Composición fenólica y actividad antioxidante in vitro de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata (Urb & Ekman) Borhidi

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(1)Composición fenólica y actividad antioxidante in vitro de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata (Urb. & Ekman) Borhidi Autora: Isela Maria Bofil Morrell Tutoras: Dra. C. María Elisa Jorge Rodríguez Lic. Taimi de la Caridad Boffill Morrell. Santa Clara, Junio,2018.

(2) Este documento es Propiedad Patrimonial de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, y se encuentra depositado en los fondos de la Biblioteca Universitaria “Chiqui Gómez Lubian” subordinada a la Dirección de Información Científico Técnica de la mencionada casa de altos estudios. Se autoriza su utilización bajo la licencia siguiente: Atribución- No Comercial- Compartir Igual. Para cualquier información contacte con: Dirección de Información Científico Técnica. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Carretera a Camajuaní. Km 5½. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP. 54 830 Teléfonos.: +53 01 42281503-1419.

(3)

(4) Exergo.

(5) "Emprenda todo lo que pueda hacer o haya soñado hacer. El arrojo lleva consigo genio, fuerza y magia." Goethe.

(6) Dedicatoria.

(7) DEDICATORIA. A mi mamá, mi hermana y papá Rolando guías en mis experiencias, responsables y partícipes del cumplimiento de cada uno de mis sueños. A Yobani por estar siempre presente y cuidar de mí. A mi tutora Elisa por su paciencia y ser un ejemplo a seguir. A mis 11 compañeros de aula por compartir conmigo cada aventura y el apoyo durante estos cinco años..

(8) Agradecimientos.

(9) AGRADECIMIENTOS A todos mis profesores en especial a Elisa por su paciencia, por transmitirme sus conocimientos y por sus consejos. A mi mamá y a Rolando porque cada sacrificio ha dado frutos, por entregarme todo su amor y por no poner límites en mi desarrollo personal y profesional. A mi hermana mis logros hoy son tuyos, gracias por tus acertados consejos. A Yobani por haberme apoyado en las buenas y en las malas, por permitirme contar contigo en todo momento. A mis amigas por los días de desvelo, por ser luz, refugio, paciencia, consejos, esperanza, por compartir experiencias juntas y convertir estos cinco años en uno de los mejores momentos de mi vida..

(10) Resumen.

(11) RESUMEN. RESUMEN La planta estudiada en el presente trabajo, Mosiera crenulata, es endémica de la provincia de Sancti Spiritus y se encuentra en peligro de extinción, razones que han motivado a que el grupo de botánicos del Centro de Casilda de Sancti Spiritus y el Departamento de Farmacia de la UCLV hayan incluido esta especie entre sus prioridades de investigación. Con el objetivo de evaluar las potencialidades de sus posibles usos en la medicina tradicional cubana se desarrolló el presente trabajo. Se obtuvieron tres extractos secos utilizando como solventes acetona 100%, acetona 70:30 y metanol 70:30, a través de la maceración con agitación y posterior extracción líquido-líquido y rotoevaporación. Se determinó el contenido fenólico y de flavonoides para cada extracto, a través del ensayo Folin- Ciocalteu y de Cloruro de aluminio respectivamente, evidenciándose valores similares para los tres extractos. Estos resultados se encuentran en total correspondencia con los obtenidos al evaluar la actividad antioxidante (AA) en los extractos, la cual fue evaluada por cinco ensayos in vitro (tres determinaron la actividad antirradicálica y dos la quelación de metales). Los tres extractos mostraron una actividad antioxidante considerable en los dos mecanismos, aunque con ligeras diferencias; el extracto acetona 100% mostró una AA antirradicálica ligeramente superior, mientras que el extracto de metanol 70:30 mostró la mejor capacidad para quelar los metales; estas diferencias hacen suponer que los extractos tienen variación en la composición química en cuanto a los tipos de compuestos fenólicos presentes en los mismos, considerando que el contenido total de estos metabolitos es similar. Los resultados obtenidos sugieren continuar los estudios de la planta por sus posibles potencialidades para su uso como fuente de antioxidante natural.. Isela María Bofil Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B..

(12) Abstract.

(13) ABSTRACT. ABSTRACT The plant studied in the present work, Mosiera crenulata, is endemic to the province of Sancti Spiritus and it is in danger of extinction, reasons that have motivated that the group of botanists of the Casilda Center of Sancti Spiritus and the Department of Pharmacy of the UCLV have included this species among their research priorities. With the objective of evaluating the potentialities of its possible uses in Cuban traditional medicine, the present work was developed. Three dry extracts were obtained using as solvent 100% acetone, 70:30 acetone, and 70:30 methanol, through maceration with agitation and subsequent liquid-liquid extraction and rotoevaporation. The phenolic and flavonoid content was determined for each extract, through the Foling-Ciocalteu and Aluminum Chloride tests respectively, evidencing similar values for the three extracts. These results are in total correspondence with the values obtained when the antioxidant activity (AA) in the extracts was carried out, which was evaluated by five in vitro tests (three determined the antiradical activity and two the chelation of metals). As a result of these test, the three extracts showed considerable antioxidant. activity in both mechanisms, although with slight. differences; The 100% acetone extract showed a slightly higher antiradical AA, while the 70:30 methanol extract showed the best ability to chelate the metals; these differences suggest that the extracts have variation in the chemical composition in terms of the types of phenolic compounds present in the extracts, considering that the total content of these metabolites is similar. The results obtained suggest that the plant under study has potential for its use as a source of natural antioxidant.. Isela María Bofil Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B..

(14) Índice.

(15) INDICE. ÍNDICE INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1 CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 4 1.1. Las plantas medicinales como recurso terapéutico. .............................................. 4 1.2. Estudios publicados de la planta incluida en el trabajo Mosiera crenulata B. ...... 6 1.3. Los compuestos fenólicos en las plantas ............................................................... 7 1.3.1. Características estructurales.......................................................................................... 8 1.3.2. Actividad biológica de los compuestos fenólicos ....................................................... 10 1.3.3. Extracción y cuantificación de compuestos fenólicos en matrices vegetales. ......... 12 1.4. Actividad antioxidante. Métodos in vitro para su evaluación ............................... 16 1.4.1. Métodos in vitro para la evaluación de la actividad antioxidante .............................. 20 1.5. Consideraciones finales de la revisión bibliográfica: ........................................... 23 CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 24 2.1. Extractos, equipos y reactivos. .............................................................................. 24 2.2. Extractos, equipos y reactivos ............................................................................... 24 2.3. Metodología de obtención de secos extractos secos a partir de las hojas de Mosiera crenulata B........................................................................................................ 25 2.4. Determinación espectrofotométrica de los compuestos fenólicos en los extractos evaluados ....................................................................................................... 26 2.4.1. Determinación del contenido total de compuestos fenólicos .................................... 26 2.4.2. Determinación del contenido total de flavonoides en los extractos obtenidos ........ 27 2.5. Evaluación in vitro de la actividad antioxidante .................................................... 28 2.5.1. Actividad secuestradora del radical libre DPPH●. ...................................................... 28 2.5.2. Capacidad antioxidante total (TAOC).......................................................................... 29 2.5.3. Ensayo con el radical ABTS•+ ...................................................................................... 30 2.5.4. Determinación de la Actividad Quelante ..................................................................... 32 2.5.5. Determinación del poder reductor/antioxidante férrico (FRAP). ............................... 33 CAPÍTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 34 3.1. Obtención y rendimiento de los extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. ..................................................................................................................... 34. 3.2. Resultados obtenidos en la determinación de la composición fenólica de los extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata. ............................ 34 3.2.2. Determinación del contenido fenólico total. ................................................................ 34 3.2.3. Cuantificación del contenido de flavonoides en los extractos. .................................. 36 3.3. Resultados obtenidos en la determinación de la actividad antioxidante de la planta, aplicando ensayos in vitro. ............................................................................... 38 3.3.1. Actividad secuestradora del radical libre DPPH●. ...................................................... 39 3.3.2. Capacidad antioxidante total. ....................................................................................... 40 3.3.3. Ensayo del radical ABTS•+ ........................................................................................... 42 3.3.2. Determinación de la Actividad quelante de Fe 2+ ........................................................ 44 3.3.3. Fuerza antioxidante reducida del ión férrico (FRAP). ................................................ 45 CONCLUSIONES .................................................................................................................. 49 RECOMENDACIONES .......................................................................................................... 49 BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 50. Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B..

(16) Introducción.

(17) INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN Las plantas medicinales, vegetales y productos alimenticios son considerados fuentes ricas de compuestos naturales que pueden jugar un rol importante en la salud humana previendo y curando enfermedades. En las plantas medicinales estos compuestos son considerados como metabolitos bioactivos naturales que pueden ser empleados para el desarrollo de nuevos fármacos o como fitonutrientes con importantes beneficios para la salud, a pesar de que, resulta relativamente difícil determinar la cantidad en la que se encuentra cada uno de ellos en la planta, debido a la baja concentración y la variabilidad(1, 2). .. A pesar de los adelantos científicos en cuanto al conocimiento de las enfermedades y su tratamiento, aún existen muchas dudas con respecto a su origen(3). En los últimos años se ha incrementado el predominio de las enfermedades crónicas y enfermedades no transmisibles, entre las cuales, las más frecuentes son las enfermedades cardiovasculares y diversos tipos de cáncer, consideradas como las dos primeras causas de muerte, siendo uno de los principales factores de riesgo asociado con su desarrollo, la acción de las sustancias oxidantes(4, 5). El oxígeno, elemento indispensable para la vida, se encuentra generalmente en su forma más estable (O2) pero algunas veces puede ocurrir que, por medio de reacciones bioquímicas de tipo redox, por fagocitosis en una reacción inflamatoria bajo control, por exposición a radiaciones ionizantes, rayos ultravioletas, contaminación del medio ambiente, humo de cigarrillos o drogas, entre otras, se pueden generar radicales libres (RL), denominados también, especies reactivas de oxígeno, siendo uno de sus principales blancos la molécula de ADN(6). Estos ataques dañan a la célula produciendo pérdida de la homeostasis celular. Los mecanismos del daño producido por las especies reactivas de oxígeno se encuentran estrechamente vinculados con la etiopatogenia de enfermedades de elevada morbilidad y mortalidad como el cáncer(7).Todo ello ha generado un incrementado del interés por el estudio de los procesos relacionados con las especies reactivas de oxígeno, los que están íntimamente vinculados con el estrés oxidativo y la función que cumplen los antioxidantes(4, 7) . Los antioxidantes son sustancias que inhiben o retardan el proceso oxidativo, cuya actividad podría deberse a sus componentes polifenólicos (8). Los polifenoles constituyen Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 1.

(18) INTRODUCCIÓN uno de los principales compuestos con actividad antioxidante presentes en las plantas y alimentos, entre esos los flavonoides. se encuentran ampliamente distribuidos y son. sustancias que manifiestan una potente actividad antioxidante (9,. 10). , atribuyéndosele un. efecto protector contra el cáncer y sobre enfermedades coronarias, arterioesclerosis, diabetes, artritis reumática, Parkinson y Alzheimer, entre otros. Igualmente retardan el proceso de envejecimiento celular (3, 11, 12). Así pues, el uso de antioxidantes naturales ha sido promovido debido a los efectos positivos que tienen sobre la salud, pero también debido a la creciente preocupación de que algunos antioxidantes sintéticos pueden tener efectos secundarios no deseables sobre la salud(13, 14). Por esta razón, la comunidad científica en el mundo tiene, entre sus principales acciones, la búsqueda de antioxidantes naturales derivados fundamentalmente de plantas autóctonas de la flora de cada país, lo que abre nuevos caminos para futuras investigaciones sobre los posibles beneficios que estas especies estarían aportando a la salud humana. Todo lo anterior motivó el desarrollo de la siguiente investigación que va dirigida a evaluar la especie Mosiera crenulata B., planta endémica de la región central que se encuentra en real peligro de extinción y de la cual existe muy poca información en la literatura. Para la selección de la planta se tuvo en consideración el interés mostrado por el grupo de botánicos del centro de Casilda de Sancti Spiritus, quienes proponen extender su cultivo por su endemismo y requieren justificar su uso en la medicina tradicional cubana, lo que complementaría las razones para su estudio. Por tanto, para la presente tesis se formuló como problema científico la siguiente pregunta ¿Cuál es el contenido fenólico y la capacidad antioxidante frente a sistemas generadores de radicales libres de las hojas de Mosiera crenulata B? Atendiendo a ello, con el objetivo de buscar nuevas fuentes de antioxidantes naturales y resolver el problema planteado, este trabajo científico parte de la siguiente hipótesis: Si se realizan estudios que permita conocer la composición fenólica y la actividad antioxidante, en extractos obtenidos de la Mosiera crenulata B, se dispondrá de una información importante para valorar su posible uso en el campo farmacéutico y alimentario. Para fundamentar dicha hipótesis se trazaron los siguientes objetivos. Objetivo general: Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 2.

(19) INTRODUCCIÓN Determinar la composición fenólica y la actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Objetivos específicos: 1. Obtener extractos a partir de las hojas de Mosiera crenulata B, aplicando la técnica de maceración con agitación. 2. Determinar el contenido fenólico y de flavonoides en los extractos obtenidos a partir de las hojas de Mosiera crenulata B., empleando técnicas espectrofotométricas. 3. Evaluar la actividad antioxidante de los extractos, aplicando diferentes ensayos in vitro.. Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 3.

(20) CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS. Capítulo 1 Revisión Bibliográfica. Isela María Bofil Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 3.

(21) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1. Las plantas medicinales como recurso terapéutico. Las plantas medicinales son un importante patrimonio de la humanidad, que además de renovable y no contaminante, es asequible incluso a la población de los países más pobres(15). Los productos naturales empleados con el objetivo de mejorar los males que aquejaban al hombre le han acompañado en el transcurso de los siglos. Ya desde la Edad Antigua las plantas y algunos de sus derivados eran empleados en China, Babilonia y Egipto. El primer texto escrito en relación con la medicina sobre la base de plantas se reporta en la arcilla, en la cual se agrupaban una serie de tabletas grabadas con caracteres cuneiformes sobre las plantas y los autores de estas notas, redactadas 3 000 años a.n.e. Desde los sabios del Alto Egipto hasta los druidas místicos de los bosques galos, desde los médicos chinos de hace 5 000 años hasta los grandes científicos del siglo XVIII, no se ha dejado nunca la búsqueda hacia el conocimiento de las plantas y sus virtudes terapéuticas(16). Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), los medicamentos herbarios abarcan las hierbas, material herbario, preparaciones herbarias y productos herbarios acabados, que contienen como principios activos partes de plantas u otros materiales vegetales, o combinaciones de esos elementos, y su uso está bien establecido y ampliamente reconocido como inocuo y eficaz(17,. 18). . Como definición las plantas medicinales son las. que contienen, en alguno de sus órganos, principios activos, los cuales, administrados en dosis suficientes, producen efectos curativos en las enfermedades de los hombres y de los animales en general (2). Estos principios son vitaminas, minerales, carbohidratos, microelementos y agentes curativos específicos que, se usan mucho para aliviar la enfermedad e impedir que ésta vuelva, desintoxicar el organismo y apoyan al sistema inmunológico ayudándole a mantener el equilibrio(19). A partir de los 70, los avances en el campo de la Química y la Farmacia permiten aislar e identificar con relativa sencillez y rapidez los componentes de las plantas responsables de acciones terapéuticas concretas (principios activos), de tal manera que éstos pueden dosificarse y estudiarse farmacológicamente. Con ello se incrementa el empleo de las plantas medicinales, potenciado por el creciente desarrollo de medicamentos no convencionales que se sirven también de las plantas medicinales(20). Además, desde 1976 Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 4.

(22) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA la OMS ha estado promoviendo la utilización apropiada de los sistemas tradicionales de medicina como parte de los programas de Atención Primaria de Salud (APS), que comprende el empleo de plantas medicinales y de la acupuntura se creó el programa de Medicina Tradicional (MT) de la OMS(17,. 21). , justificado por varios factores como son la. eficacia en el tratamiento y prevención de primera línea para enfermedades agudas por constituir en muchos países, y en ciertos casos al interior de éstos, la única forma de atención asequible, accesible, y disponible(22). Se estima que de las 260 000 especies de plantas que se conocen en la actualidad el 10% se pueden considerar medicinales, es decir, se encuentran recogidas dentro de tratados médicos de fitoterapia, modernos y de épocas pasadas, por presentar algún uso (4). En el mundo se utilizan 10 000 especies vegetales la mayor parte en sistemas de medicina tradicional. Sin embargo, solo se usan un volumen significativo de un número relativamente bajo de ellas(1). No se dispone de los datos necesarios para precisar el valor o la difusión de la utilización de las plantas o de principios activos derivados de ellas en los sistemas de salud de los distintos países. Sin embargo, la OMS estima que quizás el 80% de los más de 4 000 millones de habitantes de la Tierra confían en medicinas tradicionales para sus principales necesidades de salud, y se puede afirmar que gran parte de las terapias tradicionales entrañan el uso de extractos de plantas o de sus principios activos(18). A pesar de los siglos de tradición, la fitoterapia –del griego phyton (planta), tratamiento de las enfermedades por plantas frescas, secas o sus extractos ha evolucionado ha ganado prestigio y eficacia, sobre todo en los últimos tiempos, acercándose cada vez más a las normas y usos que exige la medicina moderna. Como resultado de ello, actualmente se posee un mejor conocimiento de las propiedades de las plantas medicinales, se ha incrementado su empleo, se han desentrañado científicamente secretos de sus principios activos y se han descrito con más precisión sus propiedades, contraindicaciones y efectos secundarios, lo que ha redundado en una más correcta sistematización de su uso y posología(23). En Cuba la medicina tradicional que llega a nuestros días, no tiene como fuente fundamental la aborigen, porque su población fue exterminada; nos llega la desarrollada a partir del siglo XV por españoles y más tarde por africanos, chinos y yucatecas. Nuestro Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 5.

(23) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA país a partir de 1991 organiza un programa de medicina tradicional herbolaria con el objetivo de: evaluar científicamente la efectividad e inocuidad de las plantas medicinales de uso popular e incorporar al Sistema de Salud sus posibilidades terapéuticas(24). En la actualidad, los progresos de la ciencia son tales, que desconocidos horizontes se abren a la fitoterapia y otras técnicas de la medicina tradicional, nuevos métodos científicos por descubrir en las plantas, propiedades actuales de los principios activos y formas originales de utilización en la práctica médica. Los remedios se han convertido en auténticos medicamentos y el empirismo ancestral dará lugar a la ciencia del siglo XXI (25). Existen numerosos estudios que han demostrado que muchas plantas producen sustancias antioxidantes, constituyendo éstas, por lo tanto, una fuente importante de antioxidantes naturales(26-28). Esto ha hecho que sea cada vez mayor el interés en la búsqueda de antioxidantes de origen natural, que en su mayoría se debe a la presencia de compuestos fenólicos, los cuales son poderosos secuestradores de especies reactivas de oxígeno, además de tener la capacidad de inhibir enzimas generadoras de radicales libres, por cuyo motivo, la búsqueda de poderosos componentes antioxidantes en las plantas medicinales constituye un objetivo de alta prioridad (18).. 1.2. Estudios publicados de la planta incluida en el trabajo Mosiera crenulata B.  Breve descripción de la especie. Esta planta pertenece al género mosiera, el cual posee unas 40 especies de plantas con flores que pertenecen a la familia Myrtaceae. Aspectos taxonómicos(29) Nombre científico: Mosiera crenulata (Urb. & Ekman) Borhidi Nombre vernáculo: Sinonimia: Psidium crenulatum Urb. & Ekman; Myrtus crenulata (Urb. & Ekman) Bisse Familia: Myrtaceae Orden: Myrtales Clase: Magnoliopsida División: Magnoliophyta Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 6.

(24) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Descripción: arbusto con ramitas glandulosas; hojas aovadas de 4-5 cm, de obtusas a redondeadas en el ápice, truncadas o algo acorazonadas en la base, margen crenulado, pelositas en el envés en los nervios, reticuladas, puntos glandulosos translúcidos; pedúnculos axilares de 4-15 mm, 1-2-floros (figura 1.2). Figura 1.2. Foto de la Mosiera crenulada en su lugar de recolección Distribución: endemismo estricto de la zona de arenas cuarcíticas de Casilda (aproximadamente 70 km2), municipio Trinidad, provincia Sancti Spíritus, Cuba. Categoría de amenaza de extinción: En Peligro Crítico (EN)(30). La planta Mosiera crenulata es endémica de la región central de Cuba y después de haber realizado una exhaustiva búsqueda en bases de datos especializadas no se encontraron reportes de la misma en relación a su composición química y posibles usos en el campo farmacéutico.. 1.3. Los compuestos fenólicos en las plantas Las plantas constituyen una fuente importante de diversidad natural por la multitud de compuestos que sintetizan y en la mayoría de los casos son útiles en el control de enfermedades en la agricultura, la medicina humana y en la preservación de alimentos. Varios de estos químicos son metabolitos secundarios que tienen funciones importantes en la interacción entre las plantas y el medio ambiente que las rodea, pueden ser atrayentes de insectos polinizadores y actuar. en la defensa al ataque. por. microorganismos, otras plantas o animales(16, 31, 32). Las plantas destinan una cantidad significativa del carbono asimilado y de la energía a la síntesis de una amplia variedad de moléculas orgánicas que no parecen tener una función directa en procesos fotosintéticos, respiratorios, asimilación de nutrientes, transporte de solutos o síntesis de proteínas, carbohidratos o lípidos, y que se denominan metabolitos secundarios(33). Estos se agrupan en cuatro clases principales: terpenos: entre los que se Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 7.

(25) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA encuentran hormonas, pigmentos o aceites esenciales;. compuestos fenólicos:. cumarinas, flavonoides, lignina y taninos; glicósidos: saponinas, glicósidos cardiacos, glicósidos cianogénicos y glucosinolatos; alcaloides(31). Generalmente todos los vegetales, como producto de su metabolismo secundario normal, son capaces de biosintetizar un elevado número de compuestos fenólicos, algunos de los cuales son indispensables para sus funciones fisiológicas y otros son de utilidad para defenderse ante situaciones de estrés (hídrico, luminoso, etc.)(34). La naturaleza de los compuestos fenólicos en plantas es compleja. Los fenoles se asocian con procesos de maduración de plantas y tejidos, mecanismos de defensa, y características importantes de productos alimenticios derivados de plantas. Los fenoles naturales se destacan en la actualidad por ser atractivos en el campo de la nutrición, la salud y la medicina, debido a las evidencias de que pueden actuar como potentes antioxidantes, anticancerígenos, antifúngicos o moduladores de rutas importantes in vivo en mamíferos(32, 35). Existen dos rutas básicas implicadas en la biosíntesis de compuestos fenólicos: la ruta del ácido siquímico y la del ácido malónico. La ruta del ácido malónico es una fuente importante de fenoles en hongos y bacterias, pero es poco empleada en plantas superiores. La ruta del ácido siquímico es responsable de la biosíntesis de la mayoría de los compuestos fenólicos de plantas. A partir de eritrosa-4-P y de ácido fosfoenolpirúvico se inicia una secuencia de reacciones que conduce a la síntesis de ácido siquímico y, derivados de éste, aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina). La mayoría de los compuestos fenólicos derivan de la fenilalanina. La fenilalanina y el triptófano se encuentran entre los aminoácidos esenciales para los animales que se incorporan en la dieta. La tirosina no es esencial en el sentido de que los animales pueden sintetizarla por hidroxilación de fenilalanina(36). Por su importancia en el presente trabajo a continuación se profundiza en aspectos relacionados con la estructura, la acción y la determinación analítica de estos compuestos. 1.3.1. Características estructurales Los fenoles son compuestos aromáticos que se caracterizan por tener uno o varios grupos hidroxilo unidos directamente al anillo aromático (Figura 1.2). Por lo general, se nombran como derivados del miembro más sencillo de la familia, el fenol (37). Los compuestos Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 8.

(26) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA fenólicos se subdividen a su vez en fenoles simples y ácidos fenólicos, flavonoides, taninos, cumarinas y derivados quinónicos. Entre estos grupos los fenoles simples son compuestos que tienen dos o tres grupos hidroxilo en el anillo aromático, los ácidos fenólicos tienen un grupo carboxílico (grupo ácido) y grupos hidroxilo (uno o más) en un anillo aromático, los flavonoides son los polifenoles que poseen al menos 2 subunidades fenólicas y los compuestos que tienen 3 o más subunidades fenólicas se denominan taninos(38). Estos subgrupos resultaron los de mayor interés en el presente trabajo, razón por la que se describen algunos aspectos estructurales de los mismos a continuación (39).. Figura 1.2: Estructura básica del fenol  Fenoles simples: son compuestos que tienen dos (en las posiciones 1,2; 1,3 o 1,4) o tres (en las posiciones 1, 2, 3 o 1, 2, 3) grupos hidroxilo en el anillo aromático (38).  Fenoles ácidos: consisten en dos grupos: los ácidos hidroxibenzoicos y los ácidos hidroxicinámicos. Es importante recalcar que la presencia de más de un grupo hidroxilo y una mayor separación del grupo carbonilo al anillo aromático aumentan la capacidad antioxidante de estos compuestos. Los ácidos hidroxibenzoicos son compuestos que presentan un grupo carboxílico (grupo ácido) y grupos hidroxilo (uno o más) en un anillo aromático. Están presentes en alimentos tales como frutas, verduras y cereales(38). Los ácidos hidroxicinámicos se caracterizan por la presencia del grupo CH = CH-COOH en remplazo del grupo COOH presente en los ácidos hidroxibenzoicos.El doble enlace carbono (C = C) de la cadena aumenta la resonancia química, que puede ser descrita como una deslocalización de los electrones en los enlaces estabilizando los radicales libres y por lo tanto incrementa la capacidad antioxidante de la molécula (38). . Flavonoides: son un tipo particular de los polifenoles presentes en plantas, y son los. compuestos responsables del color de las flores y frutas. La estructura química típica de Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 9.

(27) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA los flavonoides consta de tres anillos: benzopirano 2-fenil, un anillo dihidroxilados fenólicos en las posiciones 5 y 7, (denotado A), un segundo anillo fenólico generalmente monohidroxilado, orto-dihidroxilados o vic- trihidroxilados (que se denota B), que también pueden contener grupos metoxi (O-CH3) como sustituyentes y el anillo C, que puede ser un anillo heterocíclicos con oxígeno pirano, pirylium o de forma pirona. En función de sus características estructurales se pueden clasificar en diferentes grupos:(36). 1. Flavanos, como la catequina, con un grupo -OH en posición 3 del anillo C. 2. . Flavonoles, representados por la quercetina, que posee un grupo carbonilo en. posición 4 y un grupo -OH en posición 3 del anillo C. 3. Flavonas, que poseen un grupo carbonilo en posición 4 del anillo C y carecen del grupo. hidroxilo en posición C3. 4. Antocianidinas, que tienen unido el grupo -OH en posición 3 pero además poseen un. doble enlace entre los carbonos 3 y 4 del anillo C.  Taninos: Difieren del resto de los fenoles simples en que son solubles en agua; su masa molecular está entre 500-3.000/4.000 unidades de masa atómica (u.m.a.), incluyendo moléculas que contienen 12-16 grupos fenólicos y 5-6 anillos aromáticos; son capaces de interaccionar con otras moléculas formando complejos. Forman precipitados con alcaloides, gelatina y otras proteínas en solución (36). El nombre taninos se refiere al proceso de curtido en el que se convierte la piel de los animales en cuero. Los taninos se clasifican en tres grupos según su estructura química: condensados, hidrolizables y complejos. 1.3.2. Actividad biológica de los compuestos fenólicos Los polifenoles poseen acciones molusquicidas, antihelmínticas, antihepatotóxicas, antinflamatorias, antidiarreicas, antiúlcera, antivirales, antialérgicas y vasodilatadoras. Se ha verificado que inhiben la replicación del Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) y del virus simplex humano (VSH), inhiben las glucosil transferasas del Streptococcus mutans (caries dental), inhiben la autoxidación del ascorbato, también inhiben efectos citotóxicos, la promoción del crecimiento tumoral y la enzima xantina monoamina oxidasa. La actividad antioxidante de los fenoles es el origen de funciones biológicas tales como la antimutagénica, anticancerígena y antienvejecimiento(3, 40). Los flavonoides, en particular, Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 10.

(28) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA exhiben una amplia gama de efectos biológicos, incluyendo actividad antibacteriana, antiviral, antiinflamatoria, antialérgica, antioxidante, antitrombótica y vasodilatadora (23, 41). Existe evidencia epidemiológica acerca de los beneficios para la salud del consumo abundante de frutas y verduras en la dieta. Altas ingestas de frutas y verduras están asociadas con el mantenimiento de la salud y la prevención de enfermedades. El pensamiento vigente vincula el alto contenido de antioxidantes con la inhibición de las enfermedades provocadas por el daño oxidativo, tales como la enfermedad cardíaca, las hemiplejias y el cáncer(41,. 42). . Se ha probado, epidemiológica y experimentalmente, la. relación existente entre una ingesta aumentada de antioxidantes en la dieta, así como de vitaminas C y E, β caroteno y la prevención de la enfermedad coronaria. Hertog (1993) determinó que la ingesta de flavonoides en la dieta, la mayoría a partir de té, se asoció con una reducción de las muertes por enfermedades coronarias (43). Los flavonoides de las plantas, específicamente los del té, son poderosos antioxidantes, comprobados in vitro en un sistema de oxidación de lipoproteínas, simulando lo que ocurre en el cuerpo humano(44). Las hierbas utilizadas para realzar y complementar los sabores de los alimentos son fuentes de compuestos fenólicos; el consumo de hierbas está asociado con una baja incidencia de cáncer y baja mortalidad por esta misma enfermedad(45). Los flavonoides y otros fenoles actúan en forma preventiva en el desarrollo del cáncer y de la enfermedad coronaria. La ingestión de vino tinto desalcoholizado o de una mezcla de compuestos fenólicos extraída de este, el consumo de dietas controladas altas en frutas y verduras incrementa significativamente la capacidad antioxidante del plasma en humanos. Estudios epidemiológicos han demostrado una asociación negativa significativa entre la ingesta de frutas y verduras y la mortalidad debida a enfermedades cardíacas(45). Un aumento en la ingesta de antioxidantes fenólicos naturales se correlaciona con una reducción de las enfermedades coronarias. Dietas ricas en compuestos fenólicos se asocian con mayor expectativa de vida. Estas propiedades incluyen actividad anticáncer, antiviral, antiinflamatoria, efectos sobre la fragilidad capilar, y habilidad para inhibir la agregación de las plaquetas humanas. Estos compuestos pueden moderar la peroxidación de los lípidos involucrados en la aterogénesis, trombosis y carcinogénesis. Sus propiedades conocidas incluyen la captura de radicales libres, fuerte actividad Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 11.

(29) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA antioxidante, inhibición de las enzimas hidrolíticas y oxidativas (fosfolipasa A2, cicloxigenasa, lipoxigenasa) y acción antiinflamatoria(26, 46, 47). Los flavonoides del vino tinto han demostrado fuerte actividad de inhibición de la oxidación de las LDL; in vitro e in vivo reducen la agregación de las plaquetas y esto se asocia con la reducción de la mortalidad por enfermedad cardiovascular. La (+) catequina ha demostrado prevenir la oxidación del plasma humano e inhibir la oxidación de las LDL. Estos metabolitos pueden explicar los efectos protectores de la dieta rica en vegetales, frutas y vino contra las enfermedades cardiovasculares. La mayor concentración de (+) catequina en el plasma se observó en sujetos que consumieron frutas, verduras y vino. Su acción antioxidante y antiagregación de las plaquetas puede explicar parcialmente la protección relativa contra la enfermedad coronaria (48). 1.3.3. Extracción y cuantificación de compuestos fenólicos en matrices vegetales. En los últimos 25 años se han producido importantes avances en la investigación consecutiva sobre la extracción, identificación y cuantificación de compuestos fenólicos como moléculas medicinales y / o dietéticas. La extracción con solvente orgánico es el principal método utilizado para extraer fenoles. Los procedimientos químicos se utilizan para detectar la presencia de compuestos fenólicos totales, mientras que las técnicas espectrofotométricas y cromatográficas se utilizan para identificar y cuantificar fenoles individuales(49, 50). El proceso de extracción es importante en el aislamiento e identificación de compuestos fenólicos. La capacidad de extracción depende del disolvente, la naturaleza y preparación de material a extraer, la estructura química de los compuestos fenólicos, temperatura, tiempo de extracción, relación sólido-líquido, método de extracción empleado y la posible presencia de sustancias de interferencia (50,. 51). . El proceso de separación puede ser. clasificado de acuerdo a la naturaleza del material extraído o por el tipo de fases en contacto, como sólido-líquido, líquido-líquido, entre otros(52). La extracción líquido- líquido (ELL) y la extracción en fase sólida (EFS) son los métodos comúnmente utilizados previos al análisis de compuestos fenólicos simples y polifenólicos presentes en las plantas. Estas técnicas siguen siendo las más empleadas para la separación de fenoles de las matrices vegetales, debido a su facilidad de uso, eficacia y la amplia aplicabilidad. Los solventes de extracción normalmente usados son los alcoholes Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 12.

(30) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA (el metanol, etanol), acetona, dietil y etil éter, el acetato. Sin embargo, los ácidos fenólicos muy polares (los ácidos benzoicos, cinámico) no pueden extraerse completamente con solventes orgánicos puros por lo que se recomiendan mezclas de alcohol–agua o de acetona-agua. Los solventes menos polares (el diclorometano, cloroformo, el hexano, el benceno) son convenientes para la extracción de compuestos no polares (las ceras, aceites, esteroles, la clorofila) que se encuentran en la matriz de la planta. La técnica es casi invariable se repite de dos a tres veces y se combinan los extractos(53). En la extracción y purificación de compuestos orgánicos mediante el empleo de solventes, se suelen seguir ciertas reglas basadas en las analogías estructurales existentes entre la sustancia a extraer y el disolvente que se empleará para tal fin. La polaridad de los compuestos es uno de los elementos a tener en cuenta al considerar la solubilidad de un soluto en un solvente dado. Es así que los solventes fuertemente polares disuelven solutos iónicos o altamente polares, mientras que los solventes poco polares no disuelven de manera eficiente los solutos iónicos, pero sí a los solutos de baja polaridad. Desde el punto de vista general los solventes pueden clasificarse en polares y no polares, existiendo además algunos de polaridad intermedia(52). - Disolventes polares: la polaridad de estos disolventes está vinculada no sólo al tipo de uniones interatómicas (de tipo iónicas o covalentes polares), sino también a la presencia de grupos funcionales polares (hidroxilo, amino) y la capacidad de formar uniones de tipo puente de hidrógeno. Los compuestos con grupos funcionales polares son solubles en este tipo de disolventes, siempre que el componente hidrocarbonado no sea relativamente grande (no más de 4 átomos de carbono, como regla general). Dentro de esta clase de disolventes encontramos al agua, los alcoholes de bajo peso molecular (metanol, etanol), la dimetilformamida, el dimetilsulfóxido y algunos ácidos de bajo peso molecular como el fórmico y el acético, aunque en este último caso hay que tener en cuenta la reactividad de los mismos. -Disolventes no polares: poseen estructura de hidrocarburos, sin grupos que confieran una marcada polaridad a la molécula. En su estructura predominan las uniones químicas C-C. Entre éstos, y en orden de polaridad creciente, encontramos al éter de petróleo, tetracloruro de carbono, ciclohexano y benceno. Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 13.

(31) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA - Disolventes de polaridad intermedia: Son aquellos disolventes cuya estructura molecular es eléctricamente asimétrica. Es el caso típico de la molécula de cloroformo, donde la distribución de polaridades creadas por los distintos tipos de uniones (de tipo covalente) crea una zona con densidad de carga negativa (átomos de cloro) y otra con densidad de carga positiva (átomo de hidrógeno) formando un dipolo. Entre este tipo de disolventes se encuentran también ciertos compuestos oxigenados que, al no poseer funciones hidroxilo como los alcoholes, pueden actuar como aceptores, pero no como dadores en uniones de tipo puente de hidrógeno. Es el caso del éter etílico, la acetona y el acetato de etilo (52). La técnica de ELL es ampliamente utilizada para separar los componentes de sistemas orgánicos. La extracción con disolvente permite purificar y concentrar los analitos de interés, antes del análisis(53). La cuantificación e identificación de los componentes fenólicos en los compuestos vegetales ha despertado un gran interés por su importancia biológica descrita en el epígrafe anterior, lo que ha hecho que cada día sean más los datos que se pueden encontrar en la bibliografía científica sobre el perfil fenólico en los vegetales. Además, la gran diversidad de compuestos fenólicos dispersos en los tejidos vegetales, así como sus diferentes estructuras químicas, han traído consigo la necesidad de desarrollar un gran número de técnicas analíticas para su identificación y cuantificación (54). Dentro de las técnicas analíticas para la cuantificación y/o identificación de compuestos fenólicos se encuentran las técnicas cromatográficas como son la cromatografía de capa fina (TCL, siglas en inglés), la cromatografía de gases (CG, siglas en inglés) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, siglas en inglés) y también se encuentran las técnicas espectrofotométricas(41, 49, 55, 56). A continuación, se describen brevemente aspectos específicos para la determinación analítica de estos metabolitos, profundizando en las técnicas aplicadas en el presente trabajo. a) Técnicas cromatográficas. Las técnicas cromatográficas han permitido la separación, aislamiento, purificación e identificación de compuestos fenólicos, así como el estudio de la interacción entre los polifenoles y otros componentes de los alimentos. Hoy en día, las técnicas de HPLC son las más empleadas para la separación y cuantificación de polifenoles. Existen distintos soportes y fases móviles que permiten el análisis de Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 14.

(32) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA antocianinas, procianidinas, flavonas y ácidos fenólicos. Mediante el empleo de HPLC, se puede determinar un gran número de polifenoles de interés nutricional, como fenoles simples, ácidos fenólicos y sus derivados, y los distintos flavonoides; sin embargo, esta técnica requiere la utilización de métodos de extracción adecuados a cada uno de los compuestos a analizar. Esto conduce a un tratamiento muy elaborado de las muestras (55, 57-60). .. b) Ensayo ultravioleta directo. Se han realizado numerosos estudios para desarrollar técnicas rápidas de. cuantificación. de compuestos fenólicos mediante ensayos. ultravioletas. Cada grupo de compuestos fenólicos se caracteriza por tener una o varias absorbancias máximas a distintas longitudes de onda dentro del espectro ultravioleta. Así, los fenoles simples tienen una absorbancia máxima entre 220 y 280 nm, mientras que los compuestos fenólicos relacionados presentan una amplia variación en la longitud de onda a la cual presentan una absorbancia máxima. Una de las técnicas más empleadas dentro de este grupo es la determinación del ácido clorogénico, el cual se cuantifica después de su extracción con etanol y posterior lectura de la absorbancia máxima a una longitud de onda de 325-328 nm(61). c) Técnicas espectrofotométricas indirectas. Los métodos espectrofotométricos no son nuevos en el campo de la química analítica y hasta hoy en día son usados frecuentemente para la determinación de polifenoles.Entre este tipo de técnicas, los métodos usados comúnmente para determinar polifenoles en alimentos destacan el ensayo de la vainillina para la determinación de compuestos flavan-3-ol, dihidrochalconas y proantocianidinas que tienen una unión simple en la posición 2,3 y poseen grupos hidroxilos en la posición meta del anillo B. (62). y el ensayo de Folin-Ciocalteu para la cuantificación de polifenoles. totales, esta técnica llegó a ser la más utilizada para determinar de manera cuantitativa a los polifenoles. Este método consiste básicamente en generar cierto color a través de la adición del reactivo de Folin-Ciocalteu en un medio alcalino a una determinada muestra. Swain. y. Goldstein. (1964),. revisaron. diversos. métodos. espectrofotométricos. y. recomendaron desde ese año el ensayo de Folin-Ciocalteu como el reactivo más conveniente para la determinación espectrofotométrica de polifenoles totales(63, 64). d) La técnica de Folin-Ciocalteu (FC) para la determinación de fenoles totales no está directamente relacionada con la medición de actividad antioxidante, pero puede ser útil Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 15.

(33) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA para tales estudios, en especial si se combinan con métodos para medir dicha actividad. Esta prueba consiste en mezclar tugstato y molibdato en un medio altamente básico (Na2CO3 al 5-10 %, acuoso). Los polifenoles son fácilmente oxidables en medio básico quienes reaccionan con el molibdato formando óxido de molibdeno MoO, este compuesto puede ser identificado y cuantificado por espectrofotometría UV/VIS debido a que absorbe a una longitud de 750 nm. El contenido de fenoles totales generalmente, se expresa en equivalentes de ácido gálico. Estas razones justifican el uso de este método en la determinación de fenoles en el presente trabajo. Esta técnica resulta, también, ampliamente utilizada para determinar el contenido total de taninos en las plantas medicinales, siendo metodologías descritas en la mayoría de las farmacopeas actuales consultadas como técnica oficial incluida para la determinación de taninos en drogas vegetales utilizando como estándar el Pirogalol. La misma incluye un tratamiento previo de la muestra para la extracción del tanino en polvo de piel y el uso FC como reactivo de color(65). . Ensayo de Cloruro de Aluminio para la determinación de flavonoides.. El compuesto tricloruro de aluminio es usado para determinar el contenido de flavonas y flavonoides y está basado en la formación de un complejo entre ion aluminio (III) y los grupos hidroxilo y carbonilo de los flavonoides. La muestra disuelta en metanol se hace reaccionar con tricloruro de aluminio y se espera 30 min, estos compuestos presentan una coloración amarilla, que permiten su determinación a partir de espectrofotometría a una longitud de onda de 430 nm. La rutina pertenece al grupo de los flavonoles y se usa rutinariamente como estándar en esta técnica. Este ensayo se encuentra reportado en un gran número de publicaciones actuales que fueron consultadas para el desarrollo del presente trabajo(41, 46, 66, 67).. 1.4. Actividad antioxidante. Métodos in vitro para su evaluación Numerosos estudios han avalado las propiedades biológicas de los polifenoles. El estudio de la capacidad antioxidante de las plantas medicinales y alimenticias ha crecido en las últimas décadas ya que un número importante de productos obtenidos de éstas, como los aceites esenciales, alcaloides y los polifenoles, poseen efectos antioxidantes los cuales son evidenciados mediante diferentes ensayos in vitro e in vivo asociados a cada uno de Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 16.

(34) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ellos(68). Estos efectos son fundamentalmente consecuencia de sus propiedades antioxidantes que pueden usualmente justificar sus acciones vasodilatadoras y vasoprotectoras,. así. como. sus. acciones. antiateroscleróticas, antiinflamatorias y antiapoptóticas. antitrombóticas, (18). antilipémicas,. .. Los antioxidantes son compuestos que pueden inhibir o retardar la oxidación de otras moléculas inhabilitando la iniciación y/o propagación de las reacciones en cadena de los radicales libres. Podemos distinguir dos categorías: sintéticos y naturales. Los primeros son compuestos de estructuras fenólicas con varios grados de sustitución alquílica, mientras que los segundos pueden ser: compuestos fenólicos (tocoferoles, flavonoides y ácidos fenólicos), compuestos nitrogenados (alcaloides, derivados de la clorofila, aminoácidos y aminas) o carotenoides(68). Los radicales libres (RL) se definen como cualquier especie química capaz de existir de forma independiente y que presenta uno o más electrones desapareados en su estructura, por lo tanto, son altamente reactivos; y también conocidos como especies reactivas del oxígeno y especies reactivas del nitrógeno, (ROS y RNS, por sus siglas en inglés, respectivamente). (69,. 70). . A bajas concentraciones son necesarios para el buen. funcionamiento celular pueden actuar como segundos mensajeros estimulando la proliferación celular y/o actuar como mediadores para la activación de las células, sin embargo, un exceso de los mismos puede acumularse hasta niveles tóxicos dando como resultado que se produzcan diversas acciones sobre el metabolismo primario, que pueden producir daño oxidativo de macromoléculas biológicas como el DNA, lípidos, carbohidratos y. proteínas.. Estos participan. en los mecanismos. fisiopatológicos. de. muchas. enfermedades, tales como: cáncer, diabetes, patologías cardiovasculares, procesos reumáticos, patologías gastroentéricas, afecciones broncopulmonares o procesos neurodegenerativos. También están implicados en procesos fisiológicos como el envejecimiento, el daño causado por el ejercicio físico agotador y otros (69). La prolongada exposición a oxidantes exógenos y/o a metabolitos endógenos en el cuerpo pueden producir ROS, (los radicales aniones superóxido, radicales hidroxilo y peróxido de hidrógeno)(69). Cuando un exceso de radicales libres se forma, puede causar la destrucción de enzimas tales como superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPx), y catalasa, generando efectos letales en las células por la oxidación de lípidos, Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 17.

(35) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA proteínas, DNA y enzimas; ocasionando reacciones en cadena que perpetúan la creación de más radicales libres aumentando el daño de tejidos (71). Los radicales libres son responsables de causar un gran número de enfermedades entre las que se incluyen el cáncer, enfermedades cardiovasculares, trastornos neuronales, Alzheimer, Parkinson, deterioro cognitivo leve, enfermedades del hígado inducidas por el alcohol, colitis ulcerosa, el envejecimiento y la aterosclerosis(5). Los compuestos antioxidantes tienen la capacidad de inhibir o interrumpir las reacciones de transformación que causan daños a las biomoléculas. En los últimos años los antioxidantes naturales provenientes de plantas (ácido ascórbico (vitamina C), α-Tocoferol (vitamina E), glutatión, carotenoides, y flavonoides), han sido frecuentemente usados en diferentes campos de la industria farmacéutica, alimentos y en medicina (71). Muchos de estos, presentan una actividad comparable con antioxidantes sintéticos de mayor uso comercial como el 2-terbutil-hidroxitolueno (BHT) y el 2-terbutil-hidroxianisol (BHA); los cuales sin embargo, pese a sus propiedades antioxidantes presentan la desventaja de tener efectos toxicológicos.(72) Un gran número de contribuciones sobre el reporte de extractos y/o sustancias validadas por sus propiedades antioxidantes se ha incrementado significativamente en los últimos años. El estudio de nuevos y efectivos antioxidantes puede ser de gran beneficio en la mejora de la calidad de vida mediante la prevención y aparición de enfermedades degenerativas. Además, de presentar un sustancial ahorro en el costo de los servicios de atención de la salud. Sin embargo, a pesar de la gran cantidad de sustancias y/o especies vegetales validadas por poseer propiedades antioxidantes para inhibir el deterioro oxidativo, son pocos los estudios complementarios y los recursos que se destinan en la investigación, ya que sólo unas pocas especies se utilizan como suplementos antioxidantes o alimentarios (73). Con base a las reacciones químicas, la gran mayoría de los ensayos para determinar la capacidad antioxidante pueden ser divididos en dos categorías: (1) Ensayos basados en la reacción por transferencia de átomos de hidrógeno (HAT, por sus siglas en inglés) y (2) Ensayos basados en la reacción por transferencia de electrones (SET, por sus siglas en inglés)(74). Los ensayos basados en SET involucran una reacción redox con el oxidante como un indicador del punto final de la reacción. La mayoría de los ensayos basados en HAT Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 18.

(36) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA monitorean una reacción cinética competitiva, generalmente están compuestos de un generador de radical libre sintético, una prueba molecular oxidable y un antioxidante. Los ensayos basados en HAT y SET fueron desarrollados para medir la capacidad de atrapar radicales libres, en lugar de la capacidad preventiva antioxidante de una muestra (74, 75). En la figura 1.2 se muestran las reacciones específicas para los ensayos basados en la HAT y ET.. En. los. últimos. años. se. han. adoptado. un. amplio. rango. de. ensayos. espectrofotométricos para medir la capacidad antioxidante de los alimentos, muestras biológicas y extractos vegetales. Usualmente los ensayos antioxidantes in vitro utilizan un captador de radicales libres y son relativamente sencillos de realizar. Entre los ensayos de captación de radicales libres, el método DPPH● (siglas en inglés de radical 2,2difenil-1picrilhidrazil) es el más rápido, es simple (no incluye muchos pasos) y de menor costo en comparación con otros modelos. Por otro lado, el ensayo de decoloración ABTS•+(siglas en. inglés. del. ácido. 2,2’-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónic). se. puede. aplicar. a. antioxidantes hidrofílicos y lipofílicos(76, 77). Por lo anterior, estos dos métodos son los más utilizados.. Figura 1.2. Mecanismos de reacción por transferencia de electrones y transferencia de átomos de hidrógeno El analizar por dos o más métodos la actividad antioxidante de un extracto es muy común en los reportes científicos ya que proporciona información complementaria. La actividad antioxidante de un extracto complejo estará dada por la suma de las capacidades antioxidantes de cada uno de sus componentes, de la interacción entre ellos y del ambiente en que están inmersos, ya que puede producirse eventualmente efectos potencializadores o inhibidores(75). Una de las estrategias más aplicadas en las medidas in vitro de la capacidad antioxidante total de un compuesto consiste en determinar la actividad del antioxidante frente a Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 19.

(37) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA sustancias cromógenas de naturaleza radicálica, ocurriendo la pérdida de color de forma proporcional con la concentración. Diversos compuestos cromógenos son utilizados para determinar la capacidad para captar los radicales libres generados, operando así en contra los efectos perjudiciales de los procesos de oxidación, que implican a especies reactivas de oxígeno(41, 78). Por otra parte, algunos metales pueden funcionar como catalizadores en la formación de radicales; de ahí que su secuestro por medio de la formación de complejos o quelatos, para prevenir la formación de radicales libres, sea otra de las estrategias antioxidantes(79). 1.4.1. Métodos in vitro para la evaluación de la actividad antioxidante La actividad antioxidante es ampliamente utilizada como parámetro para caracterizar diferentes materiales vegetales. Esta actividad se relaciona con compuestos capaces de proteger un sistema biológico del efecto potencialmente dañino de procesos que causan excesiva oxidación, involucrando especies ROS. Existen diversos métodos para la evaluación de la capacidad antioxidante de muestras biológicas. Algunos de ellos utilizan la producción de un radical orgánico o ROS y otros se basan en la oxidación-reducción de iones metálicos. Un ensayo universal de la actividad antioxidante in vitro no existe, debido a que la actividad antirradicalaria depende fundamentalmente de la naturaleza del radical y del método de generación del mismo. La elección de un sistema químico para generar especies reactivas es un punto crítico en el desarrollo de cualquier ensayo antioxidante con el fin de obtener resultados relevantes(80). Se han desarrollado varios métodos espectrofotométricos para la determinación del potencial antioxidante de diferentes sistemas bioquímicos. Estos métodos son de rápida aplicación, escasa manipulación de material biológico y bajas necesidades instrumentales, por lo que su aplicación es sencilla. La eficacia antioxidante de las muestras ensayadas se compara con patrones conocidos como ácido ascórbico o Trolox. Estos ensayos se pueden diferenciar por el procedimiento de las reacciones. Algunos utilizan el retraso en la oxidación (fase lag) como parámetro de la actividad antioxidante, otros analizan la capacidad de captación del radical libre, reducción del ion metálico o catión radical (81). Los métodos que se utilizarán en este trabajo son ampliamente empleados en diferentes estudios del poder antioxidante de sistemas biológicos (como plasma sanguíneo o tejidos), Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 20.

(38) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA tanto de extractos y compuestos aislados de especies vegetales, como productos derivados de procesos industriales. Las pruebas seleccionadas para el estudio de la actividad antioxidante son: la reacción con el radical 2,2-difenil-1 -picril hidrazilo (DPPH●), reacción con el radical 2,2’-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfonato de amonio (ABTS•+), medida de la capacidad reductora (método FRAP, siglas en inglés de Ferric Reducing Antioxidant Power), la actividad antioxidante total (TAOC, siglas en inglés), determinada por el método del molibdato de amonio y la actividad quelante(41, 56, 73, 82-84), los cuales se fundamentan a continuación. ●. 1.4.1.1. Ensayo con el radical DPPH. El fundamento de esta técnica consiste en la medición a 517 nm de la reducción del radical estable DPPH● (figura 1.3). La absorbancia característica de este radical, que posee un color violeta intenso, disminuye en presencia de un antioxidante (AH) u otro radical (R.). Por tanto, es posible cuantificar la capacidad captadora de radicales libres que poseen determinados compuestos mediante la determinación del grado de decoloración que provocan a una disolución metanólica de DPPH●(85).. Figura 1.3. Reacción del radical DPPH 1.4.1.2. Reacción con el radical ABTS•+ La base del método consiste en formar un radical catiónico ABTS•+ (cromóforo verde) basado en la acción oxidativa de peroxidasas u oxidasas sobre ABTS•+ (figura 1.4). Una solución estable de ABTS•+ también puede ser preparada con agentes oxidantes tales como dióxido de manganeso o persulfato de potasio. El radical ABTS•+ presenta máximos de absorción a 414 nm y en las proximidades del infrarrojo (645, 732 y 815 nm). Esta propiedad da la posibilidad de evitar interferencias generadas por cromógenos de la muestra a estudiar. El fundamento de este método consiste en observar la decoloración del radical ABTS•+ debido a la interacción con especies donantes de hidrógeno (86).. Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 21.

(39) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. Figura 1.4. Reacción con el radical ABTS•+.. 1.4.1.3. Medida de la capacidad reductora: Método FRAP Este método evalúa la capacidad antioxidante de una muestra biológica de acuerdo a su capacidad para reducir un determinado compuesto. Originariamente este método se lo denominó “Ferric reducing ability of plasma” (FRAP) porque fue utilizado para medir la actividad antioxidante del plasma humano. Actualmente se lo denomina “Ferric reducing antioxidant power” y su utilización se ha extendido al estudio de diferentes compuestos, mezclas o extractos biológicos. La base del método consiste en la reducción de un compuesto o mezcla de compuestos (X) sobre el Fe 3+ presente en un complejo con un compuesto orgánico: tripiridiltriazina (TPTZ, siglas en inglés) (figura 1.5). Cuando el hierro del complejo es reducido a la forma ferrosa toma un color azul que presenta un máximo de absorción a 593 nm y cuya intensidad de color es proporcional a la capacidad reductora del compuesto o compuestos ensayados(87).. Figura 1.5. Fundamento del método FRAP mostrando la reducción de TPTZ. 1.4.1.4. Actividad Quelante Al igual que el anterior este ensayo se incluye entre los que tienen mecanismo SET. En el mismo se determina la capacidad antioxidante de un compuesto basándose en la propiedad de quelación de metales, la ferrozina al unirse al hierro (Fe2+) produce un complejo de color violeta. En presencia de un agente quelante (compuesto antioxidante), Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 22.

(40) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA la formación de este complejo se ve interrumpida y como consecuencia de ello el color violeta del complejo disminuye hasta tomar un tono rojizo. En este ensayo se suele emplear como compuesto de referencia el etilen-diamin-tetra-ácido acético (EDTA). Con un máximo de 562 nm donde un incremento de la absorbancia indica la significancia de la capacidad antioxidante del compuesto en cuestión (88). 1.4.1.5. Capacidad antioxidante total por el método del molibdato de amonio (TAOC). Este ensayo refleja la capacidad de un sistema de defensa antioxidante no enzimático. En el método, llamado también método del fosfomolibdeno, el molibdeno VI (Mo 6+) se reduce para formar un complejo de color verde de fosfato/Mo 5+ a pH acídico. Valores altos de absorbancia indican que la muestra posee actividad antioxidante significativa. (89) 1.5. Consideraciones finales de la revisión bibliográfica: En la literatura consultada la planta estudiada en el presente trabajo, Mosiera crenulata, posee escasos reportes sobre su cultivo y no aparece nada publicado sobre sus posibles usos en el campo farmacéutico y/o alimentario de ninguna de sus partes. Teniendo en cuenta lo anterior y la importancia de esta especie para nuestra región, por su endemismo, en el presente trabajo se estudia el contenido de compuestos fenólicos en sus extractos y sus propiedades antioxidantes. Después de realizarse una exhaustiva revisión de la literatura especializada se puede resumir lo siguiente: (I) –No existen estudios científicos en el campo farmacéutico reportados sobre la planta evaluada. (II) – Las técnicas analíticas más utilizadas en la determinación de fenoles es la espectrofotometría indirecta y el HPLC; (III)- Existe una relación estrecha entre la composición fenólica en las plantas medicinales y la actividad antioxidante. (IV)- La actividad antioxidante transcurre por diferentes mecanismos de acción, siendo las técnicas in vitro más empleadas para su evaluación la actividad secuestradora de radical libre. DPPH●, FRAP, la actividad. quelante y el ensayo ABTS•+.. Isela María Bofill Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 23.

(41) CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS. Capítulo 2 Materiales y Métodos. Isela María Bofil Morrell – 2018 Composición fenólica y actividad antioxidante de los extractos obtenidos de las hojas de Mosiera crenulata B. Página 23.