UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
© Carolina González de Figueras, 2020
TESIS DOCTORAL
Construcción de una planta transgénica de Arabidopsis thaliana que expresa una declorinasa bacteriana y que
elimina, y degrada el pesticida lindano
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR
Carolina González de Figueras DIRECTOR
Jose Eduardo González Pastor
Madrid
U NIVERSIDAD C OMPLUTENSE DE M ADRID
F ACULTAD DE C IENCIAS Q UÍMICAS
T ESIS DOCTORAL
Construcción de una planta transgénica de Arabidopsis thaliana que expresa una declorinasa bacteriana y que elimina, y degrada el pesticida lindano
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Carolina González de Figueras
DIRECTOR
Jose Eduardo González Pastor
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
TESIS DOCTORAL
CONSTRUCCIÓN DE UNA PLANTA TRANSGÉNICA DE ARABIDOPSIS THALIANA QUE EXPRESA UNA DECLORINASA BACTERIANA, Y QUE ELIMINA Y DEGRADA EL PESTICIDA LINDANO
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR
Carolina González de Figueras
DIRECTOR
José Eduardo González Pastor
Madrid, 2020
Memoria presentada por Dª Carolina González de Figueras, licenciada en Biología, para optar al grado de
Doctor por la Universidad Complutense de Madrid
Madrid, 2020
Director
Dr. José Eduardo González Pastor
Tutor
Dr. Miguel Arroyo Sánchez
Agradecimientos
AGRADECIMIENTOS
Quiero dedicar y agradecer esta tesis a mi familia por todo su apoyo y comprensión con este tema y en resto de mi vida, vuestra ayuda, vuestra confianza, vuestra guía y vuestra paciencia. Gracias por demostrarme vuestro orgullo siempre. Siento que papá no pueda estar aquí para verlo pero sé mamá que disfrutarás por los dos y que él nos acompaña de otra manera.
Muchas gracias Vladi por todo, pero en especial por cuidar tan bien de todos y dejarte los sesos en planes para llevarte a los peques lejos cuando tenía que trabajar, eres un padrazo, lo sabes, te quiero. Gracias por tu amor y tu compañía todos estos años, el camino es más fácil contigo al lado. Gracias a Rodrigo y a Alejandro por su amor incondicional, sus dibujos en los artículos, sus besos y risas y su comprensión, siento el tiempo no compartido. Nuestra vida no ha sido más sencilla desde que llegasteis, pero sí más completa. Maitongui, mamá sé que estáis y siempre estaréis ahí cuando os necesite, gracias por toda vuestra ayuda. Muchas gracias Maite en especial por tu ayuda con la portada, ha quedado estupenda por supuesto. Os quiero y estoy orgullosa de todos vosotros.
Por supuesto quiero darte gracias Eduardo por todo, son ya muchos años juntos y sé que este trabajo ha sido una apuesta personal y un gran esfuerzo para ti. Soy consciente de tus desmanes y tus dolores de cabeza. Gracias por tu confianza, tu guía desde que llegué y montamos el laboratorio juntos, tu apoyo constante, por tu paciencia, por tu forma de decir las cosas, por tu cariño y tu amistad.
Gracias a las “niñas” del laboratorio, las que estáis y las que, aunque ya no estéis in situ seguís apoyando y sosteniendo desde fuera. Es un placer trabajar y/o haber trabajado con vosotras. La vida es más agradable cuando se trabaja a gusto con buena compañía, y “buena”
música. María gracias por tu sonrisa y tu forma de ver la vida, Ale gracias por tu madurez y alegría, Patricia gracias por pensar siempre en los demás y ayudarme siempre, Vero sabes que eres todo un ejemplo, Olga admiro tu forma de explicar las cosas y tu paz y Virginia gracias por tu comprensión y por escucharme en las clases de pintura y tu ayuda siempre. Sara, tu apoyo tecnológico siempre es indispensable muchas gracias. Salvador, trabajar a tu lado ha sido muy motivador antes de que nos abandonaras por el despacho. Gracias al resto del laboratorio también.
Muchas gracias a la Dr. Laura Barrios por su tiempo y su ayuda con la estadística, es un
“mundo” complicado en el que es mucho más sencillo adentrarse acompañado. Gracias por tu paciencia y disponibilidad.
Agradecimientos
Y por supuesto gracias a Antonio Leyva y su equipo por iniciarnos y guiarnos en el aprendizaje de trabajar con plantas. Gracias a todos los que de alguna manera habéis hecho posible esta tesis, gracias Silvia por convencerme y ayudarme, gracias a Piti por tu ayuda y consejos. Olga por todo tu esfuerzo con los geles, siento que al final no salieran. A César y Susana por sus análisis y su tiempo. Y a Pedro, Alejandro y Jesús por la ayuda en la “búsqueda arqueológica”. A Pilar por tenernos las cosas siempre a punto.
Y a Juan Pérez Mercader que apostó por mi en su momento y me dio la oportunidad de entrar en el Centro de Astrobiología.
Gracias a Rogelio y a Juan Ángel de la Unidad de Divulgación del CAB por sus estupendas fotos para las contraportadas.
Gracias a los amigos de siempre y al grupo por crear estabilidad y felicidad en mi vida.
Muchas gracias a todos, de esto, como de muchas otras cosas, tenéis parte de
“culpa”.
Índice
Índice
ABREVIATURAS ... I
ÍNDICE DE FIGURAS: ...III
ÍNDICE DE TABLAS ... IV
ABSTRACT ... 1
RESUMEN ... 3
INTRODUCCIÓN ... 5
1 LINDANO ... 7
1.1 CARACTERÍSTICAS E HISTORIA DE LA PROBLEMÁTICA DERIVADA DE SU EMPLEO COMO PESTICIDA... 7
1.2 EFECTOS DEL LINDANO Y DEMÁS ISÓMEROS DEL HCH EN LOS DISTINTOS ORGANISMOS. ... 10
1.3 NORMATIVA. ... 11
2 DEGRADACIÓN BIOLÓGICA NATURAL DEL LINDANO. ... 12
2.1 DEGRADACIÓN DEL LINDANO POR LA BACTERIA SPHINGOBIUM JAPONICUM (ANTES CONOCIDA COMO SPHINGOMONAS PAUCIMOBILIS)UT26. ... 12
2.2 OTROS MICROORGANISMOS CAPACES DE DEGRADAR EL LINDANO... 18
3 TRATAMIENTOS PARA LA DESCONTAMINACIÓN DE SUELOS CON PESTICIDAS. ... 19
3.1 EVOLUCIÓN DE LOS PESTICIDAS EN SUELOS ... 19
3.2 TECNOLOGÍAS PARA LA DESCONTAMINACIÓN DE PESTICIDAS ... 20
4 ANTECEDENTES DEL EMPLEO DE S. JAPONICUM Y DE LOS GENES LIN PARA LA DESCONTAMINACIÓN DE SUELOS CON LINDANO. ... 26
OBJETIVOS ... 29
MATERIALES Y MÉTODOS ... 33
MATERIALES ... 35
Índice
1 MATERIAL BIOLÓGICO ... 35
1.1 ESTIRPES BACTERIANAS ... 35
1.2 PLÁSMIDOS ... 35
1.3 MATERIAL VEGETAL ... 36
2 CEBADORES ... 37
3 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN ... 37
4 ANTIBIÓTICOS ... 38
5 FOSFINOTRICINA (HERBICIDA) Y LINDANO (PESTICIDA) ... 38
6 MEDIOS DE CULTIVO ... 38
6.1 MEDIO PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS... 39
6.2 MEDIOS PARA EL CRECIMIENTO DE PLANTAS ... 39
MÉTODOS ... 40
1 MANIPULACIÓN Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS Y DE PLANTAS ... 40
1.1 CRECIMIENTO BACTERIANO ... 40
1.2 CONSERVACIÓN DE LAS CEPAS BACTERIANAS ... 41
1.3 CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE PLANTAS ... 41
1.4 CONSERVACIÓN DE LAS SEMILLAS ... 43
2 MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN ... 43
2.1 TRANSFORMACIÓN BACTERIANA ... 43
2.2 TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS ... 43
3 TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR ... 45
3.1 MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS BACTERIANOS ... 45
3.2 MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE PLANTAS ... 49
4 ANÁLISIS FENOTÍPICO ... 53
4.1 ESTUDIO DE LA PARTE AÉREA DE LA PLANTA ... 53
4.2 ESTUDIO DE RAÍCES ... 54
5 ANÁLISIS DE LA DEGRADACIÓN DE LINDANO POR LAS PLANTAS MODIFICADAS ... 55
5.1 CROMATOGRAFÍA DE GASES CON ESPECTROMETRÍA DE MASAS (GC/MS-ECD) ... 55
5.2 IDENTIFICACIÓN DE LINDANO Y SUS PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN MEDIANTE CROMATOGRAFÍA CON MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA DE ALTA EFICACIA (HP-SPME) ... 58
5.3 TRATAMIENTOS ESTADÍSTICOS ... 59
6 FOTOGRAFÍA ... 62
Índice
RESULTADOS ... 63
1 CONSTRUCCIÓN DE PLANTAS QUE EXPRESAN EL GEN LINA DE LA BACTERIA SPHINGOBIUM JAPONICUM UT26S... 65
1.1 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE LINDANO TÓXICA PARA A. THALIANA ... 65
1.2 TRANSFORMACIÓN DE A. THALIANA CON EL GEN LINA ... 66
1.3 TOLERANCIA A LINDANO DE LAS PLANTAS HOMOCIGOTAS DE LA GENERACIÓN T2 ... 70
1.4 DETECCIÓN DE LA PRESENCIA DEL GEN LINA Y DE SU EXPRESIÓN EN LAS PLANTAS TRANSFORMADAS ... 70
1.5 ANÁLISIS FENOTÍPICO DE LAS PLANTAS TRANSFORMADAS CON EL GEN LINA... 74
2 ELIMINACIÓN Y DEGRADACIÓN DE LINDANO MEDIADA POR LAS PLANTAS MODIFICADAS QUE EXPRESAN EL GEN LINA ... 85
2.1 ELIMINACIÓN DE LINDANO DEL MEDIO POR LAS PLANTAS MODIFICADAS ... 85
2.2 IDENTIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN DE LINDANO EN LOS TEJIDOS DE LAS PLANTAS MODIFICADAS, EN EL MEDIO Y EN LA FASE GASEOSA ... 87
3 TOLERANCIA DE LAS PLANTAS MODIFICADAS AL LINDANO PRESENTE EN SUELOS CONTAMINADOS ... 93
DISCUSIÓN ... 97
1 LAS PLANTAS QUE EXPRESAN LINA SON RESISTENTES AL LINDANO. ... 100
2 LAS PLANTAS QUE EXPRESAN LINA ELIMINAN Y DEGRADAN EL LINDANO DEL MEDIO... 104
2.1 MODELO DE LA RUTA DE DEGRADACIÓN DE LINDANO EN PLANTAS QUE EXPRESAN LINA ... 111
3 FITORREMEDIACIÓN ... 113
3.1 LIBERACIÓN DE 1,4-DCB,1,2,4-TCB Y -PCCH POR LAS PLANTAS MODIFICADAS QUE DEGRADAN LINDANO Y SU EFECTO TÓXICO. ... 114
3.2 PROBLEMA DEL EMPLEO DE PLANTAS QUE EXPRESEN LINA EN EL MEDIO AMBIENTE ... 117
3.3 ESTRATEGIAS PARA OPTIMIZAR LA DEGRADACIÓN DE LINDANO EN SUELOS MEDIANTE PLANTAS QUE EXPRESEN EL GEN LINA. ... 118
CONCLUSIONES ... 121
BIBLIOGRAFÍA ... 125
ANEXO ... 147
Abreviaturas
I
ABREVIATURAS
1,2,4- TCB
1,2,4-triclorobenceno
1,4- TCDN
1,3,4,6-tetracloro-1,4- ciclohexadiano 2,5-
DCHQ
2,5-diclorohidroquinona
2,5-DCP 2,5-diclorofenol 2,5-
DDOL
2,5-dicloro-2,5-ciclohexadieno- 1,4-diol
A.I.C. Criterios de Información Akaike (selección modelos estadísticos) A600nm Absorbancia a 600nm
ACAT Alaska Community Action on Toxics ADN Ácido desoxirribonucleico
ADNc ADN complementario
Basta 4-(hidroxi-(metil)-fosfinol)-DL- Homoalanina /glufosinato de amonio
BHC Hexaclorobenceno (~ HCH) BSA Albúmina de Suero Bobino CaMV Virus del mosaico de la coliflor CAS Servicio de Resúmenes Químicos
(Chemicals Abstract Service) CB Clorobenceno
CCM Colección de Microorganismos (República Checa)
Chr Cromosoma
CNB Centro Nacional de Biotecnología Col-0 Columbia-0 (ecotipo)
CT Ciclo umbral
Ct Extremo de una proteína carboxilo terminal
DCB Diclorobenceno
DMSO Dimetil sulfoxido
dNTPs 2'-desoxinucleósido trifosfatos (solución con mezcla equimolar de dATP, dCTP, dGTP y dTTP)
EDTA Ácido Etilen Diamin Tetracético EEA Agencia Europea de Medio
Ambiente (European
Environmental Agency) EF-1α Factor de elongación 1α
F (test F) Test F de Levene (paramétrico de homogeneidad de varianza) FAM-490 Fluoresceína
FW Forward (oligo dirección lectura de 5' a 3')
G+C Guanina+Citosina
GC/MS Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (gas chromatgraphy-mass
spectrometry) GC/MS-
ECD (GC- ECD)
Cromatografía de Gases Masas y espectrometría de masas acopladas con Detector de Captura de Electrón (Electron Capture Detector)
GFP Green Fluorescente Protein
PCCH -pentaclorociclohexano HCH Hexaclorociclohexano His Histidina
HP-SPME (SPME- GC-MS)
Microextracción en Fase Sólida de Alta Eficacia sin espacios vacíos (High Performance Solid-Pphase Microextraction )
IARC Agencia del Investigación del Cáncer/Agency for Research on Cancer
ID Diámetro
Abreviaturas
II IHPA Asociación de Profesionales de la
Salud Independientes/
Independent Health Professionals Association
IS6100 Secuencia de Inserción 6100 kDa kiloDalton (unidad de masa
atómica) Km Kanamicina LB Luria-Bertani
m/z Relación masa carga (m/Q) mRNA ARN mensajero
MS Murashige and Skoog
MTCC Colección de Cultivos Microbianos Tipo y banco de genes (India) Nt Extremo de una proteína amino-
terminal, NH2-terminal, extremo amina
OCPs Pesticidas organoclorados
OGM Organismos Genéticamente Modificados (o GEMs)
ORFs Marco de lectura abierta o marco abierto de lectura (Open Reading Frame)
p/v peso/volumen (p/v)
PANNA Pesticide Action Network North America
pb pares de bases
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
PDMS Polydimethylsiloxane
Pfu Polimerasa encontrada en la arqueobacteria hipertermófila Pyrococcus furiosus
pH Grado de acidez o basicidad de una solución acuosa
Pm Peso molecular
POPs Pesticidas Orgánicos Persistentes
PPT DL-fosfinotricina
qPCR PCR cuantitativa o a tiempo real r.p.m Revoluciones por minuto
rev (RV) Reverse (oligo con direccion de lectura inverso 3' a 5')
Rif Rifampicina
RLe Raíces Laterales emergidas sp.nov. especie nueva (nova)
t tonelada
Taq Polimerasa producida por la bacteria Thermus aquaticus (T-aq) TBE Tampón cuya composición
contiene Tris-Borato-EDTA TCB 1,2,4-triclorobenceno
T-DNA ADN de Transferencia (ADN transferido de plásmido inductor de tumores Ti de A. tumefaciens) TIFF Formato de archivo informático
para almacenar imágenes (Tagged Image File Format)
Tris Tris(hidroximetil)aminometano (HOCH2)3CNH2
tRNAs ARNs de transferencia
Tween Monolaurato de polioxietilen- sorbitan/ mmonolaurato de polietilenglicol sorbitano (CAS9005-64-5)
US EPA (USEPA)
Agendia de Protección del Medio Ambiente de EEUU/United States Environmental Protection Agency UT26T "T" cepa tipo (type strain)
v/v volumen/volumen
WHO Organización Mundial de la Salud WT Cepa control (Wild Type)
III
ÍNDICE DE FIGURAS:
FIGURA 1. Estructura de los isómeros de HCH.
FIGURA 2. Localizaciones de zonas de alta contaminación con HCH.
FIGURA 3. Ruta de degradación del γ-HCH en S. japonicum UT26.
FIGURA 4. Esquema de los procesos que sufren los pesticidas en el medio ambiente.
FIGURA 5. Esquema de las distintas técnicas de descontaminación de suelos con pesticidas.
FIGURA 6. Técnicas de fitorremediación.
FIGURA 7. Esquema del vector p-CAMBIA 3500.
FIGURA 8. Resultados de calibración del termociclador para qPCR para nuestro ensayo (curva de fusión, curva estándar y del de agarosa).
FIGURA 9. Crecimiento de las plantas WT en medio MS suplementado con distintas concentraciones de lindano.
FIGURA 10. Diagrama de la región T-DNA de los distintos vectores utilizados.
FIGURA 11. Selección de plánulas en MS con lindano.
FIGURA 12. Crecimiento de plantas WT, LIN-A5.1, LIN-C2.1, LIN-C10.1 en MS suplementado con distintas concentraciones de lindano.
FIGURA 13. Electroforesis de gel de agarosa PCR del ADN de las plantas.
FIGURA 14. Electroforesis en gel de agarosa de RT-PCR del gen linA
FIGURA 15. Niveles de expresión del gen linA en las plantas transformadas. qPCR.
FIGURA 16. Gráfico de diagrama de caja del análisis estadístico del área de las rosetas.
FIGURA 17. Detalle de las hojas de las rosetas de cada línea de plantas en cada concentración de lindano probada.
FIGURA 18. Gráfico de diagrama de caja del análisis estadístico de la densidad radicular.
FIGURA 19. Gráfico de diagrama de caja del análisis estadístico del área radicular.
IV
FIGURA 20. Resultados del crecimiento vertical de plantas tras una semana después de trasplantar plántulas crecidas durante otra semana sin lindano y en horizontal.
FIGURA 21. ANOVA one-way de los valores obtenidos de pesticida en las placas contaminadas con HCH tras dos semanas de crecimiento de las distintas líneas de plantas modificadas y WT.
FIGURA 22. HP SPME junto con GC/MS de tejidos de plantas.
FIGURA 23. HP SPME combinada con GC/MS de parte gaseosa o volátil.
FIGURA 24. HP SMPE combinada con GC/MS de agar contaminado con lindano.
FIGURA 25. Crecimiento en tierra wt vs LIN- A5.1.
FIGURA 26. Crecimiento en tierra wt vs LIN- C2.1.
FIGURA 27. Esquema de las posibles degradaciones del lindano.
FIGURA 28. Ruta de degradación propuesta por Quintero y colaboradores (2005) en condiciones de anaerobiosis.
ÍNDICE DE TABLAS
TABLA 1. Antecedentes de la situación actual del lindano.
TABLA 2. Genoma de S. japonicum UT26
TABLA 3. Estirpes bacterianas utilizadas en este trabajo
TABLA 4. Lista de oligonucleótidos
TABLA 5. Enzimas de restricción.
TABLA 6. Antibióticos de selección empleados.
TABLA 7. Soluciones de fosfinotricina y lindano.
TABLA 8. Secuencia del gen linA.
TABLA 9. Condiciones de PCR para la obtención del gen linA.
V
TABLA 10. Condiciones de la PCR para amplificación del gen linA a partir del ADN genómico de las plantas modificadas.
TABLA 11. Condiciones de PCR para amplificar el gen linA a partir de cDNA.
TABLA 12. Condiciones para qPCR.
TABLA 13. Parámetros de las curvas estándar para las dos líneas de investigación de este trabajo.
TABLA 14. Eficiencia de transformación de A.thaliana.
TABLA 15. Pruebas con las distintas líneas seleccionadas de la generación T1.
TABLA 16. Valores de inducción de la expresión del gen linA.
TABLA 17. Tabla de efectos fijos lll de los valores de la roseta.
TABLA 18. Tabla de estadístico descriptivo de los valores de densidad radicular.
TABLA 19. Tabla de estadístico descriptivo de los valores del área radicular.
TABLA 20. Resultados medios finales de cantidad de lindano en medio MS suplementado con HCH técnico.
VI
Abstract
1
ABSTRACT
Hexachlorocyclohexane (HCH) is an organochlorine compound produced synthetically by reacting benzene with chlorine in the presence of ultraviolet light. Of the 8 possible isomers, only the γ-HCH has insecticidal activity and was named lindane, which is purified by a very inneficient process. Before the end of the 1940s, it was already produced and used on a large scale due to its low price and broad spectrum of action. Lindane has been used as an agricultural pesticide, for seed cleaning, treatment of livestock parasites, in human health (for treatment of lice and scabies), and also for the control of pest and insects that transmit diseases such as malaria.
This pesticide was used massive scale between the years 1950-1970, despite the fact that it is harmful effects on human health and the environment were already being studied. From the 1970s, restrictions started and its use gradually decreased until it was banned in at least 52 countries after the Stockholm convention in 2010 (nowadays 184 countries had been united it).
Japan was the first country to ban it in 1973, followed by others such as the United States, China and the European Union, although it is still being produced in India. At first, it was thought to be an effective and harmless pesticide but now it has become one of the largest ecological and human health problems. It had been included in Group 1 where the most dangerous pollutants are because of this carcinogenesis to human an animals (IARC, 2019). The isomers that were discarded in the lindane production process and the stored pesticide (all toxic, persistent and bioaccumulative), were stockpiled under very low security conditions in what is known as white mountains, which favors their release into the environment, contaminating soils, rivers and aquifers and therefore, entering the food chain. The volatilization of the compound has produced a dispersion from the warm areas where it was manufactured to the colder ones, producing global contamination (from the areas of production and use to the poles, high mountains and oceans). Due to its extension and toxicity, it is urgent to find a definitive, economic and sustainable solution.
This doctoral thesis work focuses on the construction of a plant capable of helping to decontaminate soils contaminated with this pesticide, through the insertion and expression into the plant genome of the bacterial gene linA, which is at the beginning of the lindane degradation pathway in the Sphingobium japonicum UT26 strain isolated soils contaminated with this compound in Japan. Thanks to molecular biology, we can design and create an organism that contains and expresses genes from another species in order to improve the initial organism to
Abstract
2
use it as a decontamination tool. It is therefore proposed to use a phytodegradation strategy to remove lindane from contaminated soils by using a modified plant that degrades this compound.
For this, the following objectives were proposed: i) insertion and expression of the S. japonicum UT26 linA gene in the model plant Arabidopsis thaliana. Construction of three different variants of the plant, one with the wild-type gene and the other two with a sequence that encodes a tail of six histidines at the Ct and Nt ends of LinA (these labels have a biochemical application and could allow the detection of the LinA protein in the modified plants); ii) evaluation of the resistance to lindane of plants expressing linA (in artificial media and in contaminated soils); iii) phenotypic characterization of plants modified in response to the pesticide; iv) analysis of compounds resulting from the degradation of lindane by the modified plants, those accumulated in their tissues and those released in the growing medium and in the atmosphere.
The results obtained have shown that the introduction and expression of the linA gene and its linA-Ct6xHis variant in A. thaliana (LIN-A and LIN-C plants), allow them to grow correctly both in artificial medium and in soil, under conditions of lethal lindane concentration for the wild plant.
Furthermore, it was found that the modified LIN-A and LIN-C plants could effectively remove lindane from the artificial medium in which they were grown, and transform it into compounds less harmful to the environment and human health, pentachlorohexene and mainly dichlorobenzene, which were detected by the HP-SPME (High Performance-Solid Phase MicroExtraction) technique coupled with CG-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) in the plant tissues, in the culture medium and in the air surrounding the plants.
In summary, this modification of the plant confers resistance to lindane, making possible the in situ degradation of this compound, so it could be used as a tool to eliminate the diffuse contamination of lindane in soils in which other classic methods are unthinkable due to their high cost. The A. thaliana plant that expresses the linA gene constitutes a proof of concept or prototype, and to use this phytoremediation strategy in soil decontamination effectively, this gene would have to be expressed in other more robust plant species, long-lived and with a greater root system, which are also capable of stimulating the diversity and abundance of microbial communities to cooperate in the lindane mineralization.
3
RESUMEN
El hexaclorociclohexano (HCH) es un compuesto organoclorado producido de forma sintética al reaccionar el benceno con el cloro en presencia de luz ultravioleta. De los 8 posibles isómeros sólo el -HCH tiene actividad insecticida y se denominó lindano, que es purificado mediante un proceso muy ineficiente. Antes de que acabara la década de los 40 ya se producía y utilizaba a gran escala por su bajo precio, eficacia y amplio espectro de actuación. El lindano se ha utilizado como pesticida agrícola, para la limpieza de semillas, tratamiento de los parásitos del ganado, en salud humana (para tratamiento de piojos y sarna), y también para el control plagas y de insectos transmisores de enfermedades como la malaria.
Este pesticida se empleó de forma masiva entre los años 1950-1970, a pesar de que ya se empezaban a estudiar sus efectos nocivos en la salud humana y en el medio ambiente. A partir de la década de los 70 empezaron las restricciones y su uso fue disminuyendo paulatinamente hasta que se prohibió en, al menos 52 países tras la convención de Estocolmo en el 2010 (a la que en la actualidad se han adscrito 184 países). El primer país que lo prohibió fue Japón en el 1973, seguido por otros como EEUU, China y la UE, aunque todavía en India se sigue produciendo. Lo que un principio parecía un pesticida efectivo que no suponía ningún riesgo para la salud, ha pasado a convertirse en uno de los problemas ecológicos y de salud humana de mayor envergadura. El IARC lo ha incluido en el Grupo 1, donde se encuentran los contaminantes más peligrosos, por ser cancerígeno para el hombre y para los animales (IARC, 2019). Los isómeros que se descartaban en el proceso de producción de lindano, junto con los depósitos del pesticida, (todos tóxicos, permanentes y bioacumulativos) se almacenaron en condiciones de ínfima seguridad en lo que se conoce como “montañas blancas” favoreciendo su liberación al medio ambiente, contaminando suelos, ríos y acuíferos y por tanto introduciéndose en la cadena trófica. La volatilización del compuesto ha producido una dispersión de zonas cálidas donde se producía hacia las más frías, lo que ha conllevado una contaminación global (desde las zonas de producción y uso hasta los polos, altas montañas y océanos). Debido a su extensión y toxicidad resulta urgente encontrar una solución definitiva, económica y sostenible.
Este trabajo de tesis doctoral se centra en la construcción de una planta capaz de ayudar a descontaminar los suelos contaminados con este pesticida mediante la inserción y expresión en el genoma de la planta modelo Arabidopsis thaliana del gen bacteriano linA que está en el inicio de la ruta degradativa del lindano en la cepa Sphingobium japonicum UT26 aislada de suelos contaminados con este compuesto en Japón. Gracias a la biología molecular podemos diseñar y crear un organismo que contenga y exprese genes de otra especie con el fin de conseguir
4
mejorar el organismo inicial para usarlo como herramienta de descontaminación. Se propone por tanto explorar la estrategia de fitodegradación para eliminar el lindano de suelos contaminados, empleando una planta modificada que degrade este compuesto.
Para ello se plantearon los siguientes objetivos: i) inserción y expresión del gen linA de S.
japonicum UT26 en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Construcción de tres variantes diferentes de la planta, una con el gen silvestre y otras dos etiquetadas con una secuencia que codifica para una cola de seis histidinas en los extremos Ct y Nt de LinA (estas etiquetas tienen una aplicación bioquímica pues podrían permitir la detección de la proteína LinA en las plantas);
ii) evaluación de la resistencia a lindano de las plantas que expresan linA (en medios artificiales y en suelos contaminados), y de su capacidad de eliminar lindano del medio; iii) caracterización fenotípica de las plantas modificadas en respuesta al pesticida; iv) análisis de los compuestos resultantes de la degradación del lindano por las plantas modificadas, las acumuladas en sus tejidos y las liberadas al sustrato de cultivo y a la atmósfera.
Los resultados obtenidos demuestran que la introducción y expresión del gen linA y de su variante linA-Ct6xHis en A. thaliana (construcciones LIN-A y LIN-C, respectivamente), le permiten crecer correctamente tanto en medio artificial como en suelo, en condiciones de concentración de lindano letales para la planta sin modificar. Además, se pudo comprobar que las plantas modificadas LIN-A y LIN-C podían eliminar eficazmente el lindano del medio artificial en el que se cultivaban, y lo transformaban en compuestos menos nocivos para el ambiente y la salud humana (pentaclorociclohexano y diclorobenceno principalmente) que se detectaron mediante la técnica de HP-SPME (microextracción en fase sólida de alta eficacia) combinada con GC-MS (cromatografía de gases- espectrometría de masas) en los tejidos de la planta y en el medio de cultivo y el aire circundante a las plantas.
En resumen, esta modificación de la planta le confiere resistencia a lindano, posibilitando la degradación in situ de este compuesto, por lo que podría utilizarse como herramienta para eliminar la contaminación difusa de lindano en suelos en los que otros métodos clásicos resultan impensables debido a su alto coste. La planta de A. thaliana que expresa el gen linA constituye una prueba de concepto o prototipo, y para el empleo de esta estrategia de fitorremediación en la descontaminación de suelos de forma efectiva, habría que expresar este gen en otras especies de plantas más robustas, longevas y con mayor sistema radicular, que además sean capaces de estimular la diversidad y abundancia de comunidades microbianas que cooperen en la mineralización del lindano.
5
INTRODUCCIÓN
6
Introducción
7
1 Lindano
1.1 Características e historia de la problemática derivada de su empleo como pesticida De acuerdo con la agencia de protección del medio ambiente estadounidense (U.S.
Environmental Protection Agency 2019) un pesticida se define como “cualquier sustancia o mezcla de ellas ideada para prevenir, destruir, repeler o mitigar cualquier plaga” (insectos, ratones u otros animales, malas hierbas o microorganismos).
El hexaclorociclohexano (HCH), también conocido como hexaclorobenceno (BHC), es un hidrocarburo organoclorado, un compuesto orgánico sintético, que pertenece al grupo de los pesticidas no iónicos y aparece en la lista prioritaria de contaminantes de la USEPA (U.S.
Environmental Protection Agency, 2013). Fue sintetizado por primera vez en 1825 por M.
Faraday al hacer reaccionar benceno (producto que acababa de descubrir) con cloro en presencia de luz (Smith, 1991). En esta primera reacción se obtiene una mezcla conocida como
“hexaclorociclohexano técnico” (Nº de Registro CAS 608-73-1) compuesta por 8 isómeros (α (+,-), β, , δ, ε, , -HCH) según la orientación de los átomos de Cl en cada molécula (Fig. 1), 4 de los cuales (α, β, δ y -HCH) son tóxicos y contaminantes recalcitrantes. Van der Linden aisló el isómero -HCH varios años después (1912), pero hasta mediados de los años 30 no sería identificado como el único “principio activo” del HCH y nombrado como “lindano” en honor a su descubridor (Matolcsy et al, 1988).
Figura 1: Estructura de los isómeros de HCH. Se diferencian por la posición axial o ecuatorial de los átomos de Cl (α, β, , δ y ε son los más importantes, mientras que eta y theta son menos comunes). Fuente (Lal et al, 2010).
Introducción
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La producción del lindano resulta muy ineficiente ya que ese isómero supone tan solo entre un 10-12% del HCH comercial (Li et al, 2003), para ser comercializado debe purificarse hasta conseguir -HCH con un 99% de pureza (Nº de Registro CAS. 58-89-9), desechando el resto que no muestra actividad insecticida (Langenhoff et al, 2002) y produce un olor y sabor desagradable que impiden su uso agrícola (Vijgen et al, 2019). Se ha estimado que de cada tonelada (t) de lindano producida se generan de 8-12 t de desechos compuestos por los otros isómeros de HCH.
El lindano una vez purificado es un sólido cristalino de gran densidad (Pm 290,83 g/mol), tiene baja solubilidad en agua, alta solubilidad en grasas, es bastante hidrofóbico y posee un olor muy característico. Al igual que el resto de isómeros de HCH presenta un punto de fusión alto (112- 113ºC) y tiene baja presión de vapor de saturación (Willett et al, 1998). Es muy estable a la luz, al agua caliente, al calor o la oxidación y a los ácidos, debido a los enlaces C-C, C-H y C-Cl. Todo ello hace que, dentro de los distintos grupos de pesticidas, los organoclorados (OCPs) (en los que se incluye el lindano) sean los más tóxicos y tengan una gran persistencia en el medio ambiente (Abhilash et al, 2013a; Köhler & Triebskorn, 2013), con una vida media estimada de 708 días en suelo y 2292 días en agua (Beyer & Matthies, 2001).
Los pesticidas tuvieron un gran auge después de la 2º Guerra Mundial (Gavrilescu & Chisti, 2005), en el caso del lindano su eficiencia, rápido efecto, fácil producción y bajo coste, extendieron su uso y fabricación por todo el mundo durante décadas entre 1950 y 2000 llegándose a producir más de 10.000.000 t (Li, 1999) (incluyendo el pico de producción de los años 60 y principios de los 70). Principalmente utilizado en agricultura, siendo Europa (con España entre los mayores consumidores) y América responsables del 69% del consumo total (Ali et al, 2014), también se usó para el control de plagas, ganadería y en la industria farmacéutica contra ectoparásitos (tratamiento de sarna, piojos y malaria entre otros) (Li et al, 1998; Vijgen, 2006). China e India se encuentran en la cabeza de producción (WHO, 1994), aunque también se obtuvieron grandes cantidades en EEUU, Europa y la antigua Unión Soviética (Breivik et al, 1999).
El consumo de lindano, con distintos nombres y formatos, ha ido fluctuando a lo largo del tiempo. Paradójicamente los picos de producción han coincidido con la prohibición del uso del compuesto en algunas regiones. La cantidad del compuesto liberado al medio empezó a disminuir a partir de 1983 debido al descenso mantenido de la producción, alcanzando niveles muy bajos a partir de 1995. A pesar de ello ha sido el pesticida más empleado durante décadas (Navarro et al, 2019; Vijgen et al., 2019) y, pese al descenso en el consumo, el problema no ha desaparecido en la actualidad. Ya en el 2011 se consideraba que globalmente sólo para
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agricultura se habían destinado 450 kilotoneladas (Kt) de lindano (Vijgen et al, 2011) y se estimaba que si se incluyeran también lo utilizado en ganadería, salud humana y uso doméstico se añadirían otros 150 kt más, lo que supondría una cantidad de desechos del resto de isómeros de HCH que rondaría los 4 -7 millones de t (Weber & Varbelow, 2013). Sólo en Europa, la Agencia Europea de Medio Ambiente (EEA) estima que hay 3 millones de sitios contaminados, de los cuales 250.000 estarían altamente contaminados y necesitarían una solución inmediata (European Environment Agency, 2007; Gillespie & Philp, 2013) y que en el 2050 el número de sitios contaminados que necesitarán tratamiento ascenderán a más del 50 %.
Hay que tener en cuenta que encontramos dos focos claros de contaminación (Lal et al., 2010):
En las zonas de producción. El desconocimiento de su toxicidad llevó a depositar los deshechos de manera incontrolada alrededor de las fábricas por todo el mundo en pilas o vertederos abiertos (muchos ilegales) conocidos como “montañas blancas”, o enterrados (PANNA, 2008; Vijgen, 2006; Weber et al, 2008). Los derrames y operaciones de desecho rutinarias también contribuyeron a aumentar la contaminación de fábricas y del suelo limítrofe a ellas más contaminado que el resto de áreas (Fang et al, 2016). Se estima que hay entre 1,6 y 4,8 millones de toneladas de residuos globales de HCH (Fig. 2).
Figura 2: localizaciones de zonas de alta contaminación con HCH basada en mapa de (Lal et al., 2010) y datos de PE 571.398, 2016.
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Contaminación difusa en el medio ambiente con bajas concentraciones de HCH debido a su uso como insecticida y a la dispersión de los vertederos. Su uso directo contra plagas ha contaminado los suelos de uso agrícola o ganadero y sus alrededores. Además, el almacenamiento abierto al aire libre ha facilitado la dispersión y volatilización del compuesto por el aire (Ukalska-Jaruga & Smreczak, 2020; Vijgen et al., 2011; Weber et al., 2008) debida al Efecto de Destilación Global que implica un movimiento de contaminantes desde regiones cálido-templadas hacia latitudes altas, donde el descenso de la temperatura provoca el depósito del compuesto volatilizado (Walker et al, 1999). Desde los años 1980 se han detectado rastros en muestras de aire, suelo, vegetación, y agua en la Antártida, el Océano Pacífico, en el Ártico, alta montaña…etc (Lal et al, 2008; U.S. Environmental Protection Agency, 1980; Willett et al., 1998). El calentamiento global agrava esta situación al aumentar la disipación del lindano del suelo de forma directa al aumento de la temperatura (Tripathi et al, 2015a).
1.2 Efectos del lindano y demás isómeros del HCH en los distintos organismos.
Los distintos isómeros del HCH se pueden acumular en microorganismos, invertebrados, peces, pájaros y mamíferos, suponiendo un peligro para todos ellos y para el ser humano (Abd Al- Rahman, 2012; Hussain et al, 2015; Vega et al., 2016). La mayor difusión del pesticida viene por la exposición derivada del consumo de alimentos contaminados, especialmente pescado, carne y leche, o incluso, agua (IHPA, 2016; Vega et al., 2016; Vijgen et al, 2018; Wycisk et al, 2013).
El lindano se ha clasificado como carcinogénico y disruptor endocrino, con efectos mutagénicos, genotóxicos y teratogénicos (Luo et al, 2016; Muñiz et al, 2017). El reglamento europeo (CE) 1272/2008 clasifica al lindano con toxicidad aguda oral (categoría 3), de inhalación y cutánea (categoría 4) y en órganos determinados por exposición repetida (categoría 2), con efectos a través de lactancia y con toxicidad acuática aguda y crónica (categoría 1). En humanos se ha observado que produce ataxia, desorientación, temblores, ataques y muerte; además, exposiciones crónicas al compuesto pueden afectar al corazón e hígado y ocasionar problemas neurológicos (sistema nervioso central), de inmunosupresión y cáncer (Nolan et al, 2012). Su exposición se relaciona con cáncer de mama, próstata, colon recto, estómago, pulmón y vejiga (Abolhassani et al, 2019; Jayaraj et al, 2016; Mortazavi et al, 2019) y con el linfoma no hodgkiniano (IARC, 2015). Se puede acumular en el cerebro y otros órganos por su lipofilidad, al igual que en la placenta (Luo et al., 2016); estudios recientes señalan también una relación entre la exposición a productos químicos clorados en el desarrollo de sobrepeso y riesgo de diabetes
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por una desregulación del mecanismo de la glucosa y disrupción de homeostasis lipídica (Henriquez-Hernandez et al, 2017).
Sabemos que este compuesto además afecta al medio ambiente: el HCH inhibe las reacciones de oxidorreducción en microorganismos del suelo, así como en bacterias amino- y metano- oxidantes (Singh & Kuhad, 1999), puede inhibir la actividad enzimática y afecta directamente a la riqueza, estructura y diversidad bacteriana según su concentración (Sun et al, 2019). Inhibe el crecimiento de la fauna del suelo (Mohamed et al, 2011; Shi et al, 2007) y excita el sistema nervioso central de los insectos diana (Agrahari et al, 2019) hasta matarlos. En las plantas tiene una toxicidad moderada con efectos negativos en la germinación, crecimiento y desarrollo inicial de diferentes especies (Calvelo Pereira, 2008; Kostoff, 1948); además de desestabilizar los principios vitales de la planta afectando a su desarrollo y fisiología, y alterando así la distribución de la biomasa, la fotosíntesis, los procesos celulares…etc (Audus, 1976).
1.3 Normativa.
Desde que se confirmó la toxicidad del lindano (y se descartó que el resto de isómeros fueran inertes) se ha restringido paulatinamente su uso de forma irregular en los distintos países productores y consumidores (tabla 1).
Tabla 1. Antecedentes de la situación actual del lindano
Año Hitos relacionados con el empleo de lindano Fuente
Evidencias de impacto negativo en el medio ambiente Efectos negativos en el hombre
Restricciones de consumo
Prohibición en Japón Li, 1999
Prohibición general en EEUU (no como pesticida ni uso farmaceútico)
USEPA 2006
U.S. Food and Drug Administration, 2009
Prohibición en China Li, 1999
2007 Prohibición en EEUU para uso agrícola U.S.EPA, 2006
2008 Phohibición integral en UE Vega et al., 2016
2009 Prohibición de lindano para uso agrícola y producción. UNEP, 2009
α-HCH, β-HCH y γ-HCH se añadieron con los “nuevos POPs” Vijgen et al., 2011, 2013 Prohibición de todo uso, a excepción farmaceútico, en al menos 52
países
además de Europa.
C.N.524.2009.treaties-4, Stockholm Convention, 22/05/2011
179 naciones ratifican este acuerdo Secretariat of the Stockholm Convencion, 2014b India único productor continuando contaminación Vijgen et al., 2011; Tripathi, 2014
Sigue permitido en algunos estados de USA U.S. Food and Drug Administration, 2009 Sigue permitido en China (para gestión de bosques y control de plagas
domésticas) Yang, Yu et al. 2016
Uso en África e India (para uso local, control de malaria y para exportar) Bajaj and Singh, 2015 2017 WHO incluye el compuesto en la lista de carcinogénicos. Grupo 1 Singh and Singh, 2019
Actualización europea de sito contaminados con HCH y depósitos (1,8- 3 millones de t)
Nueva acción denominada Acción 15 donde “se deberían identificar los sitios contaminados por POPs para su remediación ”
Falta de objetivos claros con fechas límites para la eliminación de HCH Vijgen et al., 2019 Asamblea 1 marzo, UN declara 2021-2030 "Decada de restauración de
ecosistemas" http://www.unenvironment.org/
China prohibe su producción, circulación, apliacación y exportación e
importación Wang, 2019
2020 Ratificación del convenio de Estocolmo por 184 países http://chm.pops.Int/Countries/StatusofRatifications /PartiesandSignatoires/tabld/4500/
European Commission, 2019 2014
2016 Década 50 Década 70 1979-82
2019
Calvo Pereira, 2008
2010
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La mayoría de las regulaciones se desarrollan considerando el riesgo en la salud humana en zonas residenciales, comerciales o industriales, siendo en las primeras las más restrictivas (Jennings & Li, 2015), y además, teniendo en cuenta la exposición del hombre al suelo contaminado por contacto, inhalación o ingestión. A pesar de esto sólo un cuarto de los países han definido unos valores críticos a partir de los cuales se necesita una acción correctora (o valores guía de regulación) para los cuales no hay consenso en la jurisdicción internacional, promulgando cada país sus leyes (Li, 2018) con una variación de hasta 10 órdenes de magnitud entre unos países y otros.
Los países firmantes de la Convención de Estocolmo establecen como prioritario el desarrollo de un método efectivo también desde el punto de vista económico que los elimine de forma global (Dubey et al, 2014). Los esfuerzos por remediar el problema del lindano son progresivos, pero en los últimos 30 años los datos europeos apuntan a una eliminación de tan sólo 80.000 zonas contaminadas (Gillespie & Philp, 2013). Todavía no se ha establecido un tiempo límite para eliminar el lindano, en gran parte debido al alto coste que conlleva su destrucción que, ni industria ni gobiernos, están dispuestos a asumir. Por el momento la solución más utilizada es el aislamiento en vertederos controlados que supone entre un 1-10 % tan sólo de los gastos de excavación y destrucción, una solución que no es tal pues tan solo pospone el problema (Vijgen et al., 2019), que puede seguir aumentado por el uso ilegal de estos plaguicidas en varios países (Kafaei et al, 2020; Khuman et al, 2020). El cambio climático que conlleva un aumento de las inundaciones contribuirá también a aumentar la difusión de este pesticida a los ríos cercanos a las plantas de producción (Plan Estratégico de las Tecnologías de la Información, 2016) lo que hace acuciante afrontar el problema.
2 Degradación biológica natural del lindano.
2.1 Degradación del lindano por la bacteria Sphingobium japonicum (antes conocida como Sphingomonas paucimobilis) UT26.
Tan sólo 60 años después de la primera liberación de lindano al medio (Li et al., 2003; Walker et al., 1999), se aislaron numerosas cepas bacterianas en distintos lugares geográficos, capaces de degradar el compuesto de manera aerobia (Lal et al., 2010). Ya en 1989, se identificaron más de sesenta aislados en suelos contaminados de diferentes partes de mundo capaces de degradarlo (Senoo & Wada, 1989; Yamamoto et al, 2009). Estas cepas pertenecían en su mayoría a la familia Sphingomonadaceae (con casi la mitad del total de representantes degradadoras del compuesto provenientes de Japón, India, Francia, Alemania, España, China…), aunque también se han
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caracterizado otras de géneros tan distantes como Microbacterium, Bacillus (Lal et al., 2010), Pseudomonas o Pandoraea (Sun et al, 2015) y filos como Cyanobacteria.
La química refractaria de la molécula de HCH llevó a la necesidad evolutiva de conseguir una ruta degradativa uniendo enzimas individuales de forma coordinada, esto es posible gracias a que los distintos genes están localizados en plásmidos y/o elementos móviles como secuencias de inserción (Davison, 1999). La complejidad de los isómeros del lindano añade otro punto de dificultad encontrando diferencias entre las reacciones que catalizan su eliminación, sobretodo en condiciones aerobias (Lal et al., 2010). De los 8 isómeros de HCH, sólo los isómeros α y γ-HCH pueden ser mineralizados completamente por las cepas degradadoras, los demás se transformarán en otros metabolitos menos tóxicos pero todavía recalcitrantes (Bala et al, 2012;
Geueke et al, 2013). En la actualidad, sólo se ha encontrado una ruta de degradación de HCH, mediada por los genes lin, con ejemplos tanto en la familia Sphingomonadaceae como fuera de ella (Lal et al., 2010). La reacción clave de esta ruta es la deshalogenación de compuestos halogenados que consiste en la eliminación de átomos de cloro, responsables de la toxicidad y el carácter xenobiótico del compuesto, reemplazándolos por un hidrógeno o un grupo hidroxilo.
Con esto se consigue reducir tanto el carácter recalcitrante del compuesto como el riesgo de la formación de intermediarios tóxicos como consecuencia de los pasos metabólicos (Camacho- Perez et al, 2012).
La ruta degradativa se identificó inicialmente en la cepa UT26T, también denominada MTCC 6362T o CCM 7287T (Lal et al., 2010; Nagata et al, 2007). Designada en un principio con el nombre de Sphingomonas paucimobilis, tras un cambio taxonómico, basado en los resultados obtenidos de la secuenciación de genes 16S ARNr, hibridación ADN-ADN y electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), esta cepa se dividía en tres especies distintas reclasificándolas como Sphingobium japonicum sp. nov. UT26, S. francense Sp+ y S. indicum B90A en relación con el lugar del aislamiento (Pal et al, 2005). Todas ellas han sido caracterizadas en términos genéticos y de bioquímica de la degradación de HCH (Bala et al., 2012; Lal et al., 2010; Nagata et al., 2007).
S. japonicum sp. nov. UT26 fue descubierta a finales de los años 80 en Japón (Senoo & Wada, 1989), en suelo contaminado anualmente con γ-HCH durante 15 años. Es una bacteria Gram- negativa, de color amarillo, con forma bacilar, aerobia, mesofílica, no formadora de esporas y sin motilidad. Es capaz de utilizar α-, γ- y δ-HCH (no β-HCH) como única fuente de carbono y energía en aerobiosis (Imai et al, 1989; Pal et al., 2005; Senoo & Wada, 1989). UT26 es una bacteria “especialista” para la degradación de un determinado número de compuestos (Stolz, 2009) como el lindano y otros compuestos recalcitrantes extremos (dioxinas, herbicidas
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clorados, compuestos de lignina, hidrocarbonos poliaromáticos y polietilenglicol). No obstante la capacidad de Sphingomonas para adaptarse a degradar tantos compuestos recalcitrantes puede estar favorecida por dos características:
su inusual composición de la membrana externa, que contiene glucoesfingolípidos en lugar de lipopolisacáridos (White et al, 1996), lo que le proporciona una superficie altamente hidrofóbica que facilita la asimilación de compuestos de estas características tales como HCH y otros hidrocarbonos (Kawahara et al, 1999)
la transferencia génica horizontal: los genes de degradación están asociados a secuencias de inserción como la IS6100 (Lal et al, 2006; Nagata et al, 2011) que pertenece a la familia IS6, capaz de movilizar genes replicándose y dejando una copia en el sitio original (Mahillon
& Chandler, 1998).
El genoma de S. japonicum UT26 consiste en 5 replicones circulares y aparece en la tabla 2.
Tabla 2: genoma de S. japonicum UT26
Replicón Nombre pb G+C (%) ORFs Observaciones
Cromosoma Chr1 31514.822 64,8 3.529 Principal por contener el mayor número de genes esenciales.
Cromosoma Chr2 681.892 65,9 589
Plásmido pCHQ1 190.974 63 224
Plásmido pUT1 31.776 63,7 44
Plásmido pUT2 5.398 61 8
(Gil et al, 2004; Nagata et al, 2010).
La ruta degradativa de lindano esta mediada por los genes lin (15 genes lin en total) que se encuentran dispersos en los dos cromosomas y en el plásmido pCHQ1 (Nagata et al, 2006). Los genes específicos de la ruta de conversión en sí (hasta β-cetoadipato, Fig. 3) están localizados en regiones únicas del genoma de UT26 (linA se encuentra en Chr1), mientras que el resto de genes lin se localizan en otras regiones conservadas de Sphingomonas. Todos los genes lin parecen necesarios para degradar el lindano. Por una parte linA, linB, linC, linRED y linF son específicos de conversión de -HCH a β-cetoadipato (Nagata et al., 2011). Por otra, linGHIJ son responsables de la vía β-cetoadipato. Y por último, los genes linK, linL, linM y linN forman parte del sistema de transporte y se sospechan implicados en la integridad de la membrana exterior de la bacteria y en la utilización del lindano por la misma [confiriéndole mayor tolerancia frente a los metabolitos tóxicos resultantes de la degradación, como el 2,5-DCP (Endo et al, 2005;
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Nagata et al, 1993b)]. Esta cepa cuenta con una copia de estos genes lin y con 5 copias de IS6100 (Pal et al., 2005).
La ruta de los genes lin es claramente la más accesible (y quizá la única) para la degradación aerobia de HCH. En presencia de oxígeno, la enzima LinA (-hexaclorociclohexano deshidroclorinasa) de S. japonicum UT26 cataliza la eliminación de átomos de cloro de la molécula -HCH (Mencía et al, 2006) formando un doble enlace en su lugar (van Pée &
Unversucht, 2003). La degradación se realiza en dos fases (Fig. 3): en la fase inicial de la ruta (up stream) se encuentran las deshalogenasas LinA, LinB y LinC que catalizan las reacciones de declorinación produciendo 2,5-diclorohidroquinona, y en la fase posterior (down stream), con la ayuda de las enzimas LinD, LinE, LinF, LinG, LinH y LinJ, este compuesto se metaboliza formando intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos conduciendo a la mineralización completa del lindano (Nagata et al., 2007). Los genes implicados en la fase posterior están combinados en dos grupos o clusters (Endo et al., 2005), los de la fase inicial se encuentran agrupados en uno. No todos los grupos aúnan los mismos genes sino que el contenido del clúster depende de la cepa, por ejemplo en B90A el clúster contiene los genes linA1-linF-linC. La agrupación de estos genes en clusters facilita y simplifica su transferencia a otros microorganismos (Pearce et al, 2015).
La enzima LinA inicia la ruta de degradación y cataliza, mediante dos reacciones de deshidrocloración, la transformación de lindano a 1,4-TCDN vía -PCCH (Imai et al, 1991; Nagata et al, 1999b). El paso de este compuesto a 1,2,4-TCB se supone mediado por una reacción no enzimática debido a los enlaces inestables de la molécula inicial en contraposición con la estabilidad de anillo aromático de la última (Nagata et al, 1999a; Nagata et al, 1993a). LinA y LinB forman un complejo que convierte -PCCH en 2,5-DDOL de forma eficiente porque el sustrato de LinB es químicamente inestable, curiosamente ambos genes se encuentran a gran distancia en el genoma de UT26 porque no se ha logrado aislar ningún cósmido con ambos genes. Como 1,2,4-TCB y 2,5-DCP no se degradan por ninguna enzima se consideran productos finales del proceso, quizá estén relacionados con el lento crecimiento de UT26 cuando el lindano es la única fuente de carbono y energía. 2,5-DDOL se degrada hasta 2,5-DCHQ sugiriendo una mayor ruta de asimilación del -HCH (Nagasawa et al, 1993a; Nagata et al., 1993a)
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Figura 3: Ruta de degradación del -HCH en S. japonicum UT26. Compuestos: 1, -hexaclorociclohexano (-HCH); 2, - pentaclorociclohexeno (-PCCH); 3, 1,3,4,6-tetracloro-1,4-ciclohexadieno (1,4-TCDN); 4, 1,2,4-triclorobenceno (1,2,4- TCB); 5, 2,4,5-tricloro-2,5-ciclohexadieno-1-ol (2,4,5-DNOL); 6, 2,5-diclorofenol (2,5-DCP); 7, 2,5-dicloro-2,5- ciclohexadieno-1,4-diol (2,5-DDOL); 8, 2,5-diclorohidroquinona (2,5-DCHQ); 9,clorohidroquinona (CHQ); 10, acilclorido; 11, hidroquinona (HQ); 12, ácido-6-hidroxi-4-oxohexa-2,5-dienoico (-hidroximucónico-semialdehido);
13, maleilacetato (MA); 14, -cetoadipato; 15, 3-oxoadipil-CoA; 16, succinil-CoA;17, acetyl-CoA. TCA, citrato/ ciclo ácido tricarboxílico. Basado en (Nagata et al., 2011) y (Camacho-Perez et al., 2012).
El gen linA es especialmente único ya que sólo tiene similitud con secuencias de idénticos genes linA de otras cepas bacterianas (>90 %) (Lal et al., 2010; Nagata et al., 2007), no se han encontrado homólogos en la base de datos GenBank (Böltner et al, 2005). Este gen codifica para la proteína LinA, homotetramérica con masa molecular de 16,5KDa (Nagasawa et al, 1993b;
Nagata et al., 1993b), la primera enzima en la ruta degradativa del lindano y que es el único miembro de una superfamilia de proteínas estructurales sin homología con otras proteínas conocidas (Nagata et al, 2001). En base a comparaciones estructurales se ha propuesto que la enzima LinA evolucionara de una enzima deshidratasa. Se sabe que su expresión es constitutiva (Nagata et al., 2011). Estudios empleando mutaciones que conducen a la sustitución de aminoácidos sugieren que el gen linA todavía puede evolucionar a alta velocidad bajo condiciones de presión lo que indicaría que su introducción en la ruta debe ser reciente (Nagata et al., 2007).
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La enzima LinA no necesita cofactores (Nagata et al., 2001) para catalizar los dos pasos de la fase inicial de la degradación del lindano, es específica de sustrato (Nagata et al., 1993b). Está localizada en el espacio periplásmico (junto con LinB) como otras enzimas encargadas de la detoxificación de antibióticos [como la β-lactamasa (Oliver & Cantón, 1996)], y no se secreta extracelularmente. Parece por tanto, que la degradación de compuestos halogenados xenobióticos es otra de las funciones realizadas en el espacio periplásmico, donde las enzimas entran desde el interior de forma inespecífica en vez de ser secretadas al medio de cultivo. Será en este mismo espacio donde se ataque a los contaminantes que entran desde el exterior a través de poros inespecíficos de membrana (Nagata et al., 1999b). LinA es capaz de usar como sustrato los isómeros α, γ y δ-HCH y sus correspondientes productos, ya que elimina los átomos de cloros de forma estereoselectiva al par 1,2-biaxial de hidrógeno y cloro presente en estos isómeros (que están en las posiciones 2, 6 y 1 del anillo respectivamente) (Lal et al., 2006).
La evolución de la ruta degradativa se iniciaría con una primera fase de reclutamiento de los genes de la fase inicial, cuya expresión constitutiva confirma su reciente incorporación (Nagata et al., 2007; Nagata et al., 2011). Una vez reclutados se introducirían mediante transferencia horizontal en el interior de una cepa ancestral portadora de los genes de la fase posterior, cuyas funciones son esenciales para Sphingomonas localizándose en su mayor parte (linGHIJ y linKLMN) en regiones conservadas de la cepa (Nagata et al., 2007; Nagata et al, 2014). linA además presenta un contenido en G+C (53,9%) muy diferente al de los otros genes lin analizados (Dogra et al, 2004; Nagata et al., 1999a), a excepción de linX (Ceremonie et al, 2006), lo que sugiere que es un gen endógeno que fue reclutado accidentalmente de un microorganismo con ADN genómico con bajo contenido de estas bases y con origen evolutivo desconocido. El hecho de que los 15 genes estén dispersos en los dos cromosomas y en el plásmido pCHQ1 refuerza la idea de que no se incorporaron de forma simultánea, aunque el alto nivel de conservación y la integridad de las secuencias de estos genes (excepto los del sistema de trasporte ABC) sugieren que derivan de una única fuente original. La siguiente fase en la evolución supone la consolidación de la ruta, donde se observa un incremento de la actividad IS6100 que se asocia con los genes transferidos, con especial afinidad por los genes lin con muchos sitios de inserción a su alrededor, en especial con los específicos de UT26 localizados en regiones únicas de esta cepa (linA, linC, LinRED y LinF) como se comentó antes (Nagata et al., 2011). La naturaleza dinámica de IS6100 obtenida tras secuenciar ADN de muestras de cepas de distintos orígenes naturales recogidas en varios puntos de curvas de crecimiento en medio con lindano demostró la gran cantidad de inserción de IS6100 a la largo de los genes lin lo que sugiere que la ruta está todavía evolucionando con el sistema de inserción como pieza activa (Pearce et al., 2015).
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No conocemos la función de esta ruta en el ecosistema natural de la bacteria ni sabemos si la evolución de los organismos degradadores del compuesto en los sitios contaminados está acelerando la velocidad de reducción de HCH (Lal et al., 2010). Resulta curioso constatar no obstante que los genes lin se pierden rápidamente cuando no hay exposición al HCH (Pearce et al., 2015) mientras que se adquieren cuando la concentración aumenta (Sangwan et al, 2012).
De hecho, se ha encontrado una relación directa entre cantidad de linA y la velocidad de degradación de HCH (Sun et al., 2015). Se sabe que las cepas de Sphingomonas son más diversas de lo que se pensaba en un principio y el hecho de que aparezcan nuevas cepas degradadoras subraya el papel dominante de este género en la degradación del compuesto (Böltner et al., 2005; Mohn et al, 2006), su adaptabilidad y su eficiencia degradativa (Nagata et al., 2007). Es el predominio de Sphingomonas frente a otros microorganismo en las zonas contaminadas lo que llevó a proponerla como posible biomarcador de las HCH total, β y la fracción enantiomérica de α-HCH (Xu et al, 2018).
2.2 Otros microorganismos capaces de degradar el lindano
El número de especies degradadoras del lindano aisladas del suelo contaminando aumenta constantemente (Phillips et al, 2005). Se han identificado microorganismos de diferentes géneros bacterianos como Bacillus (Lal et al., 2010; Pannu & Kumar, 2017), Staphylococcus sp y Kokuria (Kumar et al, 2016), Chromohalobacter sp capaz de degradarlo en condiciones salinas (Bajaj et al, 2017), Paracoccus (Sahoo et al, 2019), Streptomyces (Simón Solá et al, 2019), Amycolatopsis (Aparicio et al, 2018) , Micobacterium sp. (Singh & Singh, 2019) y Burkholderia spp. (Kumar, 2018), capaces de metabolizar dicho compuesto.
También se ha descrito la degradación anaerobia de lindano por especies de los géneros Clostridium, Desulfovibrio, Citrobacter y Dehalobacter (Boyle et al, 1999; Heritage & Rae, 1977;
van Doesburg et al, 2005), que finaliza con la formación de clorobencenos pues no se puede mineralizar el lindano de esta manera (Phillips et al., 2005). Todavía no se conocen ni enzimas ni genes involucrados en esta degradación (Lal et al., 2010), pero se ha descubierto que son capaces de degradar también los diferentes isómeros de HCH de forma selectiva ya que varía la comunidad bacteriana encontrada según el isómero del medio, no así la de arqueas (Qiao et al, 2020).
Los hongos también son capaces de degradar lindano, toleran mayores concentraciones de contaminantes, colonizan grandes zonas gracias a sus redes micelares, resisten en ambientes adversos como esporas y cuentan con enzimas degradadoras extracelulares (Maqbool et al, 2016; Saez et al, 2018).
Introducción
19
3 Tratamientos para la descontaminación de suelos con pesticidas.
3.1 Evolución de los pesticidas en suelos
Tras el vertido de pesticidas, éstos pueden sufrir diferentes procesos químicos, físicos o biológicos en el medio (Fig. 4). El suelo en gran medida es el sumidero de los pesticidas, la evolución definitiva vendrá mediada por factores como la topografía del lugar, la humedad, la radiación solar, la climatología, las características de la biosfera, las características estructurales y fisicoquímicas del suelo, y la estructura y características del compuesto (presión de vapor, solubilidad en agua y el coeficiente de adsorción) (Bedos et al, 2002; Tejedor et al, 1974).
Muy importante es tener en cuenta la biodisponibilidad (fracción del compuesto accesible para los organismos vivos y que determina su toxicidad). La relación entre movilidad y biodisponibilidad es directa mientras que entre la degradación y la biodisponibilidad es inversa, ya que al aumentar la degradación del compuesto, disminuye su disponibilidad para la asimilación por organismos vivos (Xing et al, 1996). Tampoco se debe obviar el “Efecto de envejecimiento (o aging)” que afirma que la biodisponibilidad disminuye según aumenta el tiempo de contacto entre los contaminantes orgánicos y el suelo (Alexander, 2000), disminuye por tanto la fracción biodegradable y aumentan las fracciones recalcitrante y no extraíble (Semple et al, 2003).
Figura 4: Procesos que sufren los pesticidas en el medio ambiente [basada en (Weber & Miller, 1989)]