BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Efectos de la sección unilateral del nervio ovárico superior
sobre la pubertad de la rata obesa Zucker
Tesis para obtener el grado de
Maestra en Ciencias Biológicas
P R E S E N T A
Biol. María Concepción Puga y Colmenares León
DIRECTOR DE TESIS
Dra. Angélica Trujillo Hernández
ASESORES DE TESIS
Dra. Adriana Berenice Silva Gómez
Dra. Leticia Morales Ledesma
I “Si una persona tiene al menos un sueño,
IV
Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca número
850196 otorgada para realizar mis estudios de maestría.
Agradezco a la Vicerrectoría de Investigación y Estudios de Posgrado de la
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla por el apoyo económico otorgado el primer año de estudios y financiamiento para congresos a lo largo de la maestría.
Agradezco a la Maestría en Ciencias Biológicas de la Benemérita Universidad
Autónoma de Puebla por haberme permitido formar parte de la primera generación en beneficio de mi formación académica y profesional.
Agradezco al laboratorio de Neuroendocrinología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la BUAP por haberme recibido y permitirme llevar a cabo este proyecto.
Agradezco al laboratorio de Neurofisiología de la Conducta y Control motor y al laboratorio de Microscopía del Instituto de Fisiología de la BUAP por el apoyo brindado para la realización de este proyecto.
V
Agradezco especialmente a mi directora de tesis, la Dra. Angélica Trujillo Hernández por haberme aceptado en su laboratorio, haber sido mi guía y mi ejemplo a seguir. Gracias no sólo por su disposición, paciencia, colaboración y
dedicación sino también por inculcarme trabajo duro, disciplina y amor por la ciencia.
Muchas gracias también por su amistad.
A los miembros de mi jurado, la Dra. Leticia Morales Ledesma, la Dra. Berenice Silva Gómez y la Dra. Berenice Venegas Meneses por haberse tomado el tiempo de revisar mi tesis y aportado comentarios que enriquecieron mi trabajo.
Al Biol. José Luis Córdoba de la Luz por su todo lo que me enseñó y su apoyo en la toma de fotos en el microscopio confocal.
A mi compañera de laboratorio y amiga la M. en C. Luz Patricia Muñoz de la Torre
por su apoyo, disposición y enseñanzas a lo largo del desarrollo de mi tesis y sobre
todo por su amistad incondicional.
A mis padres Guadalupe León Estrada y Ramón Puga y Colmenares Salinas
por ser parte esencial de mi vida, por su apoyo incondicional, por enseñarme a
nunca darme por vencida, todo lo que soy se los debo a ustedes. Siempre están en
mi mente y mi corazón, un logro más del que son parte. Los amo infinitamente.
A Luis Fernando Hidalgo Licona por ser mi soporte y mi guía, por tu compañía, amor e infinita paciencia. Gracias por permitirme crecer a tu lado y por todos los
años junto a mí, haces que la vida sea más ligera. Te amo.
A la familia Licona-Chávez por brindarme su apoyo y cariño incondicional, son un gran ejemplo de unión y amor familiar. Los quiero.
A mis amigos de toda la vida Adriana, Marco, Jiovanna, Cinthia, Sarai, Chuy, Laura
y Ricardo por su apoyo, compañía, amor y confianza y a mis compañeros de
laboratorio por su compañía y enseñanzas, qué sería de mí sin ustedes.
VI
CONTENIDO Página
RESUMEN 1
INTRODUCCIÓN 3
MARCO TEÓRICO 4
Morfofisiología del ovario 4
Funciones del ovario 8
Ovulación 8
Biosíntesis de hormonas esteroides 8
Regulación de las funciones del ovario 10
Participación del NOS en las funciones ováricas 13
Desarrollo posnatal de la rata 14
Pubertad 16
ANTECEDENTES 17
Obesidad y reproducción 17
Obesidad, problemas reproductivos y NOS 19
La rata Zucker como modelo de obesidad 22
JUSTIFICACIÓN 24
HIPÓTESIS 24
OBJETIVOS 25
METODOLOGÍA 26
Diseño experimental 26
Procedimiento quirúrgico para la sección del NOS 28
VII
Procedimiento de autopsia 29
Análisis de la población folicular 30
Cuantificación de hormonas 31 Histoquímica para la detección de catecolaminas ováricas 32
Inmunohistoquímica para tirosina-hidroxilasa 33
Análisis estadístico 34
RESULTADOS 35 EXPERIMENTO 1: Caracterización de la rata Zucker obesa 35
Curva de crecimiento 35
Peso relativo de órganos 36
Inicio de la pubertad 36
Primera ovulación 37
Población folicular 37
Morfología ovárica 38
Concentración sérica de gonadotropinas 39
Concentración de hormonas esteroides 39
Presencia de fibras que contienen catecolaminas 40
Expresión de TH en el ovario 42
Resumen de resultados 44
DISCUSIÓN 45
EXPERIMENTO 2: Efectos de la sección unilateral del NOS 49
VIII
Inicio de la pubertad 52
Primera ovulación 53
Morfología ovárica 53
Concentración sérica de gonadotropinas 55
Concentración de hormonas esteroides 55
Presencia de fibras que contienen catecolaminas 57
Expresión de TH en el ovario 59
Resumen de resultados 62
DISCUSIÓN 62
CONCLUSIONES 66
ANEXOS 68
IX ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Esquema en el que se muestran las diferentes partes del ovario (corteza, médula e hilio), así como los estadios por los cuales pasan los folículos (Elaborado por Ma. Concepción Puga y Colmenares León, 2019) 5
Figura 2. Desarrollo del folículo ovárico y el cuerpo lúteo (tomado y modificado de
Norris y López, 2011) 7
Figura 3. Esquema que muestra las rutas para la biosíntesis de las hormonas esteoroides (tomado y modificado de Gore-Langton, 1988) 9
Figura 4. Se muestra el diagrama de los grupos experimentales. SS=Sin sección del NOS, OSI=operación simulada izquierda, SNI=sección del NOS izquierdo, OSD=operación simulada derecha, SND=sección del NOS derecho 27
Figura 5. Se muestra el diseño experimental, las variables de estudio fueron el peso de los órganos (adrenales, ovarios, útero), la apertura vaginal (AV), el primer estro vaginal (PEV) y el número de cuerpos lúteos (CL) 28
Figura 6. Clasificación folicular de acuerdo al grosor de la capa de la granulosa y el
diámetro folicular 30
Figura 7. Diagrama de las medidas de los folículos que presentaron ovocito con núcleo y nucleolo en los diferentes cortes histológicos de los ovarios. La línea rosa representa el primer diámetro y la línea azul representa el diámetro perpendicular del folículo, ubicando la regla del ocular micrométrico en la membrana basal 31
Figura 8. Esquema del procedimiento general del ELISA. Obtenido y modificado de
LaboratoryInfo (2018) 31
Figura 9. Muestra del cálculo la fluorescencia específica en cada corte mediante un análisis de segmentación de color específico en Image-J 33
Figura 10. Media ± E.E. del peso corporal (g) de las hembras LE, delgadas u obesas n=9 por grupo, *p<0.05 prueba ANOVA de una vía seguida de una prueba de Tukey.
35
Figura 11. Cortes histológicos de ovario de ratas LE (A), delgada (B) y obesa (C), sacrificados el día del PEV. F=folículo, CL=cuerpo lúteo, PQ=prequiste 38
Figura 12. Media ± E.E. de la concentración sérica de FSH y LH de animales sacrificados el día del primer estro vaginal LE, delgadas y obesas. n=4 por grupo.
X
obesas n=3 por grupo. *p<0.05 vs. grupo LE, ᴥp<0.05 vs. grupo Delgadas (Kruskal-Wallis seguida de una U de Mann-Whitney) 41
Figura 15. Fibras catecolaminérgicas presentes en el ovario de ratas LE, Delgadas y Obesas sacrificadas el día del primer estro vaginal. Las fibras fluorescentes se localizaron alrededor de los folículos (señaladas en flechas amarillas) 42
Figura 16. Distribución de la expresión de las fibras que expresan tirosina hidroxilasa (TH) en secciones de ovario de ratas LE, delgadas y obesas, sacrificadas el día del primer estro vaginal 43
Figura 17. Media ± E.E. del peso de los ovarios de ratas LE, delgadas y obesas n=9. SS=Sin sección del NOS, OSI=Operación simulada izquierda, SNI= Sección del NOS izquierdo, OSD= Operación simulada derecha, SND= Sección del NOS derecho. *p<0.05 vs. su grupo sin sección, ᵜ p<0.05 vs. su grupo operación simulada
(prueba de “t” de Student) 50
Figura 18. Media ± E.E. del peso de los ovarios de LE, delgadas y obesas n=9 por grupo. SS=Sin sección del NOS, OSI=Operación simulada izquierda, SNI= Sección del NOS izquierdo, OSD= Operación simulada derecha, SND= Sección del NOS derecho. *p<0.05 vs. su grupo sin sección (Prueba de t de Student) 51 Figura 19. Media ± E.E. del peso del útero de animales con A) Sección del NOS izquierdo y B) Sección del NOS derecho n=9 por grupo; SS=Sin sección del NOS, OSI=Operación simulada izquierda, SNI= Sección del NOS izquierdo, OSD= Operación simulada derecha, SND= Sección del NOS derecho 52
Figura 20. Cortes histológicos de ovario de las ratas LE, delgadas y obesas, con sección del NOS izquierdo y derecho, todos los animales fueron sacrificados el día del PEV. F=folículo, CL=cuerpo lúteo, PQ=prequiste 54
Figura 21. Media ± E.E. de la concentración sérica de FSH y LH de animales SS=Sin sección, SNI= Sección del NOS izquierdo y SND= Sección del NOS derecho
n=5 por grupo 55
Figura 22. Media ± E.E. de la concentración sérica de P4 y T de animales SS=Sin sección del NOS, SNI= Sección del NOS izquierda y SND= Sección del NOS
derecha n=4 por grupo 56
XI Figura 25. Distribución de la expresión de las fibras que expresan tirosina hidroxilasa (TH) en secciones de ovario de ratas LE, delgadas y obesas, SS=Sin sección del NOS, SNI= Sección del NOS izquierdo y SND= Sección del NOS derecho, sacrificadas el día del primer estro vaginal 61
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Media ± E.E. del peso relativo (mg/100g de peso corporal) de ambos ovarios, adrenales y útero (mg/100 g.p.c.) de hembras LE, delgadas y obesas sacrificadas en el primer estro vaginal 36
Tabla 2. Media ± E.E. de la edad (días) de la apertura vaginal (AV) y del primer estro vaginal (PEV) de hembras LE, delgadas u obesas sacrificadas en el PEV 36
Tabla 3. Media± E.E. del número de cuerpos lúteos por ovario de ratas LE, delgadas
y obesas sacrificadas en el PEV 37
Tabla 4. Media ± E.E. del número de folículos presentes en ambos ovarios por categoría de las hembras LE, delgadas y obesas sacrificadas en el PEV, n=3 por
grupo 37
Tabla 5. Media ± E.E. del diámetro en µm de los folículos presentes en ambos ovarios por categoría de las hembras LE, delgadas y obesas sacrificadas en el PEV,
n=3 38
Tabla 6. Cantidad de fibras que expresan TH en los ovarios de las ratas LE, delgadas y obesas sacrificadas el día del primer estro vaginal, en un total de 12
cortes por grupo experimental 44
Tabla 7. Media ± E.E. de la edad (días) de la apertura vaginal (AV) de las hembras LE, delgadas y obesas sacrificadas el PEV, n=9 por grupo 52
Tabla 8. Media ± E.E. de la edad (días) del primer estro vaginal (PEV) de las hembras LE, delgadas y obesas sacrificadas el PEV, n=9 por grupo 53
Tabla 9. Media ± E.E. del número de cuerpos lúteos presente en ambos ovarios de las hembras LE, delgadas y obesas sacrificadas el PEV, n=3 por grupo 53
Tabla 10. Cantidad de fibras que expresan TH en el ovario izquierdo de las ratas LE, delgadas y obesas sacrificadas el día del primer estro vaginal 59
Tabla 11. Cantidad de fibras que expresan TH en el ovario derecho de las ratas LE, delgadas y obesas sacrificadas el día del primer estro vaginal 60
INDICE DE ANEXOS
ANEXO 1. Curva de tolerancia a la glucosa 67
1 RESUMEN
Las funciones ováricas además de ser reguladas por el eje clásico
hipotálamo-hipófisis-gónada, son moduladas a través de la información neural de las neuronas
simpáticas, parasimpáticas y sensoriales.
En ratas que presentan ovario poliquístico inducido con valerato de estradiol,
la sección quirúrgica del nervio ovárico superior, la principal fuente de noradrenalina
que llega al ovario, resulta en la disminución de noradrenalina y en una recuperación
de las funciones ováricas. Evidencias que sugieren que la eliminación del aporte
simpático restablece las funciones ováricas.
La obesidad, además de considerarse un cuadro de estrés crónico
acompañado de hiperactivación simpática, se ha relacionado con infertilidad,
desarrollo de ovarios poliquísticos y problemas al inicio de la pubertad. Sin embargo,
la relación entre las anormalidades reproductivas y la obesidad no ha recibido
suficiente atención.
Por lo que el presente estudio tuvo como finalidad generar mayor
conocimiento sobre la participación del nervio ovárico superior sobre la pubertad, el
desarrollo folicular, la esteroidogénesis y la primera ovulación en ratas con obesidad
genética, ya que hasta el momento no existen reportes en la literatura que muestren
la participación del nervio ovárico superior en la regulación de las funciones ováricas
en la rata obesa Zucker púber.
Los resultados del presente estudio indican que los animales obesos
presentan mayor peso corporal y menor peso de órganos, sin cambios en el
establecimiento de la pubertad, no ovulan, presentan estructuras prequísticas,
incremento de las concentraciones séricas de estradiol, así como un mayor tono
simpático comparados con animales control. La sección del nervio ovárico superior
izquierdo no modifica las condiciones que se observan en el animal obeso; sin
embargo, las hembras obesas sometidas a la sección del nervio ovárico superior
derecho, presentan ovulación en ambos ovarios y una disminución del tono
2
Con base a lo anterior, postulamos que la información que llega al ovario a
través del nervio ovárico superior en el animal obeso regula la ovulación, tal y como
se ha mostrado en el animal delgado, además esta participación es lateralizada. La
información generada permite establecer a la rata Zucker obesa como un modelo
animal para analizar la relación entre la obesidad y la reproducción, además de ser
el primer reporte en mostrar la participación de la información simpática que llega al
ovario por el nervio ovárico superior en la regulación de la primera ovulación en el
3 INTRODUCCIÓN
La obesidad es una patología que se presenta como consecuencia de un
desequilibrio entre la ingesta y el gasto energético (Barrios-De-Tomasi et al., 2013; Bray, 2004; Trayhurn, 2005). Se ha caracterizado como un cuadro de estrés crónico
de bajo grado de intensidad, el cual parece alterar el funcionamiento de los sistemas
nervioso, endócrino, inmunitario y reproductivo (Blancas-Flores et al., 2010).
La obesidad es más común en mujeres adultas que en hombres, por lo
menos el 70% exhiben algún grado de obesidad o sobrepeso (Dávila-Torres, 2015).
Esta condición puede influir negativamente en los mecanismos reproductivos ya que
pacientes femeninas con obesidad presentan gran cantidad de anomalías
reproductivas como es la reducción de la tasa de embarazo, mayor riesgo de
abortos espontáneos, ciclos menstruales irregulares, anovulación, ovocitos de
menor calidad, líquido folicular con cambios bioquímicos, desarrollo irregular del
endometrio y una respuesta atenuada ante las gonadotropinas (Gesink et al., 2006; Franks y Hardy, 2018).
Existe evidencia sustancial del vínculo entre la obesidad y la hiperactividad
simpática; estudios muestran que individuos con obesidad tienen incremento en los
niveles de noradrenalina (NA) urinaria y plasmática, así como aumento del flujo
simpático en reposo hacia el músculo esquelético medido por microneurografía,
alteraciones dependientes de la grasa corporal central (Thorp y Schlaich, 2015).
Estudios previos (Araya et al., 2004; Barra et al., 2014; Kuo et al., 2008; Paredes et al., 1998) muestran que el estrés crónico provocado por la exposición prolongada a un estímulo estresante, origina un desequilibrio en la homeostasis del
organismo, como es el incremento de la actividad noradrenérgica ovárica, que se
traduce en la aparición de folículos quísticos e incremento en la secreción de
andrógenos y estrógenos.
A través de diversas estrategias experimentales como es el caso de la
sección bilateral del nervio ovárico superior (NOS) se elimina la principal fuente de
aporte de noradrenalina al ovario, y se restablece la ovulación y la secreción de
4
embargo, los efectos originados por la denervación en los organismos cambian en
relación a la edad y al ovario denervado, ya que la secreción de hormonas
esteroides ováricas es asimétrica y depende de la información que llega a través
del NOS (Flores et al., 2011; Morales-Ledesma et al., 2017). A la fecha la relación de las neuronas simpáticas que inervan al ovario y la regulación de las funciones
ováricas, en condiciones de obesidad, no ha sido suficientemente explorada.
MARCO TEÓRICO
Morfofisiología de los ovarios
Los ovarios cumplen con dos procesos fisiológicos importantes: la ovulación y la
secreción de hormonas esteroides: progestágenos, andrógenos y estrógenos y
proteicas: activina e inhibina, funciones que dependen de la autorregulación del
ovario, de la inervación extrínseca que llega a través del sistema nervioso central
(SNC) y del control ejercido por el eje hipotálamo-hipófisis-gónada (HHG) (Barria et al., 1993; Domínguez et al., 2003).
En el ovario se distinguen anatómicamente tres zonas fundamentales (Fig. 1):
La corteza: Es la zona más externa del ovario que contiene los folículos que se encuentran en diversos estadios de desarrollo (Yao y Bahr, 1999; Carlson, 2009).
La médula: Es la parte más interna del ovario, formada por tejido conjuntivo, vasos linfáticos, fibras nerviosas, así como abundantes vasos sanguíneos de los que se
originan pequeñas ramas que se dirigen hacia la corteza (Yao y Bahr, 1999).
5 Figura 1: Esquema en el que se muestran las diferentes partes del ovario (corteza, médula e hilio), así como los estadios por los cuales pasan los folículos (Elaborado por Ma. Concepción Puga y Colmenares León, 2019).
Los folículos, son la unidad funcional y anatómica del ovario cuya función
principal es la manutención y maduración del ovocito, están formados por el ovocito,
la células de la granulosa y las células de la teca (Sánchez-Criado et al., 1999). El desarrollo de los folículos, llamado foliculogénesis, comprende dos pasos: el
reclutamiento inicial de folículos primordiales que inicia poco después de que se
forman los folículos y el reclutamiento cíclico de folículos que competirán por la
maduración y ovulación (Vantman y Vega, 2010).
En los roedores, el ensamblaje folicular que consiste en la formación de
folículos primordiales se incia después de 24h de vida postnatal y la población
folicular total queda establecida 48h después del nacimiento (Malamed et al., 1992). En el caso de la mujer, el proceso se inicia durante el periodo fetal después de la
semana 16 de gestación (Pangas y Rajkovic, 2015).
El reclutamiento cíclico de folículos comienza en respuesta a la maduración
6
coordina este proceso con el comportamiento sexual y la preparación fisiológica
para la gestación y continúa cíclicamente a lo largo de la vida reproductiva de la
hembra; antes de este proceso los folículos crecen pero son incapaces de formar
un antro ya que no reciben suficiente estimulación gonadotrópica (Norris y López,
2011; Pangas y Rajkovic, 2015).
El desarrollo del folículo ovárico consiste en una fase preantral independiente
de gonadotropinas y una fase antral dependiente de ellas (Fig. 2). De acuerdo a su
estructura morfológica los folículos pueden clasificarse en 4 tipos: primordiales, primarios, secundarios y preantrales.
Los folículosprimordiales presentan una monocapa de células precursoras de las células de la granulosa que rodean al ovocito el cual se encuentra detenido
en la profase de la primera división meiótica, estos folículos se encuentran en la
parte más externa de la corteza, son los más numerosos y constituyen la reserva
folicular que se encuentra en reposo durante la vida reproductiva del individuo
(McGee et al., 2000; Carlson, 2009).
Los folículos primarios presentan una monocapa de células de la granulosa con forma cuboidal que rodean al ovocito (Vantman y Vega, 2010; Pangas y
Rajkovic, 2015). A pesar de ser independientes al control gonadotrópico, las células
de la granulosa de éstos folículos pueden presentar receptores para la hormona
folículo estimulante (FSH) y estrógenos, que actúan como un factor de
supervivencia y promueven la activación de los folículos. El crecimiento restante y
la maduración hasta la formación de la cavidad antral está bajo control
gonadotrópico obligatorio (Pangas y Rajkovic, 2015).
Cuando las capas de células de la granulosa se duplican y crecen se
convierten en folículos secundarios, éstas células ya expresan receptores a la FSH y son capaces de sintetizar hormonas esteroideas (McGee et al., 2000; Smith
et al., 2014). En esta etapa el ovocito produce el factor de diferenciación del factor de crecimiento 9 (GDF-9), el cual participa en el desarrollo del folículo y en la
formación de las células de la teca, entre más capilares se asocien a éstas células
7
de receptores de la hormona luteinizante (LH) lo que aumentará la capacidad de
biosíntesis de esteroides (McGee et al., 2000).
Los folículos continuan aumentando rápidamente de tamaño en respuesta a
la FSH, se van desplazando a la corteza y comienzan a formar el antro que es una
cavidad que contiene líquido folicular (compuesto por lípidos y algunas proteínas);
estos folículos son llamados folículos terciarios, se caracterizan por la presencia de varias capas de células de la teca las cuales se dividen en teca interna que es
una capa que se encarga de la síntesis de esteroides del tipo de la androstenediona
y la teca externa compuesta por tejido conectivo (McGee et al., 2000; Zeleznik y Plant, 2015).
En este estadio las células de la granulosa presentan un engrosamiento
llamado cumulus oophoros y corona radiada, las cuales aportan nutrientes y factores de crecimiento necesarios para el crecimiento y maduración del ovocito. El
ovocito por su parte se desplaza hacia una posición excéntrica de la cavidad folicular
para poder ser ovulado, además completa la meiosis I, produciendo el ovocito
secundario y el primer corpúsculo polar, en este punto el folículo es denominado
folículo de Graaf (Zeleznik y Plant, 2015).
8 FUNCIONES DEL OVARIO
Ovulación
El proceso biológico en el cual se da la ruptura de un folículo preovulatorio y la
liberación del ovocito (detenido en metafase de la segunda división meiótica) hacia
el oviducto propiciado principalmente por el aumento de la LH y en menor medida
por la FSH es conocido como ovulación (Lawrence, 1999; Pangas y Rajkovic, 2015).
Después de la ovulación, la estructura folicular se reorganiza hasta la
formación de un cuerpo lúteo (CL), donde las células de la granulosa y la teca
interna del folículo post-ovulatorio presentan cambios morfológicos y funcionales
conocidos como luteinización. Las células luteínicas se especializan en la secreción
de progesterona (P4) para el establecimiento y mantenimiento del embarazo
(Bergman et al., 1998). El número de cuerpos lúteos presentes en el ovario indica el número de ovulaciones (Tresguerres, 1999).
Sólo una pequeña parte de los folículos logra completar su maduración,
mientras que el resto inicia un proceso conocido como atresia folicular, que es un
mecanismo de muerte programada o apoptosis en el que se da un desprendimiento
y degeneración de las células de la granulosa, fragmentación de la lámina basal,
reducción de la síntesis de ADN y de estrógenos así como la reducción de la
sanguínea, se sintetizan de novo a partir de acetato, o bien del que está almacenado
en forma de ésteres en las células de la teca interna (Tresguerres, 1999).
La síntesis de las hormonas esteroideas se lleva a cabo en la membrana
interna de las mitocondrias de las células de la teca y es mediada por la proteína
9
mitocondria, donde a partir de la unión de la LH a sus receptores y por la activación
del citocromo P450SCC ocurre la conversión del colesterol a pregnenolona (Hu et al.,
2010;Tresguerres, 1999).
Una vez sintetizada la pregnenolona puede tomar dos rutas de síntesis Δ4 y Δ5. La vía Δ4 en donde el doble enlace de carbono ocurre entre C-4 y C-5, mientras que en la Δ5 el doble enlace está presente entre C-5 y C-6. A partir de estas dos
vías se sintetizan andrógenos. En el ovario la síntesis de andrógenos sigue principalmente la vía Δ4, mientras que la vía Δ5 ocurre en la glándula adrenal. Los
andrógenos se secretan a la vena ovárica y a las células de la granulosa y ahí son
transformados en estrona y E2 por acción de la enzima aromatasa (Tresguerres,
1999; Fig. 3).
10 REGULACIÓN DE LAS FUNCIONES OVÁRICAS
Las funciones ováricas están reguladas por señales hormonales y neurales que
requieren una regulación precisa, cuantitativa y temporal, del eje HHG.
Señales hormonales
A nivel hipotalámico las neuronas GnRHérgicas liberan GnRH a los capilares de la
eminencia media la cual es transportada a través del sistema portal a los receptores
gonadotrópicos ubicados en la adenohipófisis para estimular la liberación de LH y
FSH (Morán et al., 2005; Plant, 2015).
Éstas a su vez viajan por el torrente sanguíneo y llegan al ovario donde se
unen a las células de la granulosa y de la teca para estimular la foliculogénesis y la
producción ovárica de diversos esteroides sexuales y factores de crecimiento, los
cuales en conjunto ejercen diversos efectos que resultan en una correcta función
gonadal (Morán et al., 2005; Plant, 2015).
El estradiol secretado por las células de la granulosa establece un
mecanismo de regulación inhibitorio o estimulante a nivel hipotalámico e hipofisario
a través de sus receptores estrogénicos alfa y beta, siendo el receptor alfa el que
interviene en el control de la retroalimentación negativa, a pesar de ello las neuronas
GnRHérgicas no expresan estos receptores (Xu et al., 2012).
Recientes hallazgos concluyen que Kisspeptina, un péptido producto del gen
Kiss-1, que inicialmente se relacionó con la supresión de la metástasis en células
cancerígenas y su receptor Kiss-R1 participan en el control del eje HHG. Las
neuronas kisspeptidérgicas se encuentran moduladas por neuroquinina B y
dinorfina A, que en conjunto componen el sistema KNDy, cuya función resulta en un
aumento en la secreción de GnRH, ya que la mutación o ausencia del receptor de
kisspeptina se refleja en una ausencia de los pulsos de LH e incorrecto
funcionamiento del sistema reproductivo como es el adelanto o retraso de la
pubertad (Xu et al., 2012; Sultán et al., 2018).
De modo que kisspeptina constituye un factor clave en le regulación de todos
11
control neuroendócrino de la ovulación y la retroalimentación de los esteroides
sexuales a través de la activación de las neuronas GnRH (Herbison et al., 2010).
En los roedores, las neuronas kisspeptidérgicas se encuentran en el núcleo
paraventricular anteroventral (NPV-AV) y el núcleo arcuato (ARC) las cuales son
áreas hipotalámicas que interaccionan con los somas de las neuronas GnRHérgicas
las cuales se localizan en el núcleo arcuato (ARC) y el área preóptica medial (POA),
por lo que las neuronas kisspeptidérgicas se convierten en un vínculo fundamental
entre los estrógenos y las neuronas GnRH ya que éstas a su vez expresan el
receptor de kisspeptina (GPR54) lo que sugiere su función estimulatoria sobre estas
neuronas (Xu et al., 2012).
Señales nerviosas
El ovario de los mamíferos no sólo está bajo el control del eje HHG, también se
describe una vía multisináptica entre las gónadas y SNC ejercida por neuronas que
inervan los diferentes componentes del ovario que se ha considerado como uno de
los mecanismos finos de control de la función gonadal y que en conjunto con la vía
hormonal regula la función reproductiva (Gerendai et al., 1998; Delgado et al., 2006; Fernandois et al., 2014; Morales et al., 1993).
La conexión del SNC con el ovario se da por las fibras noradrenérgicas y
peptidérgicas que llegan por medio de vías multisinápticas de la médula espinal,
mayormente en la columna intermediolateral, en la región que va del primer
segmento dorsal hasta los segmentos lumbares rostrales, posteriormente, salen de
la médula a través del asta anterior y se separan en fibras motoras que continúan
en forma de haces hacia los ganglios de la cadena simpática paravertebral (Dissen
y Ojeda, 1999; Gerendai et al., 1998).
Las fibras simpáticas que inervan los ovarios provienen de los segmentos
torácico 11 al lumbar 4 de la médula espinal y hacen sinapsis con el ganglio
celiaco-mesentérico superior (GCMS) los que dan origen a la mayoría de las fibras
postganglionares que llegan al ovario. La porción sensorial deriva del ganglio
12
el segmento lumbar craneal L2-L4, que arriban por el plexo ovárico (PO) (Apolonio,
2006; Dissen y Ojeda, 1999; Gerendai et al., 1998).
El ovario recibe la inervación simpática a través de dos vías; el NOS el cual
está asociado con el ligamento suspensorio (que sujeta al ovario, oviducto y útero
a la cavidad peritoneal) formado por fibras que contienen catecolaminas
principalmente NA, neuropéptido-Y (NPY) y péptido intestinal vasoactivo (VIP) e
inerva el tejido intersticial y la teca interna de los folículos ováricos, éstas fibras
participan en la regulación de la síntesis de hormonas esteroides ováricas, mientras
que el PO viaja a lo largo de la arteria ovárica, está formado por fibras que contienen
predominantemente a la sustancia P (SP) y al péptido relacionado con el gen de la
calcitonina (CGRP) (Aguado, 2002; Araya et al., 2004; Gerendai et al., 1998).
Durante el desarrollo embrionario de la rata, diversos sistemas de
neurotransmisión clásicos a base de neuropéptidos del sistema nervioso autónomo,
inician su actividad. El desarrollo de las proyecciones noradrenérgicas inicia desde
el día 16 de gestación, pero no será hasta la segunda mitad del periodo juvenil que
se desarrolle completamente y sea capaz de liberar catecolaminas al sistema, por
lo que la inervación simpática incrementa su actividad a medida que el ovario se
acerca a la madurez reproductiva (Ojeda y Skinner, 2006, Ricu et al., 2007).
La incorporación de NA en el ovario inicia durante el periodo neonatal e
incrementa abruptamente durante la segunda semana del desarrollo juvenil
permaneciendo elevada durante la pubertad y presentando un descenso después
de la primera ovulación. Por lo que la biosíntesis de NA y del ARNm de su receptor
son funcionales en periodos neonatales mientras que su liberación tiene un
incremento en la tercera semana de vida y esta respuesta se ve reforzada por el
estradiol, sugiriendo la participación noradrenérgica en la progresión puberal (Ricu
13 Participación del nervio ovárico superior en las funciones ováricas
Diversos estudios sugieren que la inervación simpática que llega vía el NOS
participa en la regulación del establecimiento de la pubertad, la esteroidogénesis
ovárica, el desarrollo folicular, en la ciclicidad estral y en la ovulación mediante la
modulación de la capacidad de respuesta de los ovarios a las gonadotropinas en
forma lateralizada y excitatoria, esta regulación es ejercida principalmente por la NA
y VIP (Aguado y Ojeda, 1984; Chávez et al., 1991; Flores et al., 2011; Morales et al., 1993; Morales-Ledesma et al., 2012). Estos hallazgos se han logrado a través de diferentes estrategias experimentales, como es el caso de la sección quirúrgica
o estimulación eléctrica del NOS en distintas etapas del desarrollo de los individuos.
El efecto de la sección del NOS en ratas de 4 días de edad evaluado en las
etapas prepuberal, peripuberal o adulta, muestran que existe un retraso en la
apertura vaginal, interrupción de la ciclicidad estral e incremento en el número de
cuerpos lúteos respecto a sus controles, mientras que los niveles de FSH, PRL y
GH disminuyen en todas las etapas, por lo que se ha sugerido que la participación
del NOS en la regulación de la función reproductiva se presenta desde etapas
tempranas del desarrollo ovárico y que durante el periodo posoperatorio el sistema
es capaz de compensar el número de receptores adrenérgicos ováricos, así como
el nivel de NA prácticamente en todas las etapas de desarrollo, siendo el día 41 el
que mostró mayor nivel de NA (Forneris y Aguado, 2002).
En la rata prepúber la sección bilateral del NOS no modifica la tasa ovulatoria
ni el número de ovocitos liberados, por su parte la sección unilateral del NOS resulta
en un descenso en la cantidad de ovocitos liberados por el ovario denervado y un
aumento compensador por el ovario que mantiene intacta su inervación. Se ha
observado que la sección del NOS se traduce en una caída drástica de la
concentración de NA ovárica, hecho que confirma la idea de que esta vía neural es
el mayor aporte de la amina al ovario (Aguado y Ojeda, 1984b; Chávez et al., 1991; Lawrence y Burden, 1980).
14
un alto grado de atresia folicular, así como aumento en la cantidad de folículos en
el ovario inervado (izquierdo), el aumento de folículos atrésicos podría explicarse
por una disminución en los receptores de FSH, como resultado de la denervación.
Sin embargo, la sección del NOS izquierdo no arroja los mismos resultados ya que
ambos ovarios responden de manera diferente, lo que sugiere que la comunicación
neuronal podría surgir del ovario izquierdo y dirigirse al ovario derecho.
Morales-Ledesma et al. (2012) seccionaron uni o bilateralmente el NOS para evaluar la acción del éste en la secreción de hormonas esteroideas de ratas
hembras prepuberales, 30 y 60 minutos después de la cirugía, sus resultados
indican que el efecto resultante depende de la hormona analizada, el tiempo entre
la cirugía y la autopsia y el tipo tratamiento al que el animal fue sometido. Lo que
sugiere que la información neuronal que llega a los ovarios a través del NOS en la
rata prepuberal regula la actividad de las enzimas que participan en la síntesis de
P4, T y E2 y que dicha actividad parece ser asimétrica; de manera que los
mecanismos que regulan la síntesis de cada hormona no están regulados por las
mismas señales.
DESARROLLO POSNATAL DE LA RATA
Las ratas resultan un modelo ideal para el estudio de diversas patologías ya que
presentan ciclos de vida cortos, son relativamente económicas y fáciles de manejar.
El periodo de gestación de la rata dura 21 días y la madurez sexual en el caso de
las hembras ocurre entre los 35 a 40 días después del nacimiento, siendo la
canalización de la vagina, el único indicio externo de que el animal ha alcanzado la
madurez, que ocurre después de la primera oleada de gonadotropinas (Ojeda y
Skinner, 2006).
Todos estos cambios pueden clasificarse en diferentes periodos de acuerdo a
los cambios morfológicos y fisiológicos que se presentan, en el caso de las hembras
se pueden observar desde el nacimiento hasta el momento del establecimiento de
15 1) Neonatal: esta etapa inicia al nacer el animal y termina el día posnatal siete, se caracteriza por el inicio del ensamblaje folicular independiente de
gonadotropinas, no existe un mecanismo de retroalimentación del estradiol debido a la presencia de la α-feto proteína que se une a los estrógenos e
impide que se unan a sus receptores y al bajo contenido de receptores
gonadotrópicos que comienzan a formarse entre el cuarto y quinto día, para
el caso de la FSH y días más tarde los de la LH, después de ese momento
FSH estimula la conversión de testosterona a estrógenos (Ojeda y Skinner,
2006).
2) Infantil: comprende del día 8 al 21 y representa la fase en la que ocurren los primeros eventos neuroendócrinos y tienen impacto sobre el
establecimiento de la pubertad. Los niveles de la FSH en plasma
comienzan a aumentar alcanzando sus valores máximos en el día 12
debido a un aumento en la frecuencia de las descargas de hormona
liberadora de gonadotropinas (GnRH), éste aumento en la FSH estimula el
crecimiento de los folículos que van a ovular en la pubertad (Ojeda et al.,
1980; Ojeda y Skinner, 2006). Por su parte los niveles de LH son más
elevados en este momento que en animales juveniles; aunque resulta ser
menos evidente también se presenta una elevación de FSH lo que resulta
en la activación de las neuronas noradrenérgicas (Ojeda y Skinner, 2006).
Además, la respuesta a GnRH es mucho mayor en ratas infantiles que en
juveniles por lo que pequeñas elevaciones de la misma provocan mayor
estimulación de los receptores GnRHérgicos, lo cual puede estar
relacionado a la existencia de un mayor porcentaje de gonadotropos en la
hipófisis anterior de las ratas más jóvenes. Al final del este periodo los
niveles de LH, FSH y α-feto proteína han disminuido (Ojeda y Skinner,
2006).
3) Juvenil: esta etapa finaliza alrededor de los días 30 a 32, se caracteriza por una serie de cambios sinápticos de las neuronas GnRH que
contribuyen al aumento en la capacidad de la respuesta del hipotálamo y
16
capacidad de liberación de GnRH. Este periodo se define como el momento
en el que se establece un patrón pulsátil de la LH que se refleja en un
incremento de la esteroidogénesis. A nivel ovárico se incrementa el número
de receptores para FSH y LH lo que se traduce en una respuesta
esteroidogénica máxima (White y Ojeda, 1981). Por otro lado, los folículos
todavía no alcanzan el estado ovulatorio, esta capacidad se adquiere en el
momento de la pubertad y se encuentra regulada por múltiples factores
hormonales y neurogénicos (Ojeda et al., 1986). Al final de esta etapa la concentración de LH es mayor que en las etapas anteriores, así como los
pulsos que se producen por la tarde, lo que establece un ritmo de secreción
circadiano (Andrews y Ojeda, 1981; Urbanski y Ojeda, 1984).
4) Peripuberal: esta etapa puede tener una duración variable, de acuerdo a la condición de los organismos, pero culmina con la aparición de la primera
ovulación. Conforme se alcanza la pubertad los ovarios presentan un
incremento en los receptores a la LH más pronunciado que en etapas
anteriores, los niveles de prolactina (PRL) y hormona de crecimiento (GH)
incrementan significativamente, así como la secreción de estrógenos por
el ovario en respuesta al estímulo gonadotrópico, lo que a su vez origina la
primera liberación preovulatoria de gonadotropinas (Ojeda et al., 1986; Ojeda y Jameson, 1977; White y Ojeda, 1981).
Por otro lado, la secreción de progesterona aumenta y estimula la
liberación de GnRH, todos estos eventos en conjunto inducen el
crecimiento y la maduración folicular que culmina con la ovulación, en este
momento se da el reclutamiento cíclico de folículos cuyo propósito es el
rescate de una cohorte de folículos para que alcancen la ovulación esto
sucederá a lo largo de la vida del organismo hasta el momento en que ya
no haya folículos en reserva (Advis et al., 1979; Feder, 1981).
PUBERTAD
La pubertad es un proceso biológico gradual caracterizado por diferentes cambios
17
y permiten al individuo alcanzar la capacidad reproductiva, en el caso de las
hembras de roedores, el inicio de la pubertad se puede evidenciar con la
canalización de la vagina y en el caso de las mujeres con la menarca (Clarkson,
2013; Cortés et al., 2015).
El inicio de la pubertad requiere de una serie de cambios que involucra todos
y cada uno de los niveles del eje HHG, depende de la especie, así como la
información genética particular de cada individuo y de los factores externos como la
nutrición, el fotoperiodo, la altitud y la temperatura ambiental (Ojeda y Teresawa,
2002; Vieyra, 2011). Por lo que se ha llegado a considerar como un indicador
biológico de las influencias negativas que el ambiente ejerce sobre el desarrollo de
los organismos (Sultan et al., 2018).
La activación o reactivación neuroendócrina del eje HHG es esencial para la
finalización de la pubertad y está regulado por una red compleja de genes, de
neurotransmisores y de interacciones neuronales dentro del hipotálamo (Sultan et al., 2018). En este momento la secreción de GnRH se transforma de un patrón irregular de bajo nivel a un patrón regular pulsátil, el cual es fundamental para la
estimulación de la secreción de gonadotropinas principalmente LH, que a su vez
estimulan la esteroidogénesis y la gametogénesis, aunque la activación de las
neuronas GnRH es crítica para el inicio de la pubertad, el mecanismo por el cual se
activa aún no se conoce completamente (Abreu y Kaiser, 2016).
ANTECEDENTES
OBESIDAD Y REPRODUCCIÓN
La obesidad es un padecimiento crónico de etiología multifactorial que se desarrolla
por un desequilibrio entre la ingesta y el gasto energético, se caracteriza por un
exceso en el almacenamiento de lípidos en forma de adipocitos, consecuencia de
un aumento en el consumo de alimentos de alta densidad energética combinado
con una escasa actividad física (Álvarez-Castro et al., 2011; Blancas-Flores et al.,
18
Es la enfermedad más común y perjudicial de la población adulta e infantil,
resultado de múltiples factores fisiológicos, genéticos, metabólicos y sociales que a
su vez enfatizan los factores de riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares,
osteoartritis, resistencia a la insulina, hipertensión, algunos tipos de cáncer y
múltiples desórdenes metabólicos y reproductivos (Bray, 2004; Fernández et al.,
2011).
Con la ganancia de peso se presentan alteraciones endócrinas y
metabólicas, debido a que el tejido adiposo secreta múltiples moléculas que
provienen principalmente del tejido adiposo blanco y desempeñan un papel crucial
en la homeostasis de diversos procesos fisiológicos como la regulación de la
ingesta-gasto energético (leptina, adiponectina, grelina), la respuesta inflamatoria (factor de necrosis tumoral (TNF-α) e interleucinas 1 y 6), la liberación de factores
de crecimiento como el factor de crecimiento transformante beta (TGF- β) y la
función reproductiva. Por lo que los adipocitos no sólo son receptáculos de
almacenamiento de grasas, también poseen actividad secretora y endócrina que
regula el metabolismo mediante la secreción de moléculas fundamentales para la
comunicación celular (Manzur et al., 2010).
El inicio de la pubertad en las niñas es muy sensible al estado nutricional y
las reservas de energía, debido a que la obesidad durante la infancia puede
conducir a un comienzo temprano de la pubertad relacionado a la activación de las
neuronas GnRH por la acción de la leptina como factor estimulante de las neuronas
KNDy, a un incremento de la secreción de insulina y a un aumento de la
concentración de disruptores endócrinos, aunque el mecanismo no se conoce con
exactitud (Sultan et al., 2018).
Por otro lado, la insulina estimula la esteroidogénesis en las células de la teca
y de la granulosa, aumenta el efecto estimulatorio de la LH mediante el aumento de
sus receptores, también actúa a nivel de la hipófisis aumentando la sensibilidad de
los gonadotropos a la GnRH, modula la disponibilidad de los esteroides sexuales
mediante la inhibición de la globulina transportadora de esteroides sexuales
19
insulina reducen las concentraciones de SHGB, lo que promueve el
hiperandrogenismo e incrementa las alteraciones menstruales y ovulatorias,
además el desequilibrio de la proporción LH/FSH también se asocia con un
decremento en la función ovárica (Barrios-De-Tomasi et al., 2013).
Por último, los E2, T y glucocorticoides originados a través de enzimas
expresadas en los adipocitos, influyen en el perfil de esteroides sexuales de las
personas obesas, por ello en mujeres obesas se observa hiperandrogenismo que
pudiera tener efectos fisiopatológicos en la función ovárica y desórdenes
menstruales que repercuten en la ovulación, en la maduración del ovocito, en el
desarrollo del endometrio, en la implantación y en la calidad del embrión, así como
en el incremento en el riesgo de infertilidad y ovario poliquístico (Barrios-De-Tomasi
et al., 2013; Metwally et al., 2007).
De manera que, las mujeres obesas presentan incremento en la producción
de andrógenos y estrógenos, así como de la LH, la insulina y la leptina, mientras
que las concentraciones de adiponectina, grelina y SHBG se encuentran
disminuidas. Todos estos cambios desencadenan consecuencias en sus órganos
diana, principalmente en el ovario y en el endometrio que influyen tanto en el
establecimiento de la pubertad como en el ciclo menstrual y la fertilidad. A pesar de
conocer la relación entre fertilidad y obesidad el mecanismo aun no es bien
entendido (Barrios-De-Tomasi et al., 2013; Jungheim, 2015; Metwally et al., 2007).
OBESIDAD, PROBLEMAS REPRODUCTIVOS Y NOS
Estudios realizados en las últimas décadas apoyan la relevancia del sistema
nervioso simpático tanto en la patogénesis como en las complicaciones de los
órganos diana de pacientes con obesidad, pues se ha reportado que los factores
estresantes tanto psicológicos como fisiológicos pueden perturbar las funciones
neuroendocrinas, reproductivas y metabólicas, estas alteraciones incluyen un
incremento en la actividad simpática que se puede ver reflejada en los niveles de
20
De esta manera el eje hipotálamo hipófisis adrenal (HHA) también se
encuentra implicado tanto en la patogénesis de la obesidad como en desórdenes
reproductivos, ya que es capaz de afectar los mecanismos que regulan la
reproducción al actuar sobre el HHG, aunque la hormona liberadora de
corticotropina (CRH por sus siglas en inglés) no atraviesa la barrera
hematoencefálica, origina un desequilibrio de la secreción de GnRH, que afecta
directamente los patrones de secreción de LH y FSH, además de que estos cambios
incluyen un aumento del contenido de NA ovárico que afectan la función ovárica,
propiciando la formación de quistes ováricos (Kuo et al. 2007; Lara et al., 2002).
El estrés crónico combinado con una dieta alta en grasas y azúcares conduce
a la obesidad al liberarse NPY en el tejido adiposo, estimulando la proliferación y la
diferenciación de adipocitos que provoca la elevación de los niveles de cortisol, lo
que sugiere que éste eje podría estar involucrado en la excitación simpática no sólo
a nivel sistémico sino a nivel gonadal, pues el incremento de la actividad nerviosa
se asocia con cambios en el desarrollo folicular y en la aparición de estructuras
prequísticas en el ovario (Lara et al., 2002).
El estrés intermitente por frío produce cambios en el desarrollo folicular,
hipertrofia de las células de la teca y la presencia de folículos prequísticos, todos
estos cambios son resultado de la activación de los nervios simpáticos, lo cual
coincide con algunas de las características que se observan en el ovario
poliquístico, proceso que parece ser reversible si la actividad simpática es atenuada
(Greiner et al., 2005).
Se sugiere entonces que la primera adaptación fisiológica que se establece
en los organismos para mantener la homeostasis cuando son expuestos a estímulos
estresantes, es reducir el gasto de energía, y la respuesta consecuente pudiera ser
la pérdida de peso o el aumento en la ingesta de alimentos, como se mostró en el
estudio realizado por Dorfman et al. (2009) en donde ratas expuestas a estrés crónico por frío durante 3 h/día por 4 semanas mostraron incremento considerable
21
En un estudio realizado por Gasparetti et al. (2003), en ratas expuestas a estrés crónico por frío muestran pérdida de peso y aumento en la ingesta diaria de
alimento, así como una captación más eficiente de glucosa. Es posible que el estrés
crónico promueva el desarrollo de resistencia a la insulina específicamente a nivel
ovárico por lo que probablemente ésta modifique la liberación de NA, lo que podría
explicar los cambios en el desarrollo folicular observados (Wu et al., 2003; Dorfman
et al., 2009).
En organismos a los que se sometió a periodos de restricción de movimiento
o frío, se observó un incremento en los niveles plasmáticos de NPY y NA, mientras
que el peso corporal no sufrió cambios, a menos que los individuos fueran
alimentados con una dieta alta en grasa. Esto demuestra que el origen patológico
no solo radica en la activación simpática si no en la condición metabólica (Flores et al., 2008; Kuo et al., 2008; Stranznicky et al., 2010a; Stranznicky et al., 2010b).
Paredes et al. (1998) muestran que el estrés crónico por frío en combinación con el estrés por restricción de movimiento induce aumento de la actividad simpática
del ovario, así como incremento de la síntesis de tirosina hidroxilasa adrenaly que
éste aumento está relacionado con la presencia de prequistes foliculares a las 3
semanas de exposición al estrés, mientras que a las 11 semanas de exposición al
estrés se observa una recuperación de la función ovárica, lo que podría indicar un
proceso de adecuación ante situaciones de estrés prolongado. El estrés puede ser
un factor etiológico en el origen del síndrome ovárico poliquístico (SOP) y el
aumento de la actividad noradrenérgica puede ser una característica conspicua a
este fenómeno.
Cuando se realiza la sección quirúrgica bilateral del NOS en ratas que
presentan ovario poliquístico inducido por la inyección de valerato de estradiol (VE),
se observa una reducción de la NA ovárica, así como una recuperación de la función
ovárica, es decir, se recupera la ciclicidad estral y la capacidad ovulatoria, con lo
cual los autores postulan que la alteración del sistema nervioso participa en el
22
que al igual que los organismos que son expuestos ante condiciones estresantes
presentan anomalías reproductivas; debido a esto la obesidad pudiera estar
íntimamente relacionada con la alteración simpática ovárica.
LA RATA ZUCKER COMO MODELO DE OBESIDAD
La rata Zucker representa un modelo de obesidad genética espontánea, debido a la
mutación del gen fa, la cual fue descubierta en 1961 por Lois Zucker en un cruce entre la cepa M de Merck y ratas Sherman. La obesidad vinculada a esta mutación
se hereda como un carácter autosómico recesivo, es decir, que los animales
homocigotos para el alelo fa, más conocidos como ratas Zucker obesas, exhiben obesidad, mientras que los animales heterocigotos son delgados (Aleixandre y
Miguel, 2008).
En el caso de las ratas Zucker obesas presentan obesidad de aparición
juvenil, hiperfagia, disminución del gasto energético y resistencia a la leptina, estas
características originadas por una mutación en el receptor a leptina, la cual es clave
para el balance energético y la función reproductora. Debido a que la leptina
produce inhibición de la ingesta de alimentos e incremento en el gasto energético,
estos organismos presentan grandes cantidades circulantes de leptina. También se
caracterizan por presentar resistencia a la insulina, una hiperproducción de NPY y
altos niveles de adiponectina (De lugo y Jurado, 2006; Aleixandre y Miguel, 2008;
Honma et al., 2010).
Asimismo, estas ratas se caracterizan por presentar diversas alteraciones
reproductivas como son el retraso de la pubertad, ciclos estrales prolongados,
escasa población folicular, comportamiento sexual atenuado y esterilidad (De lugo
y Jurado, 2006; Aleixandre y Miguel, 2008). En un estudio realizado por Honma et al. (2010) en ratas Zucker obesas, muestran que a medida que las ratas maduran, ganan más peso y desarrollan mayor atresia folicular, son acíclicas, presentan
esteroidogénesis reducida y cambios abruptos en los niveles de adiponectina. En
cambio, en las ratas delgadas, los niveles de andrógenos aumentaron
significativamente conforme alcanzan la pubertad con respecto a las ratas obesas,
23
estables hasta las 16 semanas, mientras que en las ratas obesas sucedió lo
contrario, los niveles de andrógenos disminuyeron durante el periodo entre las 12 y
16 semanas de edad, tiempo en el que la atresia folicular progresó, ya que niveles
bajos de andrógenos podrían inhibir el crecimiento folicular.
Las ratas obesas Zucker han resultado ser un excelente modelo experimental
para estudios de obesidad ya que a edad temprana comienzan a presentar signos
de obesidad y empeoran gradualmente, además de contar con múltiples
24 JUSTIFICACIÓN
Las funciones del ovario se encuentran reguladas por elementos endócrinos y
neurales, donde la inervación simpática noradrenérgica que llega vía el NOS
participa en la regulación del desarrollo folicular, ovulación y síntesis de hormonas
esteroideas, es asimétrica y depende tanto de la edad como del día del ciclo estral
del organismo y de su condición fisiológica (Araya et al., 2004; Flores et al., 2011; Kuo et al., 2008; Lara et al., 2002; Morales-Ledesma et al., 2012; Stranznicky et al.,
2010). Debido a que el animal obeso presenta múltiples problemas reproductivos, así como un ambiente de hiperactividad simpática ocasionada por la propia
obesidad, y dado que la relación entre la infertilidad acompañada de obesidad no
ha recibido suficiente atención (Aleixandre y Miguel, 2008; Honnma et al., 2010; Oana et al., 2005), el presente estudio tiene como finalidad generar mayor conocimiento sobre la participación del NOS sobre el desarrollo folicular, la
esteroidogénesis y la ovulación de ratas obesas Zucker.
HIPÓTESIS
En el presente trabajo partimos de la idea de que el animal obeso presenta una
hiperactividad simpática a nivel sistémico ocasionada por la propia obesidad, lo que
puede resultar en alteraciones a nivel gonadal, por lo que postulamos la siguiente
hipótesis:
Si el Nervio Ovárico Superior modula de manera estimulante las funciones ováricas,
y si en el animal obeso se presentan alteraciones en las funciones de la gónada,
entonces eliminar la inervación simpática que llega vía el NOS permitirá el correcto
funcionamiento de la gónada de ratas obesas Zucker, lo que dependerá del nervio
25 OBJETIVO GENERAL
Evaluar en la rata obesa Zucker la participación del Nervio Ovárico Superior sobre
la pubertad, la primera ovulación, el desarrollo folicular, la esteroidogénesis y la
síntesis de catecolaminas ováricas.
OBJETIVOS PARTICULARES
1.- Caracterizar el establecimiento de la pubertad, la primera ovulación, el desarrollo
folicular, la concentración de hormonas gonadotrópicas y esteroideas, la presencia
de fibras positivas a catecolaminas y de la enzima tirosina hidroxilasa en ratas
Zucker obesas.
2.-Evaluar los efectos de la sección unilateral del NOS sobre la edad de la apertura
vaginal y el primer estro vaginal en ratas Zucker obesas.
3.-Analizar los efectos de la sección unilateral del NOS sobre la primera ovulación
en ratas Zucker obesas.
4.-Determinar los efectos de la sección unilateral del NOS sobre la concentración
de hormonas gonadotrópicas y esteroideas de ratas Zucker obesas.
5.-Analizar los efectos de la sección unilateral del NOS sobre la presencia de fibras
positivas a catecolaminas y de la enzima tirosina hidroxilasa en el ovario de ratas
26 METODOLOGIA
Los animales utilizados en este proyecto se obtuvieron y mantuvieron en el Bioterio
Claude Bernard de la BUAP; todos los procedimientos se realizaron de acuerdo a los lineamientos establecidos en la “Guía para el cuidado y Uso de animales de Laboratorio”, las especificaciones establecidas por la Norma Oficial Mexicana
NOM-062-ZOO-1999 y Ley Mexicana de Protección Animal para el uso de animales de
experimentación (De la Federación, 2001). Se aplicaron todos los esfuerzos
encaminados a minimizar el sufrimiento y la cantidad de animales a utilizar en el
proyecto, así como los criterios de manejo, anestesia y eutanasia aprobados por el
comité para el cuidado y uso de animales de laboratorio (CICUAL) de la Benemérita
Universidad Autónoma de Puebla.
Se utilizaron cuarenta y cinco ratas hembras por cepa: Long Evans (LE), Lean Zucker Diabetic Fatty LZDF (Delgada) y Obese Zucker Diabetic Fatty OZDF (Obesa) teniendo un total de 138 ratas. Todos los animales se mantuvieron en condiciones controladas de 12h de luz y 12h de oscuridad y temperatura ambiental
de 22±1 °C, con libre acceso a alimento y agua. Fueron colocados cuatro individuos
por caja.
DISEÑO EXPERIMENTAL
Los animales se recibieron a los 25 días de edad y se asignaron aleatoriamente a
uno de los siguientes procedimientos experimentales (Figura 4), aquellos individuos
sin sección, es decir, sin ninguna intervención quirúrgica fueron utilizados para la
caracterización del establecimiento de la pubertad de la rata Zucker obesa
(experimento 1), mientras la sección unilateral del NOS se realizó a los 32 días de
vida (experimento 2; Figura 5).
Grupos experimentales (nueve animales en cada grupo):
Grupo sin sección (SS): Ratas hembras de los tres fenotipos sin ninguna intervención quirúrgica.
Grupo OSI: Ratas hembras de los tres fenotipos con operación simulada izquierda.
27
Grupo OSD: Ratas hembras de los tres fenotipos con operación simulada derecha.
Grupo SND: Ratas hembras de los tres fenotipos con sección del NOS derecho.
28 Figura 5. Se muestra el diseño experimental, las variables de estudio fueron el peso de los órganos (adrenales, ovarios, útero), la apertura vaginal (AV), el primer estro vaginal (PEV) y el número de cuerpos lúteos (CL).
PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO PARA LA SECCIÓN DEL NOS
Para realizar la sección del NOS los animales fueron anestesiados con
ketamina-xilacina 100mg/ml (0.10ml/100g de peso corporal). Después de anestesiar a los
animales, se procedió a realizar una incisión dorsal de piel y músculo
aproximadamente de 1cm de largo, para acceder al ligamento suspensorio, el cual
lleva al nervio ovárico superior (NOS). Se realizó la sección del nervio de acuerdo
al tratamiento correspondiente y se suturó la herida a planos con hilo absorbible.
En el caso de los individuos con operación simulada, una vez anestesiados
se realizó la incisión dorsal de piel y músculo y sin tocar ningún órgano se realizó la
29 ESTABLECIMIENTO DE LA PUBERTAD
La evaluación de la canalización vaginal se inició al día siguiente de las
intervenciones quirúrgicas, se registró el día de la apertura vaginal que indica el
inicio de la pubertad. A partir de ese momento se realizaron frotis vaginales para
determinar la etapa del ciclo estral, en el día del primer estro vaginal los animales
fueron sacrificados.
PROCEDIMIENTO DE AUTOPSIA
Antes de realizar la autopsia se registró el peso corporal, se sacrificó a los animales
por sobredosis de pentobarbital sódico 63 mg/ml (0.20 ml/100g de peso corporal).
Cuando el animal se encontraba completamente anestesiado, se colectó la sangre
por punción cardiaca, se dejó coagular durante 30 minutos. Posteriormente se retiró
el coagulo y el resto se centrifugó a 3500 rpm durante 15 min (centrifuga VELAB
VE-4000). Se separó el suero en alícuotas de 200µl y se almacenó a -20°C hasta el
momento de la cuantificación hormonal.
Además, al momento de la autopsia se disecaron los ovarios, el útero, las
glándulas adrenales y se pesaron en la balanza de precisión (OHAUS, AS120 con
sensibilidad de 0.1mg). Posteriormente los ovarios fueron sometidos al
procedimiento correspondiente: histología clásica, histoquímica o
inmunohistoquímica según fuera el caso.
Para el caso de los ovarios sometidos a histología clásica fueron fijados en
solución Bouin por 24h, deshidratados en concentraciones crecientes de alcohol
etílico, clareados en cloroformo e incluidos en parafina histológica. Posteriormente
fueron cortados en forma seriada a 10µm y recuperados en portaobjetos, se dejaron
en una cámara húmeda con formol por 24h para su posterior tinción con la técnica
hematoxilina-eosina, se hizo el montaje con resina sintética y se dejaron secar por
dos semanas. Se detectaron y contaron los cuerpos lúteos presentes en el ovario
30 ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN FOLICULAR
El análisis de la población folicular se realizó en lo ovarios derecho e izquierdo de
tres animales por grupo. Los cortes se examinaron bajo un microscopio binocular
(Zeiss, modelo Primo Star Pack 1) y con ayuda de un ocular micrométrico se
contaron y midieron los folículos que tuvieran ovocito con núcleo y nucléolo bien
definidos. Todas las secciones fueron analizadas para detectar la presencia de
quistes y prequistes siguiendo los criterios de Brawer et al. (1986).
Un quiste folicular se definió como aquel folículo desprovisto del ovocito, que
presentó una cavidad antral, gruesa capa de células de la teca y un compartimento
de células de la granulosa delgado (una monocapa). Los folículos prequísticos se
definieron como folículos grandes, con o sin ovocito, formado por cuatro o cinco
capas de células de la granulosa, que rodean un antro grande, con un
compartimento tecal aparentemente normal. Los folículos se clasificaron de acuerdo
al método de Grasa et al. (2017) en secundarios, preantrales, antrales y preovulatorios (Fig. 6). Se obtuvo el diámetro de cada uno de ellos el cual se
promedió a través de dos medidas perpendiculares (Fig. 7).
Abreviatura Tipo de folículo Diámetro del folículo (µm)
S Secundario <200
PA Preantral 200-400
A Antral 400-500
PO Preovulatorio >500
31 Figura 7. Diagrama de las medidas de los folículos que presentaron ovocito con núcleo y nucleolo en los diferentes cortes histológicos de los ovarios. La línea rosa representa el primer diámetro y la línea azul representa el diámetro perpendicular del folículo, ubicando la regla del ocular micrométrico en la membrana basal.
CUANTIFICACIÓN DE HORMONAS
Se realizó la cuantificación de P4, T y E2, así como de LH y FSH del suero obtenido
en la autopsia de cada uno de los grupos experimentales utilizando KITS
comerciales para ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA por sus
siglas en inglés) de la marca Cayman para la cuantificación de P4, T y E2 y de la
marca Unites States Biological para la cuantificación de LH y FSH siguiendo el
procedimiento establecido por el kit (Fig. 8).
Figura 8. Esquema del procedimiento general del ELISA. Obtenido y modificado de LaboratoryInfo (2018).
