FACULTAD DE MEDICINA
TESIS DOCTORAL
Acciones anti-inflamatorias del receptor nuclear PPAR
ϒ
en la isquemia
cerebral: papel de la 5-lipoxigenasa en la neuroprotección por rosiglitazona
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Iván Ballesteros Martín
Directores
María Ángeles Moro Sánchez
Ignacio Lizasoain Hernández
Olivia Hurtado Moreno
Madrid, 2013
Acciones anti-inflamatorias del receptor nuclear PPAR
γ
en la isquemia cerebral: Papel de la 5-lipoxigenasa en
la neuroprotección por rosiglitazona
TESIS DOCTORAL
IVÁN BALLESTEROS MARTÍN
Directores de Tesis María Ángeles Moro Sánchez Ignacio Lizasoain Hernández
Olivia Hurtado Moreno
5-LO 5-lipoxigenasa
15-HODE Ácido hidroxioctadecadienoico 15-HETE Ácido hidroxieicosatetraenoico 15dPGJ2 15-deoxi-∆12,14-prostaglandina J2 ACC Arteria carótida común
ADN Ácido desoxirribonucleico AIF Factor inductor de apoptosis
AHR Receptor para hidrocarburos de arilo (Aryl hidrocarbon receptor) Arg I Arginasa I
AMPA 2-amino-3-(hidroxi-5-metil-5-metilisoxazol-4-il) propionato AP-1 Proteína activadora 1
ARNm Ácido ribonucleico mensajero
ASIC Canales iónicos sensibles a la concentración extracelular de protones ATP Trifosfato de adenosina
CBA Ensayo de unión a citoquinas CD11b Cluster de diferenciación 11b CD18 Cluster de diferenciación 18
CD36 Cluster de diferenciación 36 (alias receptor de trombospondina) CD45 Cluster de diferenciación 45
CD200 Cluster de diferenciación 200 (alias OX-2) CD200R Receptor para CD200
CD206 Cluster de diferenciación 206 (alias receptor de manosa) Cdk5 Quinasa dependiente de ciclina 5
COX-2 Cicloxigenasa-2
CXCL1 Quimiocina (C-X-C motivo) ligando 1 (alias fractalquina) CXCL1R Receptor de fractalquina
cys-LTs Cisteinil leucotrienos CYTC Citocromo C
DAMPs Patrones moleculares asociados a daño DBD Dominio de union al ADN
DMSO Dimetilsulfóxido
DC-SIGN Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin EC50 Concentración efectiva media
ECV Enfermedad cerebrovascular EDTA Ácido etilendiaminotretraacético EGTA Ácido etilenglicolaminoaciltetraacético ELISA Enzimoinmunoensayo
EMSA Ensayo de movilidad electroforética retardada EROs Especies reactivas de oxígeno
FITC Isocianato de fluoresceina
Fizz1 Found in inflammatory zone 1 (aliasResistin-like molecule α) GFAP proteína ácida fibrilar de la glía
FPRL1 Receptor de N-formil-péptido (alias Receptor de Lipoxinas o ALXR) GM-CSF Factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos HDAC Deacetilasa de histonas
HEPES Ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanesulfonico
HGMB1 high-mobility group protein 1 o proteína de alta movilidad grupo 1 HRP Peroxidasa de rábano
HS Suero de caballo
HSP70 Proteína de choque térmico de 70 KDa
Iba1 Molécula adaptadora de unión a calcio inoizado tipo 1 ICAM Molécula de adhesión intracelular
IFN-γInterferón gamma IgG Inmunoglobulina G
IL-1ra antagonista del receptor IL-1 IL-1βInterleuquina 1 beta
iNOS Sintasa de óxido nitrico inducible
Inyección i.c.v Inyección intracerebroventricular Inyección i.p Inyección intraperitoneal
K-PBS Solución salina en tampón fosfato con potasio LBD Dominio de unión al ligando
LTB4 Leucotrieno B4
LXA4 Lipoxina A4
LXR Receptor liver X
MCAO Oclusión de la arteria cerebral média MCP-1 Proteina quimioatrayente de monocitos 1 M-CSF Factor estimulador de colonias de monocitos MHC-I Complejo Mayor de Histocompatibilidad I MHC-II Complejo Mayor de Histocompatibilidad II MMP9 Metaloproteasa 9
NADPH nicotina adenina dinucleótido NeuN Neuronal nuclei
NF-κB Factor nuclear kappa B NK Natural killer
NMDAN-metil-D-aspartato NO Oxido nítrico
NPY Neuropéptido Y
OMS Organización mundial de la salud
PAMPS Patrones moleculares asociados a patógenos PBS Solución salina en tampón fosfato
P/E Penicilina/Estreptomicina PE Ficoeritrina
PercP Proteina peridinin clorofila PFA Paraformaldehido
PGC-1βCoactivador 1 beta de PPARγ
PLA2 fosfolipasa A2
PPARγreceptor activado por proliferadores de peroxisomas gamma PPRE Elementos de respuesta a PPAR
PTEN fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato 3-fosfatasa RMN Resonancia magnética nuclear
RSG Rosiglitazona
RT-FRET Transferencia de energía de resonancia por fluorescencia resuelta en tiempo R-tPA Activador tisular del plasminógeno recombinante
RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa transcripción inversa RXR Receptor X de retinoides
SFB Suero fetal bovino
SHIP Fosfatasa 5' inositol que contiene dominios SH2 SMAD Superfamila mothers against DPP homolog SNC Sistema nervioso central
SOCS Supresores de la señalización dependiente de citocinas STAT Transductor de señal y activador de la transcripción TBS Solución de Tris tamponada
TGF-βFactor de crecimiento transformante beta TLRs Receptores Toll-like
TNFα Factor de necrosis tumoral alfa
TRAIL TNF Related Apoptosis Inducing Ligand o Ligando inductor de la apotosis relacionado con TNF
TTC Cloro de 2,3,5-trifenil-tetrazolio TZDs Tiazolidindionas
WT Wild type (fenotipo salvaje) Ym1 alias Chitinase-3-like protein 3
I INTRODUCCIÓN 4 1.1Enfermedad cerebrovascular 5 1.2 Fisiopatología del ictus: La cascada isquémica 7 1.3Inmunomodulación e isquemia cerebral 7
1.3.1 Sistema nervioso central y sistema inmune: la difusa frontera 9 1.3.2 La respuesta inflamatoria aguda en la isquemia cerebral 11 1.3.3 ¿Cómo mata la inflamación en el SNC? 13 1.3.4 La dinámica de la inflamación en el proceso isquémico 16 1.3.5 La modulación inmune innata: Los beneficios de reducir el daño 19 1.3.6 La activación alternativa del macrófago 22 1.3.7 Los marcadores del fenotipo inmune en el macrófago 26 1.3.8 El papel de los neutrófilos en la isquemia cerebral 26 1.4 El Receptor Activado por Proliferadores de Peroxisomas Gamma: PPARγ 28
1.4.1 PPARγy la modulación inmune 31 1.4.2 PPARγen la isquemia cerebral 33
1.5Las lipoxigenasas 36
1.5.1 Implicación de 5-lipoxigenasa en la neuroprotección mediada
por PPARγ en isquemia cerebral 38 II HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 41
2.1 Hipótesis 43
2.2 Objetivos 43
III MATERIAL Y MÉTODOS 45
3.1 Materiales 46
3.2 Diseño del protocolo experimental 46
3.2.1 Estudios in vivo 46
3.2.2 Estudios in vitro 49
3.3Procesamiento de muestras 53
3.3.1Extracción de ARN 54
3.3.2Homogenado de corteza total 54 3.3.3 Extracción de núcleos y citosoles 55 3.3.4 Preparación de cerebros para inmunofluorescencia 55 3.3.5 Preparación de suspensiones de células de la corteza cerebral
3.4.2Western blot 57 3.4.3 Caracterización celular por citometría de flujo 58 3.4.4 Ensayo de actividad transcripcional de PPARγ 59 3.4.5 Determinación de los niveles de LXA4 60
3.4.6 Determinación del volumen de infarto 61
3.4.7Inmunofluorescencia 62
3.4.8Cuantificación celular por estereología 64
3.4.9 Ensayo TR-FRET 65
3.4.10 Determinación de citoquinas por citometría 66 3.4.11 Análisis de la fagocitosis de neutrófilos 66 3.4.12 Análisis de la función fagocítica de macrófagos en cultivo 67
3.4.13Análisis estadístico 68
V RESULTADOS 69
4.1 Estudio de la implicación de 5-LO en los efectos anti-inflamatorios de
PPARγ en la isquemia cerebral: inhibición de la activación clásica o M1 70 4.1.1 Caracterización de RSG como agonista PPARγ 70 4.1.2 Estudio del papel de 5-LO en la inhibición de la activación M1
inducida por RSG en isquemia cerebral en rata 73 4.1.3 Estudio del efecto del agonista de PPARγ RSG sobre la expresión
de 5-LO tras isquemia cerebral en rata 75 4.2 Estudio de la activación alternativa o M2 en la isquemia cerebral
experimental y del papel de la vía PPARγ-5-LO en este proceso 78 4.2.1 Estudio del papel de 5-LO en la neuroprotección inducida
por RSG en la isquemia cerebral experimental en ratón 78 4.2.2 Análisis de la expresión celular de 5-LO en isquemia
cerebral experimental en ratón. Efecto de PPARγ 79 4.2.3 Estudio del papel de 5-LO en la expresión y señalización
de PPARγ en isquemia cerebral experimental en ratón 79 4.2.4 Estudio de los niveles del producto de 5-LO LXA4
en isquemia cerebral experimental en ratón. Efecto de PPARγ 82 4.2.5 Estudio de la activación alternativa o M2 en el cerebro
macrófagos en isquemia cerebral en ratón. Efecto de la vía PPARγ-5-LO 91 4.3 Efecto del producto de 5-LO LXA4 en neuroprotección y activación M2 93
4.3.1 Estudio del efecto neuroprotector de LXA4 en isquemia
cerebral experimental en rata 93 4.3.2 Caracterización de la producción de LXA4in vitro 93
4.3.3 Estudio in vitro del efecto de LXA4 en la activación M2
y en la función fagocítica de macrófagos 96
V DISCUSIÓN 99
5.1 PPARγy neuroprotección: Papel de 5-LO 100 5.2 PPARγ y activación M1: Papel de 5-LO 101 5.3 PPARγ y activación M2: Papel de 5-LO 103 5.4 PPARγ y fagocitosis de neutrófilos: Papel de 5-LO 108 5.5 Intermodulación de la actividad 5-LO y de la expresión de PPARγ 110
5.5.1 Expresión y actividad transcripcional de PPARγ
en isquemia: Implicación de 5-LO 110 5.5.2 PPARγ y la inducción de la expresión de 5-LO 111 5.6 LXA4 como mediador de las acciones de la vía PPARγ-5-LO 112
5.6.1 Implicación de RSG en la síntesis de LXA4 112
5.6.2 Neuroprotección mediada por LXA4 114
5.6.3 Implicación de LXA4 en la polarización M2 115
5.7 Sumario: La vía PPARγ-5-LO en la isquemia cerebral 116 VI CONCLUSIONES 119
VII SUMMARY 122
1.1 Enfermedad cerebrovascular
La Organización Mundial de la Salud (1989) define la Enfermedad Cerebrovascular (ECV) como “el rápido desarrollo de signos focales o globales de compromiso de la función cerebral, con síntomas de 24 horas o más, o que lleven a la muerte sin otra causa que el origen vascular”. La gravedad del episodio varía desde la discapacidad grave y la muerte hasta la recuperación parcial a casi completa.
Actualmente, la ECV es la cuarta causa de muerte en los Estados Unidos (después del infarto agudo de miocardio, el cáncer y las enfermedades respiratorias crónicas). Cada año se presentan en este país aproximadamente 795.000 nuevos casos de ictus, de los cuales 610.000 son primeros eventos y 185.000 recurrentes. Además, se estima que para el año 2030, 4 millones de estadounidenses sufrirán un infarto cerebral, produciéndose un 24,9% de incremento en la prevalencia de la ECV respecto a 2010 (Roger et al., 2012). De hecho, actualmente, la ECV es la primera causa de incapacidad en el adulto (Feigin, 2007). El coste directo e indirecto debido al ictus isquémico en la Unión Europea en el año 2003 se valoró en 34 billones de euros (Leal et al., 2006) y para Estados Unidos este mismo cálculo fue de 62,7 miles de millones de dólares (Rosamond et al., 2007). Según datos del Instituto Nacional de Estadística (2009), en nuestro país, la enfermedad cerebrovascular es la primera causa de muerte en mujeres y la segunda causa de muerte en hombres, ocupando el segundo lugar como causa de mortalidad en la sociedad española (Tabla 1.1) y consumiendo un 3-4% del gasto total sanitario. Además, no debemos de olvidar que la carga provocada por las enfermedades cerebrovasculares está aumentando rápidamente debido al envejecimiento de la población española.
Tabla 1: Principales causas de defunción en España en el año 2009*
*Instituto Nacional de Estadística (http://www.ine.es/prensa/np664.pdf) En los últimos 15 años se ha llevado a cabo un gran progreso en el tratamiento en fase aguda del ictus isquémico. Se han implementado unidades especializadas en el manejo del ictus con protocolos unificados de tratamiento y con un riguroso control de las medidas generales (Hanger et al., 2007). Esto ha ido acompañado de una gran inversión en investigación en la búsqueda de un agente neuroprotector efectivo (Auriel and Bornstein, 2010). Sin embargo, hasta la fecha, el único tratamiento aprobado es la recanalización del vaso ocluido por medio del rt-PA (Activador del Plasminógeno Tisular Recombinante -Alteplasa-). Este procedimiento fibrinolítico es un tratamiento coste-efectivo: no incrementa los costes del proceso y es eficiente. El factor principal para ello es la disminución de la incapacidad, lo que resulta en una mejor calidad de vida del paciente y una reducción de los costes sanitarios a largo plazo (Marsh and Keyrouz, 2010). Adicionalmente, la principal limitación de este tratamiento es la corta ventana terapéutica -entre 3 y 4,5 horas post-ictus- y, debido a los exigentes criterios de exclusión e inclusión, son muy pocos pacientes los beneficiados. Solo entre el 20 y el 25% de los pacientes llegan a tiempo a un
centro hospitalario, y entre el 3 y 5% de ellos son candidatos a trombolisis, de los cuales reperfunden aproximadamente un 50% (Hacke et al., 2008).
1.2 Fisiopatología del ictus: La cascada isquémica
La lesión y la muerte celular que se producen tras la isquemia cerebral están directamente vinculadas a la caída de ATP que presentan las áreas cerebrales expuestas a la depleción del flujo sanguíneo. El establecimiento de un déficit energético en el cerebro es una situación de extrema gravedad, dado que el ATP es imprescindible para multitud de procesos celulares. Este fallo bioenergético desencadena el desarrollo de una serie de eventos conocidos como cascada isquémica (Figura 1.1).
1.3 Inmunomodulación e isquemia cerebral
La isquemia cerebral lleva consigo una importante respuesta inflamatoria. Dicha respuesta se ha asociado a un aumento del daño cerebral y a un peor pronóstico en pacientes que han sufrido un infarto isquémico. Sin embargo, y dado que la inflamación es imprescindible para iniciar el proceso de neovascularización y regeneración, una respuesta inflamatoria contenida puede ser necesaria y beneficiosa. Los últimos avances en el campo de la inmunomodulación, junto con los avances en el conocimiento del fenómeno de tolerancia isquémica y el papel de la inmunidad innata en este fenómeno, nos van a permitir abrir una posibilidad para la aplicación de las terapias inmunomoduladoras en esta enfermedad.
Figura 1.1 La cascada isquémica: En la isquemia producida por la oclusión de la arteria cerebral media, la causa más común de infarto, el daño es más rápido e intenso en el centro del territorio isquémico (core isquémico), donde el flujo sanguíneo es mínimo. En la periferia de la región isquémica, también llamada penumbra, el daño neuronal se desarrolla más lento porque el flujo sanguíneo procedente de los territorios vasculares adyacentes (flujo colateral) mantiene la perfusión cerebral sobre el umbral letal. En el core isquémico, el principal mecanismo de muerte celular es el fallo energético. Sin oxígeno ni glucosa, las neuronas no pueden generar el ATP necesario para mantener el gradiente iónico a través de las membranas neuronales, principalmente mediante la ATP-asa Na+/K+. Debido a esto, una acumulación masiva de Na+ y Ca2+ en el citoplasma lleva a pérdida de turgencia y degeneración de los organelos, pérdida de la integridad de la membrana y la disolución de la célula (muerte por necrosis). En la penumbra isquémica, aunque en un primer momento la reducción del flujo no es suficiente para provocar un fallo energético y las neuronas permanecen viables durante un periodo prolongado de tiempo después del daño isquémico, éstas están sometidas a estrés y son muy vulnerables a eventos patogénicos que puedan romper su frágil equilibrio metabólico. La excesiva acumulación de glutamato en el espacio extracelular es uno de los principales factores que contribuye a la muerte de la penumbra isquémica. La resultante sobreactivación de los receptores NMDA lleva a la acumulación de Ca2+ que activará a las enzimas dependientes de este catión, como proteasas (calpaína y caspasa) y enzimas productoras de óxido nítrico, especies oxidantes y metabolitos del ácido araquidónico. Estos eventos conducen a la necrosis o a la muerte celular programada (dependiendo de la intensidad del estímulo y del estado metabólico de la neurona). Las células dañadas y muertas además tienen un papel importante en la inducción de la inflamación postisquémica porque liberaran “señales de peligro” que activarán al sistema inmune (Iadecola and Anrather, 2011).
1.3.1 Sistema nervioso central y sistema inmune: la difusa frontera En el año 1948, Peter Medawar observó un curioso fenómeno: cuando se realizaba un trasplante de tejido heterólogo en el sistema nervioso central (SNC) no se producía rechazo inmunológico (Medawar, 1948). Este hallazgo le llevó a proponer al sistema nervioso y al inmune como dos sistemas aislados e independientes. Dicho dogma ha persistido hasta épocas recientes; sin embargo, actualmente, un gran número de evidencias indican que el cerebro y el sistema inmune están estrechamente conectados en una comunicación continua que mantiene la homeostasis del tejido nervioso. De hecho, células del sistema inmune, al igual que sus mediadores, se encuentran de forma rutinaria en el SNC tanto en condiciones normales como patológicas.
La comunicación entre los sistemas inmune y nervioso se produce de forma local y distante (Figura 1.2). Localmente, la respuesta inmune en el SNC induce la activación de las células gliales y los macrófagos residentes y la infiltración de las células inmunes circulantes. En localizaciones distantes, existen muchas evidencias de comunicación neuroinmunológica, por ejemplo, en relación con la inmunosupresión post-ictus. Este fenómeno parece proteger al cerebro del daño inflamatorio, pero tiene una importante contrapartida derivada del incremento en la susceptibilidad a infecciones, hecho al que se asocia un incremento considerable de la mortalidad (Meisel et al., 2005).
Muchas de las respuestas inducidas en esta comunicación continua se
basan en las citoquinas secretadas por las células inmunes para comunicarse entre sí. Pero, curiosamente, estos mediadores tradicionalmente asociados a una función exclusivamente inmunitaria también se comunican con las neuronas y la glía y tienen la capacidad de influir en la función sináptica (Stevens et al., 2007), la plasticidad neuronal (Huh et al., 2000) y la neuroprotección (Farina et al., 2007).Y, a la inversa, se ha descrito la expresión de receptores de neurotransmisores en células del sistema inmune con capacidad para influir en la función inmunológica (Rosas-Ballina et al., 2011;
Wong et al., 2011). Valga de ejemplo la implicación de los receptores nicotínicos para acetilcolina de los macrófagos esplénicos en la inhibición de la
producción de TNFα (Probert and Selmaj, 1997). Estas evidencias, y otras
tantas que indican que muchos de los elementos que se creían propios de uno u otro sistema se comparten y complementan, involucran estrechamente al sistema inmune en el destino del cerebro isquémico y en su supervivencia tras una isquemia cerebral.
Neurotransmisores; Inervación vagal…
Figura 1.2 Comunicación entre el SNC y el sistema inmune: Las moléculas inmunes se expresan en el cerebro durante su desarrollo normal. Se ha identificado un papel importante para el complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I), el sistema del complemento y las citoquinas en el funcionamiento, modelado y plasticidad de las sinapsis. A su vez, diversos neurotransmisores pueden influir directamente en la funcionalidad del sistema inmune. (Adaptado de Garay and McAllister, 2010).
1.3.2 La respuesta inflamatoria aguda en la isquemia cerebral
La respuesta inflamatoria ante la isquemia cerebral se caracteriza por el establecimiento de una secuencia de eventos que implican al cerebro, su vasculatura, la sangre circulante y los órganos linfoides. La exquisita sensibilidad de las neuronas al daño isquémico coexiste con otros procesos que se producen de manera muy rápida tras la isquemia. En la microvasculatura cerebral, el estrés oxidativo y las especies reactivas de oxígeno (EROs) inducen la activación del sistema del complemento, las plaquetas y las células endoteliales (Iadecola and Anrather, 2011). El endotelio activado perderá la permeabilidad selectiva de barrera produciéndose la extravasación de constituyentes del plasma al cerebro. Además, se inducirá la sobreexpresión de selectinas endoteliales que favorecerán la unión de leucocitos a los vasos. Todo esto, sumado a un incremento en la secreción de proteasas de origen leucocitario, junto con la regulación a la baja de la expresión de las proteínas endoteliales de unión estrecha que sellan la unidad neurovascular, favorecerá la extravasación paracelular de proteínas y leucocitos circulantes al parénquima cerebral (del Zoppo, 2010). En definitiva, el endotelio isquémico va a propiciar una interfaz de intercambio entre el SNC y el sistema circulatorio durante el desarrollo de la respuesta inflamatoria.
Mientras la cascada isquémica progresa, la muerte celular, asociada principalmente a la necrosis tisular que induce la isquemia, lleva a una nueva fase de la respuesta inflamatoria. Las células muertas liberan “señales de peligro” que activan el sistema inmune (Figura 1.3). Dicha activación se lleva a cabo mediante un ingenioso conjunto de receptores capaces de detectar pequeños motivos moleculares que se encuentran en patógenos o, en el caso de la isquemia, en situaciones asociadas a daño tisular (Matzinger, 2002). Son de especial importancia los receptores Toll-like (TLRs) y los receptores scavenger, dado que se expresan de manera extensa en la microglía, los macrófagos perivasculares y las células endoteliales. La activación de estos receptores induce la expresión de moléculas pro-inflamatorias en sus
células diana. Todo este proceso de activación inmunológica, asociado a la defensa del huésped y a la eliminación de restos celulares, puede considerarse como una parte integral de la inmunidad innata.
Más concretamente, y como un proceso específico de activación inmune en el sistema nervioso central, la propia muerte neuronal es capaz de activar la microglía cerebral. Este proceso se produce tras la pérdida de las interacciones físicas que existen entre la microglía y las neuronas y cuya principal misión es mantener en estado quiescente la microglía. Entre estas
Figura 1.3 Muerte celular y activación de receptores de la inmunidad innata: La muerte isquémica conlleva la liberación de patrones moleculares asociados a daño (DAMPs), que activan los receptores TLR, especialmente TLR4 y TLR2. Los DAMPs liberados por la isquemia incluyen a la proteína HGMB1 (una proteína intracelular de unión al ADN), la proteína HSP60 y la proteína β-amiloide (Aβ), entre otras. También, recientemente se ha descrito que la liberación de peroxirredoxinas (Prx) tras la isquemia es un importante mediador en la activación de los receptores de la inmunidad innata (Shichita et al., 2012). Los receptores TLRs activarán la expresión de genes pro-inflamatorios mediante la activación del factor nuclear NF-κB. Los DAMPs también se derivan de la ruptura de la matriz extracelular por enzimas líticas liberadas desde las células muertas y por la acción de las especies reactivas de oxígeno sobre los lípidos. La producción de citoquinas y la activación del complemento derivada de estos eventos llevan al incremento de la infiltración de leucocitos que aumentan el daño tisular y provocan la producción de más DAMPs. (Adaptado de Iadecola and Anrather, 2011).
interacciones físicas, cabe destacar la expresión de CD200 y fractalquina (CXCL1) en la superficie de las neuronas. Estas proteínas interactúan con su receptores microgliales CD200R y CXCL1R manteniendo a la microglía en un fenotipo de reposo. Por lo tanto, la ruptura de las interacciones neurona-microglía producirá la activación microglial (Cardona et al., 2006; Matsumoto et al., 2007). De forma paracrina, el incremento de las concentraciones de glutamato extracelular derivado de la muerte neuronal va a activar a los receptores metabotrópicos de glutamato que se encuentran en la microglía, conduciéndola a la expresión de un fenotipo pro-inflamatorio (Chapman et al., 2000). Así, la extensión de la muerte neuronal desde el core isquémico a las áreas de penumbra es concomitante a una activación microglial.
Teniendo en cuenta la alta densidad vascular existente en el cerebro, los mediadores inflamatorios secretados por las células activadas del parénquima son capaces de extenderse a lo largo de los compartimentos vasculares y perivasculares, amplificando y reforzando la expresión de citoquinas, quimioquinas y moléculas de adhesión que dirigen la infiltración de las células inmunes circulantes al cerebro isquémico (Iadecola and Anrather, 2011). Se genera así una respuesta inmunológica característica de la isquemia cerebral. Estos procesos de inflamación aguda tienen como principal problema lo que se ha denominado daño asociado a la inflamación y, por tanto, la modulación de estos fenómenos neuroinmunológicos es actualmente un importante objeto de estudio como diana terapéutica en el tratamiento de la isquemia cerebral.
1.3.3 ¿Cómo mata la inflamación en el SNC?
Las especies reactivas de oxígeno, el óxido nítrico, el sistema del complemento, los receptores de inducción de la apoptosis y la vía de las perforinas representan los efectores más importantes de la muerte celular inducida durante el proceso inflamatorio.
-Especies reactivas de oxígeno y nitrógeno:
En los procesos inflamatorios se producen aniones O2- derivados de la
actividad de la enzima NADPH oxidasa. Esta proteína se expresa en todas las células inflamatorias. Además de la producción de EROs, se produce una gran cantidad de óxido nítrico (NO) derivada de la expresión de novo de la enzima inducible de la síntesis de NO (iNOS). El NO reacciona preferentemente con superóxido formando peroxinitrito, especie altamente citotóxica (Iadecola et al., 1995). El H2O2 se deriva de la dismutación del O2- y lleva asociado la aparición
de radicales hidroxilo tóxicos mediante la reacción de Haber-Weiss, facilitada además por el incremento de la disponibilidad de hierro libre en la isquemia (Lipton, 1999). Todas estas moléculas alteran proteínas celulares, lípidos y ácidos nucleicos produciendo disfunción celular o muerte y han sido implicadas en el daño tisular producido durante la inflamación post-ictus. De hecho, la supresión de la actividad NADPH oxidasa o de la enzima iNOS es capaz de proteger al cerebro durante las fases tardías de la isquemia cerebral (Iadecola and Anrather, 2011).
-El sistema del complemento:
El sistema del complemento es una cascada proteolítica compuesta por varias subunidades (C1-C9) que conduce a la lisis celular a través de la formación de una estructura en forma de poro denominada “complejo de ataque de membrana”. El complemento también es capaz de incrementar la fagocitosis (opsonización) o actuar como un estimulo de activación de la quimiotaxis para las células inflamatorias. Después de isquemia, el complemento se activa y sus componentes se sobreexpresan en la glía y las neuronas o entran al cerebro debido a la ruptura de la barrera hematoencefálica. La implicación del sistema del complemento en el daño isquémico se pone de manifiesto debido a que la eliminación de sus inhibidores, como es el caso de los ratones deficientes en CD95a, o la deleción de sus subunidades, como C3a o C5a, incrementa el daño cerebral (Iadecola and Anrather, 2011).
-Receptores inductores de la apoptosis:
Fas (CD95) es un miembro de la superfamilia de los receptores para TNF. Se expresa en las neuronas y en la glía después de isquemia. Mientras tanto, su ligando FasL (CD95L) se encuentra en neuronas, microglía, células T citotóxicas y células NK. La activación de CD95 induce la formación del complejo de señalización de la muerte inducida y la subsecuente activación de la caspasa-8 y del factor proapoptótico Bid (Strasser et al., 2009). De forma similar, el ligando inductor de la apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) se
expresa de novo después de isquemia en astrocitos y microglía e induce
apoptosis mediante la unión a sus receptores en neuronas y glía (Cui et al., 2010). Estas vías de señalización se implican en la muerte celular isquémica puesto que la inhibición de TRAIL o la mutación de Fas reducen el daño isquémico (Martin-Villalba et al., 1999).
-Perforinas y granzimas:
Este mecanismo es usado por las células T citotóxicas y las células NK, las cuales liberan perforina y granzima mediante el reconocimiento de antígenos asociados al complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I). La degranulación de la proteasa granzima y la perforina, que es análoga a la subunidad C9 del complemento, forma un complejo que es internalizado por la célula diana. Una vez en el interior de la célula, la granzima activa la apoptosis vía activación de la caspasa-3 y Bid. La implicación de esta vía en el daño isquémico se sugiere por la observación de que la deleción génica de perforinas es protectora (Liesz et al., 2011).
1.3.4 La dinámica de la inflamación en el proceso isquémico
Como hemos comentado anteriormente, tras la activación del endotelio y las células residentes, se produce en el cerebro isquémico la infiltración de células inflamatorias circulantes, que incluyen granulocitos (neutrófilos), células T, monocitos/macrófagos y otras células. Este proceso de infiltración se ha puesto de manifiesto tanto en modelos animales como en pacientes isquémicos (Jin et al., 2010). En la fase aguda de la isquemia cerebral, que comprende de minutos a horas, se promueve la adhesión y migración transendotelial de los Figura 1.4 Implicación del factor proapoptótico Bid en los mecanismos de muerte neuronal tras isquemia. La inflamación juega un importante papel en la inducción de la muerte de las neuronas tras el proceso isquémico. Las especies reactivas de oxígeno derivadas de las NADPH oxidasas de las células inmunes producen daño en el ADN. Como respuesta a ese daño, se produce la activación de p53 o la traslocación de la nucleofosmina a la mitocondria produciendo disfunción mitocondrial. En el caso de la apoptosis inducida por receptores, la activación del receptor FAS neuronal por su ligando procedente de las células inmunes desencadena una cascada de señalización vía activación de caspasas o del factor inducible de apoptosis (AIF) que culmina en la muerte de la célula. Ambos procesos, junto con la excitotoxicidad mediada por los receptores del glutamato AMPA, NMDA y de los canales iónicos sensibles a ácidos (ASIC) permiten la formación de dímeros entre los reguladores proapotóticos tbid y bax. Esta interacción forma poros en la membrana externa de la mitocondria produciendo la liberación de citocromo c (Cytc) y de AIF, que respectivamente activan la apoptosis de la célula de una manera dependiente o independiente de caspasas. La acción proapoptótica de tbid también se induce por acción de las granzimas o del receptor TRAIL. (Adaptado de Culmsee and Krieglstein, 2007).
leucocitos circulantes al parénquima cerebral. En la fase subaguda (horas a días), estos infiltrados liberarán citoquinas y quimioquinas, producirán especies reactivas de oxígeno e inducirán la activación de metaloproteinasas, lo que exacerbará la respuesta inmune cerebral causando una mayor activación de las células residentes y daño (Amantea et al., 2009; Kriz, 2006). De todas formas, hay que tener en cuenta que muchos de estos factores pro-inflamatorios tienen un papel dual. Así, por ejemplo, la contribución de la MMP-9 a la ruptura de la barrera hematoencefálica promoverá posteriormente la regeneración cerebral y la neovascularización (Amantea et al., 2009). Esta dualidad hace imprescindible el estudio de la dinámica de la inflamación en el ictus con el fin de poder aplicar las terapias inmunomoduladoras más beneficiosas para el paciente. Por lo tanto, podríamos afirmar que rara vez algo es simplemente malo o bueno, de hecho, casi todos los procesos tienen tanto aspectos beneficiosos como deletéreos y, probablemente, la mejor visión del efecto de la inflamación en el ictus sea en términos de coste versus beneficio. Así, muchos de los procesos secundarios y factores inhibidores de la regeneración persisten porque han debido ser adaptativos en términos evolutivos.
Actualmente, los estudios que se han realizado sobre la dinámica de la infiltración de células inflamatorias al cerebro isquémico se basan principalmente en las técnicas de inmunohistoquímica y de citometría de flujo. Estas técnicas presentan importantes limitaciones ya que, en el caso de la citometría de flujo, el aislamiento celular usando procesos de digestión enzimática y su posterior procesamiento ex vivo pueden provocar cambios en la expresión de antígenos en las células estudiadas. Además, en ambas técnicas no existe la posibilidad de examinar alteraciones dinámicas en el mismo animal, dado que el procedimiento requiere de su sacrificio (Jin et al., 2010). Teniendo en cuenta estas limitaciones, diferentes autores han presentado distintos modelos de infiltración tras isquemia (Figura 1.5). En esto punto, focalizaré mi atención en dos estudios en particular. El estudio presentado por el grupo de Stenzel-Poore evaluó la infiltración de las células inflamatorias mediante el empleo de la citometría de flujo en un modelo de
isquemia focal en ratón (Stevens et al., 2002). En este estudio encontraron un incremento de microglía/macrófagos activados a 18h tras MCAO, alcanzando un pico de activación a las 48h que duró hasta las 96h post-isquemia. Los neutrófilos alcanzaron su pico de infiltración a las 48h tras isquemia y continuaron elevados hasta las 96h tras la oclusión. En el caso de los linfocitos T, este incremento fue más lento, alcanzando su pico a partir de las 72h tras isquemia. En el estudio presentado por Gelderblom y colaboradores, donde se llevaron a cabo las mismas condiciones experimentales (Gelderblom et al., 2009), la acumulación de la microglía y la infiltración de macrófagos precedió a la infiltración de los neutrófilos. Las diferencias encontradas a nivel de la dinámica de la infiltración de neutrófilos requiere de atención, dado que la infiltración de los neutrófilos en la isquemia es un proceso importante por su contribución al daño cerebral y es preciso conocer si los mecanismos principales que inducen su extravasación se derivan del daño isquémico o de la señalización desencadenada por las células infiltradas.
core periinfarto Iba1 Ce ls x1 0 3he m is fe rio is qu em ic o In cr em en to Ip si la te ra l Vs C on tr al at er al Stenzel-Poore Magnus core periinfarto Iba1 core periinfarto Iba1 Ce ls x1 0 3he m is fe rio is qu em ic o In cr em en to Ip si la te ra l Vs C on tr al at er al Ce ls x1 0 3he m is fe rio is qu em ic o In cr em en to Ip si la te ra l Vs C on tr al at er al Stenzel-Poore Magnus
Figura 1.5 Dinámica del reclutamiento de células inflamatorias al cerebro isquémico en ratón. Las gráficas obtenidas a partir de los estudios de los grupos de Magnus y Stenzel-Poore (Gelderblom et al., 2009; Stevens et al., 2002), muestran la infiltración de las principales células inflamatorias tras la isquemia (Adaptado de Jin et al., 2010). A su vez, se muestra una imagen de inmunofluorescencia en cerebro de ratón 24h tras el proceso isquémico tomada en nuestro laboratorio (Ballesteros, observaciones no publicadas). En ella se observan que las células inmunorreactivas para el marcador Iba1 (microglía/macrófagos) presentan una morfología ameboide a lo largo de las regiones peri-infarto y core situadas en el hemisferio ipsilateral, lo que indica su activación tras la isquemia
En mi trabajo de investigación nos focalizaremos en la inmunidad innata y en la posibilidad de ejercer un efecto inmunomodulador en los macrófagos/microglía residentes o monocitos infiltrados. En este caso, gracias a técnicas de inmunofluorescencia empleadas rutinariamente en nuestro grupo de investigación y coincidiendo con los modelos descritos, sabemos que su activación se establece ya 24 horas tras isquemia, donde la aparición de células ameboides Iba1+ alrededor y, de forma menos frecuente, en el interior del core isquémico evidencian dicho estado (Ballesteros, observaciones no publicadas).
1.3.5 La modulación inmune innata: Los beneficios de reducir el daño
En el proceso isquémico agudo todo sucede muy rápido. Aquí, el establecimiento de un core isquémico limitado a un área del cerebro donde no hay riego sanguíneo es un proceso físico donde las alternativas que existen para salvar al tejido son nulas hasta donde llega nuestro conocimiento. Sin embargo, el estudio de los procesos inflamatorios que desencadenan la extensión del daño isquémico indica que estos procesos son teóricamente manipulables y que su correcta modulación podría ser un gran avance en el tratamiento y disminución de las secuelas neurológicas que produce la isquemia (Cuenca-Lopez et al., 2010). Más importante todavía es la posibilidad de que esta modulación pueda propiciar una resolución de la inflamación más efectiva y enfocada a potenciar los posteriores eventos de neurorreparación que podrían reducir aún más estas secuelas neurológicas. Aún así, y mientras la investigación en neurogénesis no cambie esta situación, nuestro cerebro presenta un potencial neurogénico limitado, con lo que la pérdida de neuronas post-mitóticas debido a la toxicidad mediada por el sistema inmune provoca un grave impacto en el organismo.
Tabla 2: Estrategias inmunomoduladoras empleadas para el tratamiento de ictus
Intervención Diana Características Fase de desarrollo Inhibición de TLR, sistema de complemento o receptores scavenger Eventos desencadenantes de la cascada inflamatoria Empeoramiento de infecciones después del infarto Preclínico Minociclina Múltiples, incluyendo eventos iniciales del proceso inflamatorio Generalmente seguro, pero neurotóxico en determinadas situaciones
Clínico (fase III comenzada)
Ligandos TCR Celulas T Mecanismo
desconocido Preclínico Tolerización Promueve
respuesta Th2 Sólo preventivo: respuesta humoral deletérea Preclínico Precondicionamiento Remoto Múltiple, incluyendo inflamación
Preventivo, pero puede ser probado en isquemia aguda Clínico (Fase I en hemorragia subaracnoidea completa) Inhibición de integrinas (anti-ICAM; anti-CD18) Adherencia y transmigración de leucocitos PotenciaI inmunogénico. Poco efectivo en ocasiones
Cínico (Fase III ) IL1-ra Inhibición IL-1β Seguro, útil
clínicamente en artritis Clínico (Fase II completada)
*Datos adaptados de las revisiones de (del Zoppo, 2010; Iadecola and Anrather, 2011)
En los últimos 10 años, varios estudios sobre la función de los macrófagos en los tejidos periféricos, como el pulmón o el hígado, han abierto el camino hacia la comprensión de la heterogeneidad y funcionalidad de estas células efectoras de la inmunidad innata. Así, se ha definido una fase “tóxica” inicial de la respuesta inmune caracterizada por la expresión de moléculas pro-inflamatorias, como el TNF-α, la IL-12 o la IL-1β. Esta respuesta inicial, que está principalmente mediada por el IFN-γ, se caracteriza por la aparición en el macrófago de un fenotipo denominado clásico o M1. Este fenotipo es claramente beneficioso para la defensa del huésped ante patógenos o daño. Pero, como hemos comentado anteriormente, presenta un importante componente deletéreo en la isquemia cerebral (Colton, 2009).
Así, de manera fisiológica, el organismo es capaz de reducir esta fase tóxica inicial, resolver la infección o el daño y restaurar la homeostasis tisular.
Por lo tanto, la respuesta inmune innata al daño evoluciona hacia un estado donde se requiere el reemplazamiento de las células perdidas o dañadas y la reparación de la matriz extracelular. Estos mecanismos, que reducen la fase de defensa inicial y promueven la resolución de la inflamación, son integrantes intrínsecos de la respuesta inmune innata. Así, la activación clásica del macrófago es reducida mediante bucles de retroalimentación que regulan etapas específicas del proceso de señalización de la inflamación.
Tabla 3: Mecanismos que promueven la resolución de una respuesta inmune innata al daño
Reducción de la carga patógena/endógena (PAMPs; DAMPs) Catabolismo de mediadores pro-inflamatorios
Eliminación de las células inmunes activadas
Apoptosis de macrófagos
Liberación vía drenaje linfático o vasculatura
Retroalimentación negativa de las vías de activación
Pérdida de TLRs/otros receptores Ubiquitinación y degradación Disminución de la expresión
Activación de proteínas reguladoras negativas de la activación
Proteínas de la familia tirosina fosfatasa (CD45, PTEN, SHIP) Supresión inducible de la señalización de citoquinas (SOCS) Inhibidores de la vía NF-κB (A20, fosforilación de IKK)
Receptores solubles /ligandos señuelo (IL1ra, sTNFR1) Micro-ARNs
Función neuronal (Acetilcolina, NPY, noradrenalina) Regulación del fenotipo funcional del macrófago
Activación alternativa Desactivación adquirida
*Adaptado de (Colton, 2009)
Una interesante forma de detener la fase dañina de la activación clásica del macrófago y de restaurar la homeostasis tisular después del daño es cambiar el estado de activación del macrófago desde un fenotipo pro-inflamatorio o M1 hacia un fenotipo que promueva la reparación y la reconstrucción tisular. Este estado del macrófago se ha venido a denominar activación alternativa o M2.
1.3.6 La activación alternativa del macrófago
El termino activación alternativa (M2) se adaptó tras asociar este estado de activación del macrófago con la respuesta inmune adaptativa Th2, y de aquí que el término M2 también haya sido usado para describir este estado de activación (Mantovani et al., 2005; Mosser and Edwards, 2008). Así, las citoquinas IL-4 e IL-13, comúnmente asociadas a las respuestas Th2, son sus inductores prototípicos, aunque otras citoquinas anti-inflamatorias, como la IL-10 o el TGF-β, también son capaces de producir en el macrófago cambios sustanciales que lo diferenciarían de su fenotipo clásico M1. Esta nomenclatura dicotómica M1/M2 nos es útil para el estudio de la modulación inmune en el proceso isquémico, ya que la idea de base es poder modular la inflamación hacia un fenotipo alejado del potencial dañino que presenta la activación clásica M1. Aún así, esta clasificación está muy alejada del verdadero espectro de estados de activación que pueden presentar los macrófagos. De hecho, dentro de la activación alternativa M2 hay una gran heterogeneidad, por lo que se han introducido nuevas subclasificaciones fenotípicas capaces de diferenciar distintos tipos de activación alternativa (Figura 1.6). Dentro de estos cambios, el más importante es el que propuso Gordon en 2003, al introducir un nuevo estado de macrófagos denominado “desactivación adquirida”, cuyos inductores serian principalmente la IL-10 y el TGF-β (Mosser, 2003). Así, siendo estrictos, una activación alternativa sería la inducida por las interleuquinas IL-4 e IL-13, cuya principal función inmunológica está encaminada a la eliminación de parásitos, mientras que una activación clásica o M1 tiene una función citotóxica, destinada a la eliminación de patógenos intracelulares. Pero además, las actividades metabólicas y secretoras de los macrófagos activados alternativamente favorecen funciones tróficas más que líticas, la eliminación de cuerpos apoptóticos más que la inducción de necrosis y la inducción de tolerancia más que de autoinmunidad (Gordon and Martinez, 2010).
Para comprender qué es la activación alternativa de un macrófago, hay que tener en cuenta que su activación hacia un estado plenamente funcional está influenciada por diferentes estímulos que van a determinar el destino de dicha célula (Figura 1.7). Así, aun de forma artificial, podemos diferenciar distintos procesos de activación del macrófago. Inicialmente, existe una fase primera de diferenciación, donde el monocito reclutado por el tejido madura a macrófago. En esta fase inicial, diferentes estudios in vitro indican que el balance de M-CSF, GM-CSF, ácido retinoico y lipoproteínas determinan diferencias sustanciales en el fenotipo del macrófago maduro. Durante el reclutamiento continuo de monocitos, estas células se encuentras expuestas a
Figura 1.6 Activación del macrófago: La activación clásica esta mediada por la señalización desencadenada por el IFNγ, donde se ha implicado directamente a la señalización vía STAT1 y 4. Su principal función es la defensa tisular ante patógenos intracelulares. Se caracteriza por la alta expresión de citoquinas pro-inflamatorias, MHC-II y una alta tasa respiratoria oxidativa. La activación alternativa mediada por la señalización de IL-4/13 vía STAT6 se relaciona con la reparación tisular y la reconstrucción de la matriz, aunque inmunologicamente está encaminada a la lucha contra parásitos. La desactivación adquirida, mediada por TGF-β e IL-10, vía STAT3 o SMAD se caracteriza por su capacidad de suprimir la inflamación y de fagocitar restos celulares. (Adaptado de Mosser, 2003)
concentraciones variables de mediadores que van a inducir una segunda fase de cebado (priming) por citoquinas. El termino anglosajón priming deriva del hecho de que estos estímulos no son muy potentes per se, pero influencian el potencial inflamatorio del macrófago y su respuesta a otros estímulos. En esta fase de la activación es donde podemos diferenciar entre un priming mediado por TNF-α (activación clásica) o por IL-4/IL-13 (activación alternativa). En la tercera fase de activación, que podríamos denominar respuesta a estímulo, el macrófago adquiere un fenotipo funcionalmente maduro. Este estado se produce en respuesta a estímulos microbianos, opsónicos o de daño tisular y está mediado por receptores TLR o análogos. En el caso de un macrófago activado alternativamente, la activación se produciría en un entorno Th2 como, por ejemplo, en el contexto de una infección crónica de un parásito seguida de un segundo estímulo microbiano (Gordon and Martinez, 2010). Una vez se ha establecido la activación de un macrófago, algunas propiedades de la activación alternativa pueden revertirse (plasticidad), mientras que otras son irreversibles (Stout et al., 2005).
Si el macrófago es capaz de sobrevivir a su tarea inflamatoria se debería producir una fase final comúnmente definida como desactivación. Este proceso de desactivación, en el que se ha implicado directamente a las citoquinas IL-10, TGF-β y a una multitud de mediadores anti-inflamatorios como nucleótidos, lipoxinas y glucocorticoides, contribuirá, como hemos descrito anteriormente, a la resolución de la inflamación, desactivando el potencial pro-inflamatorio del macrófago y produciendo cambios que le permitan eliminar los restos celulares y expresar funciones asociadas a la reparación. La desactivación adquirida del macrófago incluye por tanto una subpoblación con un fenotipo mixto con capacidad inmunosupresora asociada con la fagocitosis de células apoptóticas. Este tipo de activación se diferencia de la activación alternativa tanto por el agente inductor como por los cambios en la funcionalidad de la célula (Gordon and Martinez, 2010).
Mientras que mucho se conoce sobre la fuente de citoquinas anti-inflamatorias que inician la resolución y la reparación en los tejidos periféricos, este proceso es menos conocido en el SNC. Las células reguladoras de una
respuesta Th2 en el cerebro pueden no provenir de las mismas fuentes que en
la periferia. Así, IL-4, IL-13, IL-10 y TGF-β se producen en el SNC por la
microglía, los astrocitos y en algunos casos por las neuronas (Finch et al., 1993; Ledeboer et al., 2000; Morgan et al., 1993; Suzuki et al., 2005; Szczepanik et al., 2001). Se piensa que las señales que inducen su síntesis se deben a la existencia de patógenos o de factores secundarios secretados en respuesta a una actividad paracrina o autocrina. Aun así, en el caso particular de la IL-4 y la IL-13, sus niveles de ARN y proteína son muy variables y sólo se encuentran en determinados tipos de inducción (Ponomarev et al., 2007). Estos niveles de expresión pueden variar también dependiendo de la región cerebral. Por ejemplo, la microglía perivascular se encuentra expuesta a mayores niveles de IL-4 e IL-10 debido a su encuentro con células T activadas o T reguladoras que atraviesan la barrera hematoencefálica para entrar al parénquima (Perry et al., 2007; Tiemessen et al., 2007).
Diferenciación M-CSF <-> GM-CSF Priming IFNγ <-> IL-4 Activación Estímulo TLR Resolución IL-10, TGFβ, Lipoxinas
Figura 1.7 Paradigma de activación del macrófago: La activación plenamente funcional de macrófago le conduce a desarrollar diferentes papeles durante el proceso inflamatorio. Su fenotipo se establece por un complejo sistema de señalización en dónde encontramos una gran multitud de citoquinas, metabolitos, proteínas plasmáticas, PAMPs y DAMPs. En este dibujo adaptado de Gordon y Martinez (2010) se resume de forma esquemática las fases más importantes del proceso de activación. Los procesos se esquematizan de forma jerárquica, donde una primera fase de diferenciación mediada principalmente por M-CSF y GM-CSF va a determinar diferencias sustanciales en el fenotipo de un macrófago maduro una vez se haya activado. La fase de cebado está influenciada por el contexto extracelular de citoquinas que aparecen en una determinada situación inmunológica. Así, en el contexto de una infección por parásitos, los elevados niveles de IL-4 propiciarán una activación alternativa. La activación plena del macrófago se produce por un estímulo inmunogénico y está mediada por los receptores de la inmunidad innata, como los TLRs o scavenger. Una vez se ha activado el macrófago, el perfil de citoquinas y su funcionalidad vendrán determinadas por los procesos anteriores de cebado y diferenciación. Cuando el proceso inflamatorio avanza, determinadas citoquinas, como el TGF-β o la IL-10 inducirán la desactivación del macrófago, permitiendo así la resolución de la inflamación y la vuelta a la homeostasis tisular. (Adaptado de Gordon and Martinez, 2010).
1.3.7 Los marcadores del fenotipo inmune en el macrófago
La base molecular de la heterogeneidad fenotípica y funcional del macrófago ha empezado a desvelarse mediante el análisis de los perfiles de expresión génica y de las funciones efectoras en diversas situaciones patológicas. Se han llevado a cabo un gran número de estudios para identificar marcadores fenotípicos claros capaces de distinguir una activación alternativa de una activación clásica. Al mismo tiempo, estos análisis han revelado diferencias muy significativas entre los perfiles de expresión de los macrófagos murinos y humanos. Este hecho genera una importante controversia, dado que existe la necesidad de validar marcadores alternativos en ambas especies y la extrapolación de resultados obtenida en modelos animales y humanos debe tomarse con cautela. Tal es el caso de la arginasa I o la quitinasa Ym1, los cuales no pueden considerarse un buen marcador de fenotipo alternativo en humano, pero sí en el ratón (Raes et al., 2005). Al mismo tiempo, existen marcadores específicos de activación alternativa en humanos que no se encuentran en el genoma murino, como es el caso de DC-SIGN (Puig-Kroger et al., 2004).
1.3.8 El papel de los neutrófilos en la isquemia cerebral
Como he comentado anteriormente, el daño isquémico se incrementa tras la respuesta inflamatoria, lo que implica una reacción local y un influjo de células sanguíneas reclutadas por citoquinas, moléculas de adhesión y quemoquinas (Jin et al., 2010). Entre estas células, los neutrófilos se movilizan desde la médula ósea permitiendo la respuesta efectiva de la inmunidad innata. A pesar de que como he comentado se han descrito diferentes patrones de infiltración para los neutrófilos, en general, se piensa que estas células se infiltran rápidamente al cerebro isquémico, a partir de las primeras horas tras la isquemia, alcanzando sus niveles de infiltración máxima entre los días 1 y 3 tras el establecimiento del infarto y disminuyendo su número con el paso del tiempo (Jin et al., 2010; Kriz, 2006).
Tabla 4: Marcadores empleados para la caracterización de las diferentes subpoblaciones de macrófagos
Marcador Función Expresión
Macrófagos M1
IL-12 Induce el desarrollo de la respuesta Th1 Inducido por IFNγ iNOS Produce NO para matar microorganismos Depende de IFNγ CCL15 Atrae monocitos, linfocitos y eosinófilos Sobreexpresión por IFNγ CCL20 Atrae células dendríticas y células T Sobreexpresión por IFNγ CXCL9 Implicado en el tráfico de las células T Inducido por IFNγ CXCL10 Atrae células NK y células T a través de CXCR3 Inducido por IFNγ CXCL11 Atrae células NK y células T a través de CXCR3 Inducido por IFNγ
Macrófagos M2
CCL18 Atrae linfocitos, dendríticas inmaduras y monocitos Inducido por IL-4
YM1 Unión a la matriz extracelular Fuertemente inducido por IL-4 RELMα Promueve deposición de la matriz extracelular Fuertemente inducido por IL-4 CCL17 Atrae céluas T y macrófagos Inducido por IL-4 y suprimido por IFNγ Arginasa I Contrarresta la actividad de la iNOS Inducido por IL-4, también por LPS IL-27Rα Inhibe la producción de citoquinas pro-inflamatorias Sobreexpresión por IL-4
IGF1 Estimula la proliferación y supervivencia de
fibroblastos Inducido por IL-4 CCL22 Atrae células TH2 y otras células CCR4+ Inducido por IL-4 DCIR Lectina tipo C que contiene un motivo ITIM Inducido por IL-4 Estabilina 1 Receptor endocítico implicado en el sorting lisosomal Inducido por IL-4 Factor XIII-A Unión a matriz extracelular, contribuye a la
cicatrización Inducido por IL-4 y suprimido por IFNγ DC-SING Unión de carbohidratos y fagocitosis Inducido por IL-4
CD206 Unión de carbohidratos y fagocitosis Inducido por IL-4 Macrófagos de desactivación adquirida ( M2C)
IL-10 Potente citoquina antiinflamatoria Inducido por TLRs junto a otros estímulos SPHK1 Cataliza la fosforilación de la esfingosina Inducido por TLRs y complejos inmunes LIGHT Promueve señales coestimuladoras en células T Inducido por TLRs y complejos inmunes CCL1 Atrae eosinófilos y células TH2 Inducido por TLRs junto a otros estimulos Antígenos compartidos entre macrófagos M2 y de desactivación adquirida
CD36 Receptor scavenger, fagocitosis Inducido por IL-4 y LDL oxidado
CD163 Limpieza de la hemoglobina/haptohemoglobina Inducido por IL10, glucocorticoides o junto IL-4 IL1ra Inhibe la función de la IL-1 Inducido por IL-4 e IL-10
Sólo empleados como marcadores en humanos; Sólo empleados como marcadores en ratón.
*Adaptado de (Colton, 2009; Mantovani et al., 2005; Mosser and Edwards, 2008)
La infiltración de los neutrófilos al cerebro isquémico se ha asociado con un incremento del daño tisular debido a varios mecanismos inflamatorios, como adhesión al endotelio, generación de EROs o secreción de proteasas (Segel et al., 2011). Aun así, la contribución exacta de estas células al daño isquémico
continua siendo objeto de debate. Un creciente número de estudios han comenzado a indicar que los neutrófilos presentan una funcionalidad
heterogénea in vivo y una capacidad para cambiar su fenotipo in vitro tras su
exposición a citoquinas (Mantovani et al., 2011). Estas evidencias indican que los neutrófilos son capaces de responder a estímulos extracelulares dependiendo del contexto en el que se encuentren (al-Essa et al., 1995; Chakravarti et al., 2009; Puellmann et al., 2006), por lo tanto, al igual que ocurre en macrófagos, determinados estímulos son capaces de inducir en los neutrófilos la expresión de distintos fenotipos. En este contexto, ya se ha descrito la existencia de neutrófilos asociados a tumores, con capacidad pro-tumorigénica, inducidos por TGF-β y con una expresión de citoquinas y marcadores específicos (Fridlender et al., 2009). En el campo de la isquemia cerebral, la contribución de los distintos fenotipos de neutrófilos al daño isquémico no se ha estudiado.
4 El Receptor Activado por Proliferadores de Peroxisomas
Gamma: PPAR
γ
Los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPARs, peroxisome proliferator-activated receptors) pertenecen a la superfamilia de receptores nucleares. Sus funciones biológicas son muchas y variadas; abarcan desde el metabolismo de lípidos e hidratos de carbono o la proliferación y diferenciación celular, hasta la implantación y maduración del feto en mamíferos. Su localización tisular varía en función de la isoforma.
PPARα se localiza principalmente en hígado, corazón, músculo estriado, riñón
y endotelio, mientras que PPARβ/δ se considera ubicuo, expresándose
mayoritariamente en intestino, riñón y corazón. En cuanto a PPARγ, existe constancia de que se expresa prácticamente en todas partes: cerebro, epitelio intestinal (Lambe and Tugwood, 1996), los distintos componentes del sistema inmunitario, la retina, músculo esquelético e hígado entre otros, aunque se
localiza principalmente en tejido adiposo, donde lleva a cabo uno de sus papeles más relevantes, el control del metabolismo lipídico (Dreyer et al., 1992). Se ha descrito un gran número de ligandos de PPARγ. Entre los ligandos endógenos destacan los prostanoides, en concreto, 15dPGJ2
(15-deoxi-∆12,14-prostaglandina J2) (Forman et al., 1995). Otros ligandos son las formas
oxidadas de lipoproteínas de baja densidad (Nagy et al., 1998) y de esteroles (Gottlicher et al., 1992). También se han encontrado agonistas PPARγ entre los metabolitos de lipoxigenación de ácidos grasos insaturados como linoleico, linolénico y araquidónico (Forman et al., 1997). Es importante destacar que otros mediadores lipídicos ejercen un agonismo indirecto al ser fuentes de producción de ligandos endógenos, como el ácido araquidónico, del que deriva 15dPGJ2, o el ácido linoleico. Ambos ácidos grasos se liberan de las membranas por acción de la fosfolipasa A2 (PLA2) ante diversos estímulos como la isquemia.
Además de los ligandos endógenos, se han sintetizado numerosos compuestos que actúan como agonistas PPARγ. Destacan las tiazolidindionas (TZDs) o glitazonas, que son los primeros fármacos agonistas PPARγ desarrollados y que se han usado para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo II por su acción sensibilizadora a la glucemia en tejidos periféricos y por aumentar la expresión en membrana del transportador Glut-4 de glucosa (Hauner, 2002). Los principales representantes de las TZDs son rosiglitazona, pioglitazona y ciglitazona (Tugwood et al., 1996). Además de las glitazonas, existen otros agonistas sintéticos que derivan del ácido fenilacético: L-796,449; L-783,483 y L-165,461. Su naturaleza química es radicalmente distinta de la de otros agonistas PPARγ como rosiglitazona y 15dPGJ2, y son capaces de activar el receptor en el rango de concentración nanomolar; de ellos, el más potente es L-796,449.
No se conocen ligandos antagonistas endógenos de PPARγ, aunque su actividad transcripcional está inhibida por la unión de moléculas correpresoras. Sin embargo, existen antagonistas sintéticos. Algunos de ellos no son específicos para PPARγ, y otros poseen cierta actividad agonista parcial. Los
más potentes y selectivos hoy en día son T0070907 (Lee et al., 2002) y GW9662 (Gupta et al., 2001), aunque este último, a altas concentraciones,
también inhibe la actividad de PPARα y PPARβ.
Los receptores nucleares, y en concreto PPARγ, se encuentran en el núcleo de manera constitutiva e inactiva, formando un complejo con moléculas correpresoras con actividad deacetilasa de histonas (HDAC). Las moléculas correpresoras impiden la activación de PPARγ, mientras que las HDACs mantienen la cromatina circundante condensada, inhibiendo la transcripción génica (McKenna and O'Malley, 2002). PPARγ induce la transcripción de sus genes diana cuando el ligando agonista se une al receptor. Una vez activado, los correpresores se disocian del complejo y se acoplan moléculas coactivadoras. Todo ello se acopla al sistema natural de transcripción iniciando la transcripción génica a partir de los elementos de respuesta a PPAR, o PPREs. Para que PPARγ sea activo como factor de transcripción debe, no sólo acoplar un ligando agonista a su estructura, sino también formar un dímero con el receptor del ácido retinoico (RXR) (Figura 1.8) (Kodera et al., 2000).
RXR
PPAR
γ
RXR
RSG
cis-RA
cis-RA
ADN
ADN
Coactivador
Coactivador
Figura 1.8 Estructura cristalográfica del complejo PPARγ-RXR: En esta vista ortogonal se muestra al complejo PPARγ-RXR transcripcionalmente activo. Aquí, los ligandos rosiglitazona y ácido cis-retinoico (en verde) están unidos a sus receptores. El complejo lleva asociado una serie de coactivadores y su unión al DNA se produce en los elementos de respuesta para PPARγ(PPRE). (Adaptado de Chandra et al., 2008).
1.4.1 PPARγ y la modulación inmune
La expresión de PPARγ en macrófagos humanos y murinos fue descrita
por primera vez en 1998 por tres grupos de investigación diferentes (Jiang et al., 1998; Ricote et al., 1998; Tontonoz et al., 1998). Este hecho condujo a una intensa investigación sobre el papel de este receptor en la regulación de la activación y el metabolismo del macrófago. Los estudios iniciales llevados a cabo por los laboratorios de Glass y Seed indicaban que la activación
farmacológica de PPARγ atenuaba la expresión de moléculas pro-inflamatorias
como IL-1β, TNF-α e IL-6 en estas células. Un estudio más exhaustivo de este
mecanismo mostró que PPARγ tiene un efecto represor sobre diversos factores de transcripción, como NF-κB (por interacción con p50 y p65) (Chung et al., 2000), AP-1 (al interaccionar con c-Jun) (Subbaramaiah et al., 2001; Wang et al., 2002) y STAT1 (Daynes and Jones, 2002). Al activarse, PPARγ “secuestra” los coactivadores presentes en el núcleo, de tal manera que estos no están disponibles para otros factores de transcripción. Este método de inhibición se conoce como trans-represión transcripcional (Figura 1.9). Además puede interaccionar físicamente con otros factores de transcripción (por ejemplo con
la subunidad RelA/p65 de NFκB) impidiendo su funcionamiento: este fenómeno
se conoce como acoplamiento cruzado. Así, la activación de PPARγ tiene la capacidad de inhibir la actividad de factores de transcripción implicados en la inflamación, disminuyendo la expresión de sus genes diana que comprenden citoquinas y sus receptores, moléculas de adhesión y enzimas inducibles.
Además de atenuar la activación M1 del macrófago, las propiedades inmunomoduladoras del receptor PPARγ tienen un papel en la polarización M2 (Figura 1.9). Fue también el grupo de Glass quien observó que PPARγ se inducía fuertemente por la IL-4 (Huang et al., 1999). Tras este descubrimiento, la familia de receptores PPAR ha sido objeto de estudio importante en el campo de la polarización del macrófago (Chawla, 2010). Ahora sabemos que la
unión de IL-4 o IL-13 a sus receptores IL-4Rα/IL-2Rγc o IL-13Rα1/IL-4Rα,
respectivamente, inicia una cascada de señalización citoplasmática que culmina en la fosforilación del factor de transcripción STAT6 (Signal transducer
and activator of transcription 6) (Martinez et al., 2009). Como consecuencia, STAT6 dimeriza y se transloca al núcleo donde induce la expresión de sus genes diana, incluyendo los marcadores alternativos arginasa I, CD206, Ym1 y
Fizz1 y reguladores de la activación alternativa como PPARγ, PPARб o
PGC-1β. De manera sinérgica, la activación de PPARγ inducirá en el macrófago la
expresión de marcadores M2, tales como arginasa I, CD36 o CD206 (Odegaard et al., 2007).
La habilidad de las células inmunes para llevar a cabo sus funciones efectoras está estrechamente unida y controlada por su estado metabólico. Así, hace ya un siglo, se observó que la glucolisis anaerobia es necesaria para mantener el programa microbicida de los macrófagos M1 (Levene, 1912), el
cual está regulado transcripcionalmente por el Factor Inducible por Hipoxia 1α
(HIF-1α) (Cramer et al., 2003). Estas observaciones sugerían que el
metabolismo aerobio podría estar implicado en el mantenimiento de la activación alternativa del macrófago. Así, una serie de estudios demostraron que la estimulación del macrófago con IL-4 era capaz de inducir la captación y oxigenación de los ácidos grasos y la biogénesis mitocondrial (Odegaard et al.,
p50 p65 Fos Jun STAT1 STAT3
Elementos Respuesta Genes diana NF-B AP1 PPAR Agonista PPARγ Activación M1 STAT1/3 p50 p65 p50
p50 p65p65 FosFosFos JunJunJun STAT1 STAT3STAT1STAT1 STAT3STAT3
Elementos Respuesta Genes diana NF-B AP1 PPAR Agonista PPARγ PPAR PPAR Agonista PPARγ Activación M1 STAT1/3
Figura 1.9 Implicación del receptor PPARγen la modulación inmune del macrófago: La habilidad de PPARγ para inhibir la expresión de genes pro-inflamatorios derivada de su efecto transrepresor sobre diferentes factores de transcripción (NFkB, AP-1, STAT1/3) se combina con su capacidad para activar la expresión de marcadores M2, como CD36, CD206 y arginasa I. Agonista PPARγ PPRE Genes diana AF2 DBD RXR PPAR DBD Ácido Retinoico AF2 ActivaciónM2 Agonista PPARγ PPRE Genes diana AF2 AF2 DBD RXR PPAR DBD Ácido Retinoico AF2 ActivaciónM2
2007; Vats et al., 2006). Estos procesos están transcripcionalmente controlados
por PPARγ y su proteína coactivadora PGC-1βen el macrófago. De este modo,
el control de la cascada metabólica y de los reguladores del metabolismo oxidativo por IL-4 y STAT6 convierte a este metabolismo en un componente importante de la activación alternativa. Por lo tanto, la adquisición y el mantenimiento de un fenotipo M2 requiere de la regulación metabólica de
PPARγ. Este hecho se pone de manifiesto en el estudio con macrófagos
PPARγ-/-, donde la imposibilidad de mantener un correcto metabolismo
oxidativo comprometía la expresión de un fenotipo M2 (Chawla, 2010).
Además de la activación alternativa, estudios recientes han demostrado
la implicación de los receptores nucleares PPARδ y LXR (Liver X Receptor) en
el proceso de desactivación adquirida tras la fagocitosis de células apoptóticas (Gonzalez et al., 2009; Mukundan et al., 2009). De hecho, se considera que la función de estos receptores es actuar como un sensor de células apoptóticas, coordinando la limpieza de estas células y suprimiendo la autorreactividad de la
respuesta inmunológica. La adquisición mediada por PPARγ de este fenotipo
en el macrófago está aún poco explorada, pero muchas evidencias indican que
su activación tiene un efecto importante en la fagocitosis. De hecho, PPARγ es
necesario para una eliminación efectiva de los neutrófilos y su activación se ha visto asociada a un incremento de la fagocitosis (Fernandez-Boyanapalli et al., 2009; Zhao et al., 2009a).
Por otra parte, la contribución del receptor PPARγ a la polarización de
los neutrófilos nunca ha sido estudiada, pero la expresión constitutiva de este receptor en los neutrófilos y su inducción tras la exposición a citoquinas en
estas células sugiere un papel de PPARγ en la polarización de estas células.
1.4.2 PPARγ en la isquemia cerebral
Aunque el estudio del control de la inflamación modulado por estos receptores ha sido bastante intenso, las aplicaciones terapéuticas de los
