Regulación catabólica por carbono de los factores de patogenicidad de Clostridium perfringens relacionados con la gangrena gaseosa

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(1)Regulación catabólica por carbono de los factores de patogenicidad de Clostridium perfringens relacionados con la gangrena gaseosa.. Lic. en Biotecnología. Marcelo B. Méndez. Año 2013.

(2) Tesis para la obtención del título de Doctor en Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario.. Dr. Roberto Grau Director de Tesis. Rosario, Octubre 2013.. Marcelo Bernabé Méndez Licenciado en Biotecnología Matrícula Doctorado 2005.25750146.00. Doctor Roberto Grau Director de tesis FCByF-UNR. I.

(3) Méndez, 2013.. Agradecimientos.. A mis viejos y hermanos por la confianza que siempre me brindaron.. A mi familia… mis amores Gisel, Helena y Lucio que viene en camino, por el sustento, por no dejar que bajara los brazos, por ser mis guias espirituales.. A mis amigos… los de siempre y los nuevos, por no cambiar nunca, por los consejos, datos, asesoramiento… y fundamentalmente por eso que no se puede describir sencillamente.. A mi director de tesis, Roberto,… por la paciencia, el respeto, el compañerismo, la confianza y la oportunidad.. A mis tutores de tesis… por sus consejos y por soportar las idas y vueltas.. A Gabriela Michelini de la Secretaría de Postgrado por darme el sacudón a tiempo.. A todos los que de alguna manera formaron parte de esta tesis.. A mi mismo…. Agradecimiento especial a las fuentes de financiamiento: IFS (Internacional Foundation for Science, Suecia) que otorgó el primer subsidio para comenzar a trabajar con Clostridium; Fundación Antorchas, que dio el primer subsidio importante y prolongable en el tiempo que permitió continuar con los trabajos iniciados con C. perfringens; CONICET, FONCyT y ASM (American Society for Microbiology Undergraduate Research Fellowship y American Society for Microbiology International Fellowship) que continuaron con el apoyo brindado inicialmente por la IFS y Antorchas a esta línea de investigación del patógeno humano y animal C. perfringens. II.

(4) Méndez, 2013.. Resultados difundidos relacionados a la presente tesis en congresos y revistas de investigación.. 2005- Méndez, M. and Grau, R. Role of Spo0A and Sigma H in survival of Clostridium perfringens type A food poisoning. 105th International Meeting of the American Society for Microbiology. June 5-9th, Atlanta, USA.. 2006- Méndez, M., Sarker, M., and Grau, R. Role of Spo0A on biofilm formation and sliding motility in Clostridium perfringens. Fith International Congress on the Molecular Biology of Pathogenic Clostridia. May 12-15th, UK.. 2006- Grau R., Méndez, M., and Sarker, M. Spo0A is essential for biofilm formation and swarming motility in the anaerobic pathogen Clostridium perfringens. 11th International Congress on Microbial Ecology, ISME 11. August 20th, Vienna, Austria.. 2007- Méndez, M., Grau, R. Carbon catabolite repression of Type IV pili-dependent gliding. Comunicación Oral, XLIII Reunión Annual Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica y Biología Molecular (SAIB). 31: MI-C16. 17 a 20 de noviembre, Mar del Plata, Argentina.. 2008- Méndez, M., Huang, I. H., Ohtani, K., Grau, R., Shimizu, T., Sarker, M. R. Carbon catabolite repression of Type IV pilus-dependent gliding motility in the anaerobic pathogen Clostridium perfringens. J. Bacteriol. 190:48-60.. 2009- Méndez, M., Goñi, A. and Grau, R. Regulación catabólica por carbono de la producción de toxinas en Clostridium perfringens tipo A. LIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC) y LVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología (SAI). 18 a 21 de noviembre, Mar del Plata, Argentina.. 2010- Méndez, M., Ramirez, W., and Grau, R. Carbon catabolites inhibit PLC and PFO toxin production in the gas gangrene-producer Clostridium perfringens. XII Congreso. III.

(5) Méndez, 2013.. Argentino de Microbiología y I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental. 17 a 20 de octubre, Buenos Aires, Argentina.. 2012- Méndez, M. B., Goñi, A., Ramirez, W., Grau, R. R. Sugar inhibits the production of the toxins that trigger clostridial gas gangrene. Microbial Pathogenesis. 52: 85-91.. Notas periodísticas relacionadas. Jueves, 20 de julio de 2006. La Nación. Ciencia/Salud. Hallazgo de investigadores argentinos. Avance contra el tétanos y el botulismo. http://www.lanacion.com.ar/ 824707-avance-contra-el-tetanos-y-el-botulismo.. Lunes, 04 de febrero de 2008. La Nación. Ciencia/Salud. Hallan el talón de Aquiles de la bacteria que produce la gangrena. http://www.lanacion.com.ar/984290-hallan-eltalon-de-aquiles-de-la-bacteria-que-produce-la-gangrena.. Sábado, 16 de febrero de 2008. La Capital. La Ciudad. Un docente de la UNR logró frenar. la. gangrena.. http://www.lacapital.com.ar/la-ciudad/Un-docente-de-la-UNR-. logroacute-frenar-la-gangrena-20080217-0078.html#comentarios.. Distinciones. Becas internacionales. 2004-American Society for Microbiology Undergraduate Research Fellowship. Board of the Education of the American Society for Microbiology (ASM, Estados Unidos), Primera vez que la ASM otorga esta beca a un estudiante fuera de Estados Unidos. Beca que comprendía la realización de un trabajo experimental en Argentina y la posterior presentación en 105th International Meeting of the American Society for Microbiology, ASM, Atlanta, USA.. 2005-American Society for Microbiology International Fellowship. ASM, Estados Unidos, Beca destinada a la realización de un trabajo de investigación llevado a cabo en el Department of Biomedical Sciences and Microbiology, Oregon State University, Corvallis, Oregon, USA. La investigación estuvo bajo la dirección del Dr. Matfuzur Sarker, referente internacional sobre el patógeno C. perfringens. IV.

(6) Méndez, 2013.. Abreviaturas utilizadas en la presente tesis en orden alfabético. ADI - arginina deiminasa. ADN – ácido desoxiribonucleico. ADNc – ácido desoxiribonucleico cadena complementaria. ADP – adenosil difosfato. AHL – acil homoserina lactona. AI-2 - autoinductor tipo 2. AIP – autoinductor peptídico. ARN – ácido ribonucleico. ARNm – ácido ribonucleico mensajero. ARNr – ácido ribonucleico ribosomal. ATP – adenosil trifosfato. BHIA – brain heart infusion agar (agar infusion cerebro corazón). BHIGA – brain heart infusion glucose agar (agar infusion cerebro corazón glucosa). cAMP – adenosil monofosfato cíclico. CcpA - catabolite control protein A (proteína de control por catabolito A). CcpB - catabolite control protein B (proteína de control por catabolito B). CcpC - catabolite control protein C (proteína de control por catabolito C). CCR - carbor catabolite repression (represión por catabolito fuente de carbono). c-di-GMP – guanosil monofosfato bicíclico. cGMP – guanosil monofosfato cíclico. CmR- resistencia a Cloranfenicol. CPE – Clostridum perfringens enterotoxin (enterotoxina de C. perfringens). CRE – catabolite control element (elemento de control por catabolito). DO - densidad óptica. EmR- resistencia a Eritromicina. EPS – exopolisacárido. V.

(7) Méndez, 2013.. ETEC – entero toxigenic Escherischia coli (E. coli enterotoxigénica) FBP – fructosa-1,6-bifosfato. FQ – fibrosis quística. FTG – fluid tioglycolate (caldo tioglicolato fluído). GAS – group A Streptococcus (Streptococcus del grupo A). GTP – guanosil trifosfato. HprK/P – Hpr kinase/phosphatase (Hpr quinsa/fosfatasa). HTH – helix-turn-helix (dominio hélice-vuelta-hélice). IgA – inmunoglobulina A. Kb – kilopares de bases. KDa – kilo Daltons (1000 Daltons). LB – Luria Bertani. LPS – lipopolisacárido. MOPS – morpholinepropanesulfonic acid (ácido morfolinopropanosulfónico). pb – pares de bases. PBS – phosphate buffer saline (buffer fosfato salino). PCR - polimerase chain reaction (reacción en cadena de la polimerasa). PEP – phosphoenolpyruvate (fosfoenolpiruvato). PFO – perfringolisina O. PLC - fosfolipasa C. PMNs – polimorfonucleares. PNPG - para-nitrofenil--D-glucurónico. (p)ppGpp – (tri) difosfoguanina difosfato. PTS – phosphoenolpyruvate-dependent phophotransferase system (sistema de fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpirubato). QS – quorum sensing (sensado del quorum). RT-PCR – reverse transcription-polimerase chain reaction (transcripción reversareacción en cadena de la polimerasa). VI.

(8) Méndez, 2013.. RTX- repeat in toxins (repeticiones presentes en toxinas). T0 - inicio de la fase estacionaria de crecimiento. T1 - 1 h después del final de la fase exponencial de crecimiento de un cultivo. T4P - Type four pili (pili Tipo IV). TGY – Triptein glucose yeast extract (tripteína glucose extracto de levadura). TGYA – Triptein glucose yeast extract agar (agar tripteína glucose extracto de levadura). TNF- – tumor necrosis factor  (factor de necrosis tumoral ). Tris-HCl – tris (hidroximetil) aminometano hidroxicloruro (2-amino-2-hidroximetil – propano -1,3- diol hidroxicloruro). TY – Triptien yeast extract (tripteína extracto de levadura). TYA –Triptien yeast extract agar (agar tripteína extracto de levadura). UFC – unidades formadoras de colonia. VB1 y VB2 – VirR box1 y VirR box 2 (caja VirR 1 y 2).. Anglicismos utilizados en la presente tesis en orden alfabético. Gliding: movilidad bacteriana semejante a un “deslizamiento”. Swarming: desplazamiento hiperflageladas.. bacteriano. en. grupo. o. “enjambre”. de. células. Swimming: desplazamiento microbiano en medio líquido utilizando flagelo que recuerda al “nado”. Twitching: movimiento bacteriano semejante a “crispaciones, contracciones, espasmos, o temblores”.. VII.

(9) Méndez, 2013.. Índice general de contenidos. Resumen 1. Introducción. 1.1. Factores de patogenia bacteriana.. Pág. 1 3 5. 1.1.1. Cápsula.. 5. 1.1.2. Pared celular.. 6. 1.1.3. Toxinas.. 9. 1.1.4. Adhesinas.. 10. 1.1.5. Invasión.. 12. 1.1.6. Modos de vida intracelulares.. 13. 1.1.7. Regulación de factores de virulencia.. 15. 1.1.7.1. Factores sigma.. 15. 1.1.7.2. Sistema de dos componentes.. 16. 1.1.8. Pili tipo IV.. 17. 1.1.9. Biofilms.. 24. 1.1.10. Movilidad bacteriana.. 27. 1.1.10.1. Regulación de los desplazamientos bacterianos dependientes de T4P.. 33. 1.1.10.2. Funciones bacterianas dependientes de la movilidad twitching.. 35. 1.2. Metabolismo bacteriano y patogenia.. 35. 1.2.1. Competencia por el alimento.. 36. 1.2.2. Desafíos medioambientales dentro de los hospedadores.. 36. 1.2.3. Interacciones metabólicas dinámicas entre hospedadores y patógenos.. 37. 1.2.4. Los genes metabólicos ayudan a las bacterias patógenas a colonizar 37 nuevos territorios. 1.2.5. Las bacterias patógenas pueden experimentar adaptaciones. 39. VIII.

(10) Méndez, 2013.. metabólicas. 1.3. Represión catabólica.. 40. 1.3.1. Represión catabólica por carbono mediada por reguladores específicos.. 43. 1.3.2. Mecanismos de CCR entre otras bacterias.. 44. 1.3.3. CCR regula comportamientos sociales y patogenia en bacterias.. 45. 1.4. Clostridium perfringens.. 46. 1.4.1. Pili tipo IV, movilidad y formación de biofilms en C. perfringens.. 48. 1.4.2. La gangrena gaseosa producida por C. perfringens.. 51. 1.4.3. Regulación de la producción de toxinas en C. perfringens.. 55. 1.4.4. Regulación catabólica de la producción de toxinas en Clostridium.. 58. 1.5. Hipótesis de trabajo de la presente tesis.. 2. Objetivos. 2.1. Objetivos secundarios destinados al cumplimiento del objetivo principal.. 3. Materiales y métodos.. 58 62 63 64. 3.1. Cepas bacterianas y plásmidos utilizados.. 65. 3.2. Medios de cultivo y condiciones de crecimiento.. 66. 3.3. Mantenimiento de las cepas bacterianas.. 68. 3.4. Ensayos de movilidad en placa.. 68. 3.4.1. Generación de gradiente de glucosa en placa. 3.5. Plásmidos empleados en este trabajo.. 68 69. 3.5.1. Construcción de los plásmidos reporteros gusA.. 70. 3.5.2. Construcción de plásmido complementante de CcpA.. 71. 3.6. Ensayos de actividad -glucuronidasa.. 72. 3.6.1. Determinación cuantitativa.. 72. 3.6.2. Recolección de muestras.. 72. 3.6.3. Medición de la actividad -glucuronidasa.. 72. IX.

(11) Méndez, 2013.. 3.7. Antibióticos.. 73. 3.8. Determinación del número de células vegetativas y de esporas.. 74. 3.9. Electroporación de C. perfringens.. 75. 3.10.. Transformación de E. coli.. 75. 3.11.. Preparación de ADN genómico de C. perfringens.. 76. 3.12.. Obtención de ADN plasmídico de E. coli.. 77. 3.13.. Digestión con enzimas de restricción.. 77. 3.14. Determinación de la actividad de las toxinas producidas por C. perfringens.. 78. 3.14.1. Medición de la actividad lipasa.. 78. 3.14.2. Medición de la actividad hemolítica.. 78. 3.14.3. Preparación de medios de cultivo tamponados para estudio de las toxinas PLC y PFO.. 79. 3.15. Estudio de la expresión génica mediante evaluación de ARN mensajeros específicos.. 79. 3.15.1. Extracción y cuantificación de ARN de C. perfringens.. 79. 3.15.2. Transcripción reversa y amplificación a partir de ARN total.. 80. 3.15.3. Determinación de la intensidad de banda en gel por análisis de imágenes.. 81. 3.16.. Construcción de la cepa mutante en CcpA.. 3.16.1. Southerm blot de la mutante KO13.. 81 82. 3.17. Análisis de secuencias genómicas para determinar la presencia de sitios CRE.. 85. 4. Capítulo Primero: Represión catabólica de la movilidad tipo gliding en Clostridium perfringens.. 87. 4.1. La glucosa reprime la movilidad tipo gliding de cepas salvajes de C. perfringens aisladas de infecciones humanas y animales.. 88. 4.2. Represión catabólica por carbono de la movilidad gliding de C. perfringens.. 95. 4.3. Cinética de la movilidad tipo gliding dependiente de T4P en C. perfringens.. 97. 4.4. Efecto de la glucosa sobre la expresión de los genes pilT y pilD en cepa de. 100. X.

(12) Méndez, 2013.. C. perfringens productora de gangrena gaseosa. 4.5. Rol dual de la proteína reguladora CcpA en la movilidad gliding de C. perfringens.. 103. 5. Capítulo Segundo: Los carbohidratos inhiben la producción de toxinas esenciales para la iniciación y establecimiento de la gangrena gaseosa.. 109. 5.1. La producción de toxina alfa y toxina theta es inhibida por la presencia de azúcares en C. perfringens.. 111. 5.2. La expresión de los genes codificantes de las toxinas PLC y PFO es reprimida por azúcares.. 113. 5.3. La represión por catabolito de carbono de la toxina alfa y la toxina theta está bajo el control de CcpA en C. perfringens.. 116. 6. Capítulo Tercero: Regulación de los genes de las toxinas PLC, PFO y del T4P por CcpA en C. perfringens.. 120. 6.1. Regulación de genes plc y pfoA codificantes de las toxinas desencadenantes de la gangrena gaseosa.. 121. 6.1.1. Regulación de la producción de PFO por catabolito de carbono.. 124. 6.1.2. Regulación de la expresión de plc por CcpA.. 129. 6.1.3. Control por CcpA de reguladores globales de la producción de toxinas dependientes de la densidad celular en C. perfringens.. 130. 6.2. Regulación de los genes para la biosíntesis del T4P.. 6.2.1. Regulación por CcpA del pili tipo IV en C. perfringens.. 131 138. 7. Discusión.. 140. 8. Conclusión.. 153. 9. Bibliografía.. 155. XI.

(13) Méndez, 2013.. Índice de Figuras y Tablas. Pág. Figura 1: Estructuras generales en bacterias.. 8. Figura 2: Representaciones esquemáticas de dos sistemas de transducción de señales de dos componentes involucrados en la patogenia microbiana.. 17. Figura 3: Esquemas de las estructuras de los T4P.. 22. Figura 4: Mapa físico del locus de T4P en bacterias Gram-positivas.. 23. Figura 5: Biofilms producidos por distintas cepas de B. subtilis en la interface airelíquido de cultivo estacionarios.. 27. Figura 6: Movilidad bacteriana.. 31. Figura 7: Representación esquemática del control por catabolito carbonado.. 42. Figura 8: Foto ilustrativa de la generación de gases durante el crecimiento de C. perfringens.. 47. Tabla 1: Principales toxinas producidas por C. perfringens.. 48. Figura 9: Genes involucrados en la síntesis y función del T4P en C. perfringens.. 49. Figura 10: Esquema representando la regulación de toxinas mediante el sistema de dos componentes VirR/VirS en C. perfringens Cepa 13 (gangrena gaseosa).. 56. Figura 11: Esquema representando las etapas supuestas que seguiría el proceso infeccioso de la gangrena gaseosa provocada por C. perfringens.. 60. Tabla 2: Cepas y plásmidos usados en este estudio.. 65. Tabla 3: Medios de cultivo.. 67. Figura 12: Plásmido pJIR751, vector de replicación en E. coli y en C. perfringens.. 69. Figura 13: Plásmido reportero pMRS127, vector de replicación en E. coli y en C. perfringens.. 70. Figura 14: Construcción y caracterización molecular de la cepa mutante knock-out en ccpA de C. perfringens (KO13, Tabla 2).. 83. Tabla 4: Cebadores oligonucleótidos usados en este estudio.. 84. Figura 15: La glucosa reprime la movilidad gliding de C. perfringens.. 90. Figura 16: La glucosa reprime la movilidad gliding de distintas cepas de C. perfringens aisladas de diferentes patologías y hospedadores.. 91. XII.

(14) Méndez, 2013.. Figura 17: Efecto represivo dosis respuesta de la glucosa (Glu) sobre la capacidad de movilidad gliding de C. perfringens.. 92. Figura 18: Evaluación de la concentración mínima de glucosa requerida para inhibir el desarrollo del gliding de C. perfringens.. 94. Figura 19: Efecto de carbohidratos simples y complejos sobre la movilidad gliding de C. perfringens.. 96. Figura 20: Cinética del desarrollo del gliding de la Cepa 13 de C. perfringens productora de gangrena gaseosa en ausencia y presencia de glucosa.. 99. Figura 21: La glucosa reprime la transcripción de pilT y pilD en cepas de C. perfringens productoras de la gangrena gaseosa y contaminación de alimentos.. 101. Figura 22: Medición por RT-PCR de la expresión de genes para la biosíntesis del pili Tipo IV en C. perfringens.. 102. Figura 23: CcpA media la represión por catabolito de carbono del gliding en C. perfringens.. 104. Figura 24: RT-PCR para los niveles de transcriptos de pilA1, pilA2 y pilT en la cepa mutante ccpA.. 105. Figura 25: CcpA tiene un nuevo rol positivo independiente de catabolito en la movilidad gliding de C. perfringens.. 107. Figura 26: Los azúcares regulan la producción de PLC y PFO en C. perfringens.. 112. Figura 27: Los azúcares producen represión por catabolito de carbono de la expresión de los genes plc y pfoA en C. perfringens causante de gangrena gaseosa.. 115. Figura 28: CcpA media la represión catabólica por azúcar de la producción de la toxina alfa (PLC) y la toxina theta (PFO) en C. perfringens productor de gangrena gaseosa.. 118. Figura 29: CcpA juega un rol clave sobre la producción de toxinas relacionadas con la gangrena gaseosa en C. perfringens.. 119. Figura 30: Regulación de las toxinas PLC y PFO en C. perfringens Cepa 13.. 123. Tabla 5: Secuencias CRE reportadas en la bibliografía y secuencias halladas por análisis informático en C. perfringens Cepa 13.. 125. Figura 31: Secuencia de las regiones promotoras de los genes pfoA, virU y virT de C. perfringens Cepa 13 (gangrena gaseosa).. 128. Figura 32: Región promotora de plc de C. perfringens Cepa 13.. 130. Figura 33: Regulación de la biosíntesis y funcionalidad del T4P.. 135. Figura 34: Locus génico para la biosíntesis del T4P en P. aeruginosa y M. xanthus.. 136. XIII.

(15) Méndez, 2013.. Figura 35: Arreglo de genes pil en el cromosoma de C. perfringens Cepa 13 causante de la gangrena gaseosa.. 139. Figura 36: Relevancia de los azúcares en el tratamiento de heridas.. 147. Figura 37: Modelo representando la interconexión entre reguladores maestros de virulencia y metabólicos: sistema de dos componentes VirR/S y CcpA.. 149. Figura 38: Esquema que muestra el estudio global de la virulencia de C. perfringens.. 152. XIV.

(16) Resumen. Méndez, 2013.. Resumen. Clostridium perfringens es una bacteria anaeróbica, Gram-positiva, formadora de esporas, responsable de la producción de severas enfermedades histotóxicas y gastrointestinales en humanos y animales. C. perfringens es capaz de producir varias toxinas, dos de las cuales son las principales implicadas en la patología conocida como gangrena gaseosa. Debido a que esta bacteria posee un metabolismo sacarolíticofermentativo y porque la regulación catabólica por carbono está implicada en el control de diferentes comportamientos bacterianos, este trabajo investigó los efectos de la glucosa y otros carbohidratos rápidamente metabolizables sobre la movilidad tipo gliding y la producción de las toxinas fosfolipasa C (PLC) y la perfringolisina O (PFO), fundamentales para el dasarrollo de la gangrena gaseosa. Los resultados obtenidos demuestran que la regulación catabólica por carbono constituye un importante mecanismo regulatorio fisiológico que reduce la capacidad de movilizarse por gliding de la cepa de C. perfringens causante de la gangrena gaseosa (Cepa 13), asi como de un gran número de aislados patogénicos de esta bacteria derivados de humanos y animales. La inhibición del gliding en presencia de glucosa fue debida, al menos en parte, a la represión de genes involucrados en la biosíntesis y funcionalidad del pili tipo IV (T4P), el cual es requerido para la movilidad tipo gliding. El efecto inhibitorio de la glucosa sobre los genes del T4P pilT y pilD se encuentra bajo el control de la proteína regulatoria CcpA (catabolite control protein A). La deficiencia en CcpA en la cepa de C. perfringens mutante en ccpA restaura la expresión de pilT y pilD en presencia de concentraciones represivas de glucosa. La expresión de PLC y PFO en cultivos de la cepa productora de la gangrena gaseosa, Cepa 13, también es reprimida catabólicamente por carbono. La glucosa produce una fuerte inhibición dosis-dependiente del gliding y una reducción de más del 50 % en la producción de las histotoxinas PLC y PFO sin afectar el crecimiento vegetativo del patógeno. La represión de los genes plc y pfoA dependió también de CcpA, ya que una cepa deficiente en este regulador no presenta inhibición de la expresión de PLC en presencia de glucosa 2 %. Además, se observaron dos fenómenos novedosos, por un lado se descubrió que CcpA tiene un rol positivo en la expresión de pilT, pilD y la capacidad de moverse por gliding en ausencia de regulación catabólica. El otro fenómeno fue el efecto negativo que ejerce CcpA sobre la producción de toxinas, debido a que en la cepa deficiente en CcpA, PLC y PFO se expresan en un nivel superior al observado en la cepa salvaje en ausencia de regulación 1.

(17) Resumen. Méndez, 2013.. catabólica. CcpA actuaría, de acuerdo a las condiciones experimentales y fisiológicas de la célula, como un regulador positivo y negativo (en ausencia y presencia de catabolitos, respectivamente) del gliding, siendo un represor de la producción de toxinas en condiciones de regulación catabólica por carbono.. 2.

(18) Introducción. Méndez, 2013.. 1. Introducción.. 3.

(19) Introducción. Méndez, 2013.. 1. Introducción. Todo microorganismo en el planeta tiene como objetivo sobrevivir y multiplicarse para preservarse en el tiempo. Es por esto, que a lo largo de la evolución, las bacterias han colonizado y se han adaptado eficientemente a diversos nichos planetarios. Dentro de la plétora de bacterias, encontramos a las que son patógenas para otros seres vivos como ser plantas, animales y/o para el hombre. Dentro de este conjunto de microorganismos, hay bacterias que no solo poseen la capacidad de sobrevivir y, muchos de ellas, de multiplicarse en nichos abióticos sino que también tienen la habilidad de colonizar y reproducirse en ambientes bióticos ricos en nutrientes (plantas, animales, seres humanos). Para poder establecerse en los distintos hospedadores, las bacterias patógenas poseen estrategias evolutivamente perfeccionadas destinadas a contrarrestar los distintos sistemas de defensa propios de cada blanco biológico, así como para obtener nutrientes a partir de componentes celulares y estructurales del hospedador infectado. Las distintas estrategias de patogenia pueden agruparse tentativamente dentro de las siguientes categorías: las relacionadas con la adherencia del patógeno, las de evasión de los sistemas inmunes, las de obtención de nutrientes y crecimiento, las de colonización, las involucras en la movilidad bacteriana y las de persistencia a largo plazo en el hospedador. Muchas bacterias patógenas tienen la capacidad de adherirse a los tejidos de los hospedadores a quienes infectan. Esta propiedad es muy importante en las etapas iniciales de las infecciones causadas por los microorganismos que presentan esta cualidad. La importancia radica en el hecho de que al adherirse estas bacterias pueden permanecer en el lugar determinado donde pueden prosperar. Luego de esta primera etapa de adherencia tienen lugar distintos mecanismos para asegurar la persistencia en este nicho biológico. Entre ellos encontramos las estrategias para evadir el sistema inmune del hospedador (inhibición de la respuesta inmune, biofilm, cambio de determinantes antigénicos, entrada en el citosol celular, persistencia en macrófagos). Además, mecanismos involucrados en la obtención de los nutrientes del medio circundante para asegurar la proliferación y persistencia bacteriana (toxinas, proteasas y otras enzimas que degradan componentes de matriz extracelular y celulares). Si el microorganismo patógeno logra superar las biodefensas y es capaz de crecer en el medioambiente biológico del hospedador, puede entonces establecerse y de esta manera colonizar el sitio de la infección. El paso siguiente es la diseminación a otros 4.

(20) Introducción. Méndez, 2013.. tejidos y órganos, en este proceso cobra importancia las propiedades de desplazamiento bacteriano. Como último objetivo, principalemente para aquellos microorganismos que no son capaces de proliferar en otros ambientes distintos al del organismo que infectan, la persistencia a largo plazo en el hospedador asegura la supervivencia por tiempos prolongados. De no ser así deben ser capaces de sobrevivir en el medio abiótico lo suficiente para poder contactar con otro hospedador y así poder dividirse e incrementar su número para así persistir.. 1.1. Factores de patogenicidad bacteriana. 1.1.1. Cápsula.. Algunas bacterias sobreproducen y secretan grandes cantidades de polisacáridos de alto peso molecular, llamados exopolisacáridos (EPS). Esta capa de azúcares extracelulares es llamada cápsula. La producción de cápsula es uno de los principales factores de virulencia utilizado por las bacterias para evadir la erradicación desde el sitio de la infección. Especialmente, la cápsula otorga a la bacteria protección del sistema inmune del hospedador así como de los antibióticos (Figura 1A). Algunas cápsulas han mostrado tener efecto inmuno modulador; otras protegen a la bacteria de la fagocitosis evitando que los anticuerpos opsonizantes sean reconocidos por las células defensivas del hospedador (por ejemplo, macrófagos y neutrófilos). Esta fagocitosis frustrada promueve la respuesta inflamatoria ya que los macrófagos y los neutrófilos producen más citoquinas inflamatorias destinadas a eliminar la bacteria. El incremento de la respuesta inflamatoria conduce a un incremento del daño del tejido a medida que más neutrófilos y macrófagos son reclutados en el sitio de infección (Wilson, J. M. et al., 2002). Las especies de bacterias productoras de cápsula más notorias son Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus), Neisseria meningitidis (Meningococcus) y Pseudomonas aeruginosa. La cápsula de Pneumococcus es uno de sus factores de virulencia primarios, utilizando 24 genes para su biosíntesis. Hay al menos 90 tipos diferentes de cápsulas, aunque solo un subgrupo de 23 tipos causan más del 90% de las enfermedades invasivas alrededor del mundo. Las diferencias en la estructura química del polisacárido capsular determinan los serogrupos de Meningococcus. Los serogrupos B, C, Y y W135 expresan cápsulas compuestas enteramente de ácido polisiálico y ácido siálico 5.

(21) Introducción. Méndez, 2013.. unido a glucosa y galactosa, mientras que la cápsula del serogrupo A está compuesto de N-acetilmanosamina-1-fosfato. La cápsula de P. aeruginosa está compuesta de alginato (ácido manurónico y gulurónico acetilado). Las proteínas biosintéticas para alginato han sido elucidados, muchas de las cuales están involucrados en la regulación génica de producción de alginato. La característica única de las cepas de P. aeruginosa es que todas tienen la capacidad génica de producir alginato pero se encuentra más frecuentemente en los aislados de fibrosis quística. Aunque estas cápsulas tienen diferentes composiciones químicas y efectos inmuno moduladores, todas sirven para proteger a la bacteria de la respuesta inflamatoria del hospedador, como ser la activación del complemento y la muerte mediada por fagocitos (Wilson, J. M. et al., 2002).. 1.1.2. Pared celular.. Las bacterias pueden dividirse en dos grupos principales basados en las diferencias en la estructura de la pared celular: Gram-positivas y Gram-negativas (Figura 1B y 1C). Las pared celular de ambos tipos de bacterias contiene componentes tóxicos que son factores de virulencia potentes y tiene un rol central en la patogénesis de bacterias que producen shock séptico (condición frecuentemente letal que involucra el colapso del sistema circulatorio y puede resultar en la falla de múltiples órganos). A diferencia de las toxinas convencionales descriptas más adelante, las cuales son producidas por la bacteria y secretadas al medio circundante (exotoxinas), los componentes tóxicos de la pared celular de procariotas son las distintas estructuras que no son liberadas apreciablemente al medio extracelular sino hasta que la célula muere y se lisa la bacteria. Irónicamente, los antibióticos usados en el tratamiento de las sepsis pueden incrementar la cantidad de componentes tóxicos de pared celular liberados, y por lo tanto impacta negativamente en la recuperación del hospedador. Se cree, que las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas podrían activar vías comunes que conducen al shock séptico (Wilson, J. M. et al., 2002). El shock séptico es el resultado de la acción combinadas de citoquinas, de componentes del complemento y de elementos de la cascada de coagulación. Un evento que gatilla el shock séptico es la liberación de lipopolisacáridos (LPS) u otros componentes tóxicos de la pared celular bacteriana en la circulación. El LPS bacteriano 6.

(22) Introducción. Méndez, 2013.. (también conocido como endotoxina) es una molécula anfifílica embebida en la membrana externa de las bacterias Gram-negativas y se la considera generalmente como el principal componente responsable de la inducción del shock séptico, el cual frecuentemente acompaña a infecciones severas con estos microbios. El receptor primario del LPS en el hospedador es CD14, un marcador celular superficial de los macrófagos. El lípido A, la porción tóxica de la molécula de LPS, causa la liberación de numerosas citoquinas pro-inflamatorias y activa las cascadas de complemento y coagulación. Estudios recientes sugieren que receptores tipo Toll, citoquinas inflamatorias, eicosaniodes, radicales libres, el factor inhibitorio de la migración del macrófago, protein quinasas de señal y factores de transcripción, todos juegan un rol importante en la patología del shock séptico mediado por Gram-negativas (Wilson, J. M. et al., 2002). Mientras que la endotoxina media eventos claramente importantes en la reacción del hospedador durante las infecciones por Gram-negativas, las Gram-positivas pueden producir también el shock séptico y se las considera como las principales responsables de las sepsis nosocomiales. Las bacterias Gram-positivas no tienen endotoxina, pero la sola presencia de estas bacterias en los tejidos y en el sistema circulatorio provoca una respuesta inflamatoria y shock séptico similar a la generada por el LPS de Gramnegativas, siendo liberadas las mismas citoquinas elicitadas por el LPS. Esto se debe, en parte, a que los fragmentos de peptidoglicano y los ácidos teicoicos que se encuentran en la pared celular de las bacterias Gram-positivas elicitan muchas de las respuestas fisiológicas inducidas por el LPS en el hospedador infectado. El peptidoglicano y los ácidos teicoicos (polímeros de azúcares alchool fosfato) son los principales potenciadores del shock séptico. Los componentes tóxicos de la pared celular de Gramnegativas y Gram-positivas actúan principalmente a través de la activación de la respuesta inflamtoria mediante la estimulación de monocitos y macrófagos, y la subsecuente liberación de citoquinas pro-inflamatorias, especialmente del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-) y de la interleuquina-1. Además, tanto la endotoxina como el peptidoglicano pueden activar la cascada de complemento, la cual induce la liberación de TNF- a partir de monocitos y estimula la agregación de netrófilos polimorfonucleares y la vasoconstricción pulmonar. Por lo tanto, independientemente de si la infección es causada por una bacteria Gram-positiva ó Gram-negativa, los signos y síntomas son similares (Wilson, J. M. et al., 2002).. 7.

(23) Introducción. Méndez, 2013.. Las bacterias que frecuentemente están implicadas en el shock séptico incluyen los microorganismos Gram-negativos: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Meningococo;. y los. Gram-positivos:. Staphylococcus. aureus,. Staphylococcus. epidermidis y Streptococco (Wilson, J. M. et al., 2002).. Figura 1: Estructuras generales en bacterias. A) Estructuras microbianas y toxinas implicadas en la patogenia bacteriana. B) Esquema del corte transversal de la pared y membrana celular de bacterias Gram-positivas. C) Esquema del corte transversal de la pared y membrana celular de bacterias Gram-negativas.. 8.

(24) Introducción. Méndez, 2013.. 1.1.3. Toxinas.. Las toxinas son análogas a las armas biológicas, son moléculas proteináceas o no, producidas por las bacterias para destruir o dañar las células del hospedador. Ejemplos de toxinas no proteicas son el LPS (endotoxina) y el ácido teicoico. Las toxinas protéicas (exotoxinas) son generalmente enzimas que son secretadas hacia las células eucariotas por dos métodos diferentes: secreción en el medioambiente circundante (Figura 1A) o inyección directa en el citoplasma a través de sistemas de secreción tipo III u otros mecanismos. La exotoxinas bacterianas pueden ser categorizadas dentro de cuatro tipos principales basados en su composición de aminoácidos y función: toxinas A-B, toxinas proteolíticas, toxinas formadoras de poros y otras toxinas (Wilson, J. M. et al., 2002). Varias especies diferentes de bacterias contienen toxinas A-B, incluyendo P. aeruginosa, E. coli, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae y Bordetella pertussis. Las toxinas A-B tienen dos componentes: la subunidad A que posee la actividad enzimática, y la subunidad B la cual es responsable de la unión y la liberación de la toxina dentro de la célula del hospedador. La actividad enzimática de la porción A va desde la proteolítica (por ejemplo, tétano y botulismo) a ADP-ribosilante (por ejemplo, cólera, pertusis, difteria y la exotoxina A de P. aeruginosa). A pesar del rango de actividades enzimáticas de las porciones A de numerosas toxinas A-B, hay un dinucleótido adenina nicotinamida conservado uniendo porciones en la subunidad A, sugiriendo que podría haber un ancestro evolutivo común (Wilson, J. M. et al., 2002). Las toxinas proteolíticas destruyen proteínas del hospedador específicas, dando algunas de las manifestaciones clínicas características de la enfermedad. Ejemplos de toxinas proteolíticas incluyen: toxina tetánica de Clostridium tetani (Marvaud, J. et al., 1998), la toxina botulínica de Clostridium botulinum (Marvaud, J., Gilbert, K. et al., 1998), la elastasa y proteasa IV de P. aeruginosa. Los blancos para las toxinas tetánica y botulínica son las sinaptobrevinas que previenen la liberación de neurotransmisores, resultando en diferentes tipos de parálisis. Estas dos toxinas también difieren en sus sitios de afección, el botulismo se da por ingestión y causa la parálisis fláccida en nervios periféricos, mientras el tétano se produce por heridas profundas y resulta en parálisis espástica a través del sistema nervioso central. La elastasa y proteasa IV de P. aeruginosa destruyen las proteínas de matriz extracelular permitiendo la diseminación de la infección. La elastasa es un importante factor de virulencia en pneumonía por P. 9.

(25) Introducción. Méndez, 2013.. aeruginosa, mientras que la proteasa IV es importante en las infecciones corneales (Wilson, J. M. et al., 2002). Las toxinas que desestabilizan membranas se encuentran en numerosas especies de bacterias y son capaces de formar un poro en la membrana celular del hospedador, lo cual lleva finalmente a la lisis celular. Hay un número creciente de toxinas formadoras de poro incluidas en la familia RTX (repetición en toxinas, típicamente un nonapéptido rico en glicina y aspartato que uniría iones Ca2+, Linhartová, I et al., 2010) encontrada en muchos patógenos Gram-negativos. Aunque el mecanismo general de la formación del poro y las secuencias son conservadas en la familia RTX, la especificidad por la célula blanco varía. Las toxinas de la familia RTX, además, comparten al sistema de secreción tipo I como método común por el cual son liberadas. Muchas bacterias Grampositivas contienen citolisinas con un sulfidrilo activado. La mejor caracterizada entre estas citolisinas de Gram-positivas es la listeriolisina O, la cual es necesaria para el escape de Listeria monocytogenes del macrófago (Wilson, J. M. et al., 2002). Además de las toxinas A-B, otras incluyen: proteínas tipo inmunoglobulina A (IgA) proteasas, toxinas estables al calor que activan la guanilato ciclasa, y toxinas que modifican el citoesqueleto de la célula hospedadora. Las bacterias son capaces de utilizar muchos métodos diferentes para interferir en las vías de señalización y la integridad estructural de la célula hospedadora para conseguir el establecimiento y mantenimiento de la infección (Wilson, J. M. et al., 2002).. 1.1.4. Adhesinas.. Un paso clave en la interacción patógeno-hospedador es la adherencia del patógeno a la superficie del hospedador. Estas superficies incluyen: piel, membranas mucosas (cavidad oral, nasofaríngea, tracto urogenital), y tejidos profundos (tejido linfoide, epitelio gástrico e intestinal, cerco alveolar, tejido endotelial). Numerosas fuerzas mecánicas producidas por el hospedador actúan para remover los microbios de estas superficies: secreción de saliva, toz, estornudos, movimiento de mucus, peristalsis y el flujo sanguíneo. Un aspecto común de los patógenos microbianos es la expresión de factores de unión a moléculas sobre distintas células del tejido hospedador que le otorgan al microorganismo la capacidad de resistir a los mecanismos de remoción. Una vez unido o adherido a la superficie de una célula hospedadora específica, el patógeno 10.

(26) Introducción. Méndez, 2013.. es capaz de iniciar sus procesos bioquímicos específicas como ser proliferación, secreción de toxinas, invasión de la célula hospedadora y activación de las cascadas de señalización celular, que darán lugar a la enfermedad (Wilson, J. M. et al., 2002). Los factores de adherencia microbianos son llamados adhesinas y pueden ser polipéptidos (proteínas) o polisacáridos (carbohidratos y azúcares). Las adhesinas proteicas son separadas en dos grupos: las fimbriales y las afimbriales. Las fimbrias (también conocidas como pili) son apéndices que protruyen como estructuras similares a cabello desde la superficie bacteriana y están compuestas de proteínas que son empaquetadas apretadamente en un arreglo semejante a un cilindro helicoidal. Una simple proteína sirve generalmente como la principal subunidad fimbrial, sin embargo, otras proteínas también tienen roles estructurales en la punta y en la base de la fimbria. Frecuentemente, la punta fimbrial sirve para unir al receptor celular del hospedador. Los patógenos Gram-negativos, en particular, dependen de fimbrias para adherirse. Los ejemplos incluyen E. coli (para infecciones del tracto urinario y gastroenteritis) V. cholerae, P. aeruginosa y Neisseria spp. Las adhesinas afimbriales hacen referencia a proteínas que sirven como factores de adherencia, pero que no forman una estructura larga y polimérica tipo fimbria. Estas adhesinas no fimbriadas generalmente median más un contacto íntimo entre el patógeno y la célula del hospedador que el llevado a cabo por fimbrias. Las Gram-negativas (Yersinia pseudotuberculosis, E. coli enteropatogénica y Neisseria spp), las Gram-positivas (Staphylococcus spp, Streptococcus spp) y patógenos mycobacteriales expresan adhesinas afimbriales. Las adhesinas constituidas por polisacáridos son generalmente componentes de la membrana celular, la pared celular o la cápsula bacteriana. Los ácidos teicoicos hallados en las envolturas celulares de bacterias Gram-positivas sirven como adhesinas para Staphylococcus spp y Streptococcus spp. Los polisacáridos encontrados en la cápsula de Mycobacterias (glucanos y mananos) son también reconocidos por receptores celulares del hospedador (receptor 3 del complemento y receptor de manosa) y promueven la adhesión (Wilson, J. M. et al., 2002). Aunque las interacciones receptor-ligando durante la adherencia pueden dividirse en dos grupos, proteína-proteína y proteína-carbohidrato, es importante contemplar la diversidad de blancos que los microorganismos usan como receptores del hospedador. Las moléculas que sirven como receptores para bacterias incluyen proteínas que atraviesan la membrana celular, inmunoglobulinas de superficie, glicolípidos, glicoproteínas y proteínas de matriz extracelular (tal como fibronectina y colágeno). En 11.

(27) Introducción. Méndez, 2013.. al menos un caso (E. coli enteropatogénica), el patógeno inyecta su propia proteína receptora en la célula del hospedador. Una vez que se encuentra en la membrana, el receptor une luego a una adhesina afimbrial sobre la superficie de la bacteria. Es importante tener en cuenta que un simple patógeno expresa y utiliza más de una adhesina. Esta estrategia se observa en todos los tipos y especies bacterianas, Gramnegativas, Gram-positivas y Mycobacterias. Dada la importancia de la adherencia en los procesos infecciosos, actualmente gran parte de la investigación en terapias antimicrobianas está focalizada en el desarrollo de vacunas o drogas que bloqueen la etapa de adherencia en el ciclo de la infección (Wilson, J. M. et al., 2002).. 1.1.5. Invasión.. Una vez unidos a la superficie del hospedador, algunos patógenos ganan un acceso más profundo dentro del hospedador para perpetuar el ciclo de infección. Este proceso patogénico, denominado invasión, se puede dividir en dos tipos, extracelular y intracelular. La invasión extracelular tiene lugar cuando el microbio sobrepasa las barreras de un tejido para diseminarse en el hospedador mientras permanece fuera de las células del organismo infectado. Esta es una estrategia usada por el grupo A de Streptococcos -hemolítico y S. aureus. Estas especies secretan varias enzimas que degradan las moléculas celulares del hospedador: hialuronidasas (cortan proteoglicanos en el tejido conectivo), streptoquinasa y staphyloquinasa (destruyen coágulos de fibrina), lipasas (degradan grasas del hospedador acumuladas) y nucleasa (digieren ARN y ADN libre). La hemólisis producida por estas especies lisa no solo los eritrositos sino también otros tipos de células y puede contribuir a la diseminación por los tejidos de hospedador. P. aeruginosa secreta una enzima, elastasa, la cual degrada moléculas extracelulares y permite la invasión de tejido ocacionando queratitis, necrosis tisular y fibrosis quística. Las invasiones extracelulares permiten a estos patógenos acceder a nichos en tejidos donde son capaces de proliferar, expresar toxinas, iniciar respuestas inflamatorias y diseminarse a otros lugares del cuerpo. Hay evidencia creciente que sugiere que los patógenos de invasión extracelular podrían ingresar en las células del hospedador y por lo tanto usar las dos vías de invasión, la extracelular y la intracelular. La invasión intracelular tiene lugar cuando el microorganismo realmente penetra en las células del tejido del hospedador y sobrevive dentro de este medioambiente. Varios 12.

(28) Introducción. Méndez, 2013.. patógenos Gram-negativos, Gram-positivos y Mycobacterias han demostrado tener la habilidad de ingresas a células tanto fagocíticas como no fagocíticas. Algunos patógenos tienen un ciclo de vida intracelular obligado con requerimientos absolutos de las células de mamíferos para crecer; como ser Chlamydia spp, Rickettsia spp y Mycobacterium leprae. Otros patógenos son intracelulares facultativos, usando su habilidad para ingresar y sobrevivir dentro de las células como un medio para su proliferación y diseminación a otros tejidos. Un gran avance en el estudio de la patogénesis bacteriana en los últimos años ha sido la identificación de los genes que permiten al patógeno invadir células no fagocíticas del hospedador. Notoriamente, se encontró que estos genes de invasión, presentes en varios patógenos, codifican proteínas de sistemas de secreción tipo III relacionadas evolutivamente, las cuales sirven para inyectar proteínas de señalización desde la bacteria hacia la célula hospedadora. Las proteínas inyectadas luego activan las vías de señalización propias de la célula hospedadora que hacen que la misma internalice el microbio. Los mecanismos de entrada han sido bien caracterizados en Salmonella spp y Shigella spp. Una particularidad común de la señalización inducida por los sistemas de secrecióninyección tipo III es que provocan un re-arreglo de la actina de la célula hospedadora, lo cual hace que el citoesqueleto celular sea reclutado para engullir al microorganismo invasor. Tanto Salmonella como Shigella activan las proteínas regulatorias de actina, llamadas GTPasas Rho, gatillando las vías de re-arreglo de actina para formar nodos de actina por debajo del patógeno invasor. Este tipo de interacción pone de relieve el fenómeno bioquímico del diálogo entre el hospedador y el patógeno que es esencial para la penetración de la célula hospedadora (Wilson, J. M. et al., 2002).. 1.1.6. Modos de vida intracelulares.. Varios patógenos han evolucionado para sobrevivir y poder reproducirse dentro de las células del hospedador. El rango de células del hospedador en las cuales los patógenos pueden sobrevivir incluyen células no fagocíticas (epiteliales y endoteliales) y células fagocíticas profesionales (macrófagos y neutrófilos). La habilidad de sobrevivir y multiplicarse dentro de las células fagocíticas es de remarcar ya que éstas poseen mecanismos destinados a destruir las bacterias ingeridas. Estos mecanismos de muerte incluyen la producción de intermediarios oxidativos reactivos, la reducción del 13.

(29) Introducción. Méndez, 2013.. pH del interior de las vacuolas conteniendo las bacterias y la activación de proteasas degradadoras. Las estrategias que las bacterias usan para evitar su destrucción a través de estas vías están siendo bien caracterizadas (Wilson, J. M. et al., 2002). Hay tres nichos intracelulares generales en los cuales los patógenos residen: dentro de vacuolas fagolisosomales acídicas e hidrolíticamente competentes, dentro de vacuolas sin fusionarse a lisosomas, y en el citosol de la célula hospedadora. Coxiella burnettis es un ejemplo de un patógeno que es capaz de sobrevivir en el ambiente tóxico de una vacuola fagolisosomal, y se ha demostrado que son necesarios pH bajos para iniciar su replicación intracelular. Mycobacterium spp, Samonella spp, Legionella pneumophila y Chlamydia trachomatis son parte del grupo de patógenos que reside en vacuolas no lisosomales. Las vacuolas ocupadas por estas bacterias son conocidas como “especializadas” o “remodeladas” debido a que generalmente son morfológicamente diferentes de otras vacuolas y contienen una combinación de marcadores de superficie característicos. Shigella flexneri, L. monocytogenes y Rickettsia rickettsii son patógenos que residen en el citosol. Estas bacterias comparten una estrategia común de degradación enzimática de la vacuola que las contiene y se diseminan intracelularmente empleando el citoesqueleto celular (Wilson, J. M. et al., 2002). Las bacterias que sobreviven intracelularmente pueden replicarse y desimanarse dentro de las células en el área local de infección o migrar a otras zonas del cuerpo. Chlamydia y Rickettsia lisan la membrana de la célula hospedadora, liberando las bacterias infectivas que atacan e invaden células adyacentes. Además de la lisis de la célula del hospedador, Shigella y Listeria utilizan una vía de diseminación célula-célula la cual conlleva a la infección de la célula adyacente. Las bacterias que residen en macrófagos y neutrófilos pueden usar a estas células como vehículos para dispersarse sistémicamente a través del sistema circulatorio sanguíneo y linfático. Salmonella typhi, Yersinia spp y Brucella spp se mueven entre distintos tejidos de esta manera. Las bacterias de vida intracelular son particularmente problemáticas en ciertas enfermedades. Algunas infecciones intracelulares pueden persistir por años y requieren una terapia con antibióticos muy extensa, la infección por Mycobacterium tuberculosis es un ejemplo clásico. La investigación actual está focalizada en la identificación y caracterización de los factores de virulencia moleculares que las bacterias intracelulares emplean para ocupar este nicho (Wilson, J. M. et al., 2002).. 14.

(30) Introducción. Méndez, 2013.. 1.1.7. Regulación de los factores de virulencia.. El éxito de un microbio durante la patogénesis recae en su habilidad para censar y responder a la miríada de medioambientes a los que se enfrenta durante la infección del hospedador. Esto requiere el uso de un repertorio de funciones génicas de parte del microorganismo que son independientemente reguladas en respuesta a las señales medioambientelas halladas dentro del hospedador infectado. La regulación de la expresión de los factores de virulencia es muy importante para muchas bacterias patogénicas. Al ir encontrando diferentes microambientes durante el curso normal de la infección, los patógenos deben adaptase rápidamente a los nuevos medioambientes para de esta manera lograr colonizar, sobrevivir y crecer dentro del hospedador. Las bacterias llevan a cabo una intrincada regulación de los factores de virulencia mediante el uso de estrategias comunes como ser los factores sigma alternativos y la regulación coordinada de los sistemas de transducción de señales de dos componentes (Wilson, J. M. et al., 2002).. 1.1.7.1.. Factores sigma.. Los factores sigma son subunidades proteicas de la ARN-polimerasa que controlan la iniciación de la transcripción en la secuencia promotora. Los factores sigma son los principales reguladores de la expresión génica en procariotas. Las bacterias usan diferentes factores sigma para controlar la iniciación específica de la transcripción génica en diferentes promotores, incluyendo aquellos cuyos genes codifican factores de virulencia. En particular, el factor sigma RpoS (38) ha mostrado regular la expresión de genes en respuesta a los cambios durante la fase estacionaria de crecimiento, depleción de nutrientes, estrés oxidativo y osmótico. Estas condiciones medioambientales son fisiológicamente similares a las encontradas por muchos microorganismos patógenos durante el curso de una infección. El factor sigma RpoS es importante para la patogenia de un gran número de bacterias, incluyendo Salmonella typhimurium, E. coli, P. aeruginosa y L. pneumophila (Wilson, J. M. et al., 2002). Otros factores sigma involucrados en la regulación de los genes relacionados con virulencia procariota, son: RpoE (24), el cual responde a estrés periplasmático y ha demostrado ser importante para la virulencia de S. typhimurium; RpoN (54) y AlgU 15.

(31) Introducción. Méndez, 2013.. quienes regulan el fenotipo mucoso de P. aeruginosa; RpoH (32), factor sigma de estrés térmico el cual es relevante en la regulación de la virulencia de Vibrio cholerae; y sigma F, el cual afecta la expresión flagelar en el patógeno respiratorio Bordetella bronchiseptica (Wilson, J. M. et al., 2002).. 1.1.7.2.. Sistemas de dos componentes.. Los sistemas regulatorios de dos componentes consisten de dos proteínas involucradas en la regulación de la expresión, en este caso, de determinantes de virulencia. Típicamente, estos sistemas están compuestos de: una proteína censora embebida en la membrana bacteriana, la cual censa diferentes condiciones medioambientales y fisiológicas de la bacteria; y por un regulador de respuesta, el cual generalmente se une a la región promotora de un gen para activar o reprimir su transcripción (Figura 2). Este tipo de sistemas es responsable del control de muchas funciones diferentes implicadas en la virulencia bacteriana. Se han identificado muchos sistemas regulatorios de dos componentes en bacterias, los cuales están involucrados, por nombrar algunos procesos, en la regulación de la homeostasis del hierro, fosfato, nitrógeno y carbono, producción de cápsula y en la movilidad flagelar. La fracción censora de un sistema de dos componentes generalmente contiene una histidín quinasa que se autofosforila luego de la interacción con la molécula señal. El fosfato derivado del ATP en la quinasa es luego transferido al regulador de respuesta, induciendo en este un cambio conformacional que lleva a la activación del mismo, pudiendo éste unirse o liberarse del ADN promotor. El regulador de respuesta puede interaccionar con la ARNpolimerasa para incrementar la transcripción o se puede unir a la región promotora para prevenir que la polimerasa transcriba el gen debajo. Los factores de virulencia que son regulados por sistemas de dos componentes incluyen por ejemplo: la toxina pertusi de B. pertussis (BvgA/BvgS), la formación del pili y producción de toxina en V. cholerae (ToxR/ToxS), la supervivencia de Salmonella en macrófagos (PhoP/PhoQ), regulación de las porinas de membrana externa en Salmonella y E. coli, la producción de alginato en P. aeruginosa (FimS(AlgZ)/AlgR), las proteínas Yops de Yersinia pestis, y la regulación del hierro en Salmonella y Pseudomonas (Fur). La señal extracelular que es censada por la bacteria a través de estos sistemas es desconocida en muchos casos. Las similaridades entre estos diferentes sistemas de dos componentes podría ser utilizada 16.

(32) Introducción. Méndez, 2013.. para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos que puedan interferir e inhibir el proceso de transducción de la señal (Wilson, J. M. et al., 2002).. Figura 2: Representaciones esquemáticas de dos sistemas de transducción de señales de dos componentes involucrados en la patogenia microbiana. A) Sistema PhoP/PhoQ de Salmonella media respuestas a cambios del entorno y en la sobrevida en el interior de macrófagos. PhoP es la quinasa sensora de membrana que fosforila a PhoQ que es el regulador de respuesta, el cual una vez activo dirije la expresión de diversos genes. B) Sistema ToxR/ToxS de Vibrio cholerae involucrado en la producción de toxinas y pili. ToxS es la quinasa sensora unida a membrana que recibe la señal y activa mediante fosforilación al regulador de respuesta ToxR, el cual se encuentra en la membrana adyacente a ToxS (DiRita, V. J., 1992; Spectora, M. P. y Kenyonb, W. J., 2012; http://2010.igem.org/Team:Tsinghua/project/outline/m2).. 1.1.8. Pili tipo IV.. El pili tipo IV (T4P, type four pili) es un filamento extremadamente fino y muy resistente, ensamblado sobre las superficies celulares de eubacterias y de arqueas. Esta gran estructura constituída por una variedad de proteínas está involucrada en diversos procesos celulares, incluyendo movilidad, conjugación, adherencia, incorporación de ADN exógeno y formación de biofilm (Rakotoarivonina, H. et al., 2002; Averhoff, B. y Friedrich, A, 2003; Klausen, M. et al., 2003: Jurcisek, J. A. y Bakaletz, L. O., 2007; Brown, D. R. et al., 2010). El T4P es el único pili que ha sido identificado en especies Gram-negativas, Gram-positivas y arqueas, lo cual sugiere un origen muy antiguo 17.

(33) Introducción. Méndez, 2013.. (Imam, S. et al., 2011). Esta estructura bacteriana posee funciones esenciales en la patogénesis de varios patógenos humanos. El T4P es altamente dinámico y experimenta ciclos de expansión y contracción. Estas oscilaciones son centrales para las diferentes funciones del T4P. El pili tipo IV es un filamento de 5 a 8 nm de espesor y varios micrones de longitud, típicamente solo compuesto de la subunidad de pilina PilA. Los sistemas de T4P comparten un core central de 10 proteínas que formarían un complejo proteico que atraviesa la membrana bacteriana, con componentes en el citoplasma, la membrana interna, el periplasma y la membrana externa (en bacterias Gram-negativas) (Figura 3) (Burrows, L. L., 2005; Ramboarina, S. et al., 2005; Iman, S. et al., 2011). La elongación del T4P involucra la incorporación de subunidades de pilina desde la base del pili a partir de un reservorio en la membrana interna. La retracción tiene lugar a través de la remoción y transferencia de las subunidades de pilina desde la base del pili hacia la membrana interna (Bulyha, I. et al., 2009). La biosíntesis del T4P ha sido más extensamente estudiada en bacterias Gram-negativas, donde su ensamblado involucra un set de proteínas bien conservadas, codificadas generalmente por el operón pil. El ensamblado de esta estructura requiere de una proteína de membrana politópica (PilC) la cual provee la base para el armado del pili, y una ATPasa similar a VirB11 de Agrobacterium tumefaciens (PilB) que cataliza la polimerización de las subunidades de pilina. Los operones conteniendo los genes que codifican para este core proteico pueden contener, además, genes para proteínas adicionales, como ser el caso de PilM y PilN, involucradas en la formación del complejo de membrana interna para la secreción de proteínas, así como PilQ, la cual forma un poro en la membrana externa de microorganismos Gram-negativos a través del cual las proteínas son transportadas. Análisis de la estrucutra cuaternaria de PilQ muestra que estas proteínas forman un complejo dodecamérico con forma de toroide cuyo diámetro de cavidad interno es de 53°A y 65°A en P. aeruginosa, y de 52°A y 60°A en N. meningitidis (Figura 3) (Mattick, J., 2002). Los operones conteniendo los componentes del pili tipo IV también poseen, comúnmente, los genes codificantes para las pre-pilinas, las cuales contienen un péptido señal amino-terminal tripartita (extremo N-terminal cargado, dominio central hidrofóbico y el extremo C-terminal hidrofílico) responsable de dirigir estas proteínas al sistema de translocasión Sec para ser secretadas a través de la membrana citoplasmática. En contraste a los péptidos señal Sec, los péptidos señal de las pre-pilinas son procesados por PilD, una peptidasa de pre-pilinas que corta una glicina o alanina que precede al tramo hidrofóbico. El resultado de esto es un N-terminal hidrofóbico, 18.

(34) Introducción. Méndez, 2013.. usualmente conteniendo glutamato o aspartato en la posición +5, formando parte del andamiaje que media el ensamblado del pili (Mattick, J., 2002; Imam, S. et al., 2011). Análisis genéticos en P. aerugimosa también han revelado la existencia de genes que codifican proteínas menores similares a pilinas como ser: PilE, PilV, PilW, PilX, FimT y FimU, que contienen la región helicoidal amino-terminal hidrofóbica encontrada en las pilinas principales, las cuales (excepto FimT, que puede ser sustituída por FimU) son requeridas para el ensamblado del pili, la movilidad twitching (ver anglisismos página VI al inicio) y la infección por fagos específicos de pili, aparentemente en una estequiometría correcta. PilV, W y X formarían la estructura de la base del pili a nivel de la membrana interna. PilX funcionaría como ancla o terminador del pili (Mattick, J., 2002). La regulación de las oscilaciones de extensión y contracción de T4P dependen de dos proteínas motoras, PilB y PilT, las cuales son miembros de la superfamilia de ATPasas de secreción (Figura 3). Las ATPasas de secreción son proteínas hexaméricas y dinámicas que usan la energía de la hidrólisis del ATP para la translocación de proteínas y/o ADN a través de membranas. Con la excepción de PilT, todas las proteínas del T4P son necesarias para la extensión del mismo; consecuentemente PilT es solo necesaria para la contracción. La evidencia indica que PilB y PilT funcionan antagonistamente siendo la energía para el trabajo mecánico de la extensión provista por la hidrólisis del ATP en PilB y la de retracción por la hidrólisis del ATP en el motor PilT. PilT promueve no solo la movilidad tipo “twitching” (ver más adelante), sino que esta retracción mediada por PilT del T4P afecta muchos de los aspectos de la biología de este pili. En las especies de Neisseria, por ejemplo, un mutante pilT no es competente para la trasformación por ADN y es incapaz de progresar desde una etapa inicial de adherencia localizada hacia la etapa posterior de adherencia difusa. Además, un mutante en pilT muestra una agregación bacteriana incrementada, lo cual indica que la retracción del pili funcionaría a veces como una fuerza de dispersión (Brown, D. et al., 2010). Un aspecto interesante de la retracción del pili, dependiente de PilT, durante la interacción de N. gonorrhoeae con las células del hospedador, es que la retracción del pili cuando las bacterias están adheridas a la superficie celular, distorsiona y fuerza la membrana celular, estimulando vías mecano-sensitivas que promueve la expresión de genes de estrés y activa la señales cito-protectivas de la célula hospedadora bajo ataque (Howie, H. L. et al., 2005). En Neisseria no solo PilT es importante en la dinámica de síntesis y retracción del pili, sino que el nivel de piliación estaría bajo el control de PilE a nivel transcripcional y por PilC. Las proteínas PilC tienen un rol clave en la regulación de la 19.

(35) Introducción. Méndez, 2013.. piliación previniendo que el pili se retraiga. El modelo propuesto para la actividad de PilC en la dinámica de extensión-retracción del pili contempla que durante la extensión las subunidades de pilina maduras son instaladas en la membrana, luego de ser procesadas por la peptidasa de prepilinas PilD. La fibra creciente es luego traslocada a la superficie bacteriana a través de la membrana externa por la secretina PilQ. La retracción conducida por PilT es prevenida por suficiente cantidad de PilC expresada, la cual actuaría como un clip sobre el pili, debido a la capacidad de esta proteína de unirse al pili. Esto causa un impedimento estérico que evita que la fibra se retraiga. Otra posibilidad que no puede descartarse es que PilC regule la funcionalidad de la secretina de membrana externa PilQ. Durante la retracción del pili, la reducida cantidad de PilC no puede prevenir la acción de PilT (Morand, P. C. et al., 2004). La movilidad dependiente de T4P, denominada como “twitching” (ver más adelante) en Neisseria spp y P. aeruginosa, como movilidad S en Myxococcus xanthus, tiene lugar cuando las células bacterianas se encuentran en una superficie e involucra tres pasos: extención del T4P, adhesión a la superficie y retracción. Mientras que la extención no genera fuerza suficiente para mover la célula bacteriana, la retracción de T4P genera 100 pN, fuerza suficiente para mover la bacteria hacia adelante. Los T4P se retraen independientemente unos de los otros (Bulyha, I. et al., 2009). El patógeno humano Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC, entero toxigenic E. coli) tiene la capacidad de sintetizar un T4P. Este patógeno es una importante causa de diarrea infantil en países en vías de desarrollo, causa de diarrea en viajeros, siendo actualemente un patógeno re-emergente causante de diarrea en Estados Unidos. El pili tipo IV de ETEC es unos de los apéndices de colonización que emplea este patógeno para colonizar el intestino delgado, mostrando estar implicado en las etapas de adherencia temprana a receptores específicos distribuidos en las células epiteliales del intestino delgado. Por otro lado, el pili de tipo IV de ETEC es necesario para la movilidad del tipo “twitching” la cual contribuye a la patogenia de esta bacteria (Mazariego-Espinosa, K. et al., 2010). Los mecanismos moleculares de la biogénesis y las funciones asociadas al T4P permanecen pobremente comprendidos a pesar de los vastos estudios realizados en distintos microorganismos. La primera y probablemente principal razón de esto es la complejidad de este sistema biológico. Desde 10 proteínas (en V. cholerae) hasta 18 (en P. aeruginosa) son necesarias para la biosíntesis del pili. Además, proteínas que no son indispensables para la biogénesis del pili, cuyo número exacto se desconoce, son actores 20.

(36) Introducción. Méndez, 2013.. claves para la biología del T4P, siendo PilT un ejemplo de esto, debido a que no es necesaria para la biosíntesis del pili. La segunda, a veces paradójica, razón para la comprensión fragmentada de la biología del T4P es el hecho de que estos pili han sido estudiados en muchas especies de bacterias. Por lo tanto, fenotipos diferentes y difícilmente compatibles han sido asignados a mutantes con mutaciones en genes con alta conservación de secuencia e idéntica organización genómica. Por ejemplo, mutantes pilU de P. aeruginosa son hiperpiliados y no se mueven por “twitching”, en cambio un mutante en pilU de N. gonorrhoeae presenta una cantidad de pili similar a la cepa salvaje y puede desplazarse por “twitching”, pero tiene alterada la agregación y adherencia a células humanas (Brown, D. et al., 2010). En contraste con las bacterias Gram-negativas, la mayoría de los pili en especies Gram-positivas hacen uso de la vía de la sortasa, la cual reconoce y corta un extremo Cterminal con la secuencia LPXTG, y polimeriza las subunidades de pilina en complejos macromoleculares que son unidos a la pared celular de peptidoglicano. La primera indicación de que las bacterias Gram-positivas poseían estructuras similares a la del T4P fue provista por el sistema Com de Bacillus subtilis, en el cual los péptidos señal de las pre-pilinas son procesados por un homólogo a PilD denominado ComC, produciendo una estructura de superficie de alto peso molecular para la unión de ADN. Además de la principal subunidad estructural ComGC (codificada por el operón com), la biosíntesis del T4P requiere de ComGA y ComGB (homólogos a PilB y PilC, respectivamente) (Figura 3), pero no hay otros homólogos a componentes Pil. A pesar de la importancia de los T4P tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas, la identificación de las pilinas puede ser todo un desafío, debido a que los genes codificantes exhiben poca conservación de secuencia a excepción de los motivos mínimos descriptos arriba, y la caracterización estructural se ve restringida por su baja solubilidad. Muchas de las proteínas tipo pilina de T4P han sido identificadas basándose en su asociación con los genes biosintéticos de los operones pil y com, en conjunción con un posible sitio de corte para peptidasas clase III. Sin embargo, las pilinas del T4P no necesariamente tienen que estar codificadas en el mismo operón que los genes para la biosíntesis del pili (Imam, S. et al., 2011). Se han identificado posibles homólogos de proteínas biosintéticas de T4P altamente conservadas en genomas de bacterias Gram-positivas, usando dos ATPasas tipo VirB11 verificadas experimentalmente (ComGA de B. subtilis y PilB de C. perfringens) y dos. 21.

(37) Introducción. Méndez, 2013.. proteínas politópicas de membrana verificadas experimentalmente (ComGB de B. subtilis y PilC de C. perfringens) (Imam, S. et al., 2011).. Figura 3: Esquemas de las estructuras de los T4P. A) Pili tipo IV de bacterias Gram-negativas, modelado del pili de Neisseria gonorrhoeae. B) Pili tipo IV de bacterias Gram-positivas, modelado del pili de Bacillus sp. NRRL B-14911 (ver Figura 4; Imam, S. et al., 2011). C) Estructura superficial tipo T4P de arquea Sulfolobus solfataricus donde UpsE es parálogo a PilB y UpsA es la pilina. (Sonja-Verena, A. y Pohlschröder, M., 2009).. Se han identificado genes codificantes para probables T4P pilinas en los genomas de 15 especies de bacterias Gram-positivas basado en su asociación con los operones que codifican proteínas biosintéticas del pili (Figura 4). Dentro de estos operones, los genes que podrían codificar para pilinas son identificados comprobando la presencia del arreglo canónico del péptido señal (A/G)X4(D/E). Se han obtenido manualmente 58 pilinas de esta manera, basándose en la proximidad de la secuencia aminoacídica del péptido señal antes descripta al N-terminal, seguida debajo por un segmento de aminoácidos hidrofóbicos (Imam, S. et al., 2011). En el caso de arqueas, análisis recientes han conducido a un mayor entendimiento de la diversidad y biosíntesis de estructuras similares a pili tipo IV en estos microorganismos extremófilos. En Geobacter sulfurreducens el T4P, además de sus roles funcionales típicos de adherencia a superficies y agregación celular, le permite a esta bacteria capturar una significante. 22.

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