EFEITO ENTOMOTÓXICO DA JACK BEAN UREASE (JBU) E DO JABURETOX (JBTX) EM BARATAS

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(1)EFEITO ENTOMOTÓXICO DA JACK BEAN UREASE (JBU) E DO JABURETOX (JBTX) EM BARATAS.. Ana Paula Zanatta 1 Milena Jankowska 2 Anne Helene Martinelli 3 Célia Reina Carlini 4 Maria Stankiewicz 5 Chariston André Dal Belo 6. Resumo: A produção mundial de alimentos precisa atender a uma enorme demanda: enquanto a população aumenta exponencialmente a porcentagem terrestre agricultável permanece inalterada. O uso extensivo de defensivos agrícolas químicos torna-se imprescindível. Entretanto, essa prática degrada o meio ambiente e gera riscos a saúde, e por isso, a busca por novas moléculas com potencial entomotóxico torna-se uma necessidade. As ureases revelam-se uma alternativa de grande potencial biotecnológico como inseticidas naturais. A Canavalia ensiformis possui diversas isoformas ureolíticas, destacando-se a Jack Bean Urease (JBU), onde a ação entamotóxica via oral é condicionada à sua clivagem por enzimas digestivas, dando origem a peptídeos tóxicos chamados jaburetox( JBTX). Ensaios com diferentes insetos-praga, como as baratas, revelam-se alternativa ao esclarecimento dos efeitos entomotóxicos, uma vez que seu sistema nervoso primitivo é caracterizado e apresenta grande similaridade ao de outros insetos. O presente trabalho teve como objetivo esclarecer o mecanismo de entomotoxicidade da JBU(6µg/g animal) e JBTX (32µg/g animal ou 0,3µM-300µL), sobre o sistema nervoso de baratas da espécie Nauphoeta cinerea e Periplaneta americana. O comportamento de grooming foi avaliado de acordo com Sturmer et al. (2014). O comportamento exploratório foi avaliado em ensaios de locomoção, realizados como descrito por Adedara et. al. (2014). O protocolo para a preparação nervo-músculo coxal-abdutor metatorácico foi utilizado conforme descrito por Carrazoni, et al. (2016). Os ensaios eletrofisiológicos de voltage clamp e current clamp em preparação double oil gap foram realizados como descrito por Stankiewicz et al. (2012). As diferenças foram consideradas significantes quando p Palavras-chave: Jack Ben Urease; Jaburetox; Baratas; Inseticidas Naturais. Modalidade de Participação: Pesquisador. EFEITO ENTOMOTÓXICO DA JACK BEAN UREASE (JBU) E DO JABURETOX (JBTX) EM BARATAS. 1 Aluno de pós-graduação. anapaulabiotech@gmail.com. Autor principal 2 Aluno de pós-graduação. jankowska.mil@gmail.com. Co-autor 3 Outro. ahsmartinelli@yahoo.com.br. Co-autor 4 Docente. celia.carlini@pucrs.br. Co-autor 5 Docente. stankiew@umk.pl. Co-orientador 6 Aluno de graduação. charistondb@gmail.com. Co-orientador. Anais do 9º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampa | Santana do Livramento, 21 a 23 de novembro de 2017.

(2) EFEITO ENTOMOTÓXICO DA UREASE DE Canavalia ensiformis (JBU) E DO PEPTÍDEO TÓXICO JABURETOX (JBTX) EM BATARAS DA ESPÉCIE Nauphoeta cinerea E Periplaneta americana. 1. INTRODUÇÃO A produção mundial de alimentos enfrenta atualmente um enorme desafio, tão alarmante quanto sua própria dimensão: a cada 12 anos, mais um bilhão de pessoas são adicionadas ao planeta, ao passo que a porcentagem terrestre agricultável permanece inalterada (UN report, 2016). Dessa forma, o uso extensivo de defensivos agrícolas químicos torna-se imprescindível, para que a produção de alimentos atenda à demanda. Entretanto, o uso de agroquímicos é extremamente antrópica e gera riscos a saúde humana e ao meio ambiente (Devine e Furlong, 2007, WHO report, 2016). Nesse sentido, existe a necessidade premente pela obtenção de novas moléculas com potencial inseticida de origem natural, menos tóxicas aos animais e com menor impacto ao meio ambiente (Carrazoni et al, 2016). As ureases, são metaloenzimas responsáveis pela clivagem da ureia em amônia, revelando-se uma alternativa de grande potencial biotecnológico, como inseticidas naturais, por demonstrarem ação entomotóxica independente de sua ação enzimática. (Dixon et al.,1975, Carrazoni, et al, 2016) . A Canavalia ensiformis (feijão-de-porco) possui diversas isoformas ureolíticas em abundância, destacandose a Jack Bean Urease (JBU), de 270 KDa. Em insetos como o barbeiro (Rhodinus prolixus) a ação entamotóxica via oral do JBU é condicionada à sua clivagem por enzimas digestivas, dando origem a peptídeos tóxicos de aproximadamente 10KDa, chamados de Jaburetox (JBTX). Esses peptídeos circulam pela hemolinfa e levam o animal à letalidade (Carlini e Polacco, 2008). No entanto, os mecanismos de entomotoxicidade do JBU e JBTX ainda não foram totalmente esclarecidos, carecendo de uma investigação mais aprofundada (Carlini & Polacco, 2008). Ensaios com diferentes insetos-praga, como as baratas, revelam-se alternativas ao esclarecimento do mecanismo de ação de novos agentes inseticidas. A ordem Blattodea compreende espécies amplamente distribuídas pelo planeta e são consideradas resistentes à ação de inseticidas. (Carrazoni, et al 2016). A utilização de baratas como modelo experimental torna-se atraente para a neurotoxicologia: pois, além de seu sistema nervoso primitivo já ter sido caracterizado, apresenta homologia a de outros insetos (Stankiewicz et al., 2012) sendo de fácil reprodução e manutenção (Huber et al., 1990). O presente trabalho teve como objetivo esclarecer o mecanismo de entomotoxicidade da JBU e JBTX, sobre o sistema nervoso de baratas da espécie Nauphoeta cinerea e Periplaneta americana. 2. METODOLOGIA Foram utilizadas baratas adultas de ambos os sexos. Nos experimentos comportamentais os tratamentos foram administrados por uma seringa de Hamilton em volumes de 10µL, na terceira porção abdominal. O comportamento de grooming foi avaliado de acordo com Sturmer et al. (2014). O comportamento exploratório foi avaliado em ensaios de locomoção, realizados como descrito por Adedara et. al. (2014). Todos os ensaios de comportamento foram monitorados por uma câmera de vídeo e os registros..

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(4) Figura 01. Modulação do comportamento de grooming pelos peptídeos JBU (6µg/g animal) e JBTX (32µg/g animal) em comparação com o neurotransmissor Octopamina ( 15µg/ g animal) em baratas da espécie Nauphoeta cinerea. No gráfico, cada barra representa a média ± E.P.M. de no mínimo 30 ensaios. Os resultados foram considerados significativos quando p<0.05. Quanto aos ensaios de locomoção (Figura 2), no grupo controle (n=40), os valores de distância percorrida e porcentagem de tempo imóvel (que permaneceu em um mesmo ponto por mais de 3 segundos) foram respectivamente 207±20 cm 77± 2%. Nos ensaios com a JBU, houve uma diminuição na distância percorrida (74±20 cm), enquanto houve aumento no tempo em que o animal permaneceu imóvel (89± 2%). Tais dados corroboram com o teste prévio, sugerindo que no intervalo em que permaneceu parado, foi quando o animal apresentou grooming. Já nos ensaios com JBTX, houve acréscimo da distância percorrida (316±25 cm), sem alterações no tempo imóvel (75± 3%). JBTX induziu a hiperatividade (Davay, 1962). B. A 400. **. D is t â n c ia p e r c o r r id a ( c m ). T e m p o Im ó v e l (% ). 100 80 60 40 20 0 C o n tr o le. J B U 6 µ g /g. J B T X 3 2 µ g /g. a n im a l. a n im a l. *** 300. 200. **. 100. 0 C o n tr o le. J B U 6 µ g /g. J B T X 3 2 µ g /g. a n im a l. a n im a l. Figura 2. Modulação dos Peptídeos JBU (6µg/g animal) e JBTX (32µg/g animal) sobre a locomoção em baratas da espécie Nauphoeta cinérea. Em A, a distância percorrida pelo animal, em centímetros e em B, a porcentagem tempo que o animal permaneceu imóvel. No gráfico, cada barra representa a média ± E.P.M. de no mínimo 40 ensaios. Os resultados foram considerados significativos quando p<0.05 Quanto aos ensaios em preparação neuro-músculo coxal abdutor metatoáxico tanto a administração de JBU quando a de JBTX induziu bloqueio neuromuscular tempodependente durante os 120min de registro (70±7% e 62±2%, respectivamente) (Figura 3). É possível que parte do efeito entomotóxico induzido per esses compostos seja devido sua interação direta sistema nervoso desses animais. Carrazoni et al. (2016) demonstraram ação anticolinesterasica do JBU em N. cinerea, ao passo que ensaios do mesmo gênero já estejam em andamento com o JBTX. Em insetos, interneurônios colinérgicos, presentes no cordão nervoso ventral, fazem sinapse com neurônios glutamatérgicos e gabaérgicos, responsáveis pela resposta contrátil no sistema nervoso periférico. Dessa forma, esses compostos, ao inibir a enzima acetilcolinesterase, impedem que tais neurônios colinérgicos interajam com os gabaérgicos/ glutamatérgicos, portanto, havendo bloqueio neuromuscular (Carrazoni et al, 2016)..

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(6) Figura 4. Efeito do JBTX sobre (A) a corrente e (B) a voltagem em preparação double. oil gap de Periplaneta americana. No gráfico, cada ponto corresponde a média±erropadrão da porcentagem da amplitude (n=5). * P<0.05 ** P<0.01 *** P< 0.001. 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS Os dados obtidos nesse trabalho revelaram que o tamanho da molécula dos compostos pode estar influenciando, principalmente as resposta em nível de sistema nervoso central. Os ensaios eletromiográficos demonstram que a atividade entomotóxica da urease de Canavalia ensiformis está associada um bloqueio da junção neuromuscular dos insetos. Os ensaios eletrofisiológicos revelam que o mecanismo de bloqueio neuromuscular pode estar parcialmente associado a uma atividade direta da urease sobre o sensor de voltagem do canal de sódio, adiantando o tempo para a sua inativação e consequentemente diminuindo a amplitude dos potenciais de ação. Esses dados contribuem para a elucidação dos mecanismos entomotóxicos da urease de Canavalia ensiforimis e do peptídeo tóxico Jaburetox e reforçam seus potenciais biotecnológicos como inseticidas naturais. 5. REFERÊNCIAS ADEDARA, I.A., B. ROSEMBERG,D.B., SOUZA. D.O., KAMDEM, J.P. FAROMBI, E.O., ASCHNER, M. e Joao B. T. ROCHA, J.B.T., Biochemical and behavioral deficits in the lobster cockroach Nauphoeta cinerea model of methylmercury exposure. 2014 Toxicol. Res., 2015, 4, 442 CARLINI C.R. & POLACCO,J.C. Toxic Properties of Urease. CROP SCIENCE. 2008 48: 1665-1672. CARRAZONI, T. , HEBERLE, M.D.A, PERIN, A.P.A, ZANATTA, A.P., RODRIGUES, P.V., SANTOS, F.M.D., ALMEIDA, C.G.M.D, BREDA, R.V., SANTOS, D.S.D, PINTO, P.M., COSTA, J.C.D, CARLINI, C.R.M BELO, C.A.D. Central and peripheral neurotoxicity induced by Jack Bean Urease(JBU) in Nauphota cinerea cockroaches. Toxicology. 2016. 368-369(2016)-162-171. DEVINE G. J. e FURLONG, M.J. Insecticide use: Contexts and ecological consequences. Agriculture and Human Values .2007. 24:281±306 DIXON, N.E., GAZZOLA, T.C., BLAKELEY, R.L., ZERMER, B. Jack Bean Urease (EC 3.5.1.5). 1975. A metalloenzyme.A simple biological role for nickel?J Am Chem Soc;97: 4131-4133. HUBER, I., MASLER, E., RAO, B. Cockroaches As Models for Neurobiology: Applications in Biomedical Research. 1990. CRC Press. 280. STANKIEWICZ, M., DABROWSKI, M., LIMA, M. Nervous System of Periplaneta Americana Cockroach as a Model in Toxinological Studies: A Short Historical and Actual View. Journal of Toxicology.2012: 1-11. 2012. STURMER, G.D., CARRAZONI, T.F., HEBERLE, M.A., ASSIS, D.R., VINADÉ,L., BATISTA, A.P., FRANCO, J.L., DAL BELO, C.A. Modulation of dopaminergic neurotransmission induced by sublethal Doses of the organophosphate trichlorfon in cockroaches.Ecotoxicology and Environmental Safety. 109: 56-62. 2014. UNITED NATIONS(UN) report. 2016. Disponível em: goo.gl/w1qkAF. Útimo acesso em 23/09/2017, ás 9:49 WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO) Report. 2016. Disponível em: https://goo.gl/xuB3BY. Ultimo acesso em: 17/09/2017, ás 15:23.

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