Aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios de la especie medicinal Tournefortia hirsutissima.

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4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT

11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016

Memorias

Aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios de la especie

medicinal Tournefortia hirsutissima.

José Trinidad Escalera Abarca (Becario) Universidad Autónoma de Guerrero Unidad Académica de Ciencias Naturales

Programa de Verano Delfín escaleratea@gmail.com

Área en la que participa: II Biología y Química Dra. Laura Patricia Álvarez Berber (Asesor)

Profesor- Investigador de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos lalvarez@uaem.mx

Resumen

Ha habido un notable resurgimiento del interés en la investigación de productos naturales en la última década, debido a las propiedades curativas que presentan los metabolitos secundarios de éstas (John M. Walker,2006, “Aislamiento de productos naturales”Coleraine, Irlanda del Norte, Reino Unido.pag.28). El aislamiento de estos metabolitos es parte fundamental en su estudio, éste se lleva a cabo por distintas técnicas cromatográficas tanto analítica como preparativa. En el presente trabajo se utilizó como material vegetal hojas y tallos de Tournefortia hirsutissima del cual se extrajeron 5 fracciones primarias. Se trabajó con la fracción ETh3 para conseguir fracciones menos complejas por medio de CC y posteriormente se utilizó la misma técnica con las subfracciones con mayor cantidad en gramos de extracto y las más puras se mandaron a RMN para su caracterización. Se lograron identificar algunas estructuras contenidas en T. hirsutissima, donde la cromatografía analítica jugó un papel muy relevante debido al análisis que proporcionaba, fueron utilizados mezclas de disolventes como fase móvil en forma de gradiente, la cromatografía en capa fina preparativa (CPP) también fue utilizada al igual que la técnica espectroscópica de Resonancia Magnética Nuclear (RMN).

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Palabras Clave: Tournefortia hirsutissima, metabolitos secundarios, cromatografía, Resonancia Magnética Nuclear.

Introducción

Los productos naturales son pequeñas moléculas orgánicas, que también son frecuentemente llamados metabolitos secundarios y son producidos por diversos organismos vivos. Los metabolitos secundarias comprenden una variedad de diversos compuestos químicos a menudo específicos para una especie en particular, que no son estrictamente indispensables para la supervivencia. No obstante, existe un creciente interés en su estudio, ya que representan un formidable depósito potencialmente útil para los nuevos medicamentos.

Las plantas son matrices complejas, que producen una amplia gama de metabolitos secundarios con distintos grupos funcionales y polaridades (Walker,2006)

La especie Tournefortia hirsutissima pertenece a la familia Boraginaceae. Se le conoce por los nombres comunes de hierba rasposa y tlalchicinol. Es una planta arbustiva con hojas alternas con asperezas que se aprecian al tacto. Esta especie se utiliza con fines medicinales destacando los siguientes: para rozaduras de los bebes, cicatrizante, para la inflamación del riñón y diabetes.

Una muestra de la decocción de los tallos de T. hirsutissima disminuyó el pico hiperglucémico de conejos administrados con glucosa (Alarcon-Aguilara, Roman-Ramos, Perez-Gutierrez, Aguilar-Contreras, Contreras-Weber y Flores-Saenz, 1998). Los extractos de n-hexano y diclorometano de las hojas y tallos de esta especie resultó inhibir el edema en oreja de ratón inducido por TPA (resultados no publicados, obtenidos por el grupo de investigación dirigido por la Investigadora Laura Patricia Álvarez Berber).

Dentro del género Tournefortia se han aislado alcaloides, flavonas, triterpenoides y cinamatos (Yun-Lian, Yu-Ling Yueh-Hsiung, Yi-Hung y Ming-Shi 1999). Sin embargo, hasta la fecha no hay información sobre el aislamiento y la caracterización de la estructura química de los metabolitos secundarios de T. hirsutissima.

En la estancia de verano se trabajo con una fracción de extractos de tallo y hoja de T.

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cromatográficos y de RMN. Esta investigación permitirá en futuros ensayos identificar a los metabolitos secundarios con actividad antiinflamatoria.

Materiales y Métodos

1. Procedimientos generales

Para el fraccionamiento del extracto y fracciones se utilizó la cromatografía en columna (CC) con gel de sílice marca Merck Kieselgel (70 - 230 y 230 - 400 mesh) como la fase estacionaria. La cromatografía en capa fina (CCF) se utilizó para el análisis de extractos y fracciones y se emplearon placas de aluminio silical60 ALUGRAM® Sil G/UV254 marca Macherey - Nagel. Se utilizó el revelador sulfato cérico al 1% en ácido sulfúrico 2N para revelar las placas de CCF. Para la cromatografía en placa preparativa se utilizaron cromatoplacas preparativas de 20 x 20 cm RP-18 F254s, marca MERCK.

Para la eliminación del disolvente, se utilizó un rotaevaporador marca BUCHI modelo B100 (ver la ilustración de en medio de la figura 1).

Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) fueron obtenidos en un espectrómetro Varian Unity Inova de 400 MHz (ilustración de la izquierda de la figura 1) a 25 °C, con Sonda de detección directa para 1H y 13C. Los desplazamientos químicos son presentados como valores δ y se referenciaron a la resonancia de protón del disolvente (CDCl3 a 7.26 ppm).

Se utilizó el sistema acoplado Cromatografía de GasesEspectrometría de Masas (CG -EM), que consta de un cromatógrafo de gases marca Agilent modelo 6890 plus, acoplado a un detector de masas marca Agilent modelo 5973N, con ionización por Impacto electrónico. Se utilizó la columna capilar HP-5MS (5% fenil-metilpolixiloxano).

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Figura 1: Fotografías de algunos de los equipos y materiales utilizados

2. Obtención del Material vegetal

La especie medicinal Tournefortia hirsutissima fue recolectada por el M. C. Israel Hurtado en el municipio de Yautepec, Morelos el 1 de julio del 2015. La planta fue autentificada en el herbario HUMO de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos.

3. Obtención de los extractos

La planta se secó a temperatura ambiente bajo la sombra. Posteriormente, las hojas y tallos se pulverizaron por separado en un molino. Cada parte de la planta se sometió a un proceso de extracción mediante maceración a temperatura ambiente. Las maceraciones se llevaron a cabo con n-hexano y diclorometano en orden ascendente de la polaridad. Estas se realizaron durante 24 horas por triplicado. Finalmente las soluciones obtenidas se concentraron a presión reducida mediante un rotaevaporador a menos de 40 °C.

4. Separación y aislamiento

4.1 Fraccionamiento de los extractos de T. hirsutissima

A partir de 358 gr de tallo seco se obtuvieron 446 y 904 mg de extractos de n-hexano y diclorometano respectivamente. De la hoja (625 gr de material seco) se obtuvieron 8.32 y 7.72 gr de los extractos de n-hexano y diclorometano respectivamente. Los extractos anteriores se reunieron de acuerdo a un análisis por CCF. A esta muestra se le denomino extracto de T.

hirsutissima (ETh). La muestra ETh (15.7 gr) se fracciono en un embudo Büchner, utilizando 400

gr de gel de sílice (230 – 400 mesh) como la fase estacionaria y mezclas de n-hexano – Acetato de etilo como la fase móvil con incremento sucesivo de la polaridad hasta finalizar con 100% Acetato de etilo. Las fracciones colectadas se reunieron para obtener 5 fracciones diferentes (ETh1 – Eth5) de acuerdo con la CCF.

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Figura 2: Elusión de las fracciones por CCF.

4.2 Separación de la fracción ETh3

La fracción ETh3 (1.8 gr) se adsorbió en 2.36 g de gel de sílice (70 – 230 mesh) y se sometió a cromatografía en columna abierta. La columna se montó en el orden descrito; 30 g de gel de sílice (70 - 230 mesh), 0.5 g de carbón activado, 30 g de gel de sílice (70 - 230 mesh) y finalmente 0.5 g de carbón activado. El carbón activado se utilizó con el fin de eliminar los pigmentos. La elución de la fracción se llevó a cabo con mezclas n-hexano - acetona con aumento gradual de la polaridad hasta finalizar con 100% acetona.

Figura 3: Fracciones obtenidas a partir de ETh3

Se obtuvieron cien fracciones de 50mL, las cuales fueron agrupadas en catorce subfracciones diferentes (ver tabla 1) de acuerdo a las características obtenidas en CCF. Las fracciones obtenidas fueron concentradas a presión reducida mediante un rotaevaporador.

Tabla 1. Fraccionamiento de ETh3

Sistema de elución % Fracciones

obtenidas Fracciones reunidas Clave Peso en mg Hexano-acetona (99-1) 1-5 1-2 16-1 74 Hexano-acetona (98-2) 6-10 3 16-2 6 Hexano-acetona (97-3) 11-23 4-8 16-3 11

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4.3-Análisis de la

subfracción

16-5

La subfracción 16-5 (Ver tabla 1) resultó ser la más abundante de la separación de la fracción ETh3, por lo cual se decidió analizar por el sistema acoplado CG – EM.

4.4- Análisis de la fracción 16-8

De las 15 subfracciones obtenidas de la fracción ETh3, la fracción 16-8 presento el mayor grado de pureza y se analizó mediante Resonancia Magnética Nuclear.

5.-Separación de las fracciones 16-5 y 16-6

Las fracciones 16-5 y 16-6 debido a su parecido se reunieron y fueron absorbidas en 1.28 gde sílice ya que juntas pesaron 775 mg, se introdujeron en la columna. La elución en columna se inició en n-hexano y mezclas n-hexano: acetona en ciclos variados de fracciones de 15 mL aumentando la polaridad de acuerdo a las características observadas en CCF.

La columna se montó con 30 g de sílice (63-200 mesh).Al reunir las fracciones se obtuvieron un total de 150 que se reunieron hasta un total de 12 de las cuales la 20-2 fue separada ya que presentó el mayor grado de pureza (véase tabla 2).

Tabla 2. Separación cromatográfica de las fracciones 16-5 y 16-6

Hexano-acetona (96-4) 24-28 9-14 16-4 18 Hexano-acetona (95-5) 29-32 15-16 16-5 524 Hexano-acetona (94-6) 33-38 17 16-6 251 Hexano-acetona (93-7) 39-44 18-20 16-7 273 Hexano-acetona (92-8) 45-50 21-24 16-8 91 Hexano-acetona (91-9) 51-56 25-28 16-9 67 Hexano-acetona (88-12) 57-61 29-32 16-10 56 Hexano-acetona (87-13) 62-66 33-34 16-11 18 Hexano-acetona (86-14) 67-71 35-39 16-12 85 Hexano-acetona (85-15) 72-76 40-71 16-13 139 Hexano-acetona (80-20) 77-86 72-86 16-14 74 Acetona (100) 87-100 87-100 16-15 25 Peso total 1.71g

Sistema de elución % Fracciones

obtenidas

Fracciones reunidas

Clave Peso en gramos

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6.-

Separación de

la fracción

20-2

La fracción 20-2 pesaba 700 mg y fue absorbida en 1.4 gde sílice. La columna fue eluida en n-hexano y mezclas n-hexano: AcOEt en ciclos variados de fracciones de 15 mL en forma de gradiente. Se agregó 40g de sílice (fase normal de 230-400 mesh). Las fracciones obtenidas fueron monitoreadas por CCF. Se obtuvieron un total de 250 fracciones dando un total de 15 fracciones reunidas (véase tabla 3). La fracción 23-12 presentó el mayor grado de pureza.

Tabla 3. Separación de 20-2 Hexano-acetona (99-1) 11-17 27-35 20-2 658 Hexano-acetona (98-2) 18-23 36-37 20-3 26 Hexano-acetona (97-3) 24-42 38-48 20-4 30 Hexano-acetona (96-4) 43-49 49-62 20-5 9 Hexano-acetona (95-5) 50-55 63-77 20-6 13 Hexano-acetona (94-6) 56-62 78-91 20-7 8 Hexano-acetona (93-7) 63-68 92-104 20-8 7 Hexano-acetona (92-8) 69-75 105-134 20-9 6 Hexano-acetona (91-9) 76-82 135-136 20-10 7 Hexano-acetona (90-10) 83-88 137-149 20-11 5 Hexano-acetona (89-11) 89-95 150 20-12 6

Hexano-acetona (88-12) 96-101 Peso total 770

Hexano-acetona (87-13) 102-107 Hexano-acetona (86-14) 108-114 Hexano-acetona (85-15) 115-120 Hexano-acetona (84-16) 121-126 Hexano-acetona (83-17) 127-133 AcOEt (100) 134-150

Sistema de elución % Fracciones

obtenidas Fracciones reunidas Clave Peso en mg Hexano (100) 1-74 1-4 23-1 3 Hexano-AcOEt (99-1) 75-129 5-9 23-2 0 Hexano- AcOEt (98-2) 130-241 10-21 23-3 9 AcOEt (100) 242-250 22-40 23-4 51 41-86 23-5 9 87-88 23-6 6 89-95 23-7 300

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7.-

Separación y

caracterización de la fracción 23-12

La fracción 23-12 se sometió a CCF para saber si se podía separar analíticamente, lo cual resultó positivo con el sistema 99-1 benceno-AcOEt, posteriormente se utilizó el método de cromatografía en placa preparativa para intentar separarlos.

En la cromatografía por placa preparativa se utilizaron cromatoplacas preparativas de 20 x 20 cm como fase estacionaria y como fase móvil mezcla de disolventes orgánicos (95-5 n-hexano:AcOEt y 50 ml de Benceno). La cromatoplaca fue eluida una vez en ese sistema y tres veces con 95-5 n-hexano: AcOEt.

Figura 4: Elusión de la subfracción 23-12 por cromatografía en capa fina preparativa

La placa fue revelada en la orilla con sulfato cérico al 1% en ácido sulfúrico 2N.Fué observada y marcada en lámpara UV. La franja de sílice que contiene el producto puro fue

96-99 23-8 86 100-141 23-9 47 142-163 23-10 16 164-195 23-11 37 196-216 23-12 32 217-223 23-13 2 224-230 23-14 0 231-250 23-15 47 Peso total 685

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removida de la cromatoplaca y colocada en matraces erlenmeyer. Se realizaron 4 lavados con diclorometano con un periodo de 15 minutos de agitación entre ellos. Los extractos obtenidos fueron concentrados en un rotavapor a presión reducida. Se plaquearon las concentraciones obtenidas.

Resultados

Análisis de la subfracción 16-5

La subfracción 16-5 (Ver tabla 1) resultó ser la más abundante de la separación de la fracción ETh3 al obtener 524 mg, por lo cual se decidió analizar por el sistema acoplado CG – EM. El cromatograma (ver figura 5) presentó 3 componentes principales con tiempos de retención 19.12, 25.68 y 31.49 min. La comparación de los espectros de masas de estos componentes con los de la biblioteca sugiere la presencia de hexadecanoato de metilo y oxido de escualeno para los picos con tiempo de retención de 19.12 y 31.49 minutos. El pico con tiempo de retención de 25.68 minutos resulto ser el di(2-etilhexil) ftalato.

Figura 5: Cromatograma de gases de la fracción 16-5

Análisis de la subfracción 16-8

La subfracción 16-8 se analizó por CCF con un sistema 90% hexano – 10% AcOEt y se reveló con sulfato cérico al 1% en ácido sulfúrico 2N. Se observó una sola mancha (figura 6) la cual no absorbió en UV.

10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 1800000 Time--> Abundance TIC: 16LA53.D 18.31 19.12 20.76 20.83 21.03 25.68 31.49 34.59 39.37 45.97

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Figura 5: Espectro de RMN-1H de la subfracción 16-5

En concordancia con estos resultados se decidió analizar la subfracción 16-8 por RMN-1H (Figura 5). El espectro muestra señales de metilos a campo alto (1.60 y 1.68 ppm); metilenos entre 2.15-1.94 ppm; señal base oxigeno alrededor de 4.1 ppm; protones vinílicos entre 5.2 y 5.05 ppm. Las señales anteriores sugieren la presencia de un compuesto tipo terpeno. Se propone que la estructura química del componente contenido en la fracción 16-8 es el óxido de escualeno.

Discusión y conclusiones

La subfracción 16-5 presentó por CG-EM 3 componentes principales, el componente con tiempo de retención de 25.68 min resulto ser el di-(2-etilhexil) ftalato, un componente utilizado en la manufactura de contenedores plásticos. Es muy probable que dicho componente provenga de la garrafa donde se almacena el n-hexano en el laboratorio. Los otros dos componentes corresponden al hexadecanoato de metilo y al oxido de escualeno (fig. 7). El óxido de escualeno, es un precursor que da lugar a numerosos esqueletos de triterpenos tetra y pentaciclicos como son el hopeno, diplopterol, tetrahymanol, lanosterol, cicloartenol y β-amirina.

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Figura 7. Oxido de escualeno

Por lo tanto se espera que algunas de las fracciones o subfracciones del extracto ETh pueda contener algún tipo de estos compuestos.

El análisis por RMN-1H de la fracción 16-8, sugirió la presencia de un compuesto tipo triterpeno; se propuso que dicho triterpeno corresponde al oxido de escualeno por una comparación por CCF de las fracciones 16-5 (que contiene al oxido de escualeno) y 16-8 (figura 6). El análisis por RMN de la fracción 16-8 sugiere un compuesto tipo triterpeno como el óxido de escualeno.

Figura 6: Comparación entre las subfracciones 16-5 y 16-8 por CCF

Agradecimientos

En esta estancia, obtuve nuevos conocimientos, los cuales me serán de gran utilidad para mi formación académica, por lo que agradezco:

En primer lugar al programa Delfín, por permitirme participar como joven investigador en el XXI Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico 2016.

Al CONACYT por permitirme participar en el cuarto encuentro de jóvenes investigadores.

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También a la Universidad Autónoma de Guerrero por apoyarme con los trámites correspondientes para obtener este logro. Así mismo a la investigadora, Dra. Laura Patricia Álvarez Berber, por aceptar ser la coordinadora del proyecto que desempeñe durante la estancia.

Al igual que al M. C. Israel Hurtado Díaz por ser el autor y aceptar ser asesor de este proyecto “Aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios de la especie medicinal

Tournefortia hirsutissima” que se llevó a cabo en el Centro de Investigaciones Químicas (CIQ),

de la UAEM. A la M. C. Silvia Marquina Bahena quien fungió como asesora y mostro interés para obtener un trabajo adecuado. Así mismo a las compañeras Q. I. Isis Aidan Yatziri Ventura Salazar y M. C. Maritza Leonor Maldonado que me explicaron los procesos necesarios durante este proyecto.

Por ultimo agradezco a mis padres por el apoyo incondicional que me brindaron durante toda la estancia.

Referencias

Adolfo Andrade-Cetto , Cristina Revilla-Monsalve y Helmut Wiedenfeld, 2007

Alarcon-Aguilara, Roman-Ramos, Perez-Gutierrez, Aguilar-Contreras, Contreras-Weber y Flores-Saenz, 1998

Cheryl A Lans, 2006

John M. Walker,2006, “Aislamiento de productos naturales”Coleraine, Irlanda del Norte, Reino Unido.pag.28

Jose P. Llongueras, Saraswathy Nair ,Dayana, Salas-Leiva • Andrea y E. Schwarzbach 2012 Marc Gottschling, Nadja Diane, Hartmut H. Hilger y Maximilian Weigend, 2004

Nadja Diane, Harald Forther, y Hartmut H. Hilger, 1999

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