelson y Moore 1988).
Según Arav et al. (1996), la fase de
transición de los lípidos de membrana de ovocitos en fase de VG ocurre entre 13 y 200C, y alrededor de los 100C para los ovocitos en MII. Cuando los ovocitos en fase de VG fueron congelados a 130 C, solo el 40% de ellos mantuvo la integridad de la membrana a diferencia de la exposición a 40 C (51%) y 380 C (78%). En contraste, no se observaron diferencias significativas en la integridad de la membrana para ovocitos en metafase II congelados a la misma temperatura. En ovocitos en fase de VG congelados a 40C, el 26% se maduró y el 19% se fertilizó. Se observó una disminución de la tasa de fertilización (60% vs. 76%) y el incremento de la tasa de polispermia (24% vs. 12%) para ovocitos en metafase II congelados y no congelados respectivamente.
En trabajos desarrollados por Horvath y Seidel (2006), se demostró que la incubación de
ovocitos en varias concentraciones de colesterol (0. 0.75 ó 1.5 mg/l) en presencia de SFB por 25-45 minutos, no resulta en diferentes tasas de desarrollo después de la descongelación y el cultivo in vitro. Sin embargo, se observó un incremento de la tasa de división y el total de embriones de 8 células a partir de ovocitos preincubados por 1 h con 2 mg/ml de colesterol y cultivados en medios químicamente definidos en comparación con aquellos no tratados con colesterol o fueron vitrificados en presencia de SFB (55, 41 y 38% de embriones de 8 células respectivamente).
Según Rizos et al. (2001), las condiciones de
cultivo in vitro después de la vitrificación pueden afectar la calidad y el rendimiento de embriones. Se ha demostrado que el empleo del fluido oviductal sintético en el cultivo in vitro
induce un incremento significativo del número de embriones al día 7 (31.3 vs. 13.2%) y 8 (36.8 vs. 23.7%) en comparación con el cultivo en medio de cultivo de tiroide (TCM199) con células de la granulosa. Nakagata (1992) informó nacimientos vivos a partir de ovocitos de ratón en MII después de la vitrificación con 2 M de DMSO + 2 M de acetamida + 4 M de PG, con una baja tasa de supervivencia fetal (3%).
El estadio de maduración nuclear afecta la capacidad de supervivencia del ovocito a la crioconservación. Se ha demostrado que ovocitos inmaduros en estadio de VG, pueden sobrevivir a la congelación y ser cultivados para producir embriones viables (Watson et al. 1987; Gook et al. (1993). No obstante, la elección de una fase
intermedia, reduciría los problemas asociados a la crioconservación de ovocitos en fase de VG o MII. Magnusson et al. (2008), demostraron que
la concentración del crioprotector y el estadio de maduración nuclear afectan el potencial de desarrollo de los ovocitos bovinos después de la vitrificación.
Se han obtenido gestaciones (Yang et al.
1998) y nacimientos (Kubota et al. 1998), a
partir de ovocitos bovinos congelados en estadio de VG. Los ovocitos en estadio de VG tienen una menor conductibilidad hidráulica y como consecuencia del proceso de congelación se presentan frecuentes rupturas de las ¨gap junctions¨ (uniones del ovocito con las células del cúmulo) que intervienen en el intercambio metabólico y la maduración del ovocito (Hochi 1997).
En trabajos desarrollados por Men et al.
(2002), se evaluó el efecto de la fase de meiosis y dos protocolos de maduración en la resistencia de ovocitos bovinos a la vitrificación. Se utilizaron ovocitos en fase de vesícula germinal rota y MII así como ovocitos madurados por 22 h, en medio suplementado con FSH o LH. En el primer experimento se obtuvo una tasa de división similar para ovocitos en ambos estadios (53.56 vs. 58.01%). Sin embargo, la proporción de embriones obtenidos fue significativamente superior a partir de ovocitos vitrificados en MII que en vesícula germinal rota (1.06 vs. 8.37%, respectivamente). La tasa de división de ovocitos en MII utilizando una suplementación con LH fue superior que cuando se suplementó con FSH (61.13 vs 50.33%), así como la proporción de embriones formados (11.79 vs. 5.19%).
Según Pellicer et al. (1988), congelar
ovocitos con una mayor cantidad de células del cúmulo, garantiza una mayor tasa de supervivencia posdescongelación. De acuerdo con los resultados de Ruppert-Lingham et al.
(2003) y Modina et al. (2004), cuando los
ovocitos son denudados disminuye su potencial de desarrollo in vitro. Contrariamente, Chian et al. (2004), indican que ovocitos bovinos
madurados in vitro pueden ser vitrificados con éxito con una mezcla de EG y 1,2-propanodiol en ausencia de las células del cúmulo sin que se afecte la tasa de supervivencia pos- descongelación.
De acuerdo con los resultados presentados por Vieira et al. (2002), ovocitos vitrificados en
fase de VG con un 20% de ethilenglicol (EG), 20% de DMSO y 0.5 molar de sucrosa, son competentes para producir embriones. Se ha logrado la obtención de embriones a partir de ovocitos de ratón vitrificados en fase de VG y MII (Stachecki y Willadsen 2000).
Según Men et al. (2003), los bajos resultados
verificados en la congelación de ovocitos pueden ser debidos a la apoptosis (mecanismo de muerte celular programada) necesaria para el desarrollo normal y la homeostasis de los tejidos, proceso que puede activarse debido a una gran variedad de causas no fisiológicas, como la temperatura, la toxicidad, la oxidación y la radiación (Wyllie
et al. 1980).
El estudio de organismos que sobreviven en condiciones extremas de congelación indica que poseen la habilidad de aumentar el azúcar
intracelular, fundamentalmente la trealosa, como un mecanismo de protección y supervivencia (Crowe y Crowe 2000).
A causa de que los azúcares parece que necesitan estar presentes en ambos lados de una membrana celular para brindar protección óptima, cualquier azúcar utilizado en la crioprotección tiene que ser capaz de entrar al interior de la célula a través de la membrana plasmática (Chen et al. 2001). La limitada
habilidad de la trealosa para cruzar las membranas celulares es un obstáculo en la capacidad de utilización de la misma, por lo que se han ideado algunas estrategias para mejorar la habilidad de las células de mamíferos en utilizarla, incluyendo la microinyección (Eroglu
et al. 2002). En tal sentido, se estudia la
incorporación de azúcares al ovocito destinado a la congelación por microinyección (Wright et al.
2004).
Resultados de Carroll et al. (1990),
demostraron que los ovocitos de ratón expuestos a 1.5 molar de DMSO y PG mostraron cambios en la zona pelúcida y exocitosis prematura de los gránulos corticales. Sin embargo, Hotamisligil et
al. (1996), no encontraron diferencias
significativas en el desarrollo de embriones obtenidos a partir de ovocitos de ratón en metafase II criopreservados con 6 molar de EG y 0.5 molar de sacarosa.
El desarrollo de la vitrificación de ovocitos permitió acelerar la velocidad de congelación, reducir el tiempo exposición al crioprotector y el empleo de pequeños volúmenes del mismo (Kuleshova y Lopata 2002) y obtener embriones in vitro y nacimientos vivos en diferentes especies (Aono et al. 2003, Diez et al. (2005).
Contrariamente, Albarracin et al. (2005),
demostraron que la vitrificación tiene un efecto nocivo en la organización de huso acromático de ovocitos bovinos (Hyttel et al. 2000) y daña la
estructura del ADN (Men et al. 2003).
Estado actual de las metodologías empleadas en la vitrificación de ovocitos
El fenómeno de la vitrificación se investigó por primera vez por Luyet (1937) quien observó la propiedad de ciertos CP de solidificar sin la formación de cristales de hielo. Más tarde se demostró que era posible vitrificar embriones
murinos (Rall y Fahy 1985) y de Drosophila (Steponkus 1990).
La vitrificación es la solidificación de una solución a bajas temperaturas sin la formación de cristales de hielo (Vajta 2000), fenómeno que se obtiene con el aumento extremo de la viscosidad a grandes velocidades de enfriamiento eliminando la cristalización intracelular. No obstante, ocurren daños, principalmente tóxicos y osmóticos; por esta razón, se utilizan combinaciones de CP. La gran velocidad de congelación obtenida por este método permite disminuir el tiempo de contacto entre el ovocito y los CP, disminuyendo los efectos tóxicos y osmóticos, y reduce también el riesgo de que se produzcan lesiones por la exposición a bajas temperaturas, debido al rápido paso por la zona de "temperatura crítica" entre -15 y - 600C.
A partir de ese momento, la vitrificación comenzó a ser una alternativa viable para la criopreservación de ovocitos y tejido ovárico animal (Bosch et al. 2004, Pereira y Marques
2008), ovocitos humanos (Gosden 2005) con reducción de los daños durante la congelación y descongelación (Valojerdi y Salehnia 2005). Esto permitió el desarrollo de otras biotecnologías como la transferencia nuclear
(Atabay et al. 2004) y la inyección
intracitoplasmática de semen (ICSI) (Mavrides y Morrol 2005).
La vitrificación implica la inmersión directa dentro del nitrógeno líquido (NL) (Yang y Leibo 1999) que logra una tasa de enfriamiento de 14.000 a 24.000°C/minuto. La mayor parte de los métodos de vitrificación utilizan pajuelas francesas de 0.25 ml. cuyas dimensiones no permiten alcanzar velocidades de enfriamiento y calentamiento que sobrepasen los 2000ºC/min.
Vajta (1997), ensayó una técnica denominada Opend Pulled Straw (OPS) que consiste en adelgazar una pajuela plástica de 0.25 ml, calentándola sobre una platina y estirándola en su parte central, hasta que su diámetro interior llegue a 0.7- 0.8 mm (el diámetro inicial de una pajuela clásica es de 1,7 mm), y el grosor de las paredes a 0.07 mm (grosor inicial 0.15 mm). Luego de enfriada la pajuela es cortada en su parte más delgada. El ovocito es recogido por la parte más fina de la pajuela mediante capilaridad y luego esta es inmediatamente sumergida en NL. Estos cambios en las características de las pajuelas permiten un mayor contacto entre las
células y la fuente de frío, por lo cual, las velocidades de enfriamiento se incrementan notablemente.
El método OPS permite lograr una velocidad de enfriamiento de 20.000°C/minuto, logrando reducir el tiempo de exposición a los CP y los daños por el efecto tóxico de los mismos (Vieira
et al. 2002). Los cambios de temperatura en este
sistema son hasta 10 veces más rápidos que en el sistema clásico de vitrificación, con pajuelas estándar debido al reducido volumen de solución (0.5 ml vs 5 ml en las pajuelas normales), el
contacto directo entre la fuente de frío o de calor, la delgadez de la pared de las pajuelas, el rápido y fácil cargado de los ovocitos, menos riesgo de lesiones de la zona pelúcida y dilución inmediata de los CP durante el proceso de calentamiento (Vajta et al. 1998).
La vitrificación de ovocitos inmaduros equinos y bovinos por el método OPS con más de dos capas de células del cúmulo o vitrificados después de 36-40 (equino) o 22-24 (bovino) horas de maduración demostró que hubo diferencias significativas en la tasa de maduración de ovocitos bovinos (70%) y equinos (30%). La tasa de supervivencia no difiere entre grupos de tratamiento ni entre especies (Hurtt et al. 2000). Según Hochi (2003),
las lesiones celulares en ovocitos equinos inmaduros ocurren cerca de los sitios de unión o “gap-junctions”.
Según Albarracin et al. (2005) la
vitrificación de ovocitos de las vacas adultas mostraron una mayor sensibilidad a la exposición de los CP, mientras que el procedimiento de vitrificación parece tener un efecto más perjudicial en los ovocitos de ternera.
De acuerdo con los resultados de Hochi et al.
(2001), la supervivencia de ovocitos madurados in vitro es superior cuando se usa el método OPS, utilizando capilares de 1400 mm de diámetro (tasa de congelación, 3000 grados C/min; tasa descongelación, 8000 grados C/min). Se obtuvo una supervivencia de 86%, tasa de penetración del 79%, y un 69% de fertilización.
Velocidades similares fueron obtenidas utilizando micropipetas de vidrio (Mezzalira, 1999) confeccionadas a partir del calentamiento y enfriamiento de tubos de vidrio (micro hematocrito) hasta obtener un diámetro interno próximo a 0.35 mm. Estas micropipetas se utilizan abiertas y las estructuras se envasan por
capilaridad. Una ventaja de su utilización es que tienen un menor diámetro en relación con el OPS (0.8 mm). Resultados de Vieira et al. (2008)
refieren que la vitrificación de ovocitos bovinos inmaduros usando micropipetas de vidrio en nitrógeno líquido (-196 grados C) o super enfriado (< or =-200 grados C), resulta en blastocitos viables y nacimiento de terneros vivos después de la producción in vitro de
embriones.
El método Cryoloop descrito por Lane (1999) permite el contacto directo entre los ovocitos contenidos en la SV y el NL, aumentando la velocidad de enfriamiento (Begin
et al. 2003). Estos recipientes requieren
volúmenes muy pequeños de la suspensión que contiene el ovocito o embrión (menos de 1-2 ml) y en consecuencia, el número de muestras se restringe. Como alternativa surgió el método Nylon Mesh Holder descrito por Matsumoto et al. (2001), que consiste en el uso de una malla de
nailon de 60 µm de espesor, confeccionadas de forma triangular, para facilitar la manipulación y que permite vitrificar un gran número de ovocitos a la vez. Resultados de Modina et al.
(2004) ponen de manifiesto que la vitrificación de ovocitos bovinos en estadio de VG usando este método y acompañado de la exposición de un solo paso en la SV. Esto minimiza el daño estructural en las organelas con un mayor rendimiento de embriones viables producidos in vitro.
Velocidades aún mayores pueden ser obtenidas con la exposición a vapores de NL utilizando el método “solid-surface vitrification” (SSV) (Dinnyes et al. 2000) que consiste en
poner el ovocito en una solución de equilibrio, en tres gotas pequeñas de la SV y colocarlos directamente sobre una superficie metálica pre-enfriada (-150 a -180°C), parcialmente sumergida en NL, proceso que se cumple en menos de 30 segundos. Kong et al. (2000)
vitrificaron en una ultra mini pajuela (1.0 – 0.8 mm de diámetro) para reducir el daño por el gran volumen de la SV, y obtuvieron tasas de desarrollo embrionario del 72% a la descongelación y cultivo.
En trabajos desarrollados por Li et al. (2002),
se demostró que ovocitos bovinos vitrificados por el método OPS en una SV de 20% EG + 20% DMSO y 35% EG + 5% PVP + 0.4 M trealosa, la tasa de desarrollo embrionaria
(12.5% vs. 6.0%) no fue estadísticamente significativa. El desarrollo hasta embriones en el grupo control no vitrificado fue significa-tivamente superior (22.6%). No obstante, se demostró la posibilidad de obtener embriones a partir de ovocitos criopreservados en coincidencia con los informaciones de Vieira et al. (2002).
Otra de las formas de obtener mayores velocidades de enfriamiento es la aplicación de vacío al NL (Márquez 2005). La reducción de la presión sobre el NL induce un super enfriamiento, bajando la temperatura de -1960C hasta -2100C.
Según Mavrides y Morroll (2002), la vitrificación utilizando el Cryoloop y la ICSI permite obtener una tasa de supervivencia de 90.5% posfertilización in vitro (FIV) en
comparación con la congelación lenta (54.4%). Los resultados de Yasuyuki et al. (2005), indican
que la vitrificación de un gran número de ovocitos en estadio de VG por el método de Nylon Mesh Holder acompañado con la exposición a un pase del crioprotector, minimiza los daños estructurales, con un incremento del rendimiento de embriones viables en la producción de embriones in vitro.
Kuwayama y Kato (2000), describió el método Cryotop que consiste en una pajuela de 0.25ml con la extremidad en forma de bisel, donde la SV que contiene el ovocito se deposita en una gota pequeña en la pared de esta tablilla, que se sumerge directamente en el nitrógeno líquido. La velocidad de congelación con este método es de aproximadamente 23.000°C/min. El uso del NL al vacío reduce la presión y permite obtener mayores velocidades de congelación, lo que induce el descenso de la temperatura de -196°C a -210°C (Arav et al.
2000).
Acorde con los resultados de Morató et al.
(2008), una baja proporción de ovocitos vitrificados por el método OPS muestran una configuración normal del huso acromático (37.8%) comparado con ovocitos frescos no vitrificados (69.9%), mientras, se observó una configuración del huso acromático normal significativamente superior en ovocitos vitrificados por el método de Cryotop (60.2%).
Estudios desarrollados por Papis et al. (2000)
utilizando la vitrificación por el método Droplets, demostraron que la preequilibración de
grupos de ovocitos bovinos en una solución de 3% de EG por 30 segundos, mejora la tasa de división hasta blastocisto y blastocisto expandido, dando lugar al nacimiento de un ternero saludable, por la transferencia de 4 embriones obtenidos por este método.
En el método ¨Gel Loading Tip¨ descrito por Tominag et al. (2001), las estructuras son
colocadas en una solución de equilibrio por 2 minutos, a continuación son transferidas a la SV por 30 segundos y envasadas por capilaridad en un gel contenido en la extremidad de una pajuela que se coloca directamente dentro del NL.
Resultados de Kim et al. (2007) indican que
ovocitos bovinos inmaduros pueden sobrevivir a la vitrificación por Microdrop, ser madurados, fertilizados y cultivados in vitro hasta la
producción de embriones. Más tarde Yang et al.
(2008) señaló que la mayoría de los ovocitos sobreviven a la vitrificación por el método de Microdrop (92.50%) aunque la tasa de división y de formación de blastocitos después de la activación partenogenética fue menor (46.5% y 11.1%) que en el grupo control no vitrificado (86.6% y 13.5%). Acorde con este estudio, los ovocitos bovinos vitrificados son capaces de resistir el desarrollo in vitro e incluso la transferencia nuclear con una tasa de fusión similar entre grupos (58.33% vs. 53.19%). Sin embargo, la formación de blastocitos (22.2%, 7.4%, P <0.05) difirió entre el grupo control y vitrificado.
La velocidad de enfriamiento cuando la pajuela se coloca dentro del NL depende de varios factores, tales como el volumen de la sustancia crioprotectora, el diámetro interno de la pajuela, la densidad de la pared de la pajuela y la forma de contacto entre el NL y la solución que contiene las estructuras. La mayoría de las técnicas están basadas en el contacto directo del NL con la solución crioprotectora que contiene los ovocitos, lo que puede ser una fuente de contaminación (Fountain 1997). Estos peligros pueden ser evitados utilizando NL filtrado o envasando las estructuras en un recipiente hermético estéril antes de su almacenamiento (Lane 1999).
CONCLUSIONES
La congelación de ovocitos permitirá disponer de un banco de germoplasma materno,
lo que constituye una herramienta poderosa para la aplicación potencial en los campos de la investigación biomédica y la infertilidad humana y animal. A pesar de la diversidad de métodos utilizados para la criopreservación de ovocitos, la vitrificación ofrece resultados económi-camente atrayentes, por lo que es necesario desarrollar investigaciones que posibiliten la adecuación de un método que permita obtener mayores tasas de sobrevivencia y viabilidad embrionaria.
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Revisado 20 de febrero de 2008
