A mi familia, A mis padres Emma y Augusto, y A mis hermanas
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(25) A mi familia, A mis padres Emma y Augusto, y A mis hermanas.
(26) Agradecimientos. A la doctora Beatriz Lizárraga por la oportunidad y apoyo en la realización de este trabajo y al Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos donde se realizó el trabajo.. Al Blgo. Hernán Mendoza y a los técnicos de laboratorio Irma Sifuentes, Sofía Orellana, Jaime Huamani y Christian Vera por el apoyo e instrucción técnica.. A los Blgs. Olimpio Ortega, Raúl Tito y Gian Carlo Iannacone por el apoyo y asesoría técnica.. A mis compañeros de laboratorio Susan Polo y Rolando Martinez.. A los donantes de muestra, pobladores de la provincia de Andahuaylas, quienes con su participación hicieron posible que este estudio se llevara a cabo..
(27) ÍNDICE. Página. 1. RESUMEN SUMMARY. 1 2. 2. INTRODUCCIÓN. 3. 3. OBJETIVOS. 10. 3.1. OBJETIVO GENERAL 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. MATERIAL BIOLÓGICO. 11. 4.1.1. POBLACIÓN DE ESTUDIO 4.1.2. TAMAÑO DE LA MUESTRA. 4.2. MÉTODOS DE MUESTREO. 12. 4.2.1. PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS 4.2.2. PROCEDIMIENTOS DE RECOLECCIÓN DE MUESTRA. 4.3. MÉTODOS DE EXPERIMENTACIÓN. 13. 4.3.1. AISLAMIENTO DEL ADN 4.3.1.1. 4.3.1.2.. 4.3.2. 4.3.3. 4.3.4. 4.3.5.. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE SANGRE PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE ENJUAGUE BUCAL. CUANTIFICACIÓN DEL ADN PROTOCOLO DE PCR MÚLTIPLEX VISUALIZACIÓN DE LOS AMPLIFICADOS IDENTIFICACIÓN DE LOS ALELOS. 4.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS. 16. 4.4.1. DETERMINACIÓN DE LAS FRECUENCIAS ALÉLICAS DE LA POBLACIÓN 4.4.2. ANÁLISIS DE EQUILIBRIO GENÉTICO Y COMPARACIÓN CON POBLACIONES MUNDIALES 4.4.3. RELACIONES FILOGENÉTICAS. 5. RESULTADOS 5.1. BANCO DE MUESTRAS DE ADN 5.2. IDENTIFICACIÓN DE LOS ALELOS, FRECUENCIAS ALÉLICAS y ANÁLISIS DE EQUILIBRIO GENÉTICO 5.3. COMPARACIÓN CON POBLACIONES MUNDIALES 5.4. RELACIONES FILOGENÉTICAS. 18 18 21 23. 6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS. 25. 7. CONCLUSIONES. 28. 8. RECOMENDACIONES. 29. 9. ILUSTRACIONES. 30. 10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 34. 11. ANEXOS. 38. 12. GLOSARIO. 46.
(28) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. 1. RESUMEN La variabilidad genética en una muestra poblacional de 49 individuos no emparentados de la provincia de Andahuaylas, fue analizada con los marcadores microsatélites TPOX y TH01 mediante la técnica de PCR múltiplex. Los amplificados fueron separados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y visualizados por tinción con nitrato de plata. Ambos loci resultaron polimórficos, con 5 alelos en cada loci, y se encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg. La heterocigosidad de los loci TPOX y TH01 presentaron valores bajos en comparación con lo reportado en otras poblaciones mundiales; lo cual determinó que la variabilidad genética de la población estudiada, medida por la heterocigosidad promedio por locus, resultara baja. Se estimaron valores de FST como medida de subdivisión poblacional en ambos loci, entre la muestra poblacional de Andahuaylas y poblaciones caucásicas, asiáticas, africanas, oceánicas y algunas relacionadas, en cuanto su origen, a la muestra poblacional estudiada. No se encontró subdivisión genética con la muestra poblacional peruana de Mesa Redonda (Tito y col., 2004) en los loci TPOX y TH01, ni con una muestra poblacional de hispanos residentes en Estados Unidos reportada por Budowle y col. (1999) y la población Mapuche de Argentina (Tourret y col., 1999) en el locus TPOX. Se corroboró una fuerte correlación genética con la población de Mesa Redonda mediante el análisis de las distancias genéticas de Reynolds representadas en un árbol filogenético neighborjoining.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 1.
(29) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. SUMMARY A population study in a sample of 49 unrelated individuals from the Province of Andahuaylas (Southern Peru) was carried out using the TPOX and TH01 STRs markers, in order to estimate their level of genetic variability. The two loci were typified by PCR multiplex. The PCR products were separated by electrophoresis on gel polyacrylamide and visualized by silver staining. Both loci were polymorphic, with 5 alleles each one, and met Hardy-Weinberg expectations. In both loci, the heterozygosity showed values that were low in comparison with world populations. The genetic variability of the Andahuaylas population, measured as the average heterozygosity per locus, was low. FST were calculated as a measure of population subdivision, between the Andahuaylas population and others world populations, in both loci. No appreciable genetic subdivision was found with the Peruvian Mesa Redonda Lima population (Tito et al., 2004) in both loci, and in the TPOX locus with a sample of Hispanic population from United States reported by Budowle et al. (1999) and The Mapuche population from Argentina (Tourret et al., 1999). The Reynolds’ distances represented in a neighborjoining tree confirmed the great genetic correlation with Mesa Redonda Lima population.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 2.
(30) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. 2. INTRODUCCIÓN El estudio de la variabilidad a nivel del ADN y la caracterización de marcadores moleculares en el siglo XX, fueron posibles a partir del desarrollo de nuevas técnicas de biología molecular durante las décadas del '70 y '80, tales como los métodos de hibridación (Kohne, 1970), los métodos de clonación de ADN (Jackson y col., 1972), los métodos de secuenciación (Sanger y col., 1977), el corte con enzimas de restricción (Smith, 1979) y la técnica de PCR (Polimerasa Chain Reaction; Mullis y col., 1986). Los estudios de secuencia del ADN humano han revelado la existencia de secuencias repetitivas en tandem en muchos sitios a lo largo de todos los cromosomas, que varían en el número de veces que la unidad de repetición está presente (Jeffreys y col., 1985; Nakamura y col., 1987; Weber y May, 1989). Los primeros trabajos, publicados a mediados de la década del '80, empleaban fragmentos de ADN obtenidos por digestión con enzimas, separados por electroforesis y transferidos a un soporte sólido, el cual se trataba con una "sonda" constituida por secuencias complementarias de las regiones variables, marcada radiactivamente; por autorradiografía, resultaba posible observar varias bandas, de localización desconocida dentro del genoma, pero que eran características de cada individuo y se heredaban de padres a hijos (Jeffreys y col., 1985). Cuando la unidad repetitiva del marcador genético es corta, de 2 a 7 nucleótidos, se les denomina microsatélites, o “short tandem repeats” (STRs) mientras que si la secuencia repetitiva es de 8 a 64 nucleótidos se les denomina minisatélites. También se ha acuñado el término “variable number tandem repeat” (VNTR) para designar a los minisatélites, aunque esto se presta a confusión porque todos estos polimorfismos, finalmente, representan alguna forma de repetición en tandem (Nakamura y col., 1987). En el genoma nuclear se han descrito miles de microsatélites multialélicos con un alto grado de heterocigosidad en todas las poblaciones estudiadas hasta la fecha (Pérez y TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 3.
(31) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. col., 2003; Butler y col., 2003; Budowle y col., 2001, Cabrera y col., 1995; Edwards y col., 1991). Los microsatélites también han resultado de mucha utilidad para resolver casos de paternidad e identidad (Alford y col., 1994; Hammond y col., 1994; Santos y col., 1993), y en el análisis de la variabilidad genética en muestras poblacionales globales para definir sus relaciones evolutivas e historias demográficas (Hutz y col., 2002; Mesa y col., 2000; Calafell y col., 2000,1998; Pérez-Lezaun y col., 1997). En cambio, los marcadores clásicos (de tipo sanguíneos, proteínas séricas, HLA, etc.) son muy pocos y tienen una variabilidad fenotípica limitada y en la mayoría de los casos, enmascara una variabilidad genotípica mayor. Por esta razón la tendencia actualmente en el ámbito mundial es utilizar a los STRs (Ruitberg y col., 2001); y entre éstos se emplean preferentemente al grupo de las repeticiones de secuencia tetranucleotídicas, debido a que son más estables durante el proceso de amplificación y plantean menos problemas de tipificación en comparación con las repeticiones di- y trinucleotídicas (Walsh y col., 1996; Paulson y col., 1999). Mediante la técnica de PCR (Saiki y col., 1985), se logra replicar la secuencia de repeticiones en tandem de los STRs, para lo cual se emplean iniciadores o “primers” que flanqueen la zona de interés (Jeffreys y col., 1985). Esta región es amplificada por una ADN polimerasa durante ciclos térmicos adecuados, lográndose millones de copias de la región. Los alelos de estos loci son diferenciados por el número de copias de la secuencia repetida contenida dentro de la región amplificada y son distinguidas uno del otro usando detección radioactiva, fluorescente o por tinción con nitrato de plata, luego de la separación electroforética. Los STRs TPOX y TH01 son marcadores microsatélites utilizados comúnmente en sistemas de identificación humana, como el CODIS (Combined DNA Index System, sistema combinado de indexación de ADN; Figura 1) en el cual estos dos están incluidos entre los trece marcadores empleados por la Oficina Federal de Investigación (FBI, por sus siglas en ingles) de los Estados Unidos para la identificación de individuos. En consecuencia, las frecuencias alélicas de estos marcadores han sido ampliamente reportados en varias poblaciones a nivel mundial, mostrando diferencias entre los grupos poblacionales estudiados. Uno de los trabajos realizados sobre poblaciones humanas que reporta frecuencias alélicas para estos dos marcadores, entre otros, ha sido el realizado por Steven y col. (1998). Estos investigadores estudiaron diversos grupos poblacionales de los Estados Unidos (Tablas 1 y 2); uno de estos TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 4.
(32) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. grupos poblacionales lo constituyeron una muestra de inmigrantes hispanoamericanos, cuyas frecuencias alélicas eran usadas como referencia para análisis de parentesco e identificación humana en poblaciones latinoamericanas como la población peruana.. Figura 1. Posición cromosómica de los 13 loci del CODIS, entre los cuales se encuentran el TPOX y el TH01; además se muestra el marcador genético del sexo, amelogenina. Figura tomada de la dirección electrónica: www.cstl.nist.gov/ biotech/strbase/fbicore.htm.. Tabla 1. Frecuencias alélicas de TPOX para las poblaciones Afro-Americana, Caucásico-Americana e Hispano-Americana, según Steven y col. (1998). Población Homocigotos Heterocigoto Total de muestra Alelos 6 7 8 9 10 11 12 13 Total. AfroCaucásicoHispanoAmericana Americana Americana 55 76 72 166 139 148 221 215 220 Frecuencia Frecuencia Frecuencia 0.050 0.002 0.005 0.034 0.000 0.002 0.353 0.528 0.502 0.192 0.093 0.089 0.113 0.056 0.052 0.210 0.284 0.248 0.048 0.037 0.102 0.000 0.000 0.000 1.000 1.000 1.000. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 5.
(33) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. Tabla 2. Frecuencias alélicas de TH01 para las poblaciones Afro-Americana, Caucásico-Americana e Hispano-Americana, según Steven y col. (1998). Población Homocigotos Heterocigotos Total de muestra Alelos 5 6 7 8 9 9.3 10 11 Total. AfroCaucásicoHispanoAmericana Americana Americana 60 50 54 161 163 166 221 213 220 Frecuencia Frecuencia Frecuencia 0.005 0.007 0.000 0.152 0.237 0.239 0.376 0.148 0.309 0.233 0.117 0.086 0.127 0.155 0.139 0.090 0.331 0.218 0.018 0.005 0.009 0.000 0.000 0.000 1.000 1.000 1.000. Tabla 3. Información específica de los loci TPOX y TH01. GENBANK es la base de datos de secuencias génicas del Instituto Nacional de Salud (NIH, por sus siglas en ingles) de los Estados Unidos disponible en Internet en la dirección electrónica: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html LOCUS STR. LOCALIZACIÓN NOMBRE DEL LOCUS EN EL GENBANK, CROMOSÓMICA DEFINICIÓN DEL LOCUS. TPOX. 2p23–2pter. TH01. 11p15.5. HUMTPOX, Gen de la peroxidasa tiroidea humana (Human thyroid peroxidase gene) HUMTH01, Gen de la tirosina hidroxilasa humana (Human tyrosine hydroxylase gene). TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. SECUENCIA REPETIDA. AATG. AATG. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 6.
(34) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. El STR TPOX (GenBank M68651) se ubica en el cromosoma 2 humano, insertado en el décimo intrón del gen de la peroxidasa tiroidea (localización cromosómica: 2p23-2pter); conteniendo repeticiones del tipo (AATG)n (Anker y col., 1992) (ver Tabla 3 y Figura 2), donde n puede ser 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14 (10 alelos) (Tabla 4).. Figura 2. Secuencia del STR TPOX del GenBank (M68651), que presenta 11 repeticiones de la secuencia (AATG); además, se aprecia la posición de alineamiento de los “primers” reportados por Huang y col. (1995), marcado por las flechas. Figura modificada de la dirección electrónica: www.cstl.nist.gov/ biotech/strbase/images/tpox.jpg. Tabla 4. STR TPOX Tamaños de los alelos y estructura de las repeticiones usando los iniciadores reportados por Huang y col. (1995). pb: pares de bases. ALELO. FRAGMENTO ESTRUCTURA DE AMPLIFICADO LAS REPETICIONES. 5. 220 pb. [AATG] 5. 6. 224 pb. [AATG] 6. 7. 228 pb. [AATG] 7. 8. 232 pb. [AATG] 8. 9. 236 pb. [AATG] 9. 10. 240 pb. [AATG] 10. 11. 244 pb. [AATG] 11. 12. 248 pb. [AATG] 12. 13. 252 pb. [AATG] 13. 14. 256 pb. [AATG] 14. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 7.
(35) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. Por otro lado, el STR TH01 (GenBank D00269) esta localizado en el cromosoma 11, insertado en primer intrón del gen de la tirosina hidroxilasa humana (localización cromosómica: 11p15.5); conteniendo repeticiones del tipo (AATG)n (Edwards y col., 1991; Polymeropoulos y col., 1991) (ver Tabla 3 y Figura 3), donde n puede ser 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 (Tabla 5). Este locus tiene los alelos 8.3, 9.3 y 10.3 en los cuales la delecion de una base (una Adenina) está presente en los alelos que contienen 9, 10 y 11 repeticiones, respectivamente. Figura 3. Secuencia del STR TH01 del GenBank (D00269), que presenta 9 repeticiones de la secuencia (AATG); además, se aprecia la posición de alineamiento de los “primers” reportados por Edwards y col. (1991), marcado por las flechas. Figura modificada de la dirección electrónica http://www.cstl.nist.gov/ biotech/strbase/images/th01.jpg.. Tabla 5. STR TH01 Tamaños de los alelos y estructura de las repeticiones usando los iniciadores reportados por Edwards y col. (1991). pb: pares de bases. ALELO. FRAGMENTO AMPLIFICADO. ESTRUCTURA DE LAS REPETICIONES. 4. 175 pb. [AATG] 4. 5. 179 pb. [AATG] 5. 6. 183 pb. [AATG] 6. 7. 187 pb. [AATG] 7. 8. 191 pb. [AATG] 8. 8.3. 194 pb. [AATG] 5 ATG[AATG] 3. 9. 195 pb. [AATG] 9. 9.3. 198 pb. [AATG] 6 ATG[AATG] 3. 10. 199 pb. [AATG] 10. 10.3. 202 pb. [AATG] 6 ATG[AATG] 4. 11. 203 pb. [AATG] 11. 12. 207 pb. [AATG] 12. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 8.
(36) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. El presente estudio pretende establecer una base de datos de parámetros genético poblacionales (frecuencias alélicas, heterocigosidad y cumplimiento de equilibrio de Hardy-Weinberg) para los marcadores genéticos STRs TPOX y TH01 en una muestra poblacional de la provincia de Andahuaylas (en la figura 4 se muestra su localización geográfica); los cuales podrán ser utilizados en: 1.) Estudios de caracterización genética, mediante el análisis del polimorfismo o variabilidad; 2.) En la práctica forense, para llevar a cabo pruebas de identificación genética y establecer relaciones de parentesco entre individuos en los casos de paternidad; 3.) En el análisis de secuencias conservadas para ubicar genes de interés y estudios de asociación entre patologías humanas y estos marcadores genéticos. Además, los datos de frecuencia alélicas proporcionados por este estudio nos permitirán compararlos con las frecuencias reportadas en otras poblaciones mediante el estadístico FST de Wright (1965) y la distancia genética de Reynolds (1983), a fin de determinar la correlación genética existente entre las poblaciones analizadas. Figura 4. Localización geográfica de la provincia de Andahuaylas.. Por otro lado, este estudio pretende aportar al establecimiento de una base de datos de marcadores microsatélites de la población peruana en general, para su aplicación en estudios. de. genética. de. poblaciones,. identificación. genética. y. ligamiento. enfermedades.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 9. de.
(37) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. 3. OBJETIVOS. 3.1. OBJETIVO GENERAL •. Establecer parámetros genético poblacionales en la población de Andahuaylas con. el fin de determinar la estructura genética para los marcadores STRs TPOX y TH01 y su correlación con otras poblaciones.. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS •. Determinar las variantes alélicas de los marcadores TPOX y TH01 en la muestra. poblacional en estudio. •. Determinar las frecuencias alélicas de los marcadores TPOX y TH01 en la. muestra poblacional en estudio. •. Determinar si la muestra poblacional en estudio se encuentra en equilibrio. genético de Hardy-Weinberg para cada marcador. •. Determinar la correlación genética existente entre la muestra poblacional en. estudio y otras poblaciones mundiales, mediante el estadístico FST de Wright (1965), en los loci TPOX y TH01. •. Establecer relaciones filogenéticas entre la muestra poblacional en estudio y otras. poblaciones mundiales mediante la distancia genética de Reynolds (1983), a partir de las frecuencias alélicas de los loci TPOX y TH01.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 10.
(38) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. 4. MATERIALES Y MÉTODOS. 4.1. MATERIAL BIOLÓGICO. 4.1.1. POBLACIÓN DE ESTUDIO. La población en estudio la constituye una muestra poblacional de la provincia de Andahuaylas. A todos los participantes se les brindo información acerca de los alcances y objetivos del presente estudio. Así mismo, se les invito a participar de manera libre y voluntaria para lo cual debieron donar una muestra de sangre o de enjuague bucal a usarse en la presente investigación. 4.1.2. TAMAÑO DE LA MUESTRA. La muestra analizada para el presente trabajo esta constituida por 49 personas no emparentadas entre sí (Tabla 15, en anexos), las cuales fueron seleccionadas de acuerdo a los siguientes criterios:. Criterios de inclusión •. Personas cuya ascendencia por dos generaciones atrás hayan nacido en uno de los distritos de la provincia de Andahuaylas.. •. Personas mayores de 18 años.. •. Personas que accedan a participar en el estudio y firmar un consentimiento convenido.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 11.
(39) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. Criterios de exclusión •. Personas cuya ascendencia por dos generaciones atrás no hayan nacido en uno de los distritos de la provincia de Andahuaylas.. •. Personas no mayores de 18 años.. •. Personas que no accedan a participar en el estudio ni firmar un consentimiento convenido.. 4.2. MÉTODOS DE MUESTREO. 4.2.1. PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS. Se aplicó una encuesta a las personas que aceptaron a participar en este estudio, a fin llenar una ficha de datos, como el lugar de nacimiento y nombre de sus padres y abuelos (ver anexos, Pág. 39). Luego, se solicitó al participante que firme una hoja de consentimiento (ver anexos, Págs. 40 y 41) en la cual acuerda entrar al estudio de manera. libre. y. voluntaria.. Seguidamente. se. invitó. al. participante. seguir. el. procedimiento para la toma de muestra.. 4.2.2. PROCEDIMIENTOS DE RECOLECCIÓN DE MUESTRA. La toma de muestra se realizó usando uno de los siguientes procedimientos: •. El participante realizó un enjuague bucal con 20 ml de una solución conocida. comercialmente como Listerine, la cual se depositó directamente a un tubo de centrífuga de 50 ml estéril.. •. Un técnico especialista extrajo una pequeña muestra de sangre venosa, 5 ml,. mediante el sistema de vacío usando tubos vacutainer VenojectII EDTA(K3 ) estériles.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 12.
(40) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. 4.3. MÉTODOS DE EXPERIMENTACIÓN. 4.3.1. AISLAMIENTO DEL ADN. El aislamiento del ADN a partir de las muestras se realizó mediante el protocolo reportado por Miller y col. (1988), libre de fenol, cloroformo y alcohol isomílico, modificado según el tipo de muestra.. 4.3.1.1. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE SANGRE. Se trasvasaron las muestras de sangre de los tubos vacutainer a tubos de centrífuga de 50 ml, a lo que se le agregó 45 ml de buffer de hemólisis (NH4 Cl 0.155 M, KHCO3 10 mM y EDTA 0.02 M pH 7.4) y agitó suavemente. Después de incubar a 5 ºC por 30 minutos, se centrifugó a 2750 g por 15 minutos y se descartó el sobrenadante; luego de lo cual si se observaba que el pellet tenia color rojo, presencia de hemoglobina, se procedía a resuspender totalmente en solución hemólisis, centrifugar y descartar el sobrenadante tantas veces como fue necesario hasta obtener un pellet libre de hemoglobina. Luego al pellet se le agregó 2 ml de solución de lisis (Tris HCl 10 mM pH 8, EDTA 25 mM, NaCl 100 mM, SDS 0,5 %) y 10 ìl de Proteinasa K (10ìg/ml), y se incubó a 54 ºC en baño maría por toda la noche (al menos 20 hrs.). Luego se le adicionó 2 ml de alcohol absoluto helado, y se homogenizó la solución inclinando delicadamente el tubo hacia sus contornos, hasta observar precipitar el ADN. Se retiró el ADN con una pipeta pasteur y se le trasvasó a un tubo eppendorf de 1.5 ml. Luego se resuspendió el ADN en 1 ml de alcohol de 70º helado, se centrifugó el tubo en una microcentrífuga por 15 minutos y se descartó el sobrenadante; se eliminó el exceso de alcohol evaporándolo en una estufa a 37 ºC. Se resuspendió el ADN en 200 ìl de Buffer TE (Tris 10mM pH 8, EDTA 1mM) y se colocó a baño maría a 37 ºC por 12 horas. Las muestras del ADN completamente resuspendidas se almacenaron a –20 ºC. 4.3.1.2. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE ENJUAGUE BUCAL. Las muestras contenidas en tubos de centrífuga de 50 ml se centrifugaron a 2750 g por 15 minutos, luego se retiró el sobrenadante con una pipeta pasteur. Luego se realizaron lavados con solución salina al 0.9% enrasando hasta un volumen de 40 ml, se homogenizó y centrifugó a 2750 g por 10 minutos, luego se descartó el sobrenadante TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 13.
(41) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. con una pipeta pasteur; este proceso se repitió dos veces más. Luego al pellet se le agregó 2 ml de solución de lisis (Tris HCl 10 mM pH 8, EDTA 25 mM, NaCl 100 mM, SDS 0,5 %) y 10 ìl de Proteinasa K (10 ìg/ml), se homogenizó suavemente y se incubó a 54 ºC en baño maría por toda la noche (al menos 20 hrs.). Luego se agregó 2.5 ml de alcohol absoluto helado y homogenizó suavemente y luego se procedió a centrifugar el tubo a 1400 g por 15 minutos, descartando el sobrenadante. Luego, se agregó 2 ml de etanol de 70º helado, se resuspendió el pellet y se centrifugó a 1400 g por 15 minutos; se descartó el sobrenadante y se secó el exceso de alcohol evaporándolo en una estufa a 37 ºC. Luego se resuspendió el ADN en 1 ml de buffer TE (Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM) y se colocó a baño maría a 37 ºC por 12 horas. Luego se trasvasó a un tubo eppendorf de 1.5 ml con una pipeta pasteur, y se almacenaron a –20 ºC. En los casos en que se observó el ADN precipitado después de adicionar el etanol absoluto, éste se extrajo con una pipeta pasteur y se transvasó a un tubo ependorff de 1.5 ml; luego se resuspendió el ADN en 1 ml de etanol de 70º helado, y se centrifugó a 1400 g por 15 minutos y se descartó el sobrenadante. Se dejó evaporar el remanente de alcohol, resuspendió en buffer TE y almacenó, como se indicó anteriormente.. 4.3.2. CUANTIFICACIÓN DEL ADN. El ADN genómico aislado fue cuantificado mediante el método de medición de la absorbancia en un espectrofotómetro (LKB), empleando una celda de cuarzo de 1 ml. Para esto se realizaron diluciones 1/200 de las soluciones de ADN aislado a partir de muestras de sangre y 1/50 de las aisladas a partir de muestras de enjuague bucal, a un volumen final de 1 ml; de las cuales se tomaron lecturas de absorbancia a 260 nm (A260 ) y 280 nm (A280 ). La cantidad de ADN se calculó siguiendo la ley de Beer (Ausubel y col., 1998), teniendo en cuenta que 1 ml de una solución con una A260 igual a 1.0 es equivalente a 50 ìg de ADN de doble cadena.. 4.3.3. PROTOCOLO DE PCR MÚLTIPLEX. Se usó un protocolo de amplificación simultanea (PCR múltiplex) con los sets de “primers” diseñados para los marcadores microsatélites TPOX y TH01 (Tabla 6), reportados por Huang y col. (1995) y Edwards y col. (1991) respectivamente, y que amplifican fragmentos de 220–256 y 175–207 pares de bases respectivamente. Los dos loci se amplificaron en un volumen de reacción de 15 ìl en concentraciones finales de TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 14.
(42) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. 1x del Buffer de PCR, 2 mM de MgCl2 , 200 mM de cada dNTPs, 0.4 mM del par de “primers” TPOX, 0.4 mM del par de “primers” TH01, y conteniendo 0.5 unidades de Taq ADN polimerasa y 30 ng de ADN genómico. Las amplificaciones fueron llevadas a cabo en un Termociclador Perkin-Elmer GeneAmp 2400, usando el protocolo de incubación inicial a 95ºC por 3 minutos seguido por un programa de 35 ciclos de 94 ºC por 30 segundos, 64 ºC por 30 segundos y 72 ºC por 30 segundos, con un paso de extensión final a 72 ºC por 15 minutos.. Tabla 6. Secuencia de los “primers” para TPOX y TH01. Marcador STR TPOX TH01. Secuencia de “primers” (5' 3') 5'-ACTGGCACAGAACAGGCACTTAGG-3' 5'-GGAGGAACTGGGAACCACACAGGT-3' 5'-GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT-3' 5'-ATTCAAAGGGTATCTGGGCTCTGG-3'. 4.3.4. VISUALIZACIÓN DE LOS AMPLIFICADOS. La separación de los fragmentos amplificados se realizó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 6%, acrilamida-bisacrilamida 19:1 (Barton, 1994), de 21 cm de largo y 13 cm de ancho. La corrida electroforética se realizó en buffer TBE 0.5X, a 800 voltios por 2 horas 30 minutos, luego de cargar 4 ìl de amplificado y 2 ìl de buffer de muestra formamida (sucrosa 10%, azul de bromofenol 0.02%, xilencianol 0.02%, formamida desionisada 90ml v/v, completar a 100 ml con agua destilada). La tinción de los geles se realizó con nitrato de plata empleando el protocolo descrito por Sanguinetti y col. (1994) modificado en el laboratorio, el cual consistió en los siguientes pasos: Primero, se expuso el gel a la solución fijadora/detenedora (ácido acético glacial al 6%) por 15 minutos, luego de lo cual se retiró la solución; Segundo, se expuso el gel a la solución de tinción (nitrato de plata al 0.003%) por 10 minutos, luego de lo cual se retiró la solución; Tercero, se realizó un lavado con agua destilada por 20 seg., se descartó el agua; Cuarto se agregó la solución reveladora (Hidróxido de sodio al 20% y Formaldehído al 0.15%), exponiendo el gel hasta observar las bandas de los amplificados para luego retirar la solución; y finalmente se agregó solución fijadora/ detenedora por 5 minutos.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 15.
(43) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. 4.3.5. IDENTIFICACIÓN DE LOS ALELOS. La identificación de los alelos se realizó por comparación de migración en una corrida electroforética de los amplificados con marcadores multialélicos obtenidos en el laboratorio para los STRs TPOX y TH01. El marcador multialélico se generó utilizando muestras de sangre de 3 personas (cuya identificación no nos fue proporcionada), almacenadas en sistema FTA y cuyos genotipos fueron proporcionados por el Laboratorio Biomolecular y Genética del Instituto de Medicina Legal del Ministerio Público de su Banco de Datos de ADN. Con estas muestras se preparó una mezcla que se amplificó con los primers TPOX y TH01. El marcador multialélico para el STR TPOX contiene los alelos 6, 8, 9, 10, 11 y 12; mientras que, el marcador multialélico para el STR TH01 contiene los alelos 6, 7, 8, 9 y 9.3.. 4.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS. 4.4.1. DETERMINACIÓN DE LAS FRECUENCIAS ALÉLICAS DE LA POBLACIÓN. La frecuencia de los alelos observados para cada marcador fue estimada mediante el software PowerStats (Tereba, 1999).. 4.4.2. ANÁLISIS. DE. EQUILIBRIO. GENÉTICO. Y. COMPARACIÓN. CON. POBLACIONES MUNDIALES. La heterocigosidad esperada (He) en situación de equilibrio genético para cada locus se calculó según Nei (1987); así también, se determinó la heterocigosidad observada (Ho) y el coeficiente de endogamia ( f ) que cuantifica el exceso ( f <0) o deficiencia ( f >0, indicando la existencia de endogamia) relativa de heterocigotos en la población ( f = -1 cuando solo se observan heterocigotos, y f =1 cuando solo se observan homocigotos). Se analizó si la muestra poblacional se encontraba en equilibrio de Hardy-Weinberg mediante la prueba de Chi-cuadrado; además, se corroboró el equilibrio genético mediante las pruebas exactas de Fisher y Chi-cuadrado. Se compararon las frecuencias alélicas de los marcadores TPOX y TH01 halladas en la población de Andahuaylas con las reportadas en algunas de las poblaciones estudiadas con estos marcadores, entre las cuales se incluye una muestra poblacional peruana (Ver Tablas 16 y 17, en anexos); TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 16.
(44) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. para esto se calcularon los valores del estadístico FST de Wright (1965) entre pares de poblaciones en ambos marcadores, mediante la metodología de Weir y Cockerham (1984); a fin de determinar la existencia de subdivisión poblacional entre éstas, se tomó el valor de referencia de FST = 0.01, valor conservativo que se ajusta a la mayoría de los grupos poblacionales (Budowle, 2001). Estas estimaciones estadísticas se hallaron usando los software Genetic Data Análisis 1.0 (Lewis, 2001) y Arlequín 2.0 (Schneider y col., 2000). 4.4.3. RELACIONES FILOGENÉTICAS. Se calcularon las distancias genéticas relacionadas a valores de FST entre pares de poblaciones (Reynolds y col., 1983), usando el software PHYLIP 3.63 (Felsenstein, 2004) a partir de las frecuencias alélicas de los loci TPOX y TH01 de la muestra poblacional de Andahuaylas y las poblaciones mundiales antes mencionadas. Las distancias genéticas fueron representadas en un árbol neighbor-joining (NJ) (Saitou y Nei, 1987) usando el software MEGA versión 2.1 (Kumar y col., 2001).. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 17.
(45) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. 5. RESULTADOS. 5.1. BANCO DE MUESTRAS DE ADN Se obtuvieron muestras de ADN de alto peso molecular de 49 individuos no emparentados (17 mujeres y 32 varones), aislados de 19 muestras de sangre y 30 muestras de enjuague bucal; con concentraciones de 60 a 550 ng/ìl de ADN aislado de muestras de sangre (resuspendido en 200 ìl de buffer TE), y de 10 a 42 ng/ìl de ADN aislado de muestras de enjuague bucal (resuspendido en 1000 ìl de buffer TE). 5.2. IDENTIFICACIÓN DE LOS ALELOS, FRECUENCIAS ALÉLICAS y ANÁLISIS DE EQUILIBRIO GENÉTICO El número de variantes alélicas observados es de 5 en ambos loci (Tablas 7 y 8). En el TPOX se observaron los alelos 8, 9, 10, 11 y 12 con frecuencias iguales a 0.6122, 0.0306, 0.0102, 0.1939 y 0.1531, respectivamente; mientras que, en el locus STR TH01 se identificaron los alelos 6, 7, 8, 9 y 9.3 los cuales presentaron frecuencias iguales a 0.2755, 0.5306, 0.0510, 0.0306 y 0.1123, respectivamente. Como se muestra en la Tabla 9 la heterocigosidad observada (Ho) en el locus TPOX es de 0.5918, y en el locus TH01 es de 0.6735, con una Ho media igual a 0.6327. La heterocigosidad esperada (He) para el TPOX es de 0.5689, y para el TH01 es de 0.6329 con una He media igual a 0.6009; además, al analizar el coeficiente de endogamia ( f ) se determinó un exceso de heterocigotos, al observarse que los valores de f son menores a cero ( f<0), en ambos loci ( f = -0.0408 para el TPOX y f = -0.0649 para el TH01) y en la población de Andahuaylas tomando en cuenta los dos loci estudiados ( f = -0.0535).. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 18.
(46) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. Tabla 7. Distribución de los alelos para los STRs TPOX y TH01 en la muestra poblacional de la provincia de Andahuaylas. Nº MUESTRA TPOX TPOX TH01 TH01 Nº MUESTRA TPOX TPOX TH01 TH01 1 And01 11 11 6 7 26 And26 8 8 6 7 2 And02 8 12 7 8 27 And27 9 11 6 7 3 And03 8 8 7 7 28 And28 8 12 7 7 4 And04 8 8 7 9.3 29 And29 8 8 6 6 5 And05 8 11 6 7 30 And30 8 8 6 7 6 And06 8 11 7 7 31 And31 8 8 6 7 7 And07 8 11 7 7 32 And32 8 9 6 6 8 And08 8 11 6 6 33 And33 8 12 7 7 9 And09 8 8 6 7 34 And34 8 8 6 9 10 And10 8 8 7 9.3 35 And35 12 12 6 7 11 And11 11 11 7 9.3 36 And36 8 12 7 7 12 And12 8 11 6 7 37 And37 8 12 7 9.3 13 And13 8 11 6 7 38 And38 8 8 7 7 14 And14 8 11 6 7 39 And39 8 11 7 9.3 15 And15 8 8 7 7 40 And40 8 12 6 7 16 And16 8 8 7 9.3 41 And41 8 11 6 8 17 And17 8 8 6 8 42 And42 8 11 7 9 18 And18 8 8 7 9.3 43 And43 8 12 7 9.3 19 And19 8 12 6 7 44 And44 8 11 7 7 20 And20 8 12 7 9.3 45 And45 8 12 7 8 21 And21 8 8 7 7 46 And46 8 11 7 7 22 And22 8 11 6 9 47 And47 8 8 6 7 23 And23 9 12 6 7 48 And48 8 12 6 7 24 And24 8 12 9.3 9.3 49 And49 10 11 6 8 25 And25 8 8 7 7. Tabla 8. Distribución de las frecuencias alélicas de los loci TPOX y TH01 en la muestra poblacional de la Provincia de Andahuaylas. TPOX Alelo Frecuencia Frecuencia Alelo Absoluta Relativa 8 60 0.6122 6 9 3 0.0306 7 10 1 0.0102 8 11 19 0.1939 9 12 15 0.1531 9.3 Total 98 1.0000 Total. TH01 Frecuencia Frecuencia Absoluta Relativa 27 0.2755 52 0.5306 5 0.0510 3 0.0306 11 0.1123 98 1.0000. Tabla 9. Heterocigosidad de los loci TPOX y TH01 en la muestra poblacional de la Provincia de Andahuaylas. También se muestra el coeficiente de endogamia ( f ). Estos parámetros fueron estimados con el software Genetic Data Análisis (GDA; Lewis , 2001). TPOX TH01. He 0.5689 0.6329. Ho 0.5918 0.6735. f -0.0408 -0.0649. MEDIA. 0.6009. 0.6327. -0.0535. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 19.
(47) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. Para verificar si el número de individuos observados por genotipo se desvían del número esperado en situación de equilibrio de Hardy-Weinberg se realizó la prueba de Chi-cuadrado (χ2 ) para ambos loci a partir de los datos mostrados en la Tabla 10. El número de individuos esperados en ambos loci, para los genotipos homocigotos se calculó multiplicando el número de individuos estudiados por cada una de las frecuencias alélicas elevadas al cuadrado; y para los genotipos heterocigotos, se obtuvo multiplicando el número de individuos por el doble producto de las frecuencias de los alelos que constituyen el genotipo. Se obtuvieron valores de χ2 iguales a 9.5859 y 10.7321 para los loci TPOX y TH01, respectivamente; que se correlacionan a valores de probabilidad iguales a 0.4775 y 0.3795, respectivamente, con 10 grados de libertad (grados de libertad = Número de clases de genotipos esperados – Número de alelos observados) para ambos loci.. Tabla 10. Distribución de las frecuencias genotípicas en los loci TPOX y TH01. Se muestran las frecuencias genotípicas observadas y, las frecuencias genotípicas esperadas en situación de equilibrio genético según la ley de Hardy-Weinberg.. TPOX Genotipo. TH01 Individuos observados (O). 8/8 8/9 8/10 8/11 8/12 9/9 9/10 9/11 9/12 10/10 10/11 10/12 11/11 11/12 12/12 TOTAL. 17 1 0 13 12 0 0 1 1 0 1 0 2 0 1 49. Individuos esperados (E) 18.3647 1.8359 0.6120 11.6331 9.1853 0.0459 0.0306 0.5815 0.4591 0.0051 0.1938 0.1530 1.8423 2.9092 1.1485 49.0000. 2. (O-E) E. Genotipo. 0.1014 0.3806 0.6120 0.1606 0.8625 0.0459 0.0306 0.3012 0.6373 0.0051 3.3538 0.1530 0.0135 2.9092 0.0192. 6/6 6/7 6/8 6/9 6/9.3 7/7 7/8 7/9 7/9.3 8/8 8/9 8/9.3 9/9 9/9.3 9.3/9.3 TOTAL. χ2 = 9.5859. Individuos observados (O). Individuos esperados (E). 3 16 3 2 0 12 2 1 9 0 0 0 0 0 1 49. 3.7191 14.3257 1.3769 0.8262 3.0320 13.7953 2.6519 1.5911 5.8395 0.1274 0.1529 0.5613 0.0459 0.3368 0.6180 49.0000. 2. (O-E) E. 0.1390 0.1957 1.9133 1.6676 3.0320 0.2336 0.1603 0.2196 1.7106 0.1274 0.1529 0.5613 0.0459 0.3368 0.2361. χ2 = 10.7321. Se realizaron las pruebas exactas de equilibrio de Hardy-Weinberg para ambos loci (Tabla 11), obteniéndose valores de probabilidad mediante el análisis de Fisher iguales a 0.1369 y 0.1981 para TPOX y TH01 respectivamente; y mediante la prueba exacta de Chi-cuadrado los valores fueron iguales a 0.2841 y 0.3081 para TPOX y TH01, respectivamente.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 20.
(48) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. Tabla 11. Valores de probabilidad de equilibrio genético poblacional para ambos loci, según las pruebas de chi-cuadrado y exactas de Fisher y chi-cuadrado, estas dos últimas hallados con el software GDA (Lewis, 2001). PRUEBA Chi-Cuadrado Exacta de Fisher Exacta de Chi-Cuadrado. TPOX 0.4775 0.1369 0.2841. TH01 0.3795 0.1981 0.3081. 5.3. COMPARACIÓN CON POBLACIONES MUNDIALES La siguiente lista pertenece a las muestras poblacionales mundiales usadas para estimar las FST para los loci TPOX y TH01 a partir de las frecuencias alélicas mostradas en las Tablas 16 y 17 en anexos; todas las poblaciones se encuentran etiquetadas con números del 1 al 20, a fin de ubicarlas fácilmente en las matrices de FST generadas por el programa Arlequín que se muestran en las Tablas 12 y 13. Esta lista presenta grupos poblacionales relacionados a la muestra poblacional de la provincia de Andahuaylas (1), en cuanto al origen mestizo entre la población aborigen americana y la caucásica española, como la de Mesa Redonda (2, que esta constituida por emigrantes de la región andina peruana residentes en la ciudad capital de Lima), Mapuche (3) y dos muestras poblacionales de hispanos (4 y 5) residentes en Estados Unidos (U.S.); y también de grupos poblacionales de origen étnico oceánico (6), asiático (7, 8, 9 y 10), caucásico (11, 12, 13, 14 y 15) y africano (16, 17, 18, 19 y 20). Etiqueta Nombre de la población (Referencia) ------------------------------------------1: Andahuaylas (el presente estudio) 2: Mesa Redonda; Lima, Perú (Tito y col., 2004) 3: Mapuche; Argentina (Tourret y col., 1999) 4: U.S. Hispanos (Budowle y col., 1999) 5: U.S. Hispanos (Butler y col., 2003) 6: Australia; Aborígenes de Adelaida (Takeshita y col., 1997; Brinkmann y col., 1998) 7: Taiwán (Lee y col., 1997) 8: Japón, Okayama (Okamoto y col., 2003) 9: Japón, Gifu (Nagai y col., 1996) 10: Asiáticos (CFS, http://www.csfs.ca/databases/index.htm) 11: Vascos, Norte de España (De Pancorbo y col., 1998) 12: Suiza (Hochmeister y col., 1995) 13: U.S. Caucásicos (Budowle y col., 1999) 14: U.S. Caucásicos (Butler y col., 2003) 15: Caucásicos-canadienses (CFS, http://www.csfs.ca/databases/index.htm) 16: Namibia; Ovambo (Takeshita y col., 1997; Brinkmann y col., 1998) 17: República Centroafricana; Sanga (Destro-Bisol y col., 2000.) 18: U.S. Afro-americanos (Budowle y col., 1999) 19: U.S. Afro-americanos (Butler y col., 2003) 20: Afro-canadienses (CFS, http://www.csfs.ca/databases/index.htm). TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 21.
(49) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. Para la determinación de subdivisión poblacional entre pares de poblaciones, se tomó como referencia el valor de FST = 0.01, valor conservativo que se ajusta a la mayoría de los grupos poblacionales (Budowle, 2001). De manera que, los valores de las FST mayores a 0.01 indican la existencia de subdivisión poblacional entre las poblaciones analizadas.. En el locus TPOX, los valores de FST calculados entre la muestra poblacional de Andahuaylas y las poblaciones mundiales (Tabla 12), indican que no existe subdivisión genética con las muestras poblacionales de Mesa Redonda (2; FST = 0.00504), de Mapuche (3; FST = 0.00586) y la de hispanos residentes en Estados Unidos (4) reportada por Budowle y col. (1999) (FST = 0.00505) al ser valores menores a 0.01; mientras que, con la población de hispanos residentes en Estados Unidos (5) reportada por Butler y col. (2003) (FST = 0.01910) y las de origen étnico oceánico (6; FST = 0.29689), asiático (7, 8, 9 y 10; con un rango de valores de FST que va de 0.01640 a 0.04741), caucásico (11, 12, 13, 14 y 15; con un rango de valores de FST que va de 0.01295 a 0.03733) y africano (16, 17, 18, 19 y 20; con un rango de valores de FST que va de 0.04539 a 0.10170) indican subdivisión genética al ser valores mayores a 0.01. Tabla 12. Matriz de valores FST estimados entre pares de poblaciones para el locus TPOX. En negritas se muestran los FST estimados entre la población de Andahuaylas (1) y las otras muestras poblacionales analizadas. 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20. 2. 0.00000 0.00504 0.00000 0.00586 0.01489 0.00505 -0.00163 0.01910 0.01144 0.29689 0.28660 0.01640 0.01559 0.03655 0.01999 0.04741 0.02365 0.02864 0.01004 0.02289 0.00804 0.01295 0.00351 0.01815 0.01096 0.01836 0.01255 0.01942 0.00877 0.06215 0.04465 0.04539 0.04893 0.06758 0.06050 0.06695 0.06008 0.10170 0.09361. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 0.00000 0.01045 0.00759 0.24817 0.04059 0.03143 0.03550 0.03333 0.02423 0.02536 0.02626 0.02418 0.02603 0.03774 0.03765 0.04720 0.04795 0.07334. 0.00000 0.00648 0.26428 0.01269 0.01537 0.01923 0.00768 0.00409 0.00095 0.00684 0.00742 0.00458 0.03598 0.03469 0.04924 0.04926 0.08061. 0.00000 0.19079 0.01934 0.00270 0.00589 0.00609 0.00393 0.01040 0.00530 0.00521 0.00691 0.01190 0.01707 0.02177 0.02306 0.03995. 0.00000 0.24938 0.17691 0.17909 0.21989 0.22095 0.25752 0.21302 0.20778 0.22773 0.14369 0.15862 0.11407 0.11712 0.07122. 0.00000 0.01603 0.02918 0.00895 0.00948 0.00302 0.00121 0.00287 0.00500 0.04781 0.02092 0.04691 0.04647 0.07415. 0.00000 0.00106 0.00079 0.00364 0.01239 0.00350 0.00501 0.00687 0.01194 0.01922 0.02157 0.02297 0.03536. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 0.00000 0.00460 0.00000 0.00618 -0.00036 0.00000 0.01763 0.00313 -0.00039 0.00000 0.01188 0.00098 0.00079 0.00105 0.00000 0.01282 0.00294 0.00091 0.00124 -0.00158 0.00000 0.01182 0.00160 -0.00124 -0.00181 -0.00014 -0.00023 0.00908 0.02216 0.02008 0.03495 0.02575 0.02430 0.02886 0.02616 0.01810 0.02250 0.01258 0.00833 0.02458 0.03428 0.03001 0.04230 0.03003 0.02711 0.02647 0.03505 0.03091 0.04245 0.03056 0.02772 0.03797 0.05586 0.05380 0.07194 0.05283 0.05033. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. 15. 16. 0.00000 0.02645 0.01512 0.03312 0.03371 0.05929. 0.00000 0.01718 0.00326 0.00390 0.01266. 17. 18. 20. 0.00000 0.00353 0.00000 0.00415 -0.00196 0.00000 0.01845 0.00394 0.00557 0.00000. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 22. 19.
(50) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. En el locus TH01, los valores de FST calculados entre la muestra poblacional de Andahuaylas y las poblaciones mundiales (Tabla 13), indican que no existe subdivisión genética con la población de Mesa Redonda (2) (FST = 0.00432) al ser valores menores a 0.01; mientras que, con la población Mapuche (3) (FST = 0.08186), la de hispanos residentes en los Estados Unidos (4 y 5; con valores de FST iguales a 0.03473 y 0.05772, respectivamente) y las de origen étnico oceánico (6; FST = 0.08352), asiático (7, 8, 9 y 10; con un rango de valores de FST que va de 0.11488 a 0.19409), caucásico (11, 12, 13, 14 y 15; con un rango de valores de FST que va de 0.09541 a 0.11417) y de origen africano (16, 17, 18, 19 y 20; con un rango de valores de FST que va de 0.04005 a 0.12881) indican subdivisión genética al ser valores mayores a 0.01.. Tabla 13. Matriz de valores FST estimados entre pares de poblaciones para el locus TH01. En negritas se muestran los FST estimados entre la población de Andahuaylas (1) y las otras muestras poblacionales analizadas. 1 1 0.00000 2 -0.00432 3 0.08186 4 0.03473 5 0.05772 6 0.08352 7 0.19409 8 0.13171 9 0.11488 10 0.16710 11 0.11009 12 0.09541 13 0.10758 14 0.10979 15 0.10980 16 0.00000 17 0.00328 18 0.03158 19 0.03013 20 0.01479. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 0.00000 0.08654 0.02947 0.05296 0.09834 0.19832 0.13570 0.12044 0.17095 0.10664 0.09091 0.10135 0.09833 0.10272 0.13809 0.09319 0.04326 0.04497 0.06973. 10. 0.00000 0.06662 0.07656 0.03090 0.19917 0.14877 0.12149 0.20399 0.09258 0.07833 0.09466 0.09858 0.09055 0.23487 0.21139 0.14012 0.13132 0.15382. 0.00000 0.00116 0.06803 0.12759 0.08443 0.07854 0.11308 0.02594 0.01470 0.02118 0.02231 0.02310 0.10800 0.08581 0.03483 0.03182 0.04759. 0.00000 0.06771 0.10182 0.06735 0.06432 0.09128 0.00874 0.00298 0.00720 0.01303 0.00886 0.10380 0.08740 0.03884 0.03446 0.04585. 0.00000 0.12943 0.09816 0.07291 0.13414 0.07443 0.07138 0.08583 0.10997 0.08591 0.13924 0.12216 0.09238 0.08266 0.08975. 0.00000 0.00690 0.01391 0.00371 0.08505 0.11020 0.11352 0.15144 0.11313 0.16209 0.14049 0.11850 0.11147 0.10655. 0.00000 0.00084 0.00693 0.06531 0.08219 0.08796 0.11872 0.08803 0.13935 0.10765 0.08108 0.07552 0.07725. 0.00000 0.01600 0.06433 0.07844 0.08674 0.11738 0.08677 0.13194 0.10092 0.07682 0.07078 0.07325. 11. 12. 13. 14. 0.00000 0.08517 0.00000 0.10824 -0.00076 0.00000 0.11025 0.00036 -0.00256 0.00000 0.14613 0.01278 0.00347 0.00349 0.11181 0.00076 -0.00230 -0.00170 0.12358 0.12535 0.13291 0.13248 0.09959 0.12073 0.12487 0.12918 0.08668 0.07399 0.07191 0.07707 0.08185 0.06644 0.06460 0.06986 0.07590 0.07193 0.07409 0.07792. 0.00000 0.00328 0.16292 0.15752 0.09413 0.08806 0.10175. 15. 16. 0.00000 0.14137 0.00000 0.13752 0.00328 0.08334 0.03158 0.07618 0.03013 0.08514 0.01479. 17. 18. 19. 0.00000 0.00839 0.00000 0.00956 -0.00157 0.00000 0.00199 0.00181 0.00067 0.00000. 5.4. RELACIONES FILOGENÉTICAS La figura 5 muestra el árbol Neighbor-joining basado en las distancias de Reynolds (1983) calculadas usando las frecuencias alélicas de los loci TPOX y TH01 de la muestra poblacional de la provincia de Andahuaylas y las reportadas en diecinueve muestras poblacionales mundiales (siendo estas últimas las mismas utilizadas para calcular las FST y que se enlistan en la Pág. 21). Como se puede observar en el árbol filogenético, la población de Andahuaylas se encuentra cercanamente relacionada a la muestra poblacional peruana de Mesa Redonda, y agrupada también con las poblaciones Mapuche de Argentina y de hispanos residentes en los Estados Unidos reportada por Budowle y col. (1999). Además, se observa que las poblaciones caucásicas y asiáticas TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 23. 20.
(51) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. analizadas han sido agrupadas por su origen étnico. También se observa que la población aborigen de Australia se ubica entre las poblaciones de origen africano; mientras que la de hispanos residentes en los Estados Unidos reportada por Butler y col. (2003) se encuentra aislada, presentando mayor cercanía a la población de hispanos reportada por Budowle y col. (1999) y a las de origen étnico caucásico. Figura 5. Árbol filogenético Neighbor-Joining basado en distancias de Reynolds (1983) para los loci STRs TPOX y TH01 estudiados en la muestra poblacional de la provincia de Andahuaylas y otras poblaciones mundiales. (1): reportado por Budowle y col. (1999), (2): reportado por Butler y col. (2003). Escala de la longitud de las ramas: 0.02 unidades arbitrarias. Andahuaylas MesaRedonda Mapuche(Argentina). U.S.Caucasicos(2) U.S.Caucasicos(1) Caucasicos-canadiensesSuiza Vascos U.S.Hispanos(1) U.S.Hispanos(2). U.S.Afro-americanos(2) U.S.Afro-americanos(1). Japon(Gifu) Japon(Okayama). Afro-canadienses Rep.CentroAfricana(Sanga) Asiaticos(CFS) Namibia(ovambo) Taiwan. Australia(Aborigenes). 0.02. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 24.
(52) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. 6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS Los dos loci son polimórficos en la muestra poblacional de la provincia de Andahuaylas. En el locus TPOX se observo la presencia de 5 de las 10 variantes alélicas reportadas para este locus en las poblaciones mundiales, entre éstos tenemos los alelos 8, 9, 10, 11 y 12; mientras que, en el locus TH01 se observó la presencia de los alelos 6, 7, 8, 9 y 9.3, los cuales son 5 de las 12 variantes alélicas reportadas para este locus en las poblaciones mundiales. La población se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg para ambos loci, al establecerse que las diferencias entre las frecuencias genotípicas observadas y esperadas son no significativas, mediante la prueba de Chi-cuadrado (χ2 ) con valores de probabilidad ( p) mayores al nivel de significancia de p = 0.05 ( p = 0.4775 y p = 0.3795 para los loci TPOX y TH01 respectivamente). Estos resultados se confirmaron al analizar la base de datos de la muestra poblacional estudiada mediante las pruebas exactas de chi-cuadrado ( p = 0.284062 y p = 0.308125 para los loci TPOX y TH01 respectivamente) y Fisher ( p = 0.136875 y p = 0.198125 para los loci TPOX y TH01 respectivamente), siendo esta última adecuada para muestras poblacionales pequeñas de un número mayor a 30 individuos. Los valores negativos mostrados por el coeficiente de endogamia indican que hay más individuos heterocigotos en la muestra poblacional estudiada de lo que se esperaría en situación de equilibrio genético y que no existe endogamia o consaguinidad en esta población. La heterocigosidad esperada (He) de los loci STR TPOX y TH01 en la muestra poblacional estudiada, presentan valores que son relativamente bajos comparándolos con otras poblaciones mundiales (ver Tabla 14). Esto se debe a la presencia de un alelo con una frecuencia alta, con un valor mayor al 50 % del total observado en ambos loci,. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 25.
(53) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. correspondiendo este comportamiento al alelo 8 en el locus TPOX con un valor igual a 61.22% y al alelo 7 para el TH01 con un valor igual a 53.06%. Este comportamiento también es observado en la muestra poblacional peruana de Mesa Redonda, la cual presenta bajos niveles de heterocigosidad en ambos loci debido a una alta frecuencia del alelo 8 (57.62%) en el locus TPOX (ver Tabla 16 en anexos) y el alelo 7 (51.66%) en el locus TH01 (ver Tabla 17 en anexos). Estas distribuciones de frecuencias alélicas presentes en las muestras poblacionales peruanas de Andahuaylas y Mesa Redonda pueden ser interpretadas como el efecto estocástico de la deriva genética, que ha ocasionado un incremento en la frecuencia del alelo 8 en el locus TPOX y el alelo 7 del locus TH01; y además, probablemente representan la distribución de frecuencias alélicas de los loci TPOX y TH01 en la población peruana en general. En conclusión, la variabilidad genética, que es medida por la heterocigosidad promedio (H) por locus (Nei y Roychoudhury, 1974), detectada con estos dos marcadores STRs en la muestra poblacional estudiada, es baja en comparación con otras poblaciones mundiales. Tabla 14. Heterocigosidad esperada (He) en la muestra poblacional de Andahuaylas y las reportadas en otras poblaciones mundiales. POBLACIÓN. TPOX He. TH01 He. Promedio H. Andahuaylas (presente estudio) Mesa Redonda (Tito y col., 2004) Mapuche (Tourret y col., 1999) Japoneses (Okamoto y col., 2003) Taiwán (Lee y col., 1997) Vascos (De Pancorbo y col., 1998) Suiza (Hochmeister y col., 1995) Hispano-Americanos (Butler y col., 2003) Caucásico-Americanos (Butler y col., 2003) Afro-Americanos (Butler y col., 2003 ). 0.5689 0.5772 0.6715 0.6474 0.5657 0.6305 0.5931 0.6813 0.6367 0.7644. 0.6329 0.6430 0.6242 0.7028 0.6883 0.7960 0.7925 0.7866 0.7559 0.7378. 0.6009 0.6101 0.6479 0.6751 0.6270 0.7133 0.6928 0.7340 0.6963 0.7511. Las estimaciones de las FST para los loci TPOX y TH01 entre la muestra poblacional estudiada y la de Mesa Redonda (Tito y col., 2004), determinaron como resultado la noexistencia de subdivisión genética entre éstas, lo cual se explica en que ambas poblaciones presentan un origen mestizo de ascendencia amerindia andina y caucásica hispánica; es decir que ambas poblaciones comparten estructuras genéticas similares. Esta explicación también se aplica al no observarse subdivisión genética entre la población estudiada y las muestras poblacionales de Hispanos residentes en Estados Unidos (Budowle y col., 1999) y Mapuche de Argentina (Tourret y col., 1999) en el locus TPOX; ya que estas poblaciones comparten las características genéticas de las poblaciones de origen amerindio y caucásica. La subdivisión genética se determinó para TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 26.
(54) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. ambos loci, cuando se analizó las FST estimadas entre la población de Andahuaylas y las poblaciones de origen étnico caucásico, asiático, africano y oceánico para ambos loci.. Para este trabajo se escogió construir el árbol filogenético en base a distancias de Reynolds (1983), debido a que estas representan mejor las relaciones existentes entre poblaciones mundiales, de acuerdo a su origen étnico, a nivel de marcadores microsatélites (Pérez-Lezaun y col., 1997; Calafell y col., 1998, 2000). El árbol filogenético Neighbor-Joining de la Figura 5, agrupa correctamente las poblaciones asiáticas y caucásicas por su origen étnico; pero falla en situar a la población de Aborígenes de Australia, de origen oceánico, entre las de origen africano. Esto último puede ser explicado por la hipótesis propuesta por Nei y Ota (1991), la cual postula que las primeras migraciones hacia Australia se realizaron desde África por el sur de Asia hace más de 40,000 años atrás; sin embargo debido al escaso número de loci analizados en el presente estudio, no se puede aseverar la existencia de relaciones filogenéticas entre estas poblaciones de diferente grupo étnico, ya que en este tipo de estudios se recomienda usar un mayor número de loci para determinar correctamente las relaciones existentes entre las poblaciones analizadas (Nei y Roychoudhury, 1974, 1982; Calafell y col., 2000). Por otro lado, se confirma la cercana relación existente entre la población estudiada y la muestra poblacional peruana de Mesa Redonda, determinado anteriormente en el análisis de las estimaciones de las FST en los loci TPOX y TH01.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 27.
(55) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. 7. CONCLUSIONES •. Se ha logrado establecer una base de datos de frecuencias alélicas para los loci STRs TPOX y TH01, luego de haber estandarizado las metodologías aplicadas para el análisis de las muestras de ADN y determinado las variantes alélicas existentes en la población estudiada.. •. La muestra poblacional en estudio presenta las variantes alélicas 8, 9, 10, 11 y 12 en el locus TPOX y las variantes alélicas 6, 7, 8, 9 y 9.3 en el locus TH01.. •. Los loci TPOX y TH01 en la muestra poblacional estudiada se encuentran en equilibrio de Hardy-Weinberg.. •. La heterocigosidad para los dos loci estudiados en la muestra poblacional de la Provincia de Andahuaylas se ubica entre los valores más bajos reportados en otras poblaciones mundiales.. •. La variabilidad genética de la muestra poblacional estudiada, medida por la heterocigosidad promedio de los loci TPOX y TH01, es baja en comparación con lo reportado en otras poblaciones mundiales.. •. No existe subdivisión genética significativa en los loci TPOX y TH01 entre la muestra poblacional estudiada y la población peruana de Mesa Redonda (Tito y col., 2004).. •. Así mismo, no existe subdivisión genética significativa en el locus TPOX entre la muestra poblacional estudiada y las poblaciones de hispanos residentes en Estados Unidos estudiada por Budowle y col.(1999) y Mapuche de Argentina (Tourret y col., 1999).. •. La muestra poblacional de la provincia de Andahuaylas muestra subdivisión genética significativa en los loci TPOX y TH01 con poblaciones caucásicas, asiáticas, africanas y oceánicas.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 28.
(56) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. 8. RECOMENDACIONES. Se recomienda estudiar un mayor número de marcadores moleculares de ADN para definir mejor las relaciones filogenéticas de la población de Andahuaylas con relación a otras poblaciones mundiales estudiadas.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 29.
(57) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. 9. ILUSTRACIONES. •. Figura 6. Calidad de ADN aislado de las muestras de la Provincia de Andahuaylas.. •. Figura 7. Marcadores multialélicas para los loci TPOX y TH01.. •. Figura 8. Amplificados múltiplex TPOX y TH01 de las muestras de la población.. •. Figura 9. Identificación de los alelos TPOX y TH01 en las muestras de la población de la provincia de Andahuaylas.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 30.
(58) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. Figura 6. Calidad de ADN aislado de las muestras de la Provincia de Andahuaylas. Gel de poliacrilamida al 6 %, Urea 7M, corrido en buffer TBE 0.5x a 250 voltios por 35 minutos. Se observa la presencia de ADN de alto peso molecular.. Figura 7. Marcadores multialélicos para los loci TPOX y TH01. Gel de poliacrilamida al 6 %, Urea 7 M, corrido en buffer TBE 0.5x a 800 voltios por 35 minutos. El marcador multialélico se generó utilizando muestras de sangre de 3 personas (cuya identificación no nos fue proporcionada), almacenadas en sistema FTA y cuyos genotipos fueron proporcionados por el Laboratorio Biomolecular y Genética del Instituto de Medicina Legal del Ministerio Público de su Banco de Datos de ADN. Con estas muestras se preparó una mezcla que se amplificó con los primers TPOX y TH01. (A) En los carriles 1 y 4 se observan las bandas obtenidas luego de amplificar la mezcla de muestras de ADN de genotipo conocido para el locus TPOX; se aprecian los alelos 6, 8, 9, 10, 11 y 12; en los carriles 2 y 3 se corrieron los amplificados de las muestras And48 y And02, respectivamente (B) En los carriles 1 y 4 se observan las bandas obtenidas luego de amplificar la mezcla de muestras de ADN de genotipo conocido para el locus TH01; se aprecian los alelos 6, 7, 8, 9 y 9.3; en los carriles 2 y 3 se corrieron los amplificados de las muestras And41 y And43, respectivamente.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 31.
(59) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. Figura 8. Amplificados múltiplex TPOX y TH01 de las muestras de la población. El tamaño esperado de los alelos de los loci TPOX y TH01, deben estar dentro del rango de 220 a 256 pares de bases y de 175 a 207 pares de bases, respectivamente; lo cual coincide con las muestras analizadas en los carriles 1, 2, 3 y 4 del gel de poliacrilamida al 6% en una corrida electroforética con buffer TBE 0.5X a voltaje constante. Se utilizó un marcador estándar de tamaño de fragmentos de ADN, que es una mezcla de oligonucleótidos que se diferencian en diez pares bases entre uno y el siguiente, siendo el rango que marca de 100 a 330 pares de bases. Los carriles 1, 2, 3 y 4 presentan las muestras And45, And42, And39 y And36, respectivamente; cuyos amplificados obtenidos con los “primers” para el STR TPOX (8/12, 8/11, 8/11 y 8/12) se ubica entre las bandas de 230 a 250 pares de bases, y los amplificados obtenidos con los “primers” para el STR TH01 (7/8, 7/9, 7/9.3 y 7/7, respectivamente) se ubican entre las bandas de 180 a 200 pares de bases.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 32.
(60) UNMSM – FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN UNA MUESTRA POBLACIONAL DE LA PROVINCIA DE ANDAHUAYLAS - APURÍMAC, PERÚ - CON LOS MARCADORES MICROSATÉLITES TPOX Y TH01.. Figura 9. Identificación de los alelos TPOX y TH01 en las muestras de la población de la provincia de Andahuaylas. (A) Corrida Electroforética de amplificados múltiplex TPOX y TH01 de las muestras de la población. Las muestras son: And05, And07, And08 y And09 en los carriles 1, 2, 3 y 4, respectivamente; que presentan en el locus TPOX los alelos 8/11, 8/11, 8/11 y 8/8, respectivamente, y en el locus TH01 los alelos 6/7, 7/7, 6/6 y 6/7, respectivamente; determinados por comparación de migración con los marcadores multialélicos (M) para ambos loci. (B) Detalle de los marcadores multialélicos para ambos loci STR del gel mostrado en (A); se señalan los alelos 6, 8, 9,10 y 11 para el TPOX, y los alelos 6, 7, 8, 9 y 9.3 para el TH01.. TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Bach. AUGUSTO FERNANDO DE LA CRUZ CALVO. 33.
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