EXPOSIÇÃO À PERMETRINA NO ESTÁGIO LARVAL INDUZ DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL EM LARVAS DE DANIO RERIO

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(1)EXPOSIÇÃO À PERMETRINA NO ESTÁGIO LARVAL INDUZ DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL EM LARVAS DE DANIO RERIO. Lucia Emanueli Schimith 1 Mauro Eugênio Medina Nunes 2 Luana Paganotto Leandro 3 Renata Siqueira de Mello 4 Andressa Rubim Lopes 5 Illana Kemmerich Martins 6 Jeferson Luis Franco 7 Thaís Posser 8. Resumo: Inseticidas sintéticos da família dos piretróides, como a permetrina (PM), possuem grande aceitação para uso doméstico devido à sua baixa toxicidade em espécies não alvo. Porém, estudos têm demonstrado o aparecimento de efeitos adversos de piretróides sobre organismos em desenvolvimento, alertando para o potencial embriotóxico destes compostos. A função mitocondrial está envolvida em inúmeros processos fisiopatológicos e distúrbios que podem levar ao estresse oxidativo. Neste sentido, compostos com atividade inseticida são capazes de induzir disfunção mitocondrial, ocasionando a diminuição dos níveis de ATP e aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (ERO), desencadeando uma série de efeitos deletérios. Atualmente, peixe-zebra (Danio rerio), destaca-se como modelo animal alternativo em estudos toxicológicos de diversos compostos. O presente estudo teve como objetivo determinar as concentrações subletais de PM em um período de exposição de 24 horas, além de avaliar os efeitos da exposição aguda de concentrações subletais de PM sobre a bioenergética mitocondrial e formação de ERO em larvas de peixe-zebra.Larvas de D. rerio com 6 dias pós-fertilização (dpf) foram expostas por imersão a faixa de concentração 25-600 µg/L de PM, durante 24h, para a determinação DL50. Subsequente ao período de exposição, determinou-se a atividade das enzimas desidrogenase láctica (LDH) e citrato sintase (CS), os parâmetros de bioenergética mitocondrial e formação de ERO.Análises de bioenergética mitocondrial foram determinadas através de Respirometria de Alta Resolução (RAR). A DL50 para PM em larvas de peixe-zebra foi determinada como 108 µg/L. Foi possível observar em nossos resultados uma redução significativa em OXPHOS, tanto pelo fluxo de elétrons provenientes de CIOXPHOS quanto pela via convergente CIc+CIIOXPHOS, o que poderia indicar um déficit na produção de ATP. Da mesma forma, observamos uma redução significativa das vias convergentes CI+CIIETS e CIIETS, quando a respiração foi desacoplada usando FCCP. A relação ROX/ETS foi significativamente aumentada em ambas as concentrações de PM quando comparadas ao grupo controle.ambas as concentrações de PM causaram uma diminuição significativa na capacidade bioenergética mitocondrial. Em paralelo, a eficiência do acoplamento OXPHOS foi significativamente reduzida no tratamento com a concentração mais alta de PM. Observou-se um aumento significativo na produção de ERO no grupo exposto à concentração de 50 µg/L.A atividade enzimática LDH demonstrou-se aumentada em relação ao CTL. Observou-se ainda uma tendência à diminuição da atividade enzimática da CS no grupo tratado com 50 µg/L de PM.O comprometimento da respiração mitocondrial e a consecutiva depleção na síntese de ATP, em paralelo ao aumento nos níveis de ERO ocasionados pela exposição à PM, podem estar relacionados com os efeitos adversos sobre o desenvolvimento do peixe-zebra, além do.

(2) composto ser mais nocivo a organismos em desenvolvimento. Demonstramos pela primeira vez um desvio da principal via de oxidação final da glicose, comprometimento na fosforilação oxidativa e formação de ERO em larvas de peixe-zebra expostas ao inseticida piretróide PM. Nossos resultados corroboram na direção de efeitos precoces da PM sobre metabolismo energético de organismos em desenvolvimento, mesmo em doses subletais, desse modo servindo de estudo base para futuras investigações.. Palavras-chave: Piretróides; Embriotoxicidade; Mitocôndria; Peixe-zebra.. Modalidade de Participação: Iniciação Científica. EXPOSIÇÃO À PERMETRINA NO ESTÁGIO LARVAL INDUZ DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL EM LARVAS DE DANIO RERIO 1 Aluno de graduação. lucia.emanueli@gmail.com. Autor principal 2 Aluno de pós-graduação. mauroemnunes@gmail.com. Co-autor 3 Aluno de graduação. luanap.leandro@gmail.com. Co-autor 4 Aluno de graduação. renatasmello96@gmail.com. Co-autor 5 Aluno de pós-graduação. andressarubimlopes@gmail.com. Co-autor 6 Aluno de pós-graduação. illanakemmerich@gmail.com. Co-autor 7 Docente. jefersonfranco@gmail.com. Orientador.

(3) EXPOSIÇÃO À PERMETRINA NO ESTÁGIO LARVAL INDUZ DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL EM LARVAS DE Danio rerio 1. INTRODUÇÃO Inseticidas sintéticos da família dos piretróides, como a permetrina (PM), possuem grande aceitação para uso doméstico devido à sua baixa toxicidade em espécies não alvo. Entretanto, estudos têm demonstrado o aparecimento de efeitos adversos de piretróides sobre organismos em desenvolvimento (DeMicco et al., 2010), alertando para o potencial embriotóxico destes compostos. Indivíduos neste estágio de vida são mais susceptíveis a alterações no equilíbrio redox, resultado de suas altas taxas de proliferação, diferenciação e apoptose celular, fatores estes altamente dependentes desse equilíbrio (Dennery, 2007). As mitocôndrias são organelas de suma importância metabólica nas quais o sistema de transporte de elétrons (ETS) gera uma força próton-motriz que conduz a síntese de grandes quantidades de adenosina trifosfato (ATP) durante a fosforilação oxidativa (OXPHOS). A função mitocondrial está envolvida em inúmeros processos fisiopatológicos e distúrbios neste sistema podem levar ao estresse oxidativo (Guo et al., 2013). Neste sentido, compostos com atividade inseticida são capazes de induzir disfunção mitocondrial, ocasionando a diminuição dos níveis de ATP e aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (ERO), desencadeando uma série de efeitos deletérios (Carvalho et al., 2017). Recentemente, Danio rerio, também conhecido como peixe-zebra, tem se destacado como modelo animal alternativo em estudos de avaliação toxicológica de diversos compostos. Além de possuir atributos práticos ² como fácil manejo, baixo custo, pequeno porte e alto rendimento para triagens em larga escala ², o peixezebra, por ser um vertebrado, proporciona maior complexidade nas interações moleculares, bioquímicas, desenvolvimento embrionário e comportamental em relação aos mamíferos (Garcia et al., 2016). O presente estudo teve como objetivo determinar as concentrações subletais de PM em um período de exposição de 24 horas, além de avaliar os efeitos da exposição aguda de concentrações subletais de PM sobre a bioenergética mitocondrial e formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) em larvas de peixezebra. 2. METODOLOGIA Larvas de D. rerio com 6 dias pós-fertilização (dpf) foram expostas por imersão a faixa de concentração 25-600 µg/L de PM, durante 24h, para a determinação da Dose Letal 50% (DL50). Todos os animais, incluindo o grupo controle (CTL), foram expostos igualmente ao veículo (etanol 0,1%). Demais grupos do tratamento foram nomeados conforme a concentração de exposição à PM. Subsequente ao período de exposição, um compilado de 25 a 50 larvas por grupo experimental foi utilizado para a determinação da atividade das enzimas desidrogenase láctica (LDH) e citrato sintase (CS), dos parâmetros de bioenergética mitocondrial e formação de ERO. A atividade enzimática da LDH foi determinada pelo decaimento da absorbância (340nm) através da oxidação da nicotinamida adenina dinucleotídeo da sua forma reduzida (NADH) para sua forma oxidada (NAD+) durante a conversão de piruvato à lactato, reação catalisada pela enzima.

(4) LDH. A CS teve sua atividade enzimática determinada por espectrofotômetro (412nm), por meio do complexo formado pela conjugação de acetilcoenzima A com oxalacetato (Srere, 1968). A formação de ERO foi avaliada por espectrofluorímetro, usando ¶ ¶-diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA), conforme descrito por Ali e colaboradores (1992). Análises de bioenergética mitocondrial foram determinadas através de Respirometria de Alta Resolução (RAR), onde utilizou-se um Oxígrafo (Oxygraph 2k). Todos os experimentos foram realizados a 28°C usando o software DatLab 4.0. Por meio de titulação, analisamos as habilidades de uma série de substratos e inibidores em influenciar a função mitocondrial, sendo essa influência refletida nas diferenças de estados respiratórios. Utilizamos glutamato, piruvato, malato e succinato como substratos oxidáveis em todos os experimentos. Após a estabilização do sinal, ou seja, a respiração basal suportada por substratos endógenos, a respiração mediada pelo Complexo I (CI ² CILEAK) foi determinada usando piruvato, glutamato e malato. A fosforilação oxidativa (OXPHOS) mediada pelo CI (CIOXPHOS) foi avaliada usando adenosina difosfato (ADP). A respiração de ETS representa o desacoplamento da respiração usando carboxicianeto - 4 (trifluorometoxi)-fenilhidrazona (FCCP); A respiração ETS mediada por CII (CIIETS) foi determinado com o uso de rotenona. A adição de Antimicina A foi usada na inibição do complexo III (CIII), resultando na respiração não mitocondrial, onde avaliou-se o consumo residual de oxigênio (ROX) com pequenos vazamentos de elétrons no estado desacoplado. Os dados resultantes foram submetidos ao teste estatístico de variância OneWay ANOVA e pós-teste de Tukey, considerando significativos os resultados quando p” TXH IRUDP H[SUHVVRV HP PpGLD “ 6 ( 0 3. RESULTADOS e DISCUSSÃO A DL50 para PM em larvas de peixe-zebra foi determinada como 108 µg/L. Após a determinação da DL50, optou-se pelas concentrações de 25 e 50 µg/L para dar sequência as demais análises, uma vez que ambas não induziram mortalidade estatisticamente significativa (Fig. 1).. Figura 1. Taxa de sobrevivência (%) de larvas de peixe-zebra após a exposição aguda (24h) a diferentes concentrações de Permetrina (25-600). Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significantes (p<0.05).. A função mitocondrial possui alta relevância para a sobrevivência de organismos aeróbicos, sendo que a atividade bioenergética mitocondrial pode, consequentemente, ser alvo de inúmeros compostos que induzem toxicidade celular (Smith et al., 2012). A literatura especializada menciona danos ocasionados aos canais de sódio voltagem-dependentes com principal mecanismo de ação inseticida de piretróides (DeMicco et al., 2010). Estudos prévios demonstraram os efeitos adversos em peixe-zebra, nas suas diferentes fases de desenvolvimento, frente à.

(5) exposição à piretróides. Neste estudo, investigamos se a função mitocondrial pode ser alvo destes compostos. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que demonstra a capacidade de induzir a disfunção mitocondrial, em larvas de peixezebra expostas ao inseticida Permetrina. Para investigar os efeitos da PM ao nível mitocondrial, verificamos a função bioenergética mitocondrial através da Respirometria de Alta Resolução (Fig. 2). De acordo com os resultados, foi possível observar uma redução significativa em OXPHOS, tanto pelo fluxo de elétrons provenientes de CIOXPHOS quanto pela via convergente CIc+CIIOXPHOS, o que poderia indicar um déficit na produção de ATP. Da mesma forma, observamos uma redução significativa das vias convergentes CI+CIIETS e CIIETS, quando a respiração foi desacoplada usando FCCP. Para analisar a amplitude do consumo residual de oxigênio em relação à capacidade máxima de consumo de oxigênio, determinamos a relação ROX/ETS após a exposição à PM. A relação ROX/ETS foi significativamente aumentada em ambas as concentrações de PM quando comparadas ao grupo controle (Fig. 2B). A capacidade bioenergética mitocondrial foi quantificada pela subtração da respiração induzida por ADP (CIOXPHOS) dos valores basais (CILEAK) (Fig. 2C). Neste caso, ambas as concentrações de PM causaram uma diminuição significativa na capacidade bioenergética mitocondrial. Em paralelo, a eficiência do acoplamento OXPHOS foi significativamente reduzida no tratamento com a concentração mais alta de PM (Fig. 2D). Observou-se um aumento significativo na produção de ERO no grupo exposto à concentração de 50 µg/L (Fig. 3A). Este aumento na produção de ERO relaciona a exposição a PM com um possível dano oxidativo, abrindo a possibilidade do estresse oxidativo ter desencadeado a disfunção mitocondrial e redução da capacidade de geração de energia celular, caracterizando um importante mecanismo de toxicidade do inseticida estudado. Neste contexto, estudos com Deltametrina, inseticida da família dos piretróides, demonstraram a participação da disfunção mitocondrial e apoptose como importantes fatores de toxicidade em modelos de cultura celular (Juyeon et al., 2016). A relação entre estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial em larvas de peixe-zebra pode ser apresentada pela razão ROX/ETS, uma vez que esta representa a amplitude entre o consumo residual de oxigênio e a capacidade máxima de consumo de oxigênio Carvalho et al., 2017). A razão ROX/ETS foi aumentada após a exposição em ambas as concentrações de PM utilizadas, indicando uma redução do estado de acoplamento das mitocôndrias, além de demonstrar possíveis vazamentos de elétrons, o que pode indicar um aumento na produção de ERO. Corroborando estes dados, tem sido demonstrado que dano oxidativo altera a fluidez da membrana mitocondrial, comprometendo assim o estado redox celular (Raza et al., 2008). Em conjunto aos demais resultados, a redução da capacidade bioenergética e a eficiência do acoplamento de OXPHOS demonstram ineficiências bioenergéticas que comprometem a capacidade de refosforilação de ADP pela mitocôndria. A redução da OXPHOS, tanto em CIOXPHOS como CIc+CIIOXPHOS, pode estar relacionada ao fato de que alguns inseticidas exercem efeitos inibitórios significativos sobre a atividade da ATPase (Hosamani, 2013). Do mesmo modo, os efeitos da PM observados no ETS na presença do desacoplador (FCCP), tanto em CIc + CIIETS e CIIETS, relacionam-se com mudanças no fluxo de elétrons que acabam por induzir a formação de ERO..

(6) Figura 2. Efeitos da Permetrina na fosforilação oxidativa em larvas de peixe-zebra após exposição aguda (A) Fluxo de oxigênio; (B) Taxa de Respiração Controle (RCR) pelo complexo I; (C) Consumo de oxigênio residual relativo a ROX/ETS; (D) Análise da capacidade bioenergética e (E) Análise do acoplamento da fosforilação oxidativa. Dados foram expressos em média ± S.E.M (*p<0.05; ***p<0.001; ****p<0.0001 comparando grupo CTL e grupos tratados; # p < 0,05 diferença entre os grupos tratados).. A atividade da enzima LDH demonstrou-se aumentada em relação ao grupo controle (Fig. 3B). Observou-se ainda uma tendência à diminuição da atividade enzimática da CS no grupo tratado com 50 µg/L de PM (Fig. 3C). Esses resultados sugerem que danos ocasionados pela exposição de larvas de peixe-zebra à PM podem estar relacionados com a disfunção mitocondrial e o metabolismo energético.. Figura 3. Efeitos da exposição de Permetrina em larvas de peixe-zebra sobre (A) níveis de ERO, (B) atividade enzimática lactato desidrogenase e (C) atividade enzimática citrato sintase. Dados foram expressos em média ± S.E.M (*p<0.05; ***p<0.001; ****p<0.0001 comparando grupo CTL e grupos tratados; # p < 0,05 diferença entre os grupos tratados).. No metabolismo da glicose, o produto final pode ser lactato ou, após a oxidação total da glicose através da respiração mitocondrial, o CO 2. O observado aumento na atividade LDH e diminuição na atividade CS, concomitantemente com a forte inibição em OXPHOS pode indicar um desvio nas rotas de síntese de ATP celular, indicando mecanismos compensatórios em relação ao metabolismo energético (Liberti & Locasale, 2016). O comprometimento da respiração mitocondrial e a consecutiva depleção na síntese de ATP, em paralelo ao aumento nos níveis de ERO ocasionados pela exposição à PM, podem estar relacionados com os efeitos adversos sobre o desenvolvimento do peixe-zebra observados por DeMicco et al. (2010), além da.

(7) maior sensibilidade apresentada por organismos em desenvolvimento a esse composto. 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS Demonstramos pela primeira vez um desvio da principal via de oxidação final da glicose, comprometimento na fosforilação oxidativa e formação de ERO em larvas de peixe-zebra expostas ao inseticida piretróide PM. Nossos resultados apontam em direção aos efeitos precoces da PM sobre metabolismo energético de organismos em desenvolvimento, mesmo em doses subletais, desse modo servindo de estudo base para futuras investigações. 5. REFERÊNCIAS ALI, S.F.; LEBEL, C.P; BONDY, S.C. Reactive Oxygen Species Formation as a Biomarker of Methylmercury and Trimethyltin neurotoxicity. Neurotoxicology, v. 13, p. 637±48, 1992. CARVALHO, N.R.; RODRIGUES, N.R.; MACEDO, G.E.; BOLIGON, A.A.; DE CAMPOS, M.M.; POSSER, T.; CUNHA, F.; COUTINHO, H.D.M; KLAMT, F.; BRISTOT, I.J.; MERRITT, T.; FRANCO, J.L. Eugenia uniflora Leaves Essential Oil Promotes Mitochondrial Dysfunction in Drosophila melanogaster Through the Inhibition of Oxidative Phosphorylation. Toxicology Research, v. 4, 2017. DEMICCO, A.; COOPER, K.R.; RICHARDSON, J.R.; WHITE, L.A. Developmental Neurotoxicity of Pyrethroid Insecticides in Zebrafish Embryos. Toxicological Sciences, n.113, p. 177±186, 2010. GUO, C.; SUN, L.; CHEN, X.; ZHANG, D. Oxidative Stress, Mitochondrial Damage and Neurodegenerative Diseases. Neural Regeneration Research, v. 8, n. 21, p. 2003-2014, 2013. GARCIA, G.R.; NOYES, P.D.; TANGUAY, R.L. Advancements in Zebrafish Applications for 21st Century Toxicology. Pharmacol Ther, v. 161, p. 11-21, 2016. HOSAMANI, R.; MURALIDHARA. Acute Exposure of Drosophila melanogaster to Paraquat Causes Oxidative Stress and Mitochondrial Dysfunction. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, v.83, n.1, p. 25-40, 2013. SMITH, R.A.; HARTLEY, R.C.; COCHEMÉ, H.M.; MURPHY, M.P. Mitochondrial Pharmacology. Trends in Pharmacological Sciences, v. 33, n. 6, p. 341-52, 2012. SCHAPIRA, A.H.; COOPER, J.M.; DEXTER, D.; CLARK, J.B.; JENNER, P.; 0$56'(1 & ' 0LWRFKRQGULDO &RPSOH[ , 'HILFLHQF\ LQ 3DUNLQVRQ¶V 'LVease. Journal of Neurochemistry, v. 54, n. 2, p. 823-7, 1990. RAZA, H.; JOHN, A.; BROWN, E.M.; BENEDICT, S.; KAMBAL, A. Alterations in Mitochondrial Respiratory Functions, Redox Metabolism and Apoptosis by Oxidant 4hydroxynonenal and Antioxidants Curcumin and Melatonin in PC12 Cells. Toxicology Applied Pharmacology, v. 226, n. 2, p. 161-8, 2008. LIBERTI, M.V.; LOCASALE, J.W. The Warburg Effect: How Does it Benefit Cancer Cells?. Trends in Pharmacological Sciences, v. 41, n. 3, p. 211-8, 2016. JUYEON, K.; PARK, J.H.; PARK, Y.S.; CHUL KOH, H. PPAR-y Activation Attenuates Deltamethrin-Induced Apoptosis By Regulating Cytosolic PINK1 and Inhibiting Mitochondrial Dysfunction. Toxicology Letters, v. 260, p. 8-17, 2016. SRERE, P.A. Citrate Synthase. Methods Enzymol, v. 13, p. 3-11, 1969. DENNERY, P.A. Effects of Oxidative Stress on Embryonic Development. Birth Defects Res C Embryo Today, v. 81, n. 3, p. 155-62, 2007..

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