EL CULTIVO DE SINOVIOCITOS TIPO A Y B CON FINES TERAPÉUTICOS EN

Adolfo Lorenzo Rojas UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOANALISIS

EXPERIENCIA EDUCATIVA:

Métodos de cultivo celular

B B

E E

E

A

B

.

NOMBRE DEL CATEDRÁTICO:

Dr. Enrique Juárez Aguilar

ALUMNO:

Adolfo Lorenzo Rojas

Séptimo Periodo

Xalapa, Veracruz a 03 de diciembre de 2009

Adolfo Lorenzo Rojas EL CULTIVO DE SINOVIOCITOS TIPO A Y B CON FINES TERAPÉUTICOS EN PACIENTES

JÓVENES CON GONARTROSIS CAUSADA POR SOBREPESO.

Introducción

Dentro de la patología traumática, la rodilla es probablemente la articulación más estudiada;

presenta algunas características que la diferencian del resto de las grandes articulaciones. La principal es que está compuesta por el juego de tres huesos, fémur, tibia y rótula. Los dos primeros conforman el cuerpo principal de la articulación, que soporta el peso corporal, y la rótula cumple una misión atípica, a modo de polea sobre la que se apoyan los tendones cuadricipital y rotuliano.

Es además una articulación bicondílea. Los dos cóndilos femorales ruedan sobre la superficie casi plana de los platillos tíbiales. El apoyo de un hueso sobre otro es libre, sin topes óseos para mantenerla y necesita el amarre de los ligamentos.

Todas las superficies de deslizamiento articular están cubiertas por cartílagos protectores del hueso en las zonas de contacto. La fricción anómala, por mala captación de superficies o por sobrecarga, provoca alteraciones patológicas en estos cartílagos. El hueso, al perder su protección, también sufre daños estructurales. Toda la articulación sufriría un proceso degenerativo, ocasionando con el tiempo una artrosis.

Existe, por tanto, una cubierta cartilaginosa para ambos cóndilos femorales, platillos tíbiales y facetas rotulianas. La capa de cartílago es más gruesa en los puntos de mayor fricción. En el fémur lo es en la porción media de los cóndilos y en la garganta de la tróclea. En la tibia aumenta en el centro de las cavidades glenoideas o platillos, y se adelgaza en la periferia. Los meniscos o fibro-cartílagos semilunares, internos y externos, constituyen otra forma de estructura cartilaginosa en el interior de la rodilla.

Ambos meniscos poseen anclajes que evitan su desplazamiento y los mantienen en su posición periférica. Los cuernos, anterior y posterior, de

Adolfo Lorenzo Rojas ambos meniscos poseen inserciones propias. Además, todo el contorno externo del menisco está unido a la cápsula articular, lo que ayuda a mantener su posición.

 El ligamento menisco-femoral sujeta el cuerno posterior del menisco externo a la escotadura intercondílea.

 El ligamento transverso une por delante los dos meniscos ⁽¹⁾.

Las superficies articulares están recubiertas de una delgada capa de cartílago articular.

Generalmente este cartílago es de una variedad de cartílago hialino. Es un elemento que actúa de almohadillado y no está vascularizada (no tiene venas) ni inervada (no tiene nervios). Está especialmente adaptado a las fuerzas de fricción, para combatir el desgaste óseo.

Anexos a las superficies articulares se encuentran los siguientes elementos:

Capsula articular: Entre las superficies óseas de las diartrosis, se tiende un manguito fibroso que es la cápsula articular. Cierra las dos superficies articulares, haciendo que se produzca una cavidad. Tiene naturaleza fibrilar, se encuentra constituida por colágeno que se colocan en dos capas o estratos:

 Estrato superficial: son fibras de colágeno que se disponen longitudinalmente. Su misión es impedir que las fuerzas de tracción separen las superficies articulares.

 Estrato profundo: la disposición de las fibras varía; unas tienen una dirección oblicua y otras se disponen circularmente. Esta disposición impide las fuerzas de presión o torsión sobre las superficies articulares.

Membrana sinovial: Recubre la cara interna de la cápsula articular, y hace un pliegue en las inserciones capsulares (es como si la membrana fuese más grande que la cápsula y tuviese que hacer una "arruga" en las zonas inmediatamente continuas). Está muy vascularizada e inervada. Es la encargada de generar un líquido hacia el interior de la articulación llamado: líquido sinovial. Está formada por dos tipos de células:

 Sinoviocitos A

 Sinoviocitos B

Adolfo Lorenzo Rojas Líquido sinovial: Gracias a este líquido el cartílago se nutre por difusión. Se está continuamente regenerando ya que la membrana sinovial está constantemente absorbiendo líquido y fabricándolo para que exista un equilibrio entre formación y absorción.

Cartílago articular: La superficie articular y el cartílago articular forman una unidad anatómica-funcional, una unidad mecánica, y no sufre fenómenos de inflamación.

Por el contrario la cápsula articular y la membrana sinovial forman una unidad reactivo- inflamatoria. Tras un golpe fuerte la membrana sinovial genera más líquido que es lo que produce la inflamación de la articulación.

El cartílago articular se encuentra ubicado sobre las superficies articulares. Cuando la osificación llega a las superficies articulares, el cartílago articular no se osifica, sigue siendo una maqueta cartilaginosa elástica y maleable ⁽⁴⁾.

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Planteamiento del problema

Las articulaciones son los puntos de unión entre dos o más huesos, permiten el movimiento del aparato locomotor y ayudan a amortiguar las fuerzas reactivas que inciden sobre el cuerpo al movernos; con el paso del tiempo nuestras articulaciones se van desgastando, lo cual puede provocar una patología llamada artrosis. El desgaste de las articulaciones entre los huesos de las rodillas se denomina gonartrosis, misma que puede ser producto de un proceso normal con el aumento de la edad, o bien puede presentarse en personas menores de 65 años debido al aumento de peso (obesidad) o por malformaciones óseas en esta zona.

La osteoartritis de rodilla es una enfermedad que afecta con mayor frecuencia a las personas mayores de 65 años de edad, principalmente mujeres, pero no excluye a personas jóvenes. Afortunadamente se cuenta con marcadores serológicos que orientan al pronóstico oportuno de la enfermedad ⁽³⁾, lo cual debería ser aprovechado para evitar futuras repercusiones en la morfología de las articulaciones propias de las rodillas. Es por esa razón que sería muy acertado conocer una metodología alternativa como tratamiento de la gonartrosis utilizando la terapia celular.

La aplicación de la terapia celular en la regeneración del la membrana sinovial, la cual recubre la cara interna de la capsula articular y hace un pliegue en las inserciones capsulares, se enfoca a la obtención de sinoviocitos, que como se mencionó anteriormente, se pueden presentar en dos tipos:

 Sinoviocitos A.- Células de defensa que fagocita las estructuras extrañas.

 Sinoviocitos B.- Células que fabrican líquido sinovial.

Gracias a este líquido el cartílago se nutre por difusión. Tiene un pH idóneo para que no puedan nacer gérmenes en su interior impidiendo las infecciones de huesos, es un mal medio de cultivo. Permite recoger los detritos (desechos) del cartílago, por lo tanto limpia la articulación y también la lubrica, por lo que gracias a él hay un menor rozamiento entre las superficies articulares y habrá más facilidad para que se desplacen.

Adolfo Lorenzo Rojas Este líquido sinovial se está continuamente regenerando ya que la membrana sinovial está constantemente absorbiendo líquido y fabricándolo para que exista un equilibrio entre la formación y absorción. Está compuesto principalmente por agua (90%) y está desprovisto de células, salvo cuando se produce el deterioro del cartílago articular, que se descaman las células del cartílago y flotan en el líquido.

El cartílago articular se encuentra ubicado sobre las superficies articulares. Cuando la osificación llega a las superficies articulares, el cartílago articular no se osifica, sigue siendo una maqueta cartilaginosa elástica y maleable. Su composición es: 80% agua, 14% sustancias orgánicas y 6% sustancias minerales. Su grosor oscila entre 1 y 5 mm. y será más grueso en la rodilla, en la cadera, en general en las articulaciones inferiores que son las que reciben más peso y por lo tanto necesitan más cartílago.

Es importante dejar claro que la aplicación de la terapia celular en la gonartrosis podría ser viable en estadios no severos de la enfermedad, debido a que no hay daños muy significativos en las articulaciones y sobre todo en la membrana sinovial.

El diagnóstico temprano de la gonartrosis en pacientes obesos y relativamente jóvenes sería un punto clave para la aplicación de la terapia celular de acuerdo a los siguientes criterios diagnósticos:

Clínicos

 Dolor en la rodilla

 Crepitaciones en el movimiento activo

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 Rigidez matutina menor de 30 minutos

 Edad mayor de 38 años

Radiológicos Presencia de:

 Disminución del espacio articular

 Osteofitos

 Esclerosis sub condral

 Quistes

Clasificación (Ahlbäck): su aplicación se apoya en utiliza una radiografía AP con carga de peso y medir el espacio articular; los hallazgos se agrupan en grados:

GRADO HALLAZGOS

I Disminución del espacio articular.

II Obliteración del espacio articular.

III Compresión ósea ligera (<5 mm).

IV Compresión ósea moderada (5-10 mm).

V Compresión ósea severa (>10 mm).

En base a lo anterior se tiene que los estadios tempranos de la gonartrosis son el I y II ⁽⁸⁾. Como se puede observar en la tabla anterior en los estadios I y II aún no hay daño en cuanto a la morfología y función de la rodilla aunque se pueden hacer manifiestas una serie de molestias que el médico puede detectar durante la exploración física.

De acuerdo a lo explicado anteriormente se puede determinar que el fin del cultivo celular sería el obtener a los sinoviocitos, los cuales son las células constituyentes del líquido sinovial, encargados de fabricar largas cadenas de polímeros de azúcar llamadas hialuronano y lubricina

Adolfo Lorenzo Rojas (células B) y de remover las sustancias indeseables del liquido sinovial tales como eritrocitos, células muertas de la misma membrana sinovial, así como bacterias (células A).

Se puede concluir que el momento más acertado para aplicar la terapia celular con los sinoviocitos en la gonartrosis es en los estadios III y IV, porque es aquí cuando hay una alteración presente en las estructuras óseas y en algunos casos se comienza tener una hipertrofia de la membrana sinovial formándose unos mamelones sinoviales, que a la larga sufren un proceso de condroificación y osificación. La separación de éstos mamelones puede conducir a la formación de cuerpos libres intra-articulares, y es ahí donde podrían actuar los sinoviocitos A (para remover sustancias indeseables) además de alternar con los sinoviocitos B desempeñando su función (brindar lubricación y fabricar ácido hialurónico) permitiéndole al médico y nutriólogo disminuir el peso del paciente mientras la membrana sinovial recobra su función y morfología original.

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Estrategia

El conocer la constitución del líquido sinovial, que es donde se encuentran inmersas las células que se desean cultivar, permite determinar las fuentes de donde se podrían obtener las muestras idóneas para comenzar con el cultivo celular de sinoviocitos.

La composición del líquido sinovial es la de un ultrafiltrado del plasma, con la misma composición iónica ⁽²⁾. Aunque es pobre en proteínas, este puede presentar componentes del complemento y anticuerpos antinucleares, lo cual podría repercutir en una respuesta inmunológica del paciente frente al tratamiento con células provenientes de otro organismo; es por esa razón que la fuente de células para el cultivo debe provenir del mismo paciente para evitar reacciones adversas a la transfusión de las células o algún tipo de rechazo de las mismas durante la terapia.

La obtención del líquido sinovial se podría llevar a cabo mediante una técnica diagnóstica que se realiza en todas las articulaciones diartrodiales siempre que exista una acumulación de líquido en su interior. Esta técnica se llama artrocentesis y se puede obtener una mínima cantidad de líquido en algunas articulaciones sanas, como la rodilla o el metatarso del dedo gordo del pie. La complicación más temible por este método es la infección, por lo que debe hacerse con técnica adecuada de asepsia. Está contraindicada cuando existan lesiones cutáneas en el lugar de la punción, alteraciones graves de la coagulación y durante episodios de bacteriemia, aunque cuando se sospecha una artritis séptica no hay contraindicaciones absolutas ⁽⁷⁾, lo cual no es el caso de la gonartrosis en los estadios III y IV.

En cuanto a las condiciones del medio de cultivo de los sinoviocitos, de acuerdo a las características físicas y químicas del líquido sinovial, se necesitaría un medio que proporcione una consistencia viscosa, una densidad aproximadamente de 1.010 g/ml, una cantidad de proteínas inferior a 2.5 g/dl, bajas concentraciones de glucosa, nitrógeno no proteico (urea y ácido úrico) entre 20 y 40 mg/dl y un pH generalmente de 7.4 ⁽²⁾.

El medio de cultivo ideal sería un medio en suspensión, con el fin de obtener un ambiente muy parecido en el que se encuentran los sinoviocitos procedentes del líquido sinovial.

Adolfo Lorenzo Rojas Un medio que aporta algunas de las características del líquido sinovial anteriormente mencionadas es el Medio RPMI 1640, el cual fue desarrollado en 1966 por Moore y sus colaboradores del Roswell Park Memorial Institute. Este medio fue formulado para mantener fibroblastos en suspensión, hoy en día se utiliza para el mantenimiento de numerosas líneas celulares e hibridomas ⁽⁶⁾.

La composición de dicho medio de cultivo es la siguiente ⁽⁸⁾:

Esta mezcla de sales enriquecida con aminoácidos y otros componentes esenciales para el crecimiento celular actúa como una solución nutritiva en el cultivo celular. La presentación del Medio RPMI 1640 puede ser en polvo o en forma líquida ⁽⁶⁾, esta última presentación se utilizaría para la obtención de los sinoviocitos.

En base a lo anterior se puede determinar que el recipiente de cultivo que se utilizaría seria el frasco de Roux, el cual se encuentra disponible en diferentes tamaños, es recomendable para el

Adolfo Lorenzo Rojas mantenimiento de las líneas y la producción de células, o bien para el crecimiento de células en suspensión ⁽¹⁰⁾.

La manera de aplicar la terapia celular en pacientes relativamente jóvenes con gonartrosis producida por sobrepeso podría ser el mismo método por el cual se obtuvo la muestra de líquido sinovial.

La artrocentesis podría ser utilizada como la técnica por la cual se introduzcan los sinoviocitos obtenidos del cultivo celular, de la misma manera se necesitaría una limpieza en toda la zona de punción para evitar infecciones a la hora de la punción interarticular.

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Resultados esperados

Los resultados esperados del cultivo celular en el medio RPMI 1640 (en suspensión) sería la proliferación de sinoviocitos A y B en una pequeña cantidad de líquido sinovial, el cual se formaría a partir de dichas células contenidas en el frasco de Roux.

Para la identificación y diferenciación microscópica de los sinoviocitos se podría hacer una tinción con Hematoxilina y Eosina, en la que se buscaría la siguiente morfología:

Sinoviocitos A: Se observarían al microscopio con aspecto macrofágico, con abundantes microvellosidades superficiales y algunos lisosomas.

Sinoviocitos B: Se observarían al microscopio fibroblastos con la presencia de un claro Retículo Endotelial Rugoso ⁽⁵⁾.

Es importante señalar que para seguir expandiendo el cultivo celular, se tendrían que conservar en nitrógeno líquido algunas de las células obtenidas, en caso de que el paciente lo requiera en un futuro.

Como se mencionó anteriormente, los sinoviocitos A y B se introducirían al paciente mediante la técnica de artrocentesis permitiendo una regeneración celular de la membrana sinovial y con esto una mejoría notable en el paciente menor de 65 años de edad con gonartrosis causada por sobrepeso.

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Referencias bibliográficas

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