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Universidad de La Salle

Ciencia Unisalle

Ingeniería Ambiental y Sanitaria Facultad de Ingeniería

1-1-2017

Propuesta de diseño e implementación de

protocolo institucional para el uso del biorreactor

en condiciones aerobias ubicado en el Centro

Tecnológico de Ambiente y Sostenibilidad (CTAS)

de la Universidad de La Salle

Anyi Paola Rodríguez Moreno Jessika Alejandra Roa Celis

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Rodríguez Moreno, A. P., & Roa Celis, J. A. (2017). Propuesta de diseño e implementación de protocolo institucional para el uso del biorreactor en condiciones aerobias ubicado en el Centro Tecnológico de Ambiente y Sostenibilidad (CTAS) de la Universidad de La Salle. Retrieved fromhttps://ciencia.lasalle.edu.co/ing_ambiental_sanitaria/704

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PROPUESTA DE DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE PROTOCOLO INSTITUCIONAL PARA EL USO DEL BIORREACTOR EN CONDICIONES AEROBIAS UBICADO EN

EL CENTRO TECNOLÓGICO DE AMBIENTE Y SOSTENIBILIDAD (CTAS) DE LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE

ANYI PAOLA RODRÍGUEZ MORENO JESSIKA ALEJANDRA ROA CELIS

UNIVERSIDAD DE LA SALLE

PROGRAMA DE INGENIERÍA AMBIENTAL Y SANITARIA FACULTAD DE INGENIERÍA

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PROPUESTA DE DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE PROTOCOLO INSTITUCIONAL PARA EL USO DEL BIORREACTOR EN CONDICIONES AEROBIAS UBICADO EN

EL CENTRO TECNOLÓGICO DE AMBIENTE Y SOSTENIBILIDAD (CTAS) DE LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE

ANYI PAOLA RODRÍGUEZ MORENO JESSIKA ALEJANDRA ROA CELIS

Trabajo de grado presentado como requisito para obtener el título de: Ingeniero Ambiental y Sanitario

Director:

Oscar Fernando Contento Rubio Ingeniero Químico

Línea de investigación: Innovación y desarrollo tecnológico

UNIVERSIDAD DE LA SALLE

PROGRAMA DE INGENIERÍA AMBIENTAL Y SANITARIA FACULTAD DE INGENIERÍA

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3 Nota de aceptación __________________________ __________________________ __________________________ __________________________ __________________________ Director __________________________ Jurado __________________________ Jurado

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Bogotá, noviembre 2017

Dedicatoria

Gracias al esfuerzo de mis padres Álvaro Rodríguez y sobre todo mi madre Luz Moreno quien con mucho esfuerzo y dedicación me enseñó a ser una mujer de armas tomar, es que hoy se hace posible culminar una nueva etapa de mi vida. El gran amor que les tengo me permitió seguir adelante en este arduo camino. A mi abuela Evelia Cuervo quien con su gran entereza y valentía me guio durante muchos años y me enseño que como pilar fundamental de mi vida siempre debería tener a Dios en mi corazón. A Andrés Romero quien siempre estuvo ahí en los momentos en los que quería desistir y el cual constantemente encontraba las palabras adecuadas para darme una voz de aliento. Solo me queda por decir que agradezco por todo su amor, dedicación y por enseñarme cada uno a su manera ser una mejor persona y una mejor profesional. A mi compañera Jessika Roa, porque sin ella no hubiera sido posible culminar esta etapa de mi vida, por soportar todos mis estados de ánimo.

Anyi Paola Rodríguez Moreno

Al motor de mi vida, mi familia. Mis padres Jorge Roa y Dora Celis y mi hermano William Roa por motivarme constantemente a alcanzar mis sueños, por forjarme como la persona que soy hoy en día y por luchar incansablemente para culminar esta etapa de mi vida.

A mi compañera de tesis y amiga, Paola Rodríguez porque sin ella todo este proceso no hubiese sido posible y sin duda fuimos el complemento perfecto.

A cada una de las personas que dejaron en mi memoria enseñanzas, alegría y amor.

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Agradecimientos

A Dios por permitirnos culminar este proceso y poner personas en nuestro camino que marcaron nuestras vidas.

A nuestras familias, por ser apoyo, amor, coraje, fuerza y valentía durante nuestra carrera profesional y a nivel personal.

A nuestro director, el ingeniero Oscar Contento por su entera disposición, apoyo e interés en cada etapa del proceso.

A cada uno de los laboratoristas del CTAS de la Universidad de La Salle, por su paciencia y apoyo incondicional y todas las personas que cada día contribuyeron para que esto fuese posible.

Anyi Paola Rodríguez Moreno Jessika Alejandra Roa Celis

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Contenido

GLOSARIO ... 10 RESUMEN ... 13 INTRODUCCIÓN ... 15 JUSTIFICACIÓN ... 17 1. MARCO DE REFERENCIA ... 18 1.1. MARCO TEORICO ... 18

1.1.1. Reactor de cochada de mezcla completa ... 19

1.1.2. Reactor de flujo continuo o mezcla completa ... 19

1.1.3. Reactor de flujo en pistón o flujo tubular... 20

1.1.4. Reactor de flujo con dispersión longitudinal ... 20

1.2. MARCO CONCEPTUAL... 21

1.2.1. Biodigestor Actum ... 21

1.2.2. Identificación del equipo ... 21

1.2.3. Características del equipo ... 22

1.2.4. Materiales ... 22 1.2.5. Consorcio Microbiano ... 23 2. MARCO LEGAL ... 25 3. OBJETIVOS ... 26 3.1. OBJETIVO GENERAL ... 26 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 26 4. ENFOQUE METODOLÓGICO ... 27 5. RESULTADOS Y ANÁLISIS ... 28 5.1. PRUEBAS PRELIMINARES... 28

5.1.1. Hidratación y determinación de la cantidad del consorcio microbiano EPIZYM ... 29

5.1.2. Curva espectral ... 31

5.1.3. Curva de calibración ... 35

5.1.4. Montaje pruebas preliminares ... 39

5.1.5. Resultados pruebas preliminares ... 41

5.2. PRUEBAS ESPECÍFICAS ... 50

5.2.1. Revisión inicial del equipo ... 50

5.2.2. Montaje pruebas específicas ... 54

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6. CONCLUSIONES ... 63

7. RECOMENDACIONES ... 64

8. REFERENCIAS ... 66

9. ANEXOS ... 68 ANEXO 1... ¡Error! Marcador no definido. ANEXO 2... ¡Error! Marcador no definido. ANEXO 3... ¡Error! Marcador no definido. ANEXO 4... ¡Error! Marcador no definido.

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Tabla de ilustraciones

Ilustración 1. Esquema del reactor de cochada en mezcla completa. ... 19

Ilustración 2. Reactor de flujo continuo y mezcla completa... 20

Ilustración 3. Esquema de un reactor de flujo en pistón. ... 20

Ilustración 4. Dimensiones Biorreactor. ... 22

Ilustración 5. Etapas y actividades a desarrollar para el cumplimiento del proyecto. ... 27

Ilustración 6. Cantidad en masa de Consorcio microbiano EPYZYM- HC. ... 30

Ilustración 7. Hidratación de consorcio microbiano EPYZYM-HC... 30

Ilustración 8. Montaje pruebas preliminares... 40

Ilustración 9. Degradación aeróbica de petróleo crudo. ... 50

Ilustración 10. Soporte y panel de control. ... 51

Ilustración 11. Instalación manómetro, válvula de seguridad y válvula descompresión. ... 51

Ilustración 12. Montaje en el biorreactor en prueba específica. ... 54

Ilustración 13. Tapa del biorreactor. ... 54

Ilustración 14. Descripción para modificar dígitos. ... 55

Ilustración 15. Control de temperatura. ... 55

Ilustración 16. Control de velocidad de agitación. ... 56

Tabla de Tablas

Tabla 1. Marco legal CTAS, Universidad de La Salle. ... 25

Tabla 2. Valores de absorbancia en longitudes de onda de 280nm a 345nm para los 6 patrones. ... 34

Tabla 3. Volúmenes requeridos de la solución madre para llegar a la solución B. ... 36

Tabla 4. Absorbancia leída en longitud de onda de 293nm y 333nm. ... 36

Tabla 5. Resultados SSV Muestra #1-20°C. ... 42

Tabla 9. Resultados de absorbancias y concentración. Muestra #1-20°C. ... 46

Tabla 13. Ajuste de Velocidad angular. ... 52

Tabla 14. Resultados SSV (AM) Biorreactor. ... 58

Tabla 15. Resultados SSV (PM) Biorreactor. ... 58

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Tabla de Gráficas

Gráfica 1. Barrido de valores de absorbancia para patrón 1,2 y 3. ... 34

Gráfica 2. Barrido de valores de absorbancia para patrones 4, 5 y 6. ... 35

Gráfica 3. Absorbancia Vs concentración (293nm). ... 37

Gráfica 4. Absorbancia Vs concentración (333nm). ... 38

Gráfica 5. Sólidos suspendidos volátiles VS. Tiempo. ... 44

Gráfica 6. Concentración VS Tiempo en pruebas preliminares. ... 48

Gráfica 7. Ajuste de velocidad de agitación en el controlador. ... 53

Gráfica 8. SSV VS Tiempo, Biorreactor. ... 60

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GLOSARIO

BIODEGRADACIÓN: Es el resultado de los procesos de digestión, asimilación

y metabolización del compuesto orgánico por microorganismos saprófitos o saprozoicos, tales como bacterias, hongos, protozoos y otros. (Branco, 1984)

BIORREACTOR: Un biorreactor es un sistema que mantiene activamente un ambiente

biológico, en este sistema, se lleva a cabo un proceso químico donde se involucran organismos y sustancias activas. (Quiminet, 2011)

BIOTECNOLOGÍA: La biotecnología se refiere a toda aplicación tecnológica que utilice

sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos. (Universidad de Concepción. Centro de

biotecnología, s.f.)

CONSORCIO MICROBIANO: es una asociación natural de dos o más poblaciones

microbianas, de diferentes especies, que actúan conjuntamente como una comunidad en un sistema complejo, donde todos se benefician de las actividades de los demás. La asociación refleja estilos de vida sinérgicos o sintróficos (que significa “comiendo juntos”) en el que el crecimiento y el flujo cíclico de nutrientes se conduce más efectiva y eficientemente que en poblaciones individuales (Ochoa & Montoya, 2010).

CURVA DE CALIBRACIÓN: es una gráfica que relaciona la concentración de al menos

cinco soluciones de estándar de concentraciones conocidas, con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (λ max). (Introducción teórica. Fundamentos de espectrofotometría. Guía TP 2. Química II, 2010)

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CURVA ESPECTRAL: Las curvas espectrales de la absorción muestran el rango de las

longitudes de onda en las que un material determinado absorbe la radiación infrarroja, así como el porcentaje de la absorción. (InfraredHeaters, 2015)

HIDROCARBUROS: Compuestos orgánicos formados solamente por hidrógeno y carbono,

muy abundantes en la naturaleza, que constituyen los petróleos y los gases de los yacimientos petrolíferos y forman parte de numerosas esencias, etc. Se dividen en dos series: acíclica y cíclica. La primera, llamada también alifática o grasa, comprende los -de cadena abierta. La segunda, también llamada aromática, está formada por los –de cadena cerrada. (Zamora editores)

LIOFILIZACIÓN: Es el método más utilizado para la conservación de microorganismos.

Básicamente consiste en someter a temperaturas de congelación rápidamente una suspensión de microorganismos y eliminar el agua como vapor de agua directamente del hielo sin pasar por el estado intermedio líquido. (Vanegas López, 2015)

METABOLISMO MICROBIANO: El término metabolismo designa la totalidad de las

reacciones químicas que se producen en un organismo vivo. Dado que las reacciones

químicas liberan o consumen energía, el metabolismo se puede concebir como una función de equilibrio energético. (Funke, Tortora, & Case, 2007).

PROCESO AEROBIO: Es un proceso de respiración de oxígeno en el cual el oxígeno libre

es el único aceptor final de electrones. El oxígeno es reducido y el carbono es oxidado, al igual que la materia orgánica o inorgánica. Todos los organismos que usan oxígeno libre como aceptor de electrones son aerobios. (Romero, 2008)

TRATAMIENTO: Procedimiento cuyo efecto se mide y se compara con otros. (Torres

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TÓXICO: Es toda sustancia química que, incorporada al organismo vivo a determinada

concentración, produce en virtud de su estructura química y a través de mecanismos fisicoquímicos y bioquímicos, alteraciones de la fisicoquímica celular, que pueden ser transitorias o permanentes, siempre incompatibles con la salud y en algunos casos con la vida. (Bello Gutiérrez & López de Cerain Salsamendi, 2001)

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RESUMEN

La Universidad de La Salle y el programa de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, con el fin de incentivar proyectos de investigación, creó un espacio para el desarrollo académico donde se pueden realizar procedimientos experimentales, mediante el uso de plantas piloto, en relación con el tratamiento de agua, aire, suelo y demás recursos.

No obstante, durante el desarrollo de este espacio, se evidenció que el biorreactor a nivel de planta piloto, no es utilizado ni tenido en cuenta como herramienta para fomentar el

aprendizaje de los estudiantes. En consecuencia, el presente trabajo tiene como objetivo principal diseñar e implementar un protocolo institucional para el uso del biorreactor en condiciones aerobias, ubicado en el Centro Tecnológico de Ambiente y Sostenibilidad (CTAS) de la Universidad de La Salle, mediante una práctica experimental. Esta consistió en la remediación de agua contaminada con hidrocarburo (crudo) por medio del uso de un consorcio microbiano “EPIZYM-HC”.

En primer lugar, se realizó una revisión bibliográfica que permitió identificar las condiciones necesarias de control y operación tanto del biorreactor como del consorcio microbiano, lo anterior relacionando variables como la tasa de crecimiento microbiano (mg SSV/L), requerimiento de nutrientes, grado de agitación, temperatura, entre otros. Posteriormente, se realizó el diagnóstico inicial de la planta piloto, en el cual se determinó fallas en el

controlador del equipo, razón por la cual se tuvo que realizar un ajuste en la programación del mismo; también se encontró fallas en el sistema eléctrico asociados al calentamiento de la chaqueta. Adicionalmente fue necesario acondicionarlo mediante la instalación de un

medidor de presión y una válvula de seguridad, la cual permite mayor operatividad si en dado caso se realizan procesos anaerobios. Por otra parte, se llevó a cabo cuatro análisis a escala laboratorio, las cuales permitieron establecer las condiciones iniciales de trabajo con respecto a la cantidad de hidrocarburo, tiempo de reacción, velocidad de agitación, temperatura y

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cantidad en gramos del consorcio microbiano. De acuerdo a esto, se procedió a realizar el análisis en el biorreactor a nivel planta piloto con condiciones similares. Se utilizó el método gravimétrico para la medición de sólidos suspendidos volátiles y el método fotométrico para la medición de absorbancias en el espectrofotómetro “GENESYS 10S UV-Vis” de

fluorescencia ultravioleta. Los resultados obtenidos en las pruebas preliminares arrojaron que el crecimiento microbiano y degradación de crudo son mejores en condiciones de temperatura de 40 ºC, y así replicarlo en las pruebas específicas. Finalmente, se concluye que, a

volúmenes de 155 mililitros, la cinética de la degradación es más rápida mientras que para las pruebas en el biorreactor es necesario contar con 20 días de análisis para observar una

degradación del hidrocarburo.

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INTRODUCCIÓN

Los hidrocarburos son combustibles fósiles utilizados para la generación de nuevas fuentes de energía alrededor del mundo. No obstante, es posible que se presente contaminación tanto en suelos, agua y aire durante su proceso de extracción debido a constantes derrames

accidentales, como se ha presentado en Colombia. Dichos derrames traen consigo

consecuencias que en algunos casos pueden ser irremediables como la alteración de fauna y flora, el deterioro paisajístico, contaminación de fuentes hídricas, entre otras. (Velásquez, 2016)

Ahora bien, para la reducción de esta problemática existen tecnologías que permiten mitigar los impactos provenientes de la contaminación en cuanto al recurso agua, cuyo propósito es modificar las características físicas y químicas de los componentes, con el fin de disminuir o eliminar la toxicidad de los compuestos que la contienen, logrando así, abastecer las

necesidades de la población, disminuir los impactos ambientales asociados a la contaminación del recurso hídrico y dar cumplimiento de los requerimientos legales ambientales, dispuestos en Colombia.

Dentro de las tecnologías existentes para el tratamiento de aguas contaminadas con hidrocarburo, se utilizan procesos biológicos los cuales permiten transformar la materia orgánica en procesos y productos que pueden ser utilizados posteriormente para un fin. Lo anterior mediante el uso de biorreactores.

Un biorreactor es un recipiente en el cual se lleva a cabo una reacción catalizada por enzimas o células, libres o inmovilizadas, junto con los mezcladores, equipos de toma de muestras y aparatos de control. (Moreno & Bayo, 1996)

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De acuerdo a lo anterior, el presente trabajo tiene como finalidad ser una herramienta de apoyo que permita desarrollar trabajos de investigación relacionados con la remediación de agua contaminada con hidrocarburos mediante el uso del biorreactor en condiciones aerobias a nivel de planta piloto ubicado en el Centro Tecnológico de Ambiente y Sostenibilidad (CTAS) de la Universidad de La Salle, por medio de un consorcio microbiano “EPIZYM-

HC”, controlando parámetros como temperatura, velocidad de agitación y disponibilidad de

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JUSTIFICACIÓN

El Centro Tecnológico de Ambiente y Sostenibilidad (CTAS) actualmente cuenta con una variedad de elementos que facilitan el aprendizaje de los estudiantes y profesores de diferentes espacios académicos de la Universidad de La Salle. Sin embargo, no se hace uso de estos por falta de protocolos de operación que incentiven su uso.

Con el presente proyecto, se pretende diseñar e implementar un protocolo institucional que contenga una metodología experimental para el uso del Biorreactor, el cual se trabajará en condiciones aerobias para la recuperación de aguas contaminadas con hidrocarburo. Éste contará con la descripción de los insumos, instrumentos y pasos a realizar para llevar a cabo dicho procedimiento, así como también, condiciones operacionales y de funcionamiento básico del equipo.

El proyecto es importante en la medida que permite al Programa de Ingeniería Ambiental y Sanitaria y a los demás programas de ingeniería, promover el uso de equipos de avanzada que no están siendo utilizados en la actualidad, beneficiando aquellos espacios académicos que se interesen en pruebas a nivel de planta piloto que contengan procesos de transformación de materia orgánica, crecimiento de cultivos o transferencia de oxígeno.

Finalmente, dicha propuesta podrá ser utilizada como apoyo a diferentes líneas de investigación en las demás facultades de la Universidad de La Salle y personal externo interesado.

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1. MARCO DE REFERENCIA

1.1. MARCO TEORICO

La biotecnología es una ciencia aplicada que utiliza organismos vivos y sus procesos bioquímicos con la finalidad de obtener, crear o modificar productos para usos específicos. Esta tecnología ha crecido y evolucionado hasta tal punto durante los últimos años que el número de profesionales que trabajan en las distintas áreas relacionadas directamente con ella es cada vez mayor. (Renneberg, 2008)

Dentro de estas biotecnologías, se encuentra el uso de biorreactores, los cuales hacen parte de procedimientos que incluyen la transformación de materia orgánica, en biogás o metano, crecimiento de cultivos o transferencia de oxígeno.

El tratamiento en los reactores se efectúa con incorporación de aire y agitación para acelerar el proceso metabólico y formación de flóculos. (Hernández, 1996)

Según el autor Jairo Romero los procesos de tratamiento de aguas operan, generalmente, como procesos de flujo continuo durante el periodo de tratamiento. En ocasiones el proceso es discontinuo, en cochadas, con una carga instantánea del reactor y descarga posterior, sin adiciones intermedias de afluente ni extracción de efluentes. Las reacciones entre el afluente y el efluente están determinadas por las características de dispersión del reactor y por la cinética de las reacciones dentro de él. Los dos extremos fundamentales de características de dispersión de un reactor son el flujo en pistón y el flujo en mezcla completa. En este último el afluente se mezcla instantáneamente con el contenido del reactor mientras que en el primero el fluido se mueve a través del reactor sin que ocurra su mezcla.

Los diferentes reactores ideales son:

 Reactor de cochada de mezcla completa  Reactor de flujo continuo o mezcla completa  Reactor de flujo en pistón

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19

 Reactor de flujo con dispersión longitudinal

 Combinación, en serie o en paralelo de los reactores anteriores

1.1.1. Reactor de cochada de mezcla completa

Es un reactor caracterizado por la inexistencia de afluente y efluente con existencia de mezcla completa del contenido del tanque; es un reactor con dispersión infinita. Este reactor constituye un sistema cerrado y es muy usado en experimentos de laboratorio. A medida que una reacción procede en dicho reactor, la composición y distribución relativa de los reactantes y productos cambia con el tiempo. La mezcla hace que la concentración de reactantes y productos sea uniforme en todo el reactor. (Véase Ilustración 1) (Romero, 2008)

Ilustración 1. Esquema del reactor de cochada en mezcla completa.

Fuente: (Romero, 2008).

1.1.2. Reactor de flujo continuo o mezcla completa

Esta constituido generalmente, por un tanque cilíndrico o cuadrado con mezcla mecánica; las partículas de fluido del afluente se dispersan de inmediato dentro del tanque, haciendo que abandonen el tanque en proporción a su población estadística y permitiendo suponer que el contenido del reactor es homogéneo e igual al del afluente. En otras palabras, las partículas del afluente se dispersan inmediatamente al entrar al reactor, o sea, la dispersión es infinita. El tanque tendrá un contenido homogéneo, una composición uniforme en su volumen y, por tanto, la concentración del afluente es idéntica a la del licor de mezclado del reactor. (Véase

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20

Ilustración 2. Reactor de flujo continuo y mezcla completa.

1.1.3. Reactor de flujo en pistón o flujo tubular

Es un reactor en el cual el fluido se desplaza y sale del tanque en la misma secuencia en la cual entra; las partículas del fluido retienen su identidad y permanecen en el tanque un periodo igual al tiempo teórico de retención hidráulica; es un reactor con dispersión nula. En la práctica son reactores formados por tanques con relación longitud/ancho muy grande para minimizar la dispersión longitudinal. Si se visualiza el concepto de flujo en pistón como un flujo en el cual el fluido, al llegar al reactor, es encerrado en paquetes herméticos que luego viajan a lo largo del tanque, sin transferir ninguna sustancia de un paquete a otro, aunque exista mezcla completa dentro de cada paquete, se puede considerar que cada paquete es un minirreactor de cochada en mezcla completa. (Véase Ilustración 3) (Romero, 2008)

Ilustración 3. Esquema de un reactor de flujo en pistón.

1.1.4. Reactor de flujo con dispersión longitudinal

Adicional a los reactores anterior, Jairo Romero menciona que el reactor de flujo con dispersión longitudinal, tiene régimen de flujo intermedio entre los reactores ideales de

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21

mezcla completa (dispersión = ∞) y de flujo en pistón (dispersión = 0), o sea son tanques con mezcla intermedia.

1.2. MARCO CONCEPTUAL

En este apartado del documento se dan a conocer las diferentes especificaciones del biorreactor con el que se trabajó a lo largo del proyecto ya que será de suma importancia conocer sus características en cuanto a funcionamiento y materiales.

1.2.1. Biodigestor Actum

El equipo BIODIGESTOR es, en su forma más simple, un contenedor cerrado y hermético, dentro del cual se deposita el material orgánico a fermentar (excrementos de animales y humanos, desechos vegetales-no se incluyen cítricos ya que acidifican, etc) en determinada dilución de agua para que a través de la fermentación anaerobia se produzca gas metano y fertilizantes orgánicos ricos en nitrógeno, fósforo y potasio, y además, se disminuya el potencial contaminante de los excrementos. Este sistema también puede incluir una cámara de carga y nivelación del agua residual antes del reactor, un dispositivo para captar y

almacenar el biogás y cámaras de hidrogenación y postratamiento (filtro y piedras, de algas, secado, entre otros) a la salida del reactor. (Innovaciones Actum S.A.S , 2016).

1.2.2. Identificación del equipo

Biodigestor “biodigestor de fondo agitado con control de temperatura y volumen de 20 litros para laboratorio” deberá identificarse como:

● “Biodigestor de fondo agitado con control de temperatura y volumen de 20L

para laboratorio”

● Modelo: biodigestor ● Serie: 6215

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22 1.2.3. Características del equipo

Es un biodigestor metálico, con control de velocidad de agitación, versátil y abierto a futuro a acoplarse con sistemas completos de Control de variables tales como iluminación LED, pH, mezcla y dosificación de gases, controles de niveles de medios, etc. (Innovaciones Actum S.A.S , 2016).

Sus dimensiones se describen a continuación:

Alto: 1267.00 mm

Diámetro tanque: 246.00 mm

Volumen: El volumen neto del reactor es de 20L.

Ilustración 4. Dimensiones Biorreactor.

Fuente: (Innovaciones Actum S.A.S , 2016).

1.2.4. Materiales

 Acero inoxidable 304 para el tanque y para los sistemas de soporte y calentamiento.  Los elementos metálicos son construidos en acero inoxidable 304 unidos mediante

soldadura inoxidable TIG.

 El vaso y chaqueta de calentamiento son fabricados en acero inoxidable 304 de alta resistencia a fluctuaciones de calor. (Innovaciones Actum S.A.S , 2016).

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23 1.2.5. Consorcio Microbiano

Según la ficha técnica proporcionada por el proveedor “Epicore BioNetworks Inc.”; éste es una formulación única de múltiples componentes que promueven la biodegradación de petróleo crudo y productos derivados del petróleo en suelo contaminado y el agua dulce o salada en condiciones aerobias.

Estos contienen microrganismos naturales que poseen amplia gama de actividad oxidante que biodegrada crudos aromáticos, parafínicos o asfálticos a dióxido de carbono, agua y células microbianas. Así como también, metabolizan químicos intermedios tales como ácidos orgánicos, alcoholes, aldehídos, cetonas y ésteres producidos por la biodegradación del petróleo crudo. (Epicore BioNetworks Inc., 2017).

“EPIZYM-HC” inoculante es un ecosistema microbiano formulado con estabilizantes

añadidos y estimulantes del crecimiento. Los microbios se derivan de fuentes naturales y son crecidas en condiciones de control de alta calidad para evitar la contaminación de

microorganismos peligrosos. Son cultivados en una base de hidratos de carbono de origen natural que da al producto su aspecto granular general. Contiene más de 4,4 trillones de microorganismos aerobios facultativos por kg (2 trillones/libra). (Epicore BioNetworks Inc., 2017)

1.2.5.1. Modo de acción

El consorcio microbiano “EPIZYM-HC” utiliza la degradación microbiana para descomponer hidrocarburos contaminantes, enzimáticamente convertirlos en condiciones aerobias en dióxido de carbono, agua y células microbianas.

Dentro de los límites especificados, la eficiencia de los microbios y las enzimas del mismo varía con la temperatura. Típicamente, la biodegradación de petróleo crudo se duplica con cada aumento de 10°C de temperatura entre 10°C – 40°C. (Epicore BioNetworks Inc., 2017)

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24

1.2.5.2. Almacenamiento del producto

Para el almacenamiento del producto se recomienda:

 No guardar de forma continua a temperaturas superiores a 40°C.  Almacenar fuera de la luz directa del sol en un área bien ventilada.  Mantener los productos secos hasta que esté listo para hidratar.

 No mezclar con cualquier material que no estén recomendados por “Epicore

BioNetworks Inc”, especialmente los biocidas y productos químicos agresivos.

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25

2. MARCO LEGAL

Es importante tener en cuenta la normatividad del Centro Tecnológico de Ambiente y Sostenibilidad de la Universidad de La Salle ya que como se mencionó anteriormente es el lugar donde se efectuó la práctica; esto con el fin de hacer un uso responsable y adecuado del laboratorio. Tabla Contenido Reglamentación Centro Tecnológico de Ambiente y Sostenibilidad (CTAS)

● Para permitir el acceso a los laboratorios, es indispensable el uso de la bata (blanca, de algodón y manga larga).

● El uso de guantes, tapabocas y cofia es indispensable para la permanencia en el laboratorio.

● La entrada a los laboratorios debe ser ordenada, conservándose este orden durante el desarrollo de las prácticas.

● Dentro de los laboratorios y salones anexos, queda estrictamente prohibido fumar e introducir cualquier tipo de alimento o bebida; Salvo que se vayan a ocupar en el desarrollo de la práctica. Así mismo, se recomienda no utilizar lentes de contacto, zapatos abiertos, anillos, pulseras, dijes, aretes largos, etc.

● Los útiles y pertenencias que no cumplan un contenido en la práctica, deberán ser colocados en el lugar indicado por el maestro (a) o laboratorista.

● Todos los materiales, equipos y reactivos proporcionados, deberán ser utilizados de acuerdo a las indicaciones del instructivo de la práctica, del maestro (a) o laboratorista. Cualquier accidente, por irresponsabilidad, en que resulten dañados material o equipo, estos deberán ser recuperados al laboratorio por los integrantes del equipo o por la persona responsable, De no hacerlo, se le suspenderá el acceso al laboratorio en las prácticas posteriores.

Tabla 1. Marco legal CTAS, Universidad de La Salle.

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26

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

Diseñar e implementar el protocolo institucional para el uso del Biorreactor en condiciones aerobias, ubicado en el Centro Tecnológico de Ambiente y Sostenibilidad (CTAS) de la Universidad de La Salle, mediante una práctica experimental que permita realizar procesos biológicos para la recuperación de aguas.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Generar las condiciones adecuadas de funcionamiento del biorreactor, teniendo en cuenta que será necesario implementar un sistema de control de presión, válvula de seguridad y sistema de control de temperatura.

 Desarrollar una práctica que permita evaluar procesos biológicos que sean empleados en el tratamiento de agua contaminada con hidrocarburos (crudo) a fin de establecer una herramienta para el aprendizaje de los estudiantes de la Universidad de La Salle.  Establecer un protocolo de operación del biorreactor en condiciones aerobias para el

tratamiento de agua contaminada con hidrocarburo (crudo) producto de la práctica experimental llevada a cabo.

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4. ENFOQUE METODOLÓGICO

En la Ilustración 5 se muestra el desarrollo metodológico del presente proyecto de investigación el cual contempla tres distintas etapas con sus respectivas actividades. Las actividades propuestas permitieron dar cumplimiento a los objetivos planteados y tener como resultado final un protocolo institucional que sirva como apoyo académico e incentive la utilización del biorreactor en condiciones aerobias.

Ilustración 5. Etapas y actividades a desarrollar para el cumplimiento del proyecto.

Fuente: Elaboración propia, 2017. Etapa

preliminar

• Consultar y recopilar información bibliográfica de planta piloto y Biorreactores.

• Reconocer los componentes físicos, estructurales, manejo electrónico y digital que conforman el Biorreactor.

• Identificar las condiciones necesarias de control y operación del biorreactor y del consorcio microbiano.

Etapa

experimental

• Reestructurar el biorreactor puesto que actualmente no está en condiciones de operatividad.

• Realizar caracterización inicial de la muestra a tratar. • Realizar tratamiento a la muestra en pruebas preliminares.

• Identificar las condiciones ideales de trabajo con respecto a la velocidad de agitación y la temperatura.

• Determinar y seleccionar la mejor alternativa en cuanto a condiciones operacionales para la degradación de hidrocarburos.

• Realizar tratamiento a la muestra de la prueba específica. • Identificar errores operacionales.

Evaluación y análisis

• Interpretar los resultados obtenidos de la etapa experimental. . • Describir variables a tener en cuenta y resultados esperados.

• Elaborar el protocolo institucional que describa la metodología experimental para el uso adecuado del biorreactor

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28

5. RESULTADOS Y ANÁLISIS

En este apartado se muestras los resultados obtenidos a partir de las pruebas preliminares y especificas desarrolladas durante el proyecto.

5.1. PRUEBAS PRELIMINARES

Para determinar la eficiencia en la degradación de hidrocarburos por medio del consorcio microbiano “EPIZYM- HC” en el biorreactor a nivel planta piloto del CTAS de la

Universidad de La Salle, fue necesario, en primera instancia realizar los procesos de

degradación en las pruebas preliminares, a fin de establecer las condiciones ideales de trabajo con respecto a la cantidad de hidrocarburo a degradar, temperatura requerida para el

crecimiento microbiano, velocidad de agitación, concentración del consorcio representada gr/ml, así como también los parámetros necesarios para definir la eficiencia de cada uno de los procesos. Para los procedimientos en el laboratorio en relación a las pruebas preliminares, se trabajó en iguales proporciones de masa de hidrocarburo, consorcio microbiano y agua, variando la temperatura en 20°C, y asegurando una agitación por medio de agitadores

magnéticos. Los experimentos descritos a continuación se llevaron a cabo por duplicado, con el propósito de corroborar los resultados obtenidos en la degradación de crudo.

Ahora bien, es importante mencionar que, para determinar la degradación y por ende la concentración de crudo, fue necesario realizar la curva espectral y la curva de calibración de la solución utilizando el Espectrofotómetro de fluorescencia ultravioleta de la Universidad de La Salle. Para realizar la degradación del crudo se utilizó un consorcio de microorganismos

(30)

29

5.1.1. Hidratación y determinación de la cantidad del consorcio microbiano EPIZYM

Según lo establecido por la ficha técnica, el consorcio inoculante se presenta en un estado de polvillo y debe ser re-hidratado con agua tibia a 30ºC, durante 30 minutos; la re- hidratación se realiza previo al sistema. Para hacer la mezcla entre el agua y los microorganismos se tuvo en cuenta una relación 1:10 es decir una parte de “EPIZYM-HC” con 10 partes de agua.

NOTA:La re-hidratación se efectuó para todas las pruebas realizadas.

Los materiales utilizados fueron los siguientes:

 Balanza analítica.  Plancha de calentamiento  Espátula  Termómetro digital  Vidrio de reloj  Beaker de 250 ml

Antes de realizar la re-hidratación fue importante determinar la cantidad de agua y crudo a tratar. Para el caso de pruebas preliminares se determinó que se trabajaría con 5 gramos de crudo en 150 gramos de agua, para tener un total de 155 gramos en la solución a tratar.

Según la ficha técnica del consorcio microbiano la cantidad en peso de los microorganismos está dada por la siguiente ecuación:

𝑔𝑟 𝑑𝑒 𝐸𝑃𝐼𝑍𝑌𝑀 𝐻𝐶 = 𝑔𝑟 𝑑𝑒 ℎ𝑖𝑑𝑟𝑜𝑐𝑎𝑟𝑏𝑢𝑟𝑜 𝑎 𝑑𝑒𝑔𝑟𝑎𝑑𝑎𝑟

40 =

5 𝑔𝑟 𝑑𝑒 ℎ𝑖𝑑𝑟𝑜𝑐𝑎𝑟𝑏𝑢𝑟𝑜 40

(31)

30

Luego de esto se determinó la cantidad de agua en la que se tenía que re-hidratar el

consorcio; los resultados obtenidos para 0,2 gramos de “EPIZYM-HC” fueron 2 ml de agua tibia.

Para las pruebas específicas se determinó que se trabajaría con 500 gramos de crudo en 10000 gramos de agua, para tener un total de 10500 gramos en la solución a tratar.

𝑔𝑟 𝑑𝑒 𝐸𝑃𝐼𝑍𝑌𝑀 𝐻𝐶 = 500 𝑔𝑟 𝑑𝑒 ℎ𝑖𝑑𝑟𝑜𝑐𝑎𝑟𝑏𝑢𝑟𝑜 40

= 12,5 𝑔𝑟 𝑑𝑒 𝐸𝑃𝐼𝑍𝑌𝑀 𝐻𝐶

Los resultados obtenidos para 12,5 gramos de “EPIZYM HC” (Véase Ilustración 6) fueron 125 ml de agua tibia (Véase Ilustración 7).

Ilustración 6. Cantidad en masa de Consorcio microbiano EPYZYM- HC.

Fuente: Elaboración propia, 2017.

Ilustración 7. Hidratación de consorcio microbiano EPYZYM-HC.

(32)

31

Cabe aclarar que dichos procedimientos se realizaron teniendo en cuenta las especificaciones dadas en la ficha técnica del ecosistema microbiano.

NOTA: Se seleccionó un consorcio microbiano ya que las bacterias individualmente pueden

metabolizar un rango ilimitado de compuestos, en contraste con los consorcios microbianos que pueden degradar mezclas complejas de hidrocarburos en diferentes ambientes. (Lozano, 2005).

5.1.2. Curva espectral

La metodología base que se escogió para leer concentración de hidrocarburo en el agua fue el de espectrofotometría ya que es uno de los métodos de análisis más usado, y se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz. (U. Cursos, Facultad de medicina, 2010).

El equipo empleado fue:

 Espectrofotómetro de fluorescencia ultravioleta “GENESYS 10S UV-Vis”

Fue necesario implementar esta metodología para la determinación de hidrocarburo (Crudo) ya que el CTAS de la Universidad de La Salle no contaba con ningún método que permitiera hacer la medición de este compuesto en el agua. El procedimiento fundamentalmente está basado en el propuesto por el manual de técnicas analíticas para la determinación de parámetros fisicoquímicos y contaminantes marinos postulado por el INVEMAR.

La curva espectral es la que permite establecer la longitud de onda a la cual debe ser leída la muestra con crudo. La longitud de trabajo para la práctica que se desarrolló en el Biorreactor corresponde, a la λ en la cual la absorbancia del analito fue máxima. Para seleccionar el λmax,

(33)

32

se realizó una gráfica de absorbancias de la solución, medidas a distintas longitudes de onda; para la ratificación de los resultados fue necesario realizar 6 diferentes patrones como

muestran la Gráfica 1 y la Gráfica 2.

Para el blanco de la curva se utilizó hexano al 96% de pureza ya que éste tiene una presión de vapor que permite trabajar en el laboratorio sin tener pérdidas significativas mientras se procesan las muestras de las pruebas realizadas. Se consigue fácilmente en el mercado y no es tan costoso respecto a otras sustancias que pueden utilizarse como el criseno o el cloroformo. No es tóxico, ni tiene afectaciones a la salud.

En la Tabla 2, se evidencian los resultados de absorbancias obtenidos para los 6 patrones

con concentraciones de 0,05 mg/L; 0,10 mg/L; 0,20 mg/L; 0,30 mg/L; 0,35 mg/L; 0,40 mg/L; 0,50 mg/L respectivamente. En el Espectrofotómetro “GENESYS 10S UV-Vis” se

realizó un barrido de los valores de absorbancia para las longitudes de onda de 280nm a 345nm.

CURVA ESPECTRAL Longitud de

onda (ʎ)

Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5 Patrón 6

280 0,005 0,006 0,031 --- --- --- 281 0,014 0,026 0,022 --- --- --- 282 0,027 0,001 0,009 --- --- --- 283 0,002 0,008 0,022 --- --- --- 284 0,016 0,014 0,017 --- --- --- 285 0,002 0,009 0,02 --- --- --- 286 0,021 0 0,004 --- --- --- 287 0,013 0,007 0,009 --- --- --- 288 0,003 0,036 0,033 --- --- --- 289 0,003 0,046 0,052 --- --- --- 290 0,008 0,057 0,042 --- --- --- 291 0,005 0,081 0,065 --- --- --- 292 0,01 0,111 0,089 --- --- --- 293 0,041 0,155 0,142 --- --- --- 294 0,024 0,151 0,136 --- --- ---

(34)

33

onda (ʎ)

295 0,032 0,159 0,124 --- --- --- 296 0,025 0,169 0,137 --- --- --- 297 0,005 0,143 0,120 --- --- --- 298 0,023 0,16 0,131 --- --- --- 299 0,018 0,159 0,127 --- --- --- 300 0,012 0,148 0,122 --- 0,001 --- 301 0,018 0,151 0,127 --- 0,008 --- 302 0,012 0,144 0,119 --- 0,009 --- 303 0,01 0,137 0,112 --- 0,005 0,009 304 0,008 0,136 0,114 --- 0,015 0,008 305 0,012 0,124 0,111 --- 0,023 0,007 306 0,004 0,118 0,102 --- 0,037 0,006 307 0,006 0,118 0,101 --- 0,039 0,005 308 0,007 0,109 0,100 --- 0,045 0,018 309 0,001 0,106 0,090 --- 0,049 0,027 310 0,001 0,106 0,092 --- 0,048 0,033 311 0,005 0,100 0,090 --- 0,051 0,035 312 0,002 0,096 0,083 --- 0,053 0,037 313 0,003 0,095 0,081 --- 0,057 0,040 314 0,002 0,091 0,079 --- 0,059 0,053 315 0,001 0,088 0,078 0,001 0,060 0,055 316 0,004 0,087 0,075 0,003 0,067 0,057 317 0,002 0,086 0,076 0,006 0,070 0,059 318 0,003 0,083 0,072 0,009 0,069 0,061 319 0,003 0,083 0,070 0,003 0,073 0,063 320 0,002 0,083 0,070 0,010 0,075 0,063 321 0,003 0,081 0,068 0,008 0,076 0,066 322 0,003 0,079 0,067 0,014 0,078 0,067 323 0,003 0,078 0,066 0,006 0,079 0,068 324 0,003 0,077 0,065 0,002 0,081 0,069 325 0,003 0,076 0,064 0,009 0,082 0,067 326 0,004 0,073 0,062 0,013 0,088 0,069 327 0,003 0,074 0,062 0,018 0,089 0,074 328 0,003 0,072 0,061 0,024 0,087 0,088 329 0,004 0,07 0,06 0,028 0,088 0,089 330 --- 0,069 0,059 0,032 0,090 0,095 331 --- 0,068 0,057 0,035 0,095 0,097 332 --- 0,065 0,054 0,037 0,111 0,118 333 --- 0,066 0,055 0,059 0,125 0,121

(35)

34

onda (ʎ)

334 --- 0,064 0,053 0,057 0,122 0,118 335 --- 0,063 0,052 0,055 0,119 0,115 336 --- 0,062 0,051 0,052 0,118 0,112 337 --- 0,061 0,050 0,050 0,117 0,109 338 --- 0,059 0,049 0,049 0,116 0,106 339 --- 0,058 0,047 0,047 0,115 0,103 340 --- 0,057 0,045 0,045 0,100 0,102 341 --- 0,056 0,044 0,042 0,098 0,101 342 --- 0,055 0,043 0,041 0,097 0,096 343 --- 0,054 0,042 0,037 0,095 0,091 344 --- 0,053 0,041 0,035 0,092 0,086 345 --- 0,052 0,040 0,032 0,088 0,081

Tabla 2. Valores de absorbancia en longitudes de onda de 280nm a 345nm para los 6

patrones.

Fuente. Elaboración propia, 2017.

Nota: En las casillas que aparece “---” no registro lectura de absorbancia.

A partir de los resultados obtenidos de absorbancia en las diferentes longitudes de onda se realizaron las respectivas gráficas para analizar el comportamiento de los 6 patrones.

Gráfica 1. Barrido de valores de absorbancia para patrón 1,2 y 3.

Fuente. Elaboración propia, 2017. 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 280 283 286 289 292 295 298 301 304 307 310 313 316 319 A b so rb an cia Longitud de onda (ʎ)

Barrido de longitudes de onda (ʎ)

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35

Gráfica 2. Barrido de valores de absorbancia para patrones 4, 5 y 6.

Según los resultados obtenidos en la Gráfica 1 se puede observar que el comportamiento para el patrón 1, 2 y 3 tuvo mayor valor de absorbancia en el ʎ: 293nm y para los patrones 4, 5 y 6 de la Gráfica 2 la longitud de onda en la que se evidencio una mejor lectura fue en la ʎ: 333nm lo que permite determinar que para concentraciones de 0,05 mg/L a 0,25 mg/L se leerán en longitud de onda de 293nm (Rango Bajo) y para concentraciones mayores a 0,25 mg/L la lectura se realizara en longitud de onda de 333nm (Rango Alto).

5.1.3. Curva de calibración

La curva de calibración se realizó teniendo en cuenta los valores obtenidos en la curva espectral ya que esta permitió determinar las longitudes de onda en las que se obtuvo mayor excitación con respecto a los patrones trabajados. En la lectura de crudo disuelto en hexano se obtuvo una longitud de onda para concentraciones entre 0,05 mg/L a 0,25 mg/L de 293 nm y para concentraciones entre 0,25 mg/L y 0,50 mg/L una longitud de onda de 333 nm.

Para elaborar la curva fue necesario diluir la muestra de crudo hasta 5.000 mg/L para obtener la solución madre. Por lo concentrado del analito fue necesario llevarlo a una solución B; para que cubriera un intervalo adecuado de concentraciones. La solución B se diluyó hasta llegar a una concentración de 10 mg/L. En la

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 300 305 310 315 320 325 330 335 340 345 A b so rb an cia Longitud de onda (ʎ)

Barrido de longitudes de onda (ʎ)

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36

Tabla 3 se muestran los valores en mililitros que se necesitaron para obtener las disoluciones.

Patrón Crudo Solución madre 5000 mg/L Solución B Volumen 25 ml Concentración 10 mg/L Volumen de solución de 5000 mg/L 0,05 ml

Tabla 3. Volúmenes requeridos de la solución madre para llegar a la solución B.

Cabe mencionar que a partir de la solución B se prepararon los patrones del analito y de ahí se procedió a medir la señal analítica o absorbancia proporcionada por los mismos. Los valores obtenidos se muestran en la

Tabla 4. La longitud de onda a la cual fue leída dependerá de la concentración de los

patrones. Concentración (mg/L) ʎ = 293 ʎ = 333 1 0,050 0,01 2 0,100 0,041 3 0,150 0,057 4 0,200 0,111 5 0,250 0,136 0,057 6 0,300 0,067 7 0,350 0,121 8 0,400 0,155 9 0,500 0,242

Tabla 4. Absorbancia leída en longitud de onda de 293nm y 333nm.

La medida de la concentración mediante un método instrumental se basa en la existencia de una relación proporcional entre dicha concentración y la señal analítica o respuesta que genera un instrumento. (Facultad de ciencias exactas y naturales , 2017).

(38)

37

Generalmente esta relación es lineal, de modo que puede expresarse como:

𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏

Donde “x” es la concentración del analito, “y” la señal medida (Absorbancia), “b” la ordenada en el origen y “m” la pendiente de la recta.

Esta ecuación de la recta se obtuvo mediante la calibración con disoluciones de concentración conocidas (Véase

Tabla 4) a partir de los valores de las concentraciones de crudo en las soluciones se ajustó la

recta. Las ecuaciones de la recta se muestran en la Gráfica 3 y la Gráfica 4.

Gráfica 3. Absorbancia Vs concentración de muestra patrón y la ecuación de la recta para

una longitud de onda de 293nm. Fuente. Elaboración propia, 2017.

y = 0,644x - 0,0256 R² = 0,9743 0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120 0,140 0,160 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 A bsor banc ia Concentración (mg/L)

Absorbancia Vs Concentración (293nm)

(39)

38

Gráfica 4. Absorbancia Vs concentración de muestra patrón y la ecuación de la recta para

una longitud de onda de 333nm. Fuente. Elaboración propia, 2017.

La ecuación utilizada para determinar la concentración de crudo en las muestras que se analizaron parte de la ecuación de la recta dada para cada una de las longitudes de onda. Para absorbancias que fueron leídas en longitud de onda de 293nm la ecuación fue:

𝑦 = 0,644 𝑥 − 0,0256

𝑥 =𝑦 + 0,0256 0,644 Dónde:

x: Concentración de Crudo en la muestra (mg/L) y: Absorbancia leída en la muestra de agua.

Para absorbancias que fueron leídas en longitud de onda de 333 nm la ecuación fue:

𝑦 = 0,7724 𝑥 − 0,1497

𝑥 =𝑦 + 0,1497 0,7724 Dónde:

x: Concentración de Crudo en la muestra (mg/L) y: Absorbancia leída en la muestra de agua.

y = 0,7724x - 0,1497 R² = 0,9796 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 A bsor banc ia Concentración (mg/L)

Absorbancia Vs Concentración (333nm)

(40)

39

Como se realizó un modelo lineal se puede interpretar que el término “b” indica la magnitud de la señal estimada del blanco que se supone es la señal que corresponde al cero de

concentración de crudo que se quiere determinar, para la longitud de onda de 293 nm fue de 0,0256 y para la λ de 333nm fue de 0,1497, mientras que “m” es la pendiente de la recta de calibrado e indica la sensibilidad y corresponde a la constante de proporcionalidad entre la señal y la concentración (Facultad de ciencias exactas y naturales , 2017), la sensibilidad para λ de 293nm es de 0,644 y para λ de 333nm es de 0,7724.

Como estadísticamente una calibración realizada a partir de dos puntos es muy pobre fue necesario realizar la curva con 5 patrones para cada longitud de onda. Adicionalmente para el procedimiento estadístico de la determinación de los coeficientes “b” y “m” fue necesario realizar una regresión por mínimos cuadrados, la cual es una herramienta útil porque a partir de la gráfica de los datos obtenidos (Gráfica 1 y Gráfica 2) se pudieron detectar puntos o fallas en la linealidad de los valores como se evidencia en el coeficiente de correlación “R2_”.

El “R2”_{es el que determina la medida de la relación lineal entre las cinco variables de la} gráfica, esto permite dar validez o no a los datos obtenidos. El “R2” va a depender del solvente utilizado puesto que éste aumenta o disminuye la solubilidad del soluto. Según los valores para el coeficiente de correlación de la Gráfica 3, R² = 0,9743 para longitud de onda de 293nm y R² = 0,9796 para longitud de onda de 333 nm en la Gráfica 4 se puede

determinar que son válidos para establecer la concentración de crudo en las muestras de agua que se analizaron.

5.1.4. Montaje pruebas preliminares

El procedimiento realizado para el montaje de las pruebas preliminares se describe a continuación:

(41)

40

1. En dos Erlenmeyer y dos botellas de vidrio de 250 mililitros (boca ancha) (para evitar algún tipo de evaporación) se añadieron 150 ml de agua lluvia y un agitador magnético. 2. En la balanza de precisión se pesó el vidrio de reloj y se taró el mismo para

posteriormente, pesar 10 gramos de crudo y vertirlos en cada uno de los envases (Véase

Ilustración 8).

3. Por último, se adicionó el consorcio microbiano “EPYZYM-HC” re- hidratado (Véase

numeral 5.1.1), y se selló con papel vinipel con agujeros en la parte superior.

Los materiales utilizados para realizar el montaje de las pruebas preliminares fueron:

 (2) Erlenmeyer de 250 ml

 (2) Botellas de vidrio (Boca ancha)  (4) Agitador magnético

 Vidrio de reloj  Espátula

 Balanza analítica de precisión  10 gr de crudo

 150 ml de agua lluvia.  Vinipel

Ilustración 8. Montaje pruebas preliminares.

(42)

41 5.1.5. Resultados pruebas preliminares

Las muestras de las pruebas preliminares se tomaron mediante una pipeta de 5 ml aforada y un pipeteador, tomando en cada uno de los montajes, volúmenes de 15ml. Siguiendo los lineamientos establecidos por el “Standard Methods for the Examination of Water and

Wastewater”- United States Environmental Protection Agency (EPA) se determinaron los

sólidos suspendidos volátiles de cada una de las muestras con el fin de analizar el crecimiento del consorcio microbiano “EPYZYM-HC”. Posteriormente, los sólidos disueltos fueron centrifugados a 5000 rpm por 30 minutos con el propósito de eliminar los microorganismos que el filtro de fibra de vidrio no era capaz de retener. Paso seguido, se tomaron 10 ml de la muestra y adicionando 10 ml de hexano, se llevaron a un embudo de decantación con el fin de hacer la extracción de las sustancias orgánicas presentes en el crudo. Luego, las muestras fueron agitadas vigorosamente durante 5 minutos y así por diferencias de densidades se extrajo la fase del hexano. Después se midió en el Espectrofotómetro “GENESYS 10S

UV-Vis” de fluorescencia ultravioleta utilizando celdas de cuarzo de 3,5 ml tomando como

blanco el hexano, y como la muestra la extracción del mismo realizada en el embudo de decantación.

Para hallar los Sólidos Suspendidos Totales, se utilizó la siguiente ecuación:

𝑆𝑆𝑇(𝑚𝑔 𝐿 ) =

(𝐴 − 𝐵) ∗ 1000 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑚𝑙) Dónde:

 A= peso del residuo seco más filtro (mg)  B= peso filtro inicial (mg)

Cálculo de los sólidos suspendidos totales, día 1 (AM):

𝑆𝑆𝑇 (𝑚𝑔 𝐿 ) =

(422,40 𝑚𝑔 − 418,50 𝑚𝑔) ∗ 1000

(43)

42

A continuación, se muestran los resultados obtenidos por método gravimétrico en las pruebas preliminares:

Tabla 5. Resultados SSV Muestra #1-20°C.

V o lu m e n F il tr a d o (m l) V o lu m e n F il tr a d o (l ) w i (g r ) w i (m g ) w f (g r ) w f (m g ) S o li d o s s u s p e n d id o s To ta le s (m g /l ) w 1 (g r ) w 1 (m g ) w 2 (g r ) w 2 (m g ) S o li d o s S u s p e n d id o s to ta le s (m g /l ) Dia 1 15 0,015 0,4185 418,50 0,4224 422,40 260,00 0,4275 427,50 0,4323 432,30 320,00 Dia 2 15 0,015 0,3096 309,60 0,3178 317,80 546,67 Dia 3 15 0,015 0,4435 443,50 0,4556 455,60 806,67 0,4291 429,10 0,4424 442,40 886,67 Dia 4 15 0,015 0,4305 430,50 0,4525 452,50 1466,67 0,3654 365,40 0,4028 402,80 2493,33 Dia 5 15 0,015 0,3611 361,10 0,4014 401,40 2686,67 0,3697 369,70 0,4129 412,90 2880,00 Dia 6 15 0,015 0,3697 369,70 0,4273 427,30 3840,00 0,3618 361,80 0,4180 418,00 3746,67 Dia 7 15 0,015 0,3736 373,60 0,4206 420,60 3133,33 0,7821 782,10 0,8129 812,90 2053,33 Dia 8 15 0,015 0,3666 366,60 0,3983 398,30 2113,33 Dia 9 15 0,015 0,3634 363,40 0,3795 379,50 1073,33 0,3646 364,60 0,3750 375,00 693,33 Muestra #1- 20 Ignición a.m p.m Ignición N/A N/A V o lu m e n fi ltr a d o (m l) V o lu m e n F il tr a d o (l ) w i (g r ) w i (m g ) w f (g r ) w f (m g ) S o li d o s s u s p e n d id o s To ta le s (m g /l ) w 1 (g r ) w 1 (m g ) w 2 (g r ) w 2 (m g ) S o li d o s S u s p e n d id o s to ta le s (m g /l ) Dia 1 15 0,015 0,4387 438,70 0,4447 444,70 400,00 0,4661 466,10 0,4738 473,80 513,33 Dia 2 15 0,015 0,4534 453,40 0,4658 465,80 826,67 Dia 3 15 0,015 0,3078 307,80 0,3216 321,60 920,00 0,4179 417,90 0,4319 431,90 933,33 Dia 4 15 0,015 0,7799 779,90 0,7947 794,70 986,67 0,7815 781,50 0,8040 804,00 1500,00 Dia 5 15 0,015 0,3597 359,70 0,3878 387,80 1873,33 0,3664 366,40 0,3958 395,80 1960,00 Dia 6 15 0,015 0,3645 364,50 0,3915 391,50 1800,00 0,3707 370,70 0,3965 396,50 1720,00 Dia 7 15 0,015 0,3627 362,70 0,3865 386,50 1586,67 0,7771 777,10 0,7995 799,50 1493,33 Dia 8 15 0,015 0,3662 366,20 0,3897 389,70 1566,67 Dia 9 15 0,015 0,3620 362,00 0,3832 383,20 1413,33 0,3592 359,20 0,3741 374,10 993,33 Muestra # 2- 20 Ignición Ignición N/A N/A a.m pm

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Fuente: Elaboración propia,2017.

La medida de Sólidos suspendidos volátiles, es el peso de los compuestos que son

volatilizados a 550°C durante 15 minutos contenidos en 15 mililitros de muestra, estos se asociaron a la cantidad de materia orgánica en suspensión o a los microorganismos presentes en las muestras; se expresa en mgSSV/L. La diferencia entre los Solidos Suspendidos Totales (SST) y los Solidos Suspendidos Volátiles (SSV) corresponde a los sólidos suspendidos fijos (SSF) y son una medida de la fracción inorgánica presente en la muestra expresados como

V o lu m e n fi ltr a d o (m l) V o lu m e n F il tr a d o (l ) w i (g r ) w i (m g ) w f (g r ) w f (m g ) S o li d o s s u s p e n d id o s To ta le s (m g /l ) w 1 (g r ) w 1 (m g ) w 2 (g r ) w 2 (m g ) S o li d o s S u s p e n d id o s to ta le s (m g /l ) Dia 1 15 0,015 0,4446 444,60 0,4494 449,40 320,00 0,4414 441,40 0,4509 450,90 633,33 Dia 2 15 0,015 0,7810 781,00 0,7906 790,60 640,00 Dia 3 15 0,015 0,4320 432,00 0,4423 442,30 686,67 0,3689 368,90 0,3799 379,90 733,33 Dia 4 15 0,015 0,3096 309,60 0,3217 321,70 806,67 0,4463 446,30 0,4587 458,70 826,67 Dia 5 15 0,015 0,3626 362,60 0,3780 378,00 1026,67 0,3645 364,50 0,3809 380,90 1093,33 Dia 6 15 0,015 0,3604 360,40 0,3798 379,80 1293,33 0,3658 365,80 0,3976 397,60 2120,00 Dia 7 15 0,015 0,3604 360,40 0,3764 376,40 1066,67 0,7845 784,50 0,7991 799,10 973,33 Dia 8 15 0,015 0,3662 366,20 0,3802 380,20 933,33 Dia 9 15 0,015 0,3622 362,20 0,3722 372,20 666,67 0,3635 363,50 0,3721 372,100 573,33 a.m Ignición p.m Muestra # 1- 40 Ignición N/A N/A V o lu m e n fi ltr a d o (m l) V o lu m e n F il tr a d o (l ) w i (g r ) w i (m g ) w f (g r ) w f (m g ) S o li d o s s u s p e n d id o s To ta le s (m g /l ) w 1 (g r ) w 1 (m g ) w 2 (g r ) w 2 (m g ) S o li d o s S u s p e n d id o s to ta le s (m g /l ) Dia 1 15 0,015 0,4454 445,40 0,4546 454,60 613,33 0,4461 446,10 0,4560 456,00 660,00 Dia 2 15 0,015 0,4354 435,40 0,4484 448,40 866,67 Dia 3 15 0,015 0,4441 444,10 0,4574 457,40 886,67 0,7787 778,70 0,7929 792,90 946,67 Dia 4 15 0,015 0,3072 307,20 0,3301 330,10 1526,67 0,7762 776,20 0,7998 799,80 1573,33 Dia 5 15 0,015 0,3727 372,70 0,3977 397,70 1666,67 0,3616 361,60 0,4087 408,70 3140,00 Dia 6 15 0,015 0,3672 367,20 0,4175 417,50 3353,33 0,3625 362,50 0,3906 390,60 1873,33 Dia 7 15 0,015 0,3625 362,50 0,3876 387,60 1673,33 0,7744 774,40 0,7947 794,70 1353,33 Dia 8 15 0,015 0,3598 359,80 0,3762 376,20 1093,33 Dia 9 15 0,015 0,3663 366,30 0,3805 380,50 946,67 0,3672 367,20 0,3790 379,00 786,67 a.m Ignición Ignición p.m Muestra # 2- 40 N/A N/A

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mgSSF/L (Contreras, 2001). En los resultados obtenidos para las cuatro muestras, la fracción de sólidos inorgánicos es mínima puesto que, al realizar el cálculo para determinar los

mismos, el wf del filtro es igual o menor al wi, por lo que se deduce que no hay aparición de compuestos metálicos, arenas, arcillas o gravas.

En las pruebas preliminares, cabe recordar que por disponibilidad de materiales y equipos en el Centro Tecnológico de Ambiente y Sostenibilidad de la Universidad de La Salle y con el fin de garantizar las condiciones semejantes de agitación y temperatura, se tuvo que utilizar Erlenmeyer y botellas de vidrio de 250 mililitros, por lo que se decidió trabajar con un volumen de 150 ml de agua lluvia en cada uno de los montajes y así filtrar un volumen de 15 ml para evitar la disminución de los microorganismos presentes en el sustrato. En la Gráfica

5 se observa el crecimiento del consorcio microbiano “EPYZYM-HC” entendida como la

biomasa presente en la mezcla.

Gráfica 5. Sólidos suspendidos volátiles VS. Tiempo.

En la Gráfica 5 se observa la fase de latencia de las cuatro muestras. Esta fase representa el periodo de evolución en el que los microorganismos cambian a una nueva condición, siendo

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 SS V (m g /L ) Tiempo (Dias)

SSV Vs Tiempo

SSV Muestra # 1- 20 (mg/L) SSV Muestra # 2 -20 (mg/L) SSV Muestra # 1- 40 (mg/L) SSV Muestra # 2- 40 (mg/L)

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esta similar para las muestras analizadas a temperaturas de 20 y 40ºC; cabe mencionar que en esta fase existe gran actividad metabólica y aumento en el tamaño individual de los

microorganismos y por ende su peso. Después de transcurrir 4 días los microorganismos aumentan exponencialmente; allí se adaptaron a las condiciones ambientales teniendo en cuenta variables como temperatura, agitación, oxígeno y disponibilidad de nutrientes. Sin embargo, se puede notar que en la muestra #2-20°C la fase exponencial no tuvo la actividad esperada con respecto a las demás. Se puede observar que luego de alcanzar la fase

estacionaria que es muy corta en las 4 muestras, comienza la disminución progresiva de la cantidad de microorganismos y esta ha entrado en su fase de muerte. Las fases de crecimiento en las cuatro muestras son demasiado rápidas y esto se debe a que el consorcio es

especializado en el consumo de hidrocarburo y desde el principio se hace un consumo de este.

Teniendo en cuenta las variables mencionadas, aquellas que afectan el crecimiento microbiano están relacionadas entre otras con la disponibilidad de nutrientes. Dichos nutrientes deben ser suficientes para garantizar que no se detenga la fase exponencial de los microorganismos; en otras palabras, que se adapten y sobrevivan al alimento disponible. Para el desarrollo del proyecto no se tuvo en cuenta el pH, puesto que como es un consorcio microbiano y en él se encuentra todo tipo de hongos y bacterias, no predominan

microorganismos acidófilos (pH inferior a 2) ni alcalófilos (pH mayor a 10). Ahora bien, la temperatura es una de las variables más importantes que afectan el crecimiento y la

supervivencia de los microorganismos. A pesar de que en la ficha técnica del consorcio microbiano “EPYZYM- HC” se describe que ellas trabajan entre temperaturas de 10°C a 40°C, se pudo evidenciar que a 40°C su comportamiento es mucho mejor puesto que, los aumentos de temperatura permiten alcanzar mayores velocidades de degradación y

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lograr el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos, puesto que éste es el medio de transporte de sus nutrientes o alimento.

Para la determinación de concentración de crudo en el agua se utilizó la siguiente ecuación:

𝑦 = 0,7724 𝑥 − 0,1497

𝑥 =𝑦 + 0,1497 0,7724 Dónde:

x: Concentración de Crudo en la muestra. (mg/L) y: Absorbancia leída en la muestra de agua.

Cálculo de la concentración de crudo en la muestra # 1- 20ºC, día 1 (AM)

𝑥 =0,504 + 0,1497

0,7724 = 0,846 𝑚𝑔/𝐿

Ahora bien, se muestran los resultados obtenidos por el método fotométrico en las pruebas preliminares: Muestra # 1-20ºC AM PM Absorbancia Concentración (mg/L) Absorbancia Concentración (mg/L) Día 1 0,504 0,846 0,450 0,776 Día 2 0,289 0,568 NR NR Día 3 1,094 1,610 1,009 1,500 Día 4 1,044 1,545 0,425 0,744 Día 5 0,287 0,565 0,352 0,650 Día 6 0,325 0,615 0,418 0,735 Día 7 0,464 0,795 0,540 0,893 Día 8 0,431 0,752 NR NR Día 9 0,411 0,726 0,369 0,672

Tabla 9. Resultados de absorbancias y concentración. Muestra #1-20°C.