INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
“Efecto de la Prolactina en la Función Efectora de las Células NK en Hepatitis C”
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRIA EN CIENCIAS DE LA SALUD
PRESENTA:
MARIA LUISA HERNANDEZ MEDEL
DIRECTORES DE TESIS DC en C. MA DE LA LUZ SEVILLA GONZALEZ
DC en C. JOSELIN HERNANDEZ RUIZ
ÍNDICE
Pagina
Agradecimeinto 5
Glosario 6
Relación de tablas y graficas
8
Resumen 9
Summary 12
Introducción 14
Antecedentes 17
Justificación 25
Objetivos 26
Material y métodos 27
Resultados 37
Discusión 51
Conclusiones 56
Perspectivas 58
Bibliografía 59
Anexos 71
AGRADECIMIENTO
Se agradece al Instituto Politécnico Nacional, Sección de Estudios de Posgrado e Investigación de la Escuela Superior de Medicina, al Hospital General de México, sección de enseñanza e investigación, Unidad de Medicina Experimental de la UNAM “ HIPAM” por el apoyo en la realización de la Maestría en Ciencias de la Salud.
GLOSARIO DE TERMINOS ALB: Albumina
ALT: Alanino aminotransferasa AST: Aspartato aminotransferasa
Citocinas: proteínas producidas por muchos tipos celulares que median las reacciones inflamatorias e inmunitarias, las citocinas son unos de los principales mediadores de la comunicación entre las células del sistema inmune.
CMN: Células mononucleares
CD4: Subpoblación de linfocitos T cuyas funciones efectoras principales consisten en activar a los macrófagos en la respuesta inmunitaria celular y promueve la producción de anticuerpos por las células B en la respuesta inmunitaria humoral
CD8: Célula T que produce citocinas que bloquean la activación y función de otros linfocitos T efectores. Las células T supresoras se identificaron inicialmente como linfocitos de clase CD8.
DED: Dominio de muerte FA: Fosfatasa alcalina
FADD: Dominio de muerte asociado a Fas HCC: Hepatitis Crónica C
GGT: Gammaglutamil transferasa.
INFγ: Interferon gama INF: Interferon beta INFα: Interferón alfa
NK: Célula natural killer. Subpoblación de linfocitos derivados de la médula ósea, diferentes de las células B o T, que actúan en las respuestas inmunitarias para destruir a
las células infectadas por microorganismos mediante mecanismos líticos directo y secretando INF.
PRL: Prolactina
VHC-RNA: Carga viral para virus de hepatitis C.
TRAIL: Ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF
Células Th1: Subpoblación funcional de células T colaboradoras que secreta un conjunto especifico de citocinas como INFγ y cuya función principal consiste en estimular la defensa mediada por los fagocitos contra infecciones especialmente en microorganismos intracelulares.
Células Th2: Subpoblación funcional de células T colaboradoras que secreta un conjunto especifico de citocinas IL-4, IL5, cuyas funciones principales consiste en estimular las reacciones inmunitarias mediadas por IgE por eosinofilos/mastocitos y regulan negativamente la respuesta Th1
TNF: Factor de necrosis tumoral VHC: Virus de hepatitis C
VIH: Virus de inmunodeficiencia humana
Relación de Tablas y Gráficas Tabla 1: Principales características demográficas de los pacientes
Tabla 2: Comportamiento de las principales pruebas de funcionamiento hepático Figura 1: Concentración de Prolactina sérica antes y después del tratamiento con Levosulpiride y Cimetidina
Figura 2: Porcentaje de células NK fase in vivo antes y después del estado de hiperprolactinemia
Figura 3: Expresión de TRAIL sobre la célula NK fase in vivo antes y después del estado de hiperprolactinemia.
Figura 4: Expresión de NKG2D sobre la célula NK fase in vivo antes y después del estado de hiperprolactinemia.
Figura 5: Expresión de Perforina en la célula NK fase in vivo antes y después del estado de hiperprolactinemia.
Figura 6: Expresión de CD16 sobre la célula NK fase in vivo antes y después del estado de hiperprolactinemia.
Figura 7: Comportamiento de carga viral (RNA-VHC) antes y después del estado de hiperprolactinemia
Figura 8: Linfocitos totales antes y después del estado de hiperprolactinemia Figura 9: Porcentaje de las células NK con los diferentes estímulos, fase in vitro Figura 10: Expresión de TRAIL sobre la célula NK, fase in vitro.
Figura 11: Expresión de NKG2D sobre la célula NK, fase in vitro Figura 12: Expresión de CD16 sobre la célula NK, fase in vitro
RESUMEN
Introducción: El virus de la hepatitis C (VHC) es uno de los mayores problemas de salud Pública en México y el mundo, principal, indicación de transplante hepático.
Objetivo: Se analizó el efecto de prolactina como activador de la respuesta de células NK en pacientes infectados con VHC. Se ha descrito cierta asociación entre el embarazo y mejoría en la infección con VHC, que podría ser explicada por la prolactina. Se considera que un estado de hiperprolactinemia moderada podría activar las células NK mejorar la respuesta contra VHC.
Material y métodos: Se incluyeron 11 pacientes infectados con VHC crónica vírgenes a terapia antiviral. Se realizo BH, pruebas de funcionamiento hepático, VHC-RNA basal para establecer daño hepático. Los pacientes recibieron terapia por 2 semanas con Levosulpiride 75 mg al día mas Cimetidina 1600 mg al día, condicionando un estado de hiperprolactinemia moderada. Se analizó en sangre periférica in vivo antes y después de terapia cuantificación de linfocitos totales, VHC-RNA, porcentaje total de células NK, así como la expresión de TRAIL, NKG2D CD16 y perforina en extirpe de NK por citometría de flujo. Adicionalmente un ensayo in vitro con NK en fase basal, se hicieron 4 grupos, 1 control con PBS, grupo 2 con prolactina, grupo 3 con IL-2 y grupo 4 con prolactina + IL2, por 72 hr, evaluando expresión de TRAIL, NKG2D, perforina y CD16, por citometría de flujo, posterior al estimulo
Resultados. Posterior a la terapia con Levosulpiride y Cimetidina, se condiciono un estado de hiperprolactinemia moderada en todos los pacientes, con media, de 37.9 ng/mL, en linfocitos totales se observó incremento con relación a la basal con una p 0.012. En fase in vivo e in vitro el porcentaje de NK no mostraron cambios significativo, la expresión de TRAIL posterior al estado de hiperprolactinemia mostró incremento en todos los pacientes con p 0.003, NKG2D, Perforina y CD16 no
mostraron diferencias significativas, posterior al estado de hiperprolactinemia, en relación a la carga viral antes y después del tratamiento no se observo una diferencia significativa, en el análisis de cada caso observamos una disminución en VHC-RNA en 6 de 11 pacientes.
La prueba estadística utilizada es prueba T para muestras relacionadas. En la fase in vitro, se analizaron 7 pacientes, para la comparación entre grupos se utilizó la prueba
para comparación de varianza ANCOVA. En células NK, bajo los diferentes estímulos control (PBS), PRL, IL-2, IL-2+PRL. En número las células NK no se modifico con una p NS, se observo mayor expresión de estas moléculas de citotoxicidad y reconocimiento como TRAIL, NKG2D y CD16 cuando se estimulo a las células NK con IL-2, IL-2 + Prolactina, en especial la mayor expresión de TRAIL se observo cuando se estimulo a la célula NK con IL-2 + Prolactina con p de .001, la expresión de NKGD2 y CD16 fue mayor cuando se estimulo con IL-2 sola que con IL-2 + Prolactina, con p de .003, p .020.
Conclusión: Con el estado de hiperprolactinemia moderada, inducido farmacológica- mente, se logró activar a la célula NK, lo cual pudo corroborarse con incremento en TRAIL en fase in vivo, ya que esta descrito que las células NK logran tener mayor expresión de TRAIL cuando estas células NK están activadas, y en este estudio posterior al estado de hiperprolactinemia, se logro incremento en su expresión, con p de .005, el porcentaje total del número de células NK posterior al estado de hiperprolactinemia no mostró incremento, con p NS, hubo incremento en número de linfocitos totales con una p de 006. En relación a la carga viral, la prolactina no tiene acción antiviral conocida, sin embargo se observo disminución en 6 de 11 pacientes, pero esta disminución no es estadísticamente significativa. En fase in vitro, no se
observó cambio en número de células NK posterior al estimulo con prolactina con p de .439, cuando se estimulo con IL-2 y con IL-2+ PRL, con p .001.
La expresión de TRAIL, no se observo mayor expresión en células NK, cuando se puso Prolactina solo, TRAIL muestra mayor expresión cuando se combina con IL-2 condicionando un efecto sinérgico con p de .002.
Palabras clave: Hepatitis C Crónica, Prolactina, células NK, TRAIL, NKG2D, Perforina.
SUMMARY
Introduction: The hepatitis C virus (HCV) is one of the biggest problems of public health in Mexico and the world, main indicator of hepatic transplant.
Objective: The effect of prolactin was analyzed as activator of the response of NK cells in patients infected with HCV. A certain association between pregnancy and the improvement in the infection with HCV, which could be explained by prolactin has been described. It is considered that an state of moderate hyperprolactinemia could activate the NK cells and improve the response against HCV.
Material and methods: Eleven patients infected with chronic HCV without prior antiviral therapy. BH was carried out, hepatic functionality tests, basal HCV-RNA to establish hepatic damage. Patients received therapy for 2 weeks with 75 mg of Levosulpiride a day plus 1600 mg Cimetidine a day, conditioning a state of moderate hyperprolactinemia. Quantification of lymphocytes was analyzed in vivo in the peripheral blood before and after the therapy, HCV-RNA, total percentage of NK cells, as well as the expression of TRAIL, NKG2D, CD16, and perforin in extract of NK by flow cytometry. In addition to this an in vitro procedure with NK in basal phase, 4 groups were made, 1 control with PBS, group 2 with prolactin, group 3 with IL-2 and group 4 with prolactin+IL-2 for 72 hours evaluating the TRAIL expression, NKG2D, perforin and CD16 by flow cytometry after the stimulation.
Results: After the therapy with Levosulpiride and Cimetidine, an state of moderate hyperprolactinemia was conditioned in all the patients, with an average of 37.9 ng/mL, in total lymphocytes it was observed an increase with the relation to the basal with a p 0.012. In phase in vivo and in vitro the percentage of NK didn’t show meaningful changes, the TRAIL expression after the state of hyperprolactinemia showed increase in all the patients with p 0.003, NKG2D, Perforin and CD16 didn’t show significant
differences, after the state of hyperprolactinemia, in relation to the HCV-RNA before and after the maneuver no meaningful difference was observed, in the analysis of each case we observed a decrease in HCV-RNA in 6 of 11 patients.
The statistic test used is test T for related samples. In the phase in vitro 7 patients were analyzed, or the comparison between groups the test for comparison of variance ANCOVA was used. In NK cells, under the different stimulations (control-PBS), PRL, IL-2, IL-2+PRL. NK cell number in unchanged with an NS p, was observed stronger expression of cytotoxic molecules and recognition as TRAIL, NKG2D and CD16, when stimulus for NK cells with IL-2 and IL-2 + Prolactin, especially the increased expression of TRAIL was observed when the NK cell stimulation with IL-2 + Prolactin with p of .001, the expression of NKG2D and CD16 was stronger when stimulated with IL-2 only with Il-2 + Prolactin with p de .003, p .020.
Conclusion: With the state of moderate hyperprolactinemia, pharmaceutically conditioned, it was able to activate of NK cell, which was corroborated with the increase in TRAIL in in vivo phase, as it is described that the NK cells are able to have stronger expression of TRAIL when this NK cells are activated and in this analysis after the hyperprolactinemia it was achieved the increase of its expression with a p of .005 . The total percentage of NK cells after the state of hyperporlactinemia did not show increase with p NS, there was no increase in the number of total lymphocytes con una p de .006. In relation to the viral charge, prolactin has no known antiviral although a decrease was observed in 6 of 11 patients but this decrease was not statistically significant. In the TRAIL result, there was no stronger expression in the NK cells when prolactin was put alone. TRAIL shows stronger expression when it is combined with IL-2 + prolactin conditioning a synergic effect with a p of .002.
Keywords: Chronic hepatitis C, NK cells, perforin, TRAIL, NKG2D.
INTRODUCCION
El virus de la hepatitis C (VHC) fue descubierto en 1984 (1) y es la causa más frecuente de enfermedad hepática crónica en todo el mundo, se estima que un 3% de la población mundial tiene infección crónica por VHC. Posterior a la infección por el VHC, se estima que aproximadamente 20% de los casos se presentan como hepatitis aguda y el resto son asintomáticos en esta fase aguda de la infección.
Los mecanismos responsables de la persistencia o cronicidad de la infección por virus de Hepatitis C, así como los factores involucrados en la lesión hepática (efecto citopático) aún no han sido esclarecidos en su totalidad. Aproximadamente el 80% de los pacientes infectados con el VHC evolucionan a la cronicidad y en 20% se observa la resolución de la etapa aguda de la hepatitis (2). Aquellos pacientes con infección aguda por VHC que son capaces de eliminar el virus de la sangre y tienen una hepatitis aguda autolimitada, desarrollan una potente respuesta inmunológica de tipo Th1 (producción de IL-2, IFN-γ, linfocitos T citotóxicos, aumento de la actividad de las células NK, etc.) acompañada de una débil respuesta Th2. Por lo contrario, los pacientes que desarrollan una infección crónica muestran predominantemente una respuesta inmunológica de tipo Th2 (producción de IL-4, IL-10 que favorecen la producción de autoanticuerpos y regulan a la baja la respuesta Th1) (4).
Lo anterior sugiere fuertemente que la presencia y el efecto biológico de citocinas Th1 es fundamental en la protección de la infección por VHC; en tanto que la producción preferente de citocinas Th2 puede tener un efecto inhibitorio de la respuesta inmunológica celular del paciente y por lo tanto, favorecer la persistencia de la infección.
El papel de la Prolactina como una hormona y como una citosina, está fuera de toda discusión (5, 6). En especial, la PRL tiene efectos biológicos muy parecidos a las
citocinas de tipo Th1 (6,7), como su capacidad para estimular la actividad citotóxica de las células NK, activar el factor de transcripción del factor regulador del interferón (IRF-1) e interactuar, o estimular la síntesis de IL-2, IL-12 e IFN- en linfocitos T y en células NK (6,7,8,9,10,11). Además, se ha sugerido que para mantener una inmunocompetencia normal, es necesario mantener la PRL circulante en concentraciones fisiológicas (>20 ng/ml), los valores normales de prolactina son:
hombres 2-18 ng/mL, mujeres no embarazadas 2-29 ng/mL, mujeres embarazadas 10- 209 ng/mL.
La prolactina es un mediador celular que induce la proliferación celular, activa la respuesta inmune, y se ha probado como inmunomodulador en virus de inmunodeficiencia humana (VIH) con efectos positivos en el intento por reconstituir el sistema inmunológico. Hasta el momento poco se conoce a cerca del papel que pudiera tener la prolactina en la infección por el VHC, y la investigación en esta línea nos permitió ampliar el conocimiento de la inmuno-patogénesis de esta enfermedad viral.
Este estudio se realizó en el Hospital General de México, en el periodo de Febrero a Julio del 2010, servicios participantes: Servicio de Infectología unidad 405, y en el laboratorio de hígado, páncreas y motilidad (HIPAM) del departamento de Medicina Experimental de la UNAM. Se incluyeron 11 pacientes infectados con HVC, todos masculinos, con una media de edad de 40.6 años.
El propósito de este estudio fue saber.
1.- La capacidad que tiene la prolactina para estimular a las células NK en número y/o porcentaje.
2.- Evaluar el efecto de la prolactina in vivo, sobre la capacidad citotóxica de células NK y su capacidad de expresión de TRAIL, Perforina y NKG2D en pacientes, antes y después de la terapia.
3.- Evaluar el efecto in vitro, de células NK de pacientes con los diferentes estímulos, PBS (control), Prolactina, Interleucina-2, Prolactina+Interleucina-2, y analizar su proliferación y su a capacidad citotóxica con la expresión de TRAIL, NKG2D y CD16 sobre la NK y secreción de citocinas en el sobrenadante de cultivos.
4.- Si al inducir un estado de hiperprolactinemia moderada en pacientes infectados con HVC se logra disminuir la carga viral a través de la activación de células NK, este estado de hiperprolactinemia se condiciono a través de 2 fármacos, Cimetidina 1600 mg/día y Levosulpiride 75 mg/ día por 2 semanas en pacientes infectados con VHC 5.- Determinar la concentración de prolactina, perfil hormonal, pruebas de funcionamiento hepático, biometría hemática antes y después del tratamiento (basal y después de 2 semanas de tratamiento) en los pacientes infectados con VHC
ANTECEDENTES
El VHC es responsable de aproximadamente 20% de los casos de hepatitis aguda y de un 80% de los casos de hepatitis crónica (2). La hepatitis C crónica (HCC) es la causa más frecuente de cirrosis hepática y de carcinoma hepatocelular en México y el mundo.
Siendo la hepatopatía terminal causada por el VHC la indicación más frecuente para transplante de hígado (3).
Los mecanismos responsables de la persistencia o cronicidad de la infección por virus de Hepatitis C, así como los factores involucrados en la lesión hepática (efecto citopático) aún no han sido totalmente esclarecidos. Aproximadamente el 80% de los pacientes infectados con el VHC evolucionan a la cronicidad y en 20% se observa la resolución de la etapa aguda de la hepatitis (1). Aquellos pacientes con infección aguda por VHC que son capaces de eliminar el virus de la sangre y tienen una hepatitis aguda autolimitada, se desarrolla una potente respuesta inmunológica de tipo Th1 ( producción de IL-2, IFN-γ, linfocitos T citotóxicos, aumento de la actividad de las células NK, etc.), y respuesta especifica a VHC, con TCD4 TCD8, un 10% de todos los linfocitos de sangre periférica, reconocen antígenos de VHC, en esta fase aguda hay reclutamiento de linfocitos TCD4 y TCD8 al hígado coincidiendo con el inicio de lesión hepática incremento de alaninoamino transferasa (ALT), disminución de títulos de VHC y finalmente eliminación de VHC y una débil respuesta Th2.
Por el contrario, los pacientes que desarrollan una infección crónica muestran predominantemente una respuesta inmunológica de tipo Th2 (producción de IL-4, IL- 10 que favorecen la producción de autoanticuerpos y regulan a la baja la respuesta Th1) (4). Donde la respuesta de tipo celular especifica a VHC se describe como ineficiente funcionalmente dañadas y se consideran los siguientes mecanismos, 1.- Células T-VHC especificas están presentes en baja cantidad tanto en sangre periférica como en hígado
de pacientes infectados con VHC crónica, menos de 0.05% de todos los linfocitos de sangre periférica. 2.- Estos linfocitos no proliferan 3.- Los linfocitos son lesionados en su función efectora, debido a un estado de sobreregulación, este daño en la célula T es mas pronunciado en el hígado, sitio de replicación viral, que en linfocitos T de sangre periférica, lo que sugiere que la respuesta inmune adaptativa no es la única que contribuye a progresión de la enfermedad.
Lo anterior sugiere fuertemente que la presencia y el efecto biológico de citocinas Th1 es fundamental en la protección de la infección por VHC; en tanto que la producción preferente de citocinas Th2 puede tener un efecto inhibitorio de la respuesta inmunológica celular del paciente y por lo tanto, favorecer la persistencia de la infección. Si bien, se desconoce(n) la(s) causa(s) de esta diferencia en la respuesta inmunológica temprana del paciente con infección aguda por VHC, se ha propuesto que un desequilibrio entre la respuesta inmune tipo Th1 y Th2 puede estar involucrado en la progresión de la enfermedad, en la patogenía de la lesión hepática y en la incapacidad del paciente para eliminar el virus de su torrente circulatorio (4,13). De hecho, existe una buena cantidad de evidencia clínica, directa e indirecta, que apoya fuertemente esta hipótesis y que demuestra que el paciente con VHC tiene un perfil de citocinas tipo Th2 (14,15,16,17,18,19,20,21); aún más, en pacientes coinfectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el VHC, la administración de IL-2 (Th1) recombinante para el tratamiento del VIH, simultáneamente ocasiona una disminución de la carga viral del VHC (21,22). Curiosamente, los pacientes seropositivos para VHC pero asintomáticos, tienen una respuesta preferente de citocinas tipo Th1 (21).
Considerando esta información, no es de extrañar que se haya propuesto como una estrategia terapéutica el modificar el desequilibrio Th1/Th2 mediante el uso de
citocinas, lo cual pudiese tener implicaciones clínicas en el tratamiento de la infección crónica por VHC. Hasta la fecha, muy poco se ha avanzado en este sentido.
Por otro lado, se ha postulado que las células asesinas naturales (NK por sus siglas en inglés), centrales en la respuesta inmune a VHC, son inhibidas por el virus para evadir la respuesta que elimina el patógeno. Las células NK representan el 5-10% de linfocitos de sangre periférica, se ha observado un incremento en células NK en hígado de modelos de ratón con hepatitis viral. Las células NK son linfocitos que no poseen memoria y por tanto son consideradas parte de la respuesta innata; son capaces de reconocer patrones asociados a patógenos, células malignas, células infectadas con virus y trasplantes (24). La célula NK se activa por el reconocimiento de tres tipos de objetivos; células revestidas de anticuerpos, células infectadas por virus o bacterias intracelulares y células que carecen de moléculas clase I del MHC. A diferencia de otros linfocitos T la célula NK no requiere antígeno especifico para reconocer células infectadas por virus, una vez activada, la célula NK ejerce citotoxicidad y producción de citocinas antivirales como INFγ, factor de necrosis tumoral ( TNFα) y quimosinas, no se sabe con certeza que receptores de activación utilizan las células NK para reconocer las células infectadas con ausencia de anticuerpos.
Las células NK son capaces de montar rápidamente una respuesta efectora contra virus hepatotroficos. Se ha demostrado que en pacientes con hepatitis B, que presentan episodios inflamatorios, donde la célula NK contribuye a lesión hepática vía factor de necrosis tumoral relacionado a apoptosis inducido por su ligando TRAIL mecanismo dependiente. Varios estudios clínicos en pacientes con VHC han demostrado que la función de las NK correlaciona con recuperación espontánea de la infección aguda (25) o con efectividad del tratamiento con IFN en la infección crónica (26,27,28).
Nueva evidencia sugiere que el VHC puede evadir la inmunovigilancia de las NK por medio de múltiples mecanismos, entre ellos, la inhibición directa de las funciones de las NK a través de CD81, la regulación negativa de receptores activadores y reducción de la citotoxicidad, así como la habilidad para producir citocinas y activar células dendríticas.
Por último, numerosos estudios han reportado que las NK están reducidas en número en pacientes con VHC crónica (30).
La capacidad citotóxica de las NK está dada por moléculas inductoras de muerte en superficie como TRAIL e intracelulares como perforina (29) y específicamente TRAIL ha sido relacionado con la respuesta a hepatocitos infectados con VHC (31). En general el papel de la célula NK en infección por VHC no esta bien establecido, estudios inmunogenicos sugieren que diferentes haplotipos de la célula NK tipo receptor de inmunoglobulina (Kira) y sus ligandos HLA influyen en la progresión de la infección por VHC aguda y crónica. (97,98).
Perforina es una proteína que forma poros y es secretada principalmente por linfocitos T citotóxicos activados y células NK, y contribuye a la apoptosis de células infectadas por virus o cancerosas
Prolactina (PRL)
Inicialmente se planteó que la función primordial de la PRL estaba restringida a la glándula mamaria y la lactancia; sin embargo, posteriormente se ha ido reconociendo el pleomorfismo funcional de la hormona en el campo de la reproducción humana, así como en otras áreas. De hecho, se ha demostrado que la PRL tiene un importante papel modulador de la respuesta inmunológica en el humano (33,34,40) no sólo en la respuesta inmune humoral, sino también en la celular (32,35,36,37). Dicha función inmunomoduladora se ejerce a través de mecanismos endocrinos, parácrinos y autócrinos (37). La importancia de esta función de la PRL ha cobrado tal magnitud, que
en los últimos años se ha propuesto su potencial uso clínico como coadyuvante en el tratamiento en pacientes con infección por VIH (38,39,41), después del transplante de médula ósea (12) y aún, en pacientes con cáncer (55) o con diferentes tipos de compromiso inmunológico (7,10). Datos obtenidos de estudios in vivo en modelos experimentales, así como estudios in vitro, han demostrado que la PRL puede tener efectos similares o interactuar con citocinas linfocitarias, las cuales a su vez pueden regular su síntesis en el sitio de la respuesta inmune (5).
El papel de la PRL como una hormona y como una citosina, está fuera de toda discusión. En especial, la PRL tiene efectos biológicos muy parecidos a las citocinas de tipo Th1 (6,7), como su capacidad para estimular la actividad citotóxica de las células NK, activar el factor de transcripción del factor regulador del interferón (IRF-1) e interactuar con, o estimular la síntesis de IL-2, IL-12 e IFN- en linfocitos T y en células NK (6,-8,10,11).
Además, se ha sugerido que para mantener una inmunocompetencia normal, es necesario mantener la PRL circulante en concentraciones fisiológicas (<20 ng/ml), los valores normales de prolactina son: hombres 2-18 ng/mL, mujeres no embarazadas 2- 29 ng/mL, mujeres embarazadas 10-209 ng/mL. Aún más, la PRL puede bloquear la maduración de linfocitos Th2 inducida por los glucocorticoides, por ejemplo, durante una situación de estrés (42).
La muerte celular inducida por apoptosis es indispensable para el funcionamiento normal del sistema inmune, existen 2 vías para inducir apoptosis. 1).- vía intrínseca, 2).- La vía extrínseca, o receptor de muerte, es disparada por miembros de la familia factor de necrosis tumoral (TNF) cuando se unen a sus receptores en la superficie de la célula diana, TRAIL es parte de las proteínas que forman la familia de TNF y pertenece a la subfamilia de ligando responsable de la inducción de muerte por vía extrínseca.
TRAIL es un ligando que puede ser expresado por varias células del sistema inmunológico, como natural killer (NK), linfocitos T (linfocitos TCD4, CTD8), natural killer T ( NKT) macrófagos y células dendríticas. Para que TRAIL se exprese la célula tiene que estar activada, el interferón-γ puede inducir la expresión de TRAIL en la superficie de monocitos, linfocitos TCD4 y TCD8, células dendríticas y NK, TRAIL expresado en la superficie de NK es uno de los mecanismos efectores mas potentes de las NK, TRAIL ha sido implicado en procesos de inmunosupresión e inmunoregulación y funciones efectoras del sistema inmune, en especial en infecciones virales y enfermedades neoplásicas, ha sido demostrada la fuerte inducción de TRAIL en células NK in vivo por acción de INFγ, se considera que uno de los mecanismos de el incremento en la expresión de TRAIL depende de la coestimulación de INF y . (97, 98).
TRAIL puede inducir apoptosis por unión a sus receptores DR4 y DR5, TRAIL – R1(DR4), y TRAIL-R2(DR5) y envía la señal de apoptosis.
La señal inicial de apoptosis es mediada por la unión del ligando TRAIL con su receptos DR4 ó DR5 que se encuentra en la célula infectada en este caso podría ser el hepatocito, esta unión forma un complejo de señalización de inducción de muerte (DISC). El adaptador de moléculas, dominio de muerte asociado a Fas (FADD), trasloca a DISC donde interacciona con el dominio de muerte intracelular (DD), a través de su segundo dominio funcional, el dominio efector de muerte (DED), FADD recluta procaspasa 6 y 10 al DISC donde se auto-catalizan. Esta activación marca el inicio de la cascada de señales dependiente de caspasas. La activación completa de las caspasas efectoras conduce al desdoblamiento de las proteínas de la célula diana, fragmentación del DNA y finalmente a la muerte celular.
El receptor DR4 es un receptor de superficie y es una proteína de membrana tipo 1 denominados dominios ricos en cisteína, homólogas a las que caracterizan el dominio de unión del ligando de otros miembros de la familia del receptor TNF. DR4, fue el primer receptor de TRAIL en ser identificado, funcionalmente es similar a DR-5 ya que su principal papel es la inducción de la apoptosis, se han reportado varias mutaciones en DR4 en células cancerígenas.
El receptor DR5 se expresa en una amplia gama de tejidos, pero esta fuertemente regulada por los linfocitos activados, hay dos formas de DR5, que resultan del “ Splicing” alternativo DR5A/TRICK2A (corta) y DR5B/TRICK2B (largo), se diferencian por la presencia de un aminoácido entre el dominio transmembrana y el inicio de CRDs, ambas isoformas tienen las mismas funciones, se ha reportado que existe una regulación positiva de DR5 en respuesta al tratamiento, contra el cáncer.
Semblanza de infección por el virus de la hepatitis C e inmunodeficiencia humana.
La PRL humana como un potencial agente terapéutico
La situación actual que guarda la hepatitis causada por VHC tiene muchas similitudes epidemiológicas, clínicas, de evolución, de esquemas terapéuticos más o menos satisfactorios no exentos de efectos adversos importantes, la ausencia de un tratamiento altamente efectivo, etc, con la infección por el VIH. En la infección por VIH, después de muchos años de indiferencia científica, se han empezado a hacer descripciones más puntuales sobre la posible participación de la PRL en la fisiopatología de esta entidad.
En esencia, se ha sugerido en humanos con infección por VIH la existencia de una disminución en el tono dopaminérgico hipotalámico (y por lo tanto, una disminución del mecanismo inhibitorio), como un mecanismo de adaptación para mantener la síntesis y la liberación de PRL (tanto de origen hipofisario, como de origen
linfocitario), al nivel máximo posible, para estimular la proliferación y diferenciación de los linfocitos T, en un intento por sobrevivir (39,43). Aun más, varios grupos de trabajo (10, 38,39, 41,44), han propuesto el uso terapéutico de la PRL humana recombinante en pacientes con infección por VIH, como un complemento al uso de drogas anti-retrovirales altamente activas, como una forma fisiológica de ayudar a reconstituir el sistema inmunológico devastado en estos pacientes, aún con cargas virales indetectables en sangre. Es decir, su potencial de efectividad terapéutica se asocia a su capacidad para colaborar en la inducción de una respuesta inmunológica tipo Th1. Esto resulta aún más atractivo de considerar, si se toma en cuenta la función antiapoptótica de la PRL en diversos tejidos y estirpes celulares (47,48) y la ausencia de efectos adversos indeseables durante su administración sistémica en animales de laboratorio (9).
JUSTIFICACIÓN
Actualmente las enfermedades virales a nivel mundial tienen un alto impacto en la salud, en México aproximadamente el 1.4% de la población general esta infectada por VHC. Se considera que la respuesta inmune tiene un papel central en la persistencia de la infección viral. La prolactina es un mediador celular que induce la proliferación celular y activa la respuesta inmune. Hasta el momento poco se conoce del papel que pudiera tener la prolactina en la infección crónica por el VHC en particular sobre la estirpe de NK y su capacidad citotóxica. El presente trabajo tiene la intención de aportar al conocimiento de la inmuno de esta enfermedad viral y al diseño de nuevas estrategias de tratamiento.
HIPOTESIS
Linfocitos NK de pacientes con hepatitis C, bajo un estado de hiperprolactinemia moderada in vivo mostraran mayor expresión de moléculas TRAIL, Perforina, NKG2D y CD16.
Linfocitos NK de pacientes con hepatitis C , in vitro estimulados con PRL, IL-2 y PRL + IL-2 mostraran una mayor expresión de TRAIL, Perforina, NKG2D y CD16 que linfocitos NK sin estimulo.
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el efecto de la prolactina sobre las células NK en pacientes infectados con VHC
OBJETIVOS PARTICULARES
1.- Determinar la capacidad que tiene la prolactina para estimular a las células NK en número y/o porcentaje posterior al estado de hiperprolactinemia.
2.- Evaluar el efecto de la prolactina sobre la capacidad citotóxica células NK de pacientes con hepatitis C crónica, a través de su capacidad en expresar TRAIL, Perforina, NKG2D y CD16, antes y después del estado de hiperprolactinemia
3.- Evaluar el efecto de la Prolactina, Interleucina-2, Prolactina + Interleucina-2, sobre las células NK in vitro a través de expresión TRAIL, Perforina, NKG2D y CD16, secreción de citocinas como IL-2 y INFγ en pacientes con hepatitis C crónica
4.- Determinar la concentración sérica de prolactina, carga viral ( RNA-HVC) y genotipo de HVC, perfil hormonal, pruebas de funcionamiento hepático (PFH) y biometría hemática antes y después del tratamiento (Levosulpiride + Cimetidina) que condicionara hiperprolactinemia moderada, (basal y dos semanas después) en todos los pacientes.
MATERIAL Y MÉTODOS.
Tipo y diseño de estudio
El presente trabajo corresponde a un estudio piloto: Ensayo clínico no controlado Prueba de concepto. Estudio traslacional.
Población y tamaño de muestra
Tamaño de la muestra: teniendo en cuenta que el tipo de estudio es un ensayo clínico no controlado, de antes y después, el cálculo de tamaño de muestra se hizo en base a la formula para estimar una media.
N= (Z )2 s2 i 2
N= (1.96 )2 (3.3)2
_______________________________
0.052
N= ( 3.84) ( 10.89) 0.0025
N= 41.8 0.0025
N= 17 pacientes
Tomando una s de 3.3
Intervalo de confianza al 95%
i = 5
Este es un estudio de prueba de concepto, primero en su clase, por lo que no existen datos reportados en la literatura, se realizó esta formula a manera de ejercicio, con base a que el principal objetivo es condicionar un estado de hiperprolactinemia moderada y condicionar incremento en número o porcentaje de células NK, así como sus funciones de citotoxicidad. NK, el porcentaje en sangre periférica en pacientes con HVC es de 5- 15%, en pacientes con VHC crónica este % de NK esta disminuido. Los valores en población sana de prolactina son 2-18 ng/mL, en un estudio en pacientes con infección por VIH, donde se medio prolactina basal en un grupo control no infectado que reporto una DS de 4.4, y en el grupo infectado con VIH una DS de 3.3, (39) los valores de prolactina oscilaron entre 2-10, tomando en cuenta que el virus de hepatitis C, tiene algunas similitudes con el VIH, se tomo esta desviación estándar de 3.3.
Los resultados de la fase in vivo mostraron una distribución normal y la prueba de contraste de hipótesis que fue utilizada para su análisis es prueba t de Student para 2 muestras relacionadas. Los resultados de la fase in vitro para comparación de diferencias en los 4 grupos se analizó con ANCOVA.
Por motivos de presupuesto y tiempo solo se incluyeron 11 pacientes.
SUJETOS
Se incluyeron 11 pacientes con diagnóstico confirmado de infección por virus de hepatitis C crónica vírgenes a tratamiento antiviral, todos masculinos, (con la finalidad de evitar sesgos en relación a las determinaciones séricas de prolactina en mujeres, considerando lo ya conocido que esta hormona, puede modificar sus concentraciones por diferentes factores, principalmente hormonales).
A todos los sujetos se les dio tratamiento con Levosulpiride 25 mg cada 8 hr y Cimetidina 800 mg cada 12 hr por 2 semanas.
La media de grupo de edad fue 39.2 años, (máximo 50 y mínimo 25 años).
El tiempo de infección de VHC hasta el diagnóstico de la enfermedad presento una media de tiempo de 3.3 años. Se obtuvo el consentimiento informado, voluntario y firmado de cada uno de los individuos participantes en el estudio, el cual se realizo con estricto apego a la Declaración de Helsinki. A todos los pacientes se les realizó una historia clínica detallada
Criterios de inclusión
1.- Pacientes con hepatitis viral C crónica vírgenes a tratamiento.
2.- Sexo masculino 3.- Edad: 18 a 60 años.
4.- No consumo de alcohol.
5.- Con concentraciones séricas de PRL <20 ng/ml.
6.- Ninguno deberá haber estado recibiendo regularmente ningún fármaco conocido que aumente las concentraciones séricas de PRL durante los 4 meses previos al estudio.
Las drogas que inducen secreción de Prolactina son:
- Bloqueadores de receptores de la Dopamina
1. Cloropromazina
2. Metoclopramida
3. Haloperidol
- Inhibidores de la síntesis de Dopamina 1. Alfa Metil-Dopa
- Depletores de Catecolaminas
1. Reserpina
- Antidepresivos tricíclicos
- Inhibidores de la recaptura de serotonina - Estrógenos
- Bloqueadores de los canales de calcio - Antagonistas H2
Criterios de exclusión:
1.- Seropositividad para HBsAg, HBcAg o HBcAb en caso de ser diagnosticados hepatitis C crónica
2.- Evidencia de seropositividad para marcadores inmunológicos predisponentes de enfermedad hepática.
3.- Cirrosis hepática
Criterios de eliminación:
Respuesta nula en el incremento de la concentración de prolactina sérica.
Variable dependiente:
Prolactina Sérica
Porcentaje y/o número de células NK
Intensidad media de fluorescencia para TRAIL, NKG2D, perforina (expresión).
IFNγ. RNA-HVC ( Carga viral), Concentración de citocinas: TNF-α
Variable Independiente
Hepatitis C
Cuantitativa discreta:, Intensidad media de fluorescencia de la expresión de TRAIL, perforina, NKG2D, CD16, RNA-HVC, linfocitos totales, AST, ALT, fosfatasa alcalina
Cuantitativa continua: prolactina, albúmina sérica, tiempo de protrombina, alfa-feto proteína, concentración de citocinas y quimosinas pro-inflamatorias
Procedimiento de toma de muestras
A todos los pacientes se les tomo una muestra de sangre basal de 50 ml antes del tratamiento y una muestra de 40 ml después. En la muestra basal se realizó biometría hemática, pruebas bioquímicas, PFH (AST, ALT, ALP, BT, BD, BI GGT, Albumina, -fetoproteína), TP, TPT. Se determino la carga viral en los pacientes con hepatitis C, antes y después del tratamiento. Además se obtuvo células mononucleares (CMN) para analizar la expresión de TRAIL, perforina, NKG2D y CD16, en la subpoblación de NK por marcaje con anticuerpos monoclonales. Únicamente de la muestra basal se cultivo in vitro células NK y se analizó el efecto directo de PRL sobre estas células.
Ensayos hormonales
A todos los pacientes se les medio la concentración de TSH, T3 y prolactina en sangre al inicio del estudio y posteriormente al termino del tratamiento con Levosulpiride (DISLEP) 75 mg/día de repartido en tres tomas al día (una tableta de 25 mg 15 minutos antes de cada alimento) y Cimetidina (TAGAMED) 800 mg (2 veces al día: una en ayunas y otra antes de la cena).
Se determino valores de prolactina, la TSH y T3, mediante un método inmunoradiométrico, usando estuches disponibles comercialmente (Diagnostics Products Corporation. Los Ángeles, CA, USA). El estuche de PRL ha sido calibrado
contra el estándar WHO 3rd International Standard for PRL 84/500. La sensibilidad del ensayo es de 1.0 ng/mL.
Las muestras fueron tomadas entre las 8:00 AM y las 10:00 AM en 7 tubos de 5 mL con EDTA y 2 tubos de 5 ml sin anticoagulante y 1 de 5 ml tubo con anticoagulante para TP y TPT, en la segunda toma 2 semanas después al termino del tratamiento, se toman 5 tubos de 5 mL con EDTA y 2 tubos de 5 ml sin anticoagulante y 1 tubo de 5 ml con anticoagulante para TP y TPT.
Determinación de la carga viral VHC
La carga viral se determinó en todos los pacientes infectados con HVC, usando el método de COBAS Amplicor (Roche Diagnostics, Alemania), basal y después de tratamiento con Levosulpiride y Cimetidina.
Marcaje in vivo de NK y separación de CMN Fase in vivo
1.- Se obtuvo sangre periférica 6 tubos con EDTA de 5 ml, se centrifugó a 3000 rpm por 10 min
2.- En el tubo se observa la separación; sangre, anillo de CMN y suero, con un pipeta se aspiro el anillo de CMN de cada tubo y se colocó en un tubo Falcón de 50 ml, en total se forma 2-3 cm, se le agregó Buffer de lisis a una relación 1:10 aproximadamente, se colocó en hielo por 10 min.
3.- Se retiró del hielo y se centrifugó a 1500 rpm por 10 min, se eliminó el sobrenadante obteniendo el botón de células, se le agregó 2 ml de PBS y se mezcló.
Se preparó 2 tubos Eppendorf, uno para TRAIL ( T ) y otro para perforina ( P ) con 100µL de la suspensión celular, a cada tubo se les colocó el anticuerpo monoclonal
correspondiente, al tubo T (TRAIL, NKG2D, CD56, CD16) y al tubo P ( CD56, CD16) una cantidad de 3µL, los tubos se colocan en hielo y oscuridad en por 15 min
4.- Se retiran del hielo, a cada tubo se les agregó 500 µL de PBS y se centrifugó a 1500 rpm por 5 min, se retiró el sobrenadante, al tubo T se resuspendió en 200 µL de PBS y se agregó 100µL de formaldehído colocándolo en hielo por 10 min. Al tubo P se le agregó 50 µL de Citofix/citoperm sobre el botón se mezcla y se dejó reposar en hielo por 10 min.
Transcurridos 10 min, al tubo P se le adicionó 200 µL de perwash, ambos tubos T y P se centrifugan a 2000 rpm por 5 min, al tubo T se retira el sobrenadante y resuspende en 250 de PBS y esta listo a leer en el Citómetro de flujo.
5.- Al tubo P, se retiró el sobrenadante y se colocó 50 µL de Perwash y se agregó el ab perforina 3µL, se dejo incubar en hielo y oscuridad por 15 min y máximo 1 día.
6.- Pasado el tiempo se le agregó 200 µL de perwash y se centrifugó a 2000 rpm por 5 min, se retiró el sobrenadante, este paso se repitió por 3 ocasiones.
6.- Después de los lavados con perwash, se resuspendió con 500µL de PBS y se centrifugó a 2000 rpm por 5 min, se retiró el sobrenadante y se resuspendió con 250 µL de PBS y leer en el Citómetro de flujo.
TRAIL TRAIL
Perforina CD56,CD16
Perforina
CD56,CD16
Fase in vitro
1.- De las células restantes, paso #3, (el resto de la solución que quedo después de preparar los tubos T y P de la fase in vivo) en un tubo Falcón de 15 ml, se coloco Ficoll-Hypaque ó Lymphoprep (7-10 ml aproximadamente), se tomó este tubo y se colocó en ángulo de 45o , en una pipeta que contiene el concentrado de células, el cual se vierte sobre Ficoll-Hypaque ó Lymphoprep, primero se puso una gota que abrió paso y de forma muy lenta se vertió todo el contenido de células, se procedió a centrifugar, a 2000 rpm por 20 minutos a temperatura de 20o, con freno de 1.
2.- Después de centrifugar el tubo se obtuvieron 4 diferentes niveles, el inferior es paquete celular, Ficoll- Hypaque, CMN y plasma, con una pipeta se retiró el anillo de CMN y se colocó en un tubo Falcón (aproximadamente 1-2 ml), se agregó PBS hasta 14 ml y se centrifugó a 1500 rpm por 10 min.
3.-Se retiró el sobrenadante, el botón de células se resuspendió y se agrego medio RPBI 4-10 ml para contar células se colocó en hielo mientras se prepara una caja de 24 pozos, donde las células se incubaron con el estimulo correspondiente por 72 hr
4.-En las cajas de 4 pozos se colocaron 4 x106, células ajustando la cantidad de medio de cultivo a 1 ml en cada pozo, 4 pozos para T (TRAIL) y 4 pozos para P (perforina)
Plasma
Cél mononucleares
Ficoll-Hypaque
Paquete celular
Se agregó el estimulo 100 ng/ml de prolactina y 25 ng/ml de IL-2, se incubaron, 72 hr, cada día se observó al microscopio para verificar la viabilidad de las células
5.- Se recolectó el contenido de cada pozo (1 ml) en un tubo Eppendorf, se centrifugó a 2000 rpm por 5 min, se separó y recuperó el sobrenadante para determinación de citocinas.
6.- El botón de células se resuspendió en 50 µL de PBS, y se colocó el anticuerpo correspondientes, a los tubos T se les colocó 3 µL CD56, CD16, NKG2D, TRAIL.
A los tubos P se les coloca CD56, CD16 y se incubó en hielo y en oscuridad
por 10-15 minutos, se les adiciono 500 µL de PBS y se centrifugaron a 2000 rmp 5min, se retiró sobrenadante.
9.- Los tubos T se resuspendieron con 200 µL de PBS + 100 µL de formaldehído y se colocaron en hielo por 10 min, a los P se les adiciono 50 µL de Citofix/Citoperm y incubo en hielo por 10 min, al tubo P se le adiciono 200 µL de Perm/wash y se centrifugaron ambos tubos T y P a 2000 rpm, los tubos T se resuspendieron en 200 µL de PBS se leyó en Citómetro de flujo.
11.-Los tubos P se resuspendieron en 50 µL de Perm/Wash y se adiciono el anticuerpo Perforina en una cantidad de 3 µL, se coloco en hielo mínimo 15 min máximo un día.
PBS P IL-2 IL2+P
T
P
13.- Se resuspendió en 200 µL de Perm/Wash, se centrifugó a 2000 rpm por 5 min, este paso se repitió por 3 ocasiones.
14.- Se resuspendió en 500 µL de PBS y centrifugo a 2000 rpm por 5 min 15.- Se resuspendió en 200 µL de PBS y se leyó en Citómetro de flujo
Cronograma de actividades:
Muestra basal
50 ml Muestra 2 Sem Después
40 ml
BH PFH (AST,ALT
ALB, BT, BI,BD,) PT
IN VITRO
•Cultivos de NK (4 X 106) con PBS PR, IL-2, IL-2+ PRL, ANALIZAR
•Activación de Células NK
•Expresión de TRAIL,NKG2D y Perforina en NK
•Concentración de citocinas (IFN-, TNF-)
ANALIZAR in vivo
•Activación de Células NK
•Expresión de TRAIL,NKG2D y Perforina en NK
•Concentración de citocinas (IFN-, TNF-)
BHPFH (AST,ALT ALB, BT, BI,BD,) PT VHC Ab
RNA-HVC HORMONAS
( PRL, TSH, T3) IN VIVO Separación
de CMN Marcaje NK Para TRAIL, NKG2D, CD16
y perforina
LAB HGM LAB HGM
FLUJOGRAMA DEL ESTUDIO
UME UME
UME
LAB HGM
RESULTADOS
Las principales características demográficas, de los 11 pacientes en estudio presentaron un diagnóstico confirmado de infección por virus de hepatitis C, la media de tiempo de diagnóstico de infección por VHC fue de 3.0 años, el principal factor de riesgo en la adquisición de la infección fue desconocido. La media de edad del grupo fue 39.2 años.
Tabla 1.
Pacientes Edad Tiempo de diagnóstico de HVC
Factor de riesgo
1 44 5 años Desconocido
2 29 3 años Tatuaje
3 42 5 años Desconocido
4 44 2 años Desconocido
5 50 5 años Transfusional
6 48 3 años Transfusional
7 36 3 años Desconocido
8 44 2 años Desconocido
9 43 2 años Desconocido
10 25 1 año Desconocido
11 35 3 años Desconocido
Media 39.2 Media 3.0 años
Tabla 1. Principales características demográficas de los pacientes
El perfil de transaminazas y pruebas de funcionamiento hepático antes y después del estado de hiperprolactinemia, (ALT, AST, GGT), presentaron un incremento 1-3 U/mL (Tabla 2). No mostrando una diferencia estadísticamente significativa, por otro lado, ALB, FA no mostraron cambio significativo alguno.
MEDIA Prueba t de Student
ALT 1 ALT 2
76.3 U/L (VR:14- 63 U/L) 78.1 U/L
0.773 AST 1
AST 2
72.3 U/L (VR: 15-41 U/L) 74.2 U/L
0.608 GGT 1
GGT 2
54.1 U/L ( VR: 7-50 U/L) 60.5 U/L
0.100 ALB 1
ALB 2
3.8 g/dl ( VR: 3.5-4.8 g/dl)
3.8. g/dl
0.523
FA 1 FA 2
100.0 U/L (VR: 32-91 U/L) 99.5 U/L
0. 662
Tabla 2. Comportamiento de las principales pruebas de funcionamiento hepático 1= antes, 2= después, VR: Valor de referencia
Para estudiar el efecto que pudiera tener la prolactina, en el número, capacitad efectora y citotóxica de la célula NK en pacientes infectados con virus de hepatitis C, se
condiciono un estado de hiperprolactinemia moderada, se detecto una concentración de prolactina sérica media basal de 6.0 ng/mL. Dos semanas después, la concentración se incremento con una media de 38.3 ng/ml, después de un tratamiento a base de Levosulpiride 25 mg 3 veces al día y Cimetidina 800 mg dos veces al día por 2 semanas (Fig 1). Se tomaron muestras de sangre antes y posterior al tratamiento.
Concentración de Prolactina Sérica
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
11
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0
PRL antes PRL 2 después
ng/mL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figura 1: Concentración de prolactina sérica antes y después del estado de hiperprolactinemia
Se encontraron diferencias significativas, se utilizo t de Student para muestras pareadas con una p .001. al comparar los resultados de las muestras basales o antes del
tratamiento y después del tratamiento, en el grupo de pacientes. Media de prolactina sérica basal de 6.0 y DS 2.8, media después del estado de hiperprolactinemia 38.3 DS 15.0.
En la muestra basal, se hizo una fase in vivo y una in vitro, en la muestra posterior a las 2 semanas de tratamiento, ya bajo un estado de hiperprolactinemia sólo se realizó la fase in vivo.
Fase in vivo.
De sangre periférica, se realizó la separación de CMN, las Células NK se marcaron con Ab monoclonales, CD56, TRAIL, NKG2D, CD16, perforina, y se leyó la intensidad de florescencia por citometría de flujo.
p .001
Nosotros comparamos cambios en el porcentaje total de células NK y la expresión de TRAIL, NKG2D, CD16, perforina en las células NK a través de la medición de intensidad de fluorescencia en citometría de flujo, en muestra basal y después de dos semanas, ya bajo el estado de hiperprolactinemia.
Los pacientes que lograron un incremento en el porcentaje total de células NK los denominamos respondedores y aquellos que no presentaron cambio alguno como no respondedores.
La media del porcentaje total de NK basal fue de 10.1% y posterior al estado de hiperprolactinemia de 9.5%, un 45% (5 pacientes) presentaron una disminución en el porcentaje de células NK, 36% (4 pacientes) lograron un incremento en el porcentaje de NK, y 19% (2 pacientes) no presentaron cambios. (Fig 2).
Células NK totales
2
2
3
3 4
4
5
5 6
6 7
7 8
8 9
9 10
10
11
11 1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
% NK antes % NK después
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figura 2. Porcentaje de células NK fase in vivo antes y después del estado de hiperprolactinemia.
Se analizo con t de Student para muestras pareadas no encontrando diferencias estadísticamente significativas con una p de .520
p .520
Interesantemente la expresión de TRAIL en células NK posterior al estado de
hiperprolactemia se incremento en todos los pacientes con diferencia significativa p 0.005. (Fig 3). ( media antes 517 DS 716, media después 1337 DS 1312)
Expresión de TRAIL
1 1
3
3
4
4 5
5
6
6 7
7
8 8
9
9 10
10
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
TRAIL antes TRAIL después
MFI
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figura 3: Expresión de TRAIL sobre la célula NK fase in vivo antes y después del estado de hiperprolactinemia.
En la expresión de NKG2D, CD16 y Perforina, sobre la célula NK mostraro diferencias estadísticamente significativas, (figuras 4-6). Se utilizo prueba de t de Student para muestras pareadas para su análisis
p .005
Expresión de NKG2D
1
1 2
2 3
3 4
4
5
5 6
6 7
7 8
8 9
9
10 10
11
11
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
NKG2D antes NKG2D después
MFI
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figura 4: Expresión de NKG2D sobre la célula NK fase in vivo antes y después del estado de hiperprolactinemia.
p .133
Expresión de Perforina
3 3
5 5
6
7 6
7
9 9
10
10
1 11
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Perforina antes Perforina después
MFI
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figura 5: Expresión de Perforina en la célula NK fase in vivo antes y después del estado de hiperprolactinemia.
p .471
Expresión de CD16
1
1 2
2 3
3 5
5
6 7 6
7
8
8 9
9
10
10 11
11
0 5000 10000 15000 20000 25000
CD16 antes CD16 después
MFI
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figura 6: Expresión de CD16 sobre la célula NK fase in vivo antes y después del estado de hiperprolactinemia
En relación a la carga viral, no se encontró una diferencia significativa antes y después al estado de hiperprolactinemia, sin embargo cuando se analizó por caso se pudo observar que seis (54%) de 11 pacientes presentaron una disminución en la carga viral, 3 (27%) de 11 no presentaron cambios y 2 de 11 (18%) incrementaron la carga viral.
(Figura 7).
p .549
Comportamiento de Carga Viral de VHC
1 1
2
2
3 3
4 4
5 6 5
6 7
7 8
9 89
10 10
11 11
1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000
RNA HVC antes RNA HVC después
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
RESP ______
NO RESP
Figura 7: Comportamiento de RNA-VHC antes y después del estado de hiperprolactinemia
El recuento de linfocitos totales en BH, mostró un incremento en todos los pacientes posterior a las 2 semanas de tratamiento.
La media basal del grupo de 1861 DS 664 y 2 semanas después de 2133 DS 765, presentando una diferencias estadísticamente significativa con p de 0.006. (figura 8).
El método estadístico utilizado fue prueba t de Studens para muestras pareadas.
p .615
linfocitos totales
1
1 2
2
3
3 4
4
5
5 6
6
7 7
8
8
9 9
10 10
11
11
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Linf antes Linf después
x10e3/uL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figura 8: Linfocitos totales antes y después del estado de hiperprolactinemia.
Resultados fase in vitro
Para estudiar el efecto que pudiera tener la prolactina sobre la células NK, en su capacidad de incremento en número, activación y expresión de moléculas de citótoxicidad. Células NK fueron cultivadas bajo diferentes estímulos.
Se formaron 4 grupos, grupo 1 control con PBS, grupo 2 Prolactina, grupo 3 Interleucina-2, grupo 4 Interleucina-2 + Prolactina, esta fase solo se realizo con la muestra basal. En esta fase del estudio, se presentaron algunos problemas técnicos en el laboratorio, por lo que se perdieron 4 de 11pacientes, y se presentan los resultados de 7 pacientes.
Ya con las células MNC separadas, en cajas de cultivos de 4 pozos se colocaron 4 x106 células MNC, ajustando la cantidad con medio de cultivo a 1 ml en cada pozo
p .006
A cada pozo se le agrego el estimulo correspondiente (grupo 1-4) .
Ya con el estimulo se incubaron por 72, y posteriormente se marcaron con CD56, TRAIL, NKG2D, Perforina y CD16, y se medio la intensidad de florescencia por citometría de flujo, se separó el sobrenadante para medir IL-2 y Interferón .
Para analizar los cuatro grupos la prueba estadística utilizada fue ANCOVA.
Para analizar el porcentaje (proliferación) total de células NK, se comparó el control ( PBS) con cada grupo bajo los diferentes estímulos PRL, IL-2 y PRL + IL2.
Encontrando diferencia significativa cuando se comparo grupo 1(PBS) con grupo 3(IL- 2) p 0.001 y grupo 1(PBS) con grupo 4(PRL+IL-2) p 0.001. no hubo diferencia significativa en incremento en número de células cuando se comparo grupo 1(PBS) con grupo 2 (PRL) p de .431. (Figura 9).
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0
Porcentaje
1 2 3 4 5 6 7
Pacientes
Células NK con los diferentes estimulos
CNT PRL IL-2 IL-2+PRL
Figura 9: Porcentaje de las células NK con los diferentes estímulos, fase in vitro
Se analizó la diferencia entre grupos, en la expresión de TRAIL en la célula NK, en los 4 grupos. Grupo 1 control (PBS) con grupo 2 ( PRL), no se encontró diferencia
significativa p .101, grupo 1(PBS) con grupo 3 (IL-2) p de .010, grupo 1 (PBS) con grupo 4 (IL-2 + PRL) p de .001. Fig. 10
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000
MFI
1 2 3 4 5 6 7
Pacientes
Expresión de TRAIL sobre células NK
CNT PRL IL-2 IL-2+PRL
Figura 10: Expresión de TRAIL sobre la célula NK, fase in vitro
Cuando se analizó la diferencia, en la expresión de NKG2D sobre las células NK, se realizó por ANCOVA, los resultados obtenidos fueron, grupo 1(PBS) contra grupo 2 (PRL) p de .997, grupo 1(PBS) contra grupo 3(IL-2) p .003, grupo 1(PBS) contra grupo 4(IL-2+PRL) p .013. ( Figuras 11).
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
MFI
1 2 3 4 5 6 7
Pacientes
Expresión de NKG2D sobre células NK
CNT PRL IL-2 IL- 2+PRL
Figura 11: Expresión de NKG2D sobre la célula NK, fase in vitro
Cuando se analizó la diferencia entre grupos, de la expresión de CD16 sobre la célula NK, se aplico una prueba de ANOVA, con los siguientes resultados.
Grupo 1 (PBS) contra grupo 2 (PRL) con p .991, grupo 1 (PBS) contra grupo 3 (IL-2) con p .026, grupo 1 (PBS) contra grupo 4 (IL-2+PRL) p .280. Fig 12.
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000
MFI
1 2 3 4 5 6 7
Pacientes
Expresión de CD16 sobre célula NK
CNT
PRL IL-2 IL-2+PRL
Figura 12: Expresión de CD16 sobre la célula NK, fase in vitro
En esta fase, hubo problemas en el procesamiento de muestras para la determinación la expresión de perforina sobre la célula NK, se obtuvieron resultados parciales, no se completaron todos los resultados por lo que no se pudo realizar la ANOVA.
En el área anexos se encuentra las tablas de la ANOVA donde se analiza la comparación entre los otros grupos.
