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Detección de Cryptosporidium sp. en murciélagos de la especie Carollia perspicillata procedentes de la cueva Macaregua, Santander, Colombia

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Detección de

Cryptosporidium

sp. en

murciélagos de la especie

Carollia

perspicillata

procedentes de la cueva

Macaregua, Santander, Colombia.

PROYECTO

Rafael Felipe Fajardo Herman

Pontificia Universidad Javeriana

Facultad de Ciencias

Carrera de Microbiología Industrial

Bogotá, Colombia

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Detección de

Cryptosporidium

sp. en

murciélagos de la especie

Carollia

perspicillata

procedentes de la cueva

Macaregua, Santander, Colombia.

PROYECTO

Rafael Felipe Fajardo Herman

Proyecto de trabajo de grado presentada(o) como requisito

parcial para optar al título de pregrado en Microbiología

Industrial

Director (a):

Claudia Liliana Cuervo Patiño Ph.D.

Pontificia Universidad Javeriana

Bogotá D.C

Facultad de Ciencias

Carrera de Microbiología Industrial

2018

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Agradecimientos

 Agradezco a mis padres por ser siempre un apoyo y motivación incondicional para lograr cada uno de mis objetivos.

 A Claudia Cuervo, por darme la confianza y la oportunidad de permitirme realizar este proyecto bajo su dirección, siguiendo sus consejos y lecciones.

 A Paola Nocua y Jose Mateus por su ayuda, sus consejos y su disposición cada vez que lo necesité.

 A Sandra Chala por darme las bases para realizar todo mi trabajo.

 A mis amigos, por sus palabras de aliento y su compañía durante toda la carrera.

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NOTA DE ADVERTENCIA

Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y conclusiones

anotadas son responsabilidad solo del autor y no comprometen en nada

a la Pontificia Universidad Javeriana”

Artículo 9.18 del reglamento de los trabajos de grado de investigación.

Agosto de 1989.

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Contenido

1. Introducción ... 6

2. Planteamiento del problema y justificación ... 7

3. Marco teórico ... 8

3.1 Cryptosporidium sp. ... 8

3.2 Ciclo de vida ... 8

3.3 Criptosporidiosis ... 9

3.4 Murciélagos ... 10

3.5 Murciélagos como reservorio de microorganismos ... 10

3.6 Cryptosporidium sp. en murciélagos ... 10

3.7 Cryptosporidium sp. en Colombia ... 11

3.8 Métodos de diagnóstico de Cryptosporidium sp. ... 12

3.9 Cueva Macaregua, Santander, Colombia. ... 12

4. Objetivo general ... 13

5. Metodología ... 13

5.1 Muestras ... 13

5.2 Extracción de ADN ... 13

5.3 Reacción en cadena de la polimerasa para el gen cyt b ... 14

5.4 Reacción en cadena de la polimerasa para determinar la presencia de Cryptosporidium sp. ... 14

6. Resultados ... 15

7. Discusión ... 23

8. Conclusiones ... 24

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1. Introducción

Cryptosporidium sp., es un protozoo perteneciente al filo Apicomplexa, el cual puede llevar a cabo su ciclo de vida en un gran número de hospederos animales y en el humano. Puede transmitirse de manera zoonótica, antroponótica, y por consumo de alimentos o agua contaminada con ooquistes del parásito, causando criptosporidiosis (9). La contaminación de agua por Cryptosporidium sp. puede resultar en importantes brotes de criptosporidiosis; además es ahora considerado un patógeno importante de origen alimentario (9).

Cryptosporidium sp. es un patógeno cosmopolita, importante en salud pública. En enfermos con VIH la prevalencia oscila entre 14 y 24% (35). Por otra parte, en países en vía de desarrollo se encuentran prevalencias hasta del 32.5% (36).

De otra parte, los murciélagos son reservorios de gran cantidad de patógenos, los cuales pueden infectar a los animales domésticos y silvestres, como también a los humanos. A la fecha más de 80 especies de virus, parásitos y bacterias han sido detectados en murciélagos (11). Estudios previamente realizados han demostrado la presencia de Cryptosporidium sp. en murciélagos, uno de los primeros reportes mostró la presencia del género

Cryptosporidium sp. en murciélagos procedentes de Estados Unidos (12). Así mismo, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium hominis y un nuevo genotipo de Cryptosporidum sp. han sido identificados en murciélagos de Australia (13, 15).

Para Suramérica, a la fecha no se tienen reportes de la presencia del parásito en murciélagos.

Teniendo en cuenta lo anterior, en el presente trabajo evaluamos la presencia del protozoo Cryptosporidium sp. en murciélagos de la especie

Carollia perspicillata, procedentes de la cueva Macaregua (Santander). Para esto, a partir de ADN obtenido del intestino y mediante PCR convencional y PCR en tiempo real dirigida a los genes ribosomales, se evaluó la presencia de Cryptosporidium sp., encontrando 1 individuo positivo (1/22: 4.54%) para la presencia del parásito, mediante PCR en tiempo real. Constituyendo este, el primer reporte de la presencia del parásito en murciélagos de Colombia.

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2. Planteamiento del problema y justificación

Cryptosporidium sp., es un parásito patógeno de origen cosmopolita, con importancia en salud pública. En países en vía de desarrollo se reportan prevalencias de hasta el 32% (36). Conocido por su carácter zoonótico, antroponótico y también por su transmisión a través de alimentos y agua contaminada (9).

Cryptosporidium sp., ha sido detectado en un amplio rango de hospederos vertebrados domésticos y silvestres, tales como porcinos, bovinos, gatos, perros, camellos y murciélagos (44). Los murciélagos son reservorios de una gran cantidad de microorganismos, los cuales pueden causar infecciones importantes en los humanos; adicionalmente estos mamíferos cobran gran importancia en la dispersión de agentes infecciosos debido a su capacidad de traspasar barreras que otros mamíferos no pueden, gracias a su gran potencial de vuelo (11). Adicionalmente, la tala de bosques, la espeleología y en general la destrucción del hábitat de los murciélagos, los ha obligado a migrar a zonas urbanas (45) y a otros ecosistemas no naturales para ellos, en donde pueden llegar a contaminar fuentes de agua con ooquistes de

Cryptosporidium sp., los cuales son expulsados a través de las heces, contaminando así, cultivos y fuentes de agua que abastecen comunidades humanas y sirven como fuente de abastecimiento para el ganado. Por tanto, es de gran importancia realizar estudios acerca de la presencia de

Cryptosporidium sp. en murciélagos. Conocer la presencia del parásito en los murciélagos de la cueva Macaregua, la cueva que mayor diversidad de especies de murciélagos presenta en Colombia (9 especies) (25), podrá aportar información sobre el posible riesgo al cual se ven enfrentadas las personas que cohabiten con estos animales en las zonas urbanas y periurbanas cercanas a la cueva, así como dilucidar estrategias de control que ayuden a evitar su diseminación y, además aportar al diseño de estrategias que ayuden a la conservación de los ecosistemas de los murciélagos.

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3. Marco teórico

3.1 Cryptosporidium sp.

Cryptosporidium sp. es un parásito intracelular, causante de la criptosporidiosis. Este protozoo pertenece al Phylum Apicomplexa, clase Coccidea, subclase Coccidiasina, orden Eucoccidiida, suborden Eimeriina y familia Cryptosporiidae (1). Genéticamente se caracteriza por poseer ocho cromosomas de tamaño molecular semejante, y presentar uno de los genomas más pequeños de los organismos eucariotas (1).

Cryptosporidium sp. infecta células epiteliales, especialmente las del tracto digestivo, es un protozoo que alterna ciclos de reproducción sexual y asexual y completa su ciclo de vida en un solo hospedero (monoxéno) (2). Los ooquistes (forma ovoide), son el estadio de resistencia y propagación, miden aproximadamente de 3-8 μm de diámetro (3) y presentan cuatro esporozoítos. Se describen dos tipos de ooquistes: uno de pared gruesa, el cual sale a través de las heces, es resistente y se transmite por vía oral y el otro, es de pared delgada, posee una membrana simple, y es el responsable de la infección endógena o más comúnmente llamada autoinfección (4).

3.2 Ciclo de vida

Cryptosporidium sp. posee un ciclo de vida complejo, el cual involucra reproducción sexual (meiosis), reproducción asexual (mitosis) y diversos estadios de vida. Los ooquistes, formados previamente por un zigoto, son expulsados al ambiente a través de las heces de humanos o animales infectados(3).

Luego de la ingestión del ooquiste, en el intestino ocurre la exquistación, donde se liberan cuatro esporozoítos. Estos, invaden las células del tracto gastrointestinal quedando confinados en una vacuola parasitófora. Ahí sufren dos merogonias (merozoítos) para luego desarrollar los estadios sexuales (macrogametos y microgametos), los cuales se fusionan y forman el zigoto, para finalmente desarrollar el ooquiste con los 4 esporozoitos. Los ooquistes se diferencian en dos tipos, los de pared delgada, los cuales pueden reinfectar las células del intestino y los de pared gruesa, los cuales

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son expulsados al ambiente a través de las heces, para infectar nuevos hospederos (6).

3.3 Criptosporidiosis

La criptosporidiosis es una infección gastrointestinal ocasionada por el protozoo Cryptosporidium sp. Esta enfermedad es considerada una de las principales infecciones de carácter zoonótico en los humanos (5). A nivel mundial, la principal causa de enfermedades diarreicas ocasionadas por parásitos, en humanos, está dada por Cryptosporidium sp. Las infecciones ocasionadas por estos han sido incluidas por la Organización Mundial de la Salud, en el grupo de enfermedades descuidadas (7), siendo frecuentes en países poco desarrollados y en aquellos que se encuentran en vía de desarrollo, donde las personas, tienen acceso limitado a infraestructura básica (6).

El periodo de incubación es de 7 días, pero puede variar entre 2 y 10 días. La presentación clínica de la criptosporidiosis varía desde asintomática, a sintomática, con manifestaciones clínicas como: diarrea acuosa (síntoma más frecuente), seguido de deshidratación, pérdida de peso, dolor abdominal, fiebre, náuseas y vómitos. En pacientes inmunocomprometidos o positivos para la infección por VIH, la diarrea leve, puede llegar a convertirse en una diarrea severa (6).

La transmisión de Cryptosporidium sp. puede darse de humano a humano (ej. C. hominis), de animal a humano (ej. C. parvum) y a través de la ingestión de agua y alimentos contaminados con ooquistes (4). Los ooquistes, son resistentes a una gran variedad de químicos y desinfectantes, incluyendo el cloro, el cual es comúnmente utilizado para el tratamiento de agua potable, piscinas y parques acuáticos (7).

La mayoría de los casos de criptosporidiosis en humanos son causados por

C. hominis y C. parvum.C. parvum se presenta con mayor frecuencia en las zonas rurales, ya que su transmisión se asocia con el ganado y otros animales, mientras que C. hominis es más común en las áreas urbanas (2). Otras especies de Cryptosporidium como C. felis, C. meleagridis, C. canis, C. suis y C. muris pueden infectar al humano, sin embargo, la infección por estas especies es menos frecuente (9).

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3.4 Murciélagos

Los murciélagos son el único grupo de mamíferos capaces de realizar un vuelo verdadero. Esta capacidad de volar les ha permitido habitar casi todas las regiones del planeta, con excepción del continente Antártico y algunas remotas islas oceánicas (10). Estos animales, pertenecen al orden Chiroptera, palabra que deriva del griego: cheir (manos) y pteron (alas) (10). Actualmente se reportan más de 1.100 especies de murciélagos, las cuales constituyen la quinta parte de todas las especies conocidas de mamíferos (10).

Los murciélagos son organismos de vital importancia en todos los ecosistemas donde habitan, ya que actúan como polinizadores de plantas, dispersores de semillas y también como controladores biológicos de una gran variedad de poblaciones de insectos (10).

3.5 Murciélagos como reservorio de microorganismos

A los murciélagos se les reconoce como reservorios de una gran variedad de patógenos, los cuales pueden infectar a los humanos y a los animales domésticos. A la fecha, más de 80 especies de virus, parásitos y bacterias han sido detectados en murciélagos (11). Ciertas características como su alta densidad poblacional, y su forma de alojarse en sus dormideros (cuevas) aumentan la probabilidad de transmisión de microorganismos, entre especies. Adicionalmente, el hábito que poseen algunas especies de murciélagos de migrar distancias, de hasta 1000 km, les confiere una gran capacidad de dispersión de microorganismos patógenos para el hombre y otros animales (11).

3.6 Cryptosporidium sp. en murciélagos

La primera detección de Cryptosporidium sp. en murciélagos, se realizó en el año 1998; en el intestino de la especie Eptesicus fuscus, un murciélago capturado en la ciudad de Oregón, Estados Unidos (12). Luego, en 1999 a partir de una muestra de materia fecal del murciélago de patas grandes (Myoutes adversus), se identificó C. parvum, en Australia (13). En China en el año 2013, se identificaron dos nuevos genotipos de Cryptosporidium sp

(genotipo I y II), en cuatros especies diferentes de murciélagos (Rhinophulus sinicus, Hipposideros fulvus, Rousettus leschenaultia y Aselliscus stoliczkamus) (14).

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En el año 2016 en Australia, se detectó la presencia C. hominis y también de un nuevo genotipo de Cryptosporidum sp. en murciélagos del género

Pteropus sp., mejor conocido como zorro volador australiano (15). Para Suramérica, a la fecha no se han realizado estudios de prevalencia de

Cryptosporidium sp. en murciélagos.

3.7 Cryptosporidium sp. en Colombia

En Colombia se han realizado diversos estudios, en los cuales se ha detectado la presencia del parásito en aguas, animales domésticos y humanos.

Un estudio realizado en 2017, en cuatro plantas potabilizadoras de agua, del departamento de Nariño, demostró la presencia del parásito en 9 de 110 muestras recolectadas, cabe aclarar que este solo fue encontrado en agua cruda, más no en agua tratada (22). Así mismo, en el año 2005, ooquistes de Cryptosporidium sp. fueron detectados en agua de una planta potabilizadora de agua del municipio de Suesca, Cundinamarca. (16). De otra parte, un estudio realizado en la ciudad de Tunja (Boyacá), demostró una prevalencia de infección del 16.38% por Cryptosporidium sp. en perros (17). En el ganado bovino, diversos estudios han demostrado igualmente la presencia del parásito. Un estudio realizado en terneros del valle de Ubaté mostró que el 22% de las muestras evaluadas eran positivas para la presencia del parásito y que en al menos el 44% de las fincas evaluadas, existía un animal infectado (18). Adicionalmente, otro estudio realizado en bovinos de la Sabana Centro (Cundinamarca), mostró que el 22% de las muestras fueron igualmente positivas para la presencia del parásito

Cryptosporidium sp. (19).

Así mismo, en el año 2012, mediante un análisis del 18s ribosomal por PCR- RFLP se demostró la presencia de C. parvum en terneros Holstein en Manizales, caldas (20).

De otra parte, diversos estudios han reportado la presencia de

Crypstoporidium sp. en humanos. En el año 2015, en el municipio de Florencia, Caquetá, a partir de 124 muestras de materia fecal, de niños entre 0-5 años se obtuvo una prevalencia del 23,5% para este parásito (21).

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En cuanto a la zona de muestreo de los murciélagos de la especie Carollia perspicillata objeto de estudio en este proyecto, en el departamento de Santander se realizó un estudio en el año 2005, donde se demostró una prevalencia de Cryptosporidium sp. del 42% en un total de 121 heces de niños menores de 13 años con afecciones oncológicas del Hospital Universitario Ramón González Valencia, de la ciudad de Bucaramanga (30).

3.8 Métodos de diagnóstico de Cryptosporidium sp.

La detección de ooquistes de Cryptosporidium sp. suele ser dispendiosa cuando la infección está presente en el hospedero de manera asintomática, debido a que la concentración de ooquistes es baja y se hace necesaria la utilización de técnicas de concentración como sedimentación y flotación, para luego ser teñidas con tinciones como Ziehl Neelsen modificada. Otras técnicas utilizadas son ELISA, inmunofluorescencia directa, e Inmunocromatografía, pero no son técnicas rutinarias utilizadas para el diagnóstico de la infección (27).

3.9 Cueva Macaregua, Santander, Colombia.

La cueva Macaregua se encuentra ubicada en el departamento de Santander, municipio de Curití, vereda Las Vueltas (06° 39’ 36,2” N y 73° 06’ 32,3” O) (23). La temperatura en el municipio de Curití varía entre 12°C y 30°C, y su temperatura promedio es de 12°C (23). Tiene una extensión de 600 metros aproximadamente, en su interior cuenta con una zona seca (100 metros) y una zona húmeda, la cual posee un curso de agua los primeros 300 metros a partir de la entrada (24).

Esta cueva, hasta el momento es la que presenta mayor diversidad de especies de murciélagos en Colombia, donde se han reportado nueve especies diferentes de este mamífero (25), siendo las especies Carollia perspicillata, Mormoops megalophylla y Natalus tumidirostris, las especies que poseen mayor número de ejemplares al interior de la cueva.

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4. Objetivo general

Determinar la presencia de Cryptosporidium sp. en murciélagos de la especie

Carollia perspicillata provenientes de la cueva Macaregua en Santander.

5. Metodología

5.1 Muestras

Los murciélagos fueron colectados en los meses de febrero y septiembre del 2015, y correspondían a la especie C. perspicillata. Fueron colectados en el marco del proyecto titulado “Murciélagos procedentes de dos regiones de Colombia y su papel como reservorios de agentes infecciosos” el cual contó con el Permiso marco de recolección de especímenes de especies silvestres de la diversidad biológica para investigación con fines no comerciales, Resolución 0546, Ministerio del Medio Ambiente y Desarrollo Sostenible; ANLA; y en su momento no requirió FUA para la colecta. Los murciélagos colectados fueron depositados en la Colección de Mamíferos del Museo Javeriano de Historia Natural. Los órganos (intestino) de los especímenes de murciélagos fueron amablemente cedidos por el Laboratorio de Ecología Funcional de la Pontificia Universidad Javeriana, los cuales estuvieron almacenados en alcohol al 70% hasta el momento en el que se realizó la extracción de ADN.

5.2 Extracción de ADN

Para la extracción de ADN se procesaron 28 intestinos de murciélago de la especie Carollia perspicillata. La extracción de ADN se realizó por medio del estuche comercial “High pure PCR Template Preparation kit” (Roche) de acuerdo con las indicaciones del estuche. En cada extracción se realizó un control de extracción (CE) para verificar la pureza de los reactivos (mismo proceso de extracción, pero sin muestra).

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5.3 Reacción en cadena de la polimerasa para el gen cyt b

Para evaluar la calidad del ADN obtenido, se realizó una PCR para el gen

cyt b de mamífero, siguiendo el programa y condiciones reportadas previamente por el autor (32), usando los oligonucleótidos cyt b Unifw 5’

-TCATCMTGATGAAAYTTYGG-3’ y cyt b rev 5

ACTGGYTGDCCBCCRATTCA-3’ bajo las siguientes condiciones: Denaturación a 94° C durante 3 minutos, 30 ciclos: 94 ° C durante 1 minuto, 63° C por 1 minuto y 72° C por 2 minutos. Y una extensión final a 72° C durante 10 minutos. Con las siguientes condiciones de reacción: Buffer 1X, MgCl2 1.5 mM, dNTPS 200 μM, 10 pM de cada oligonucleótido (cyt b Unifw

y cyt b Uni rev) y 0.06 U/µL de Taq ADN polimerasa (Corpogen). Los productos de la amplificación se evaluaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con Hydragreen (ACT gen). Se utilizó marcador de peso molecular de 100 pb (Invitrogen).

5.4 Reacción en cadena de la polimerasa para determinar la presencia

de Cryptosporidium sp.

Para determinar la presencia de Cryptosporidium sp., el ADN obtenido de las muestras de intestinos de murciélagos de la especie Carollia perspicillata fue sometido a una PCR semianidada, para amplificar un fragmento del gen ARNr 18S del genero Cryptosporidium sp., de acuerdo con lo reportado por Ranjbar et. al 2018 (33). El oligonucleótido externo (5´ - GGA AGG GTT GTA TTT ATT AGA TAA AG – 3´) y el oligonucleótido anti sentido común (Cr550 5’ -TGA AGG AGT AAG GAA CAA CCT CC - 3’) fueron utilizados para amplificar un fragmento de aproximadamente 835 pb. El segundo paso de la PCR semianidada fue realizado con el oligonucleótido sentido interno Cr250 5´- GGA ATG AGT KRA GTA TAA ACC CC – 3´ y el oligonucleótido anti sentido común (Cr550), los cuales amplifican un fragmento de aproximadamente 530 pb. Las condiciones de cada PCR fueron las siguientes: PCR 1: A volumen final de 25 μl, Buffer 1X, DNTPs 0,4 mM, MgCl2 1,5 Mm, Taq polimerasa 2.5 unidades y oligonucleótidos (Fw CRP, Rv

Cr-550) 5 pM cada uno.

PCR 2: A volumen final de 25 μl, Buffer 1X, DNTPs 0,4 Mm, MgCl2 1,5 Mm,

Taq polimerasa 2.5 unidades y oligonucleótidos (Fw Cr 250, Rv Cr-550) 5 pM cada uno. Los productos de la amplificación se evaluaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. Se utilizó marcador de peso molecular de 100 pn (Invitrogen).

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6. Resultados

Para determinar la presencia de Cryptosporidium sp. en los murciélagos de la especie C. perspicillata procedentes de la cueva Macaregua (Santander), se procesaron 28 muestras: 16 muestras provenientes de individuos machos y 12 muestras de hembras (Anexo 1).

Con el propósito de determinar la calidad del ADN obtenido, inicialmente se realizó una PCR dirigida a los genes cyt b de mamíferos de acuerdo con lo reportado por Schlegel et al 2012 (32). Como se observa en la figura 1, para las muestras denominadas MT128 y MT129 se observa la amplificación del fragmento esperado de 940 pb. Sin embargo, de las 28 muestras procesadas solo 9 muestras (32%) amplificaron.

Figura 1. PCR para amplificar el gen cyt b de mamíferos pequeños.

Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con Hydragreen (ACT Gen). Cada pozo contiene 10 μl del producto de amplificación. Carril 2: MT127;

carril 3: MT128; carril 4: MT129; carril 5: control de extracción; carril 6: control gris (agua adicionada en el sitio donde se adiciona el ADN), carril 7 (blanco): control de reacción (agua adicionada en remplazo de ADN), carril 8 (C. positivo): ADN genómico de ratón Carril 1: marcador de peso molecular de 100 pb (Invitrogen), se indican algunas bandas del marcador de peso molecular.

Teniendo en cuenta el bajo porcentaje (32%) de muestras positivas mediante la PCR de cyt b, se realizaron diluciones del ADN (1/10 y 1/20) para las 19 muestras restantes negativas con el fin de disminuir la cantidad de inhibidores presentes en las muestras, y con estas se realizó nuevamente la PCR para el gen cyt b. Como se observa en la figura 2, al realizar la dilución del ADN, 12 de las 19 muestras fueron positivas para el gen cyt b.

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Figura 2. PCR para amplificar el gen cyt b de mamíferos pequeños.

Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con Hydragreen (ACT Gen). Cada pozo contiene 10 μl del producto de amplificación. Carril 1: marcador

de peso molecular de 100 pb (Invitrogen), se indican algunas bandas del marcador de peso molecular. Carril 2: MT116 Dil. 1/10; carril 3: MT116 Dil. 1/20; Carril 4: MT117 Dil. 1/10; Carril 5: MT177 Dil. 1/20; Carril 6: MT118 Dil. 1/10; Carril :7 MT118 Dil. 1/20; Carril 8: MT119 Dil. 1/10; Carril 9: MT119 Dil. 1/20; Carril 10: MT121 Dil. 1/10; Carril 11: MT121 Dil. 1/20; Carril 12: MT122 Dil 1/10; Carril 13: MT122 Dil. 1/20; Carril 14: MT127 Dil 1/10; Carril 15: MT127 Dil 1/20; Carril 16: MT 142 Dil. 1/10; Carril 17: MT142 Dil. 1/20; Carril 18: Blanco (agua adicionada en remplazo de ADN); Carril 19: Gris (agua adicionada en el sitio donde se adiciona el ADN) Carril 20: Control positivo (ADN genómico de ratón).

Con los resultados obtenidos, las 22 muestras de ADN positivas para la PCR del gen cyt b obtenidas a partir de los intestinos de murciélagos de la especie

C. perspicillata, se utilizaron para la detección de Cryptosporidium sp. mediante PCR semianidada.

Detección de Cryptosporidium sp.

Para la detección del parásito se realizó la PCR semianidada, descrita por Ranjbar et al. 2018 (33) usando el programa y condiciones reportados por el autor. Se utilizaron las diluciones (1/10) de las muestras que amplificaron el gen cyt b previamente. Sin embargo, y como se observa en la Figura 3, no se observó el fragmento de 530 pb esperado en ninguna de las 22 muestras

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evaluadas. Es importante resaltar que el control positivo (ADN genómico de

Cryptosporidium sp.)tampoco amplificó, por lo cual no podemos saber si la no amplificación es debida al programa y condiciones de PCR o a la sensibilidad de la técnica.

Figura 3. PCR para la detección de Cryptosporidium sp.

Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido Hydragreen (ACT Gen). Cada pozo contiene 25 μl del producto de amplificación. Carril 2: MT 88; Carril 3: MT 111; Carril 4: MT112 Carril 5: MT113; Carril 6: MT128; Carril 7: Control blanco (agua adicionada en remplazo del ADN); Carril 8: Control gris (agua adicionada en el sitio donde se adiciona ADN); Carril 9: Control positivo (ADN genómico de Cryptosporidium sp); Carril 1: Marcador de peso molecular de 100 pb (Invitrogen), se indican algunas bandas del marcador de peso molecular.

Teniendo en cuenta el anterior resultado y que no contamos con suficiente ADN genómico de Cryptosporidium sp. (control positivo) para estandarizar la PCR semianidada, se realizó una PCR cualitativa por tiempo real, usando como reportero SYBR™ Green y con los oligonucleótidos Fw Cr250 y Rv Cr-550, los cuales amplifican el fragmento de 530 pb del gen ARNr 18S del parásito. Esta PCR se realizó bajo el siguiente programa (Tabla 1) y las siguientes condiciones de reacción (Tabla 2).

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Tabla 1. Programa usado para la PCR en tiempo real para la detección de

Cryptosporidium sp. 50 °C 2 min 95 °C 2 min 95 °C 30 seg 40 ciclos 60 °C 45 seg 72 °C 1 min 95 °C 15 seg Curva de disociación 60 °C 1 min 95 °C 15 seg

Tabla 2. Condiciones de reacción usadas para la PCR en tiempo real para la detección de Cryptosporidium sp.

Reactivo Concentración final

PowerUp™ SYBR™ Green

1X Master Mix (2X) (ThermoFisher)

CRP-Fw 5 M Cr550-Rv 5 M ADN 2 l Agua 2 l Volumen final 10 l

Como se observa en la figura 4, el control positivo (ADN genómico de

Cryptosporidium sp.), mostró un Ct de amplificación de 20,78; y para la muestra MT155 se observó una Ct de amplificación de 28,52. Al observar la curva de disociación para estas muestras, se observó que la Tm del control positivo fue 70,8 °C y la de la muestra MT155 fue de 71,7 °C (Figura 5). Teniendo en cuenta que la PCR amplifica diferentes especies del género

Cryptosporidium y que la Tm del fragmento amplificado no ha sido reportada, realizamos un análisis bioinformático del fragmento amplificado. Para la especie C. parvum (GenBank No: S40330.1) la Tm del fragmento es de 73,9 °C, para la especie C. muris (GenBank No: X64342) es de 73,7 °C, para la especie Cryptosporidium andersoni (GenBank: AB089285.2) es de 73,9 °C y para la especie C. canis (GenBank: AF112576) es de 72,1 °C. Teniendo en

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cuenta estos resultados y que no sabemos las especies de Cryptosporidium que pueden estar presentes en los murciélagos, consideramos que la muestra MT155 es positiva para la presencia del parásito.

Figura 4. Grafico Emisión de fluorescencia (ΔRn) vs Ciclo umbral de amplificación (Ct). La gráfica muestra la amplificación de las muestras positivas.

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Figura 5. Curva de disociación de la qPCR para la detección de

Cryptosporidium sp. La gráfica muestra la Tm (Temperatura de fusión) para

las fragmentos amplificados.

Teniendo en cuenta que es la primera vez que se realiza la qPCR para la detección de Cryptosporidium sp., se evaluó el producto amplificado mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Como se observa en la Figura 6 los fragmentos del control positivo y la muestra MT155 (banda de aproximadamente 530 pb) no se observan en la electroforesis.

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Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa 1% para los fragmentos amplificados por PCR en tiempo real para la detección de

Cryptosporidium sp.

Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con Hydragreen (ACT gen). Cada pozo contiene 10 μl del producto de amplificación. Carril 2: Control de

reacción (agua adicionada en remplazo del ADN); Carril 3: Control gris (agua adicionada donde se adiciona el ADN); Carril 4: MT 155; Carril 5: Control positivo; Carril 6: Marcador 100 pb (Invitrogen); carril 7: MT 112; Carril 8: MT 129; Carril 9: MT130; Carril 10: MT 131; Carril 11: MT 141; Carril 12: MT 152; Carril 13: MT 156; Carril 14: MT 161; Carril 15: MT 173; Carril 16: MT 176; Carril 1: Marcado 100 pb (Invitrogren) se indican algunas bandas del marcador de peso molecular.

Con estos resultados, podemos decir que 1 muestra de las 22 muestras analizadas (4,5%) es positiva para la presencia de Cryptosporidium sp.

Teniendo en cuenta que anteriormente se habían realizado estudios en sangre de estos murciélagos y se había encontrado T. cruzi (31), se tenía el ADN del intestino de los murciélagos disponible y se conoce que algunas cepas de Trypanosoma cruzi, tienen tropismo por este órgano, como parte de un ejercicio académico complementario; se evaluó la presencia del parásito, en el intestino de los murciélagos de la especie C. perspicillata. Para esto, se realizó la qPCR reportada por Duffy et al. (48). Esta PCR ya se encontraba estandarizada en el laboratorio de Inmunoparasitología molecular

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de la Pontificia Universidad Javeriana. Como se observa en la figura 7; 4 de 22 muestras fueron positivas para la presencia del parásito T. cruzi (18,1%).

Figura 7. Gráfico de Emisión de fluorescencia (ΔRn) vs Ciclo umbral de amplificación (Ct) de la PCR para la detección de T. cruzi. La gráfica muestra la amplificación de las muestras positivas. Los controles se montaron por duplicado: Control positivo fuerte: ADN genómico de T. cruzi y 10.000 parásitos equivalentes/ ml, Control positivo débil: 1 parasito equivalente/ml). En el eje Y se muestra la emisión de fluorescencia vs el número de ciclos necesario para obtener la amplificación deseada, Controles negativos: Control blanco (agua adicionada en remplazo del ADN); Control gris (agua adicionada donde se adiciona el ADN).

Con estos resultados podemos decir que los murciélagos de la especie C. perspicillata procedentes de la cueva Macaregua, Santander pueden ser reservorios de múltiples microorganismos infecciosos, entre ellos parásitos protozoos.

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7. Discusión

Los murciélagos son reconocidos como reservorios de una gran variedad de patógenos, los cuales pueden infectar a humanos y animales domésticos. A la fecha más de 80 especies de virus, parásitos y bacterias han sido detectados en murciélagos (11). En Estados Unidos (12), Australia (13) y China (14), Cryptosporidium sp. ha sido reportado en especies de murciélagos tales como Eptesicus fuscus, Myoutes adversus, Rhinophulus sinicus, Hipposideros fulvus, Rousettus leschenaultia y Aselliscus stoliczkamus. Sin embargo, este parásito no ha sido reportado en especies de murciélagos de Latino América, por tanto, en este estudio se buscó evaluar la presencia de Cryptosporidium sp., en el intestino de murciélagos de la especie Carollia perspicillata.

Estudios realizados previamente en Australia (15) y China (14) reportaron prevalencias para Cryptosporidium sp. en murciélagos, de 3.2% y 7.7%, respectivamente; similar a la prevalencia encontrada en los murciélagos de la cueva Macaregua de Santander, la cual fue de 4.5%. Cabe resaltar que el hallazgo reportado en este estudio constituye el primer reporte del género

Cryptosporidium sp. en murciélagos de la especie Carollia perspicillata, en Colombia.

Como se mencionó anteriormente, algunas especies del género

Cryptosporidium sp., son conocidas por su carácter zoonótico, y también por su capacidad de transmisión a través de alimentos y agua contaminada (9), por tanto, la detección de Cryptosporidium sp., en el presente estudio, en murciélagos de la especie Carollia perspicillata, puede suponer un riesgo tanto para los animales como para los humanos que habitan en zonas urbanas y periurbanas con cierta cercanía a la cueva Macaregua, los cuales se alimentan e ingieren agua que puede llegar a estar contaminada con ooquistes del parásito. Estudios previos han demostrado que los murciélagos pueden portar especies zoonóticas, como C. parvum (13), por lo cual es importante continuar evaluando cuales son las especies de Cryptosporidium que se encuentran presentes en los murciélagos de Santander y de Colombia.

Evaluar la presencia de microorganismos, en murciélagos, que causan infección en humanos aporta información sobre el riesgo al cual se ven enfrentadas las personas que cohabitan con estos animales en las zonas

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urbanas y periurbanas cercanas a la cueva, lo cual es importante para diseñar estrategias de control que ayuden a evitar la diseminación de microorganismos causantes de enfermedades infecciosas. Así como, establecer la importancia de preservar los sitios donde habitan los murciélagos y diseñar estrategias que ayuden a la conservación de estos.

De otra parte, al no obtener muestras positivas para Cryptosporidium sp. mediante la PCR semianidada convencional, se optó por realizar una PCR en tiempo real. A pesar de que la PCR convencional es una técnica altamente sensible y específica, posee limitaciones tales como el uso obligatorio de un gel de agarosa, utilizado para verificar los productos amplificados, estando su sensibilidad limitada también por el límite de detección de ADN en una electroforesis (49). Una de las ventajas de la PCR en tiempo real, se basa en la detección de la fluorescencia directa de la muestra, brindando así una mayor sensibilidad. Diferentes aproximaciones, en diversos modelos biológicos han demostrado que la qPCR posee mayor sensibilidad que la PCR convencional, incluso bajo similares condiciones (reactivos, número de ciclos, primers utilizados, tal como lo muestra Hadfield et al. 2010 (47). Similar a lo observado por nosotros, la qPCR dirigida a los genes ribosomales mostró ser más sensible, en la detección de

Cryptosporidium sp., incluso más que una PCR semianidada.

8. Conclusiones

Se detectó la presencia de Cryptosporidium sp. en los murciélagos de la especie C. perspicillata procedentes de la Cueva Macaregua, Santander (Colombia).

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9. Bibliografía

(1) Rojas C. Cryptosporidium spp: Un parasito emergente asociado a diarrea. Revista Gastrohnup. pp. S20-S24. 2012.

(2) Janssen B, Snowed J. Cryptosporidiosis. NCBI Bookshelf, National institute of health. 2018.

(3) Martinez L, Aguila C, Bornay F. Cryptosporidium: Un género en revisión. Situación en España. Revista enfermedades infecciosas microbiología clínica. 29(2) pp. 135-143. 2011.

(4) Perez M, Bruzual E, Brito A, Hurtado P. Cryptosporidium sp y Criptosporidiosis. Revista de la sociedad venezolana de microbiología. pp 315-310. 2005.

(5) Avendaño C, Ramo C, Vergara C, Sanchez C, Quilez J. Genetic uniqueness of Cryptosporidium parvum from dairy calves in Colombia. 2018.

(6) Pumipuntu N, Piratae S. Cryptosporidiosis: A zoonotic disease concern. Veterinary World, 11(5): 681-686. 2018.

(7) Hlavsa M, Roberts V, Kahler A, Hilborn E, Wade T, Backer L. Recreational Water–Associated Disease Outbreaks United States, 2009–2010. Centers for disease control and prevention. pp 6-10. 2014.

(8) Cryptosporidiosis. Centers for disease control and prevention. 2010.

(9) Putignani L, Menichella D. Global Distribution, Public Health and Clinical Impact of the Protozoan Pathogen Cryptosporidium. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. pp 39. 2010.

(10) Mancina C, Borroto R. Mamíferos en cuba- Introducción a los murciélagos. Institute of ecology and systematic. pp 123-133. 2011.

(11) Melaun C, Werblow A, Busch M, Liston A, Klimpel S. Bats as potential reservoir hosts for vector-borne diseases. Parasitology research monographs. pp 25-61. 2013.

(12) Dubey JP, Hamir AN, Sonn RJ, Topper MJ. Cryptosporidiosis in a bat (Eptesicus fuscus). J Parasitol 84:622–623. 1998.

(13) Morgan UM, Sturdee AP, Singleton G, Gomez MS, Gracenea M, Torres J, Hamilton SG, Woodside DP, Thompson RC. The Cryptosporidium “mouse” genotype is conserved across geographic areas. J Clin Microbiol 37:1302–1305. 1999.

(14) Wang W, Cao L, He B, Li J, Hu T, Zhang F, Fan Q, Tu C, Liu Q. Molecular Characterization of Cryptosporidium in Bats from Yunnan Province Southwestern China. J. Parasitol., 99(6), pp. 1148–1150. 2013.

(26)

26

(15) Schiller S, Webster K, Power M. Detection of Cryptosporidium hominis and novel Cryptosporidium bat genotypes in wild and captive Pteropus hosts in Australia. Infection, Genetics and Evolution 44. pp 254–260. 2016.

(16) Campos C, Alarcón A, Beltrán M, Cárdenas L. Recuento y determinación de viabilidad de Giardia spp. y Cryptosporidium sp aguas potables y residuales en la cuenca alta del río Bogotá. Biomédica vol.25 no.3. 2005

(17) Rodríguez E, Abril F, Pulido M, Ospina J. Frecuencia de Cryptosporidium spp en caninos de la ciudad de Tunja, Colombia. Rev.MVZ Cordoba vol.14 no.2 Córdoba. 2009.

(18) Avendaño C, Quilez J, Sánchez C. Prevalencia de Cryptosporidium en terneros del valle de Ubaté- Chiquinquirá (Colombia). Rev. U.D.C.A Act. & Div. Cient. 13 (1): 41-47. 2010.

(19) Avendaño C, Amaya A, Bayona M. Caracterización epidemiológica de la criptosporidiosis en bovinos en la región sabana centro (Cundinamarca). U.D.C.A Act. & Div. Cient. 13 (2): 109-116, 2010.

(20) R. J. Ocampo R, F. Rivera G, López M, Álvarez L, Cardozo1, J. Primer reporte de Cryptosporidium parvum en terneros Holstein (Bos taurus) de Manizales, caldas, Colombia. Rev. Med. Vet. Zoot. vol.59 no.3. 2012.

(21) Álvarez J, Bedoya L, Garzón T. Parasitosis intestinal en niños de 0 a 5 años, inscritos en centros de atención integral ubicados en las comunas sur y nororiental del municipio de Florencia, Caquetá (Colombia). Biomédica 2015;35(Supl.4):72-222. 2015.

(22) Sánchez C. Detección y caracterización molecular de los parásitos de interés en salud pública: Giardia duodenalis, Cryptosporidium spp., Cyclospora cayetanensis, Toxoplasma gondii y Entamoeba histolytica, en agua cruda y tratada de cuatro plantas potabilizadoras del Departamento de Nariño (Colombia). Universidad Nacional de Colombia. 2017.

(23) Rueda A, Perez J. Aproximación preliminar a la estructura de una colonia de Natalus tumidirostris (Natalidae) durante la epoca de lluvia en la cueva Macaregua, Santander, Colombia. Rev Biodivers Neotrop 6:227-33. 2016. (24) Peñuela M, Perez J. Environmental and Spatial Characteristics That Affect Roost Use by Seba’s Short-Tailed Bat (Carollia Perspicillata) In A Colombian Cave. Journal of cave karst studies. 77:160-164. 2015.

(25) Perez J, Martinez D, Peñuela M, Rios MC, Estrada S, Martinez L. Macaregua: the cave with the highest bat richness in Colombia. The journal of biodiversity. 2015

(27)

27

(26) OIE Organización Mundial de Sanidad Mundial, Manual de la OIE sobre animales terrestres, Capitulo 2.9.4 Criptosporidiosis (2008). http://web.oie.int/esp/normes/mmanual/pdf_es_2008/2.09.04.%20Criptosporidio sis. pdf.

(27) Fayer, Xiao. Cryptosporidium and Cryptosporidiosis, CRC Press, 173- 195. 2008.

(28) Venturini L, Bacigalupe D, Basso W, Unzaga M, Venturini MC, Moré G. Cryptosporidium parvum en animales domésticos y en monos de un zoológico. Parasitología Latinoamericana 61(1-2):90-93. 2006.

(29) Jex AR, Rachel M, Chalmers HV, Smith G. Cryptosporidosis In Zoonoses, Biology, Clinical practice and Public Health Control, OXFORD, pp 539-568. 2008. (30). Carreño M, Velasco C, Rueda E. Prevalencia de Cryptosporidium spp en niños menores de 13 años con afecciones oncológicas. Revista Colombia Médica Universidad del Valle. Vol° 36. 2005.

(31) Herrera T. Relación entre las características ecológicas de murciélagos de la cueva Macaregua en Santander (Colombia) y la presencia de tripanosomátidos.

(32) Schlegel M, Ali H, Stieger N, Groschup M, Wolf R, Ulrich R. Molecular identification of Small Mammal species using novel Citochrome b gene derived degenerated primers. Biochem genet 50:440-447. 2012.

(33) Ranjbar R, Mirhendi H, Izadi M, Behrouz B, Mohammadi R. Molecular Identification of Cryptosporidium spp. in Iranian Dogs Using Seminested PCR: A First Report. 2018.

(34) Beck W, Pantchev N. Zoonosis parasitarias. Servet, España, pp 4-5. 2010. (35) Chacin B, Cheng N. Criptosporidiosis en pacientes con el virus de la inmunodeficiencia humana. Revista interciencia 33(10): 708-716. 2008.

(36) Cryptosporidium: a water-borne zoonotic parasite. Veterinary Parasitology 126:37-56. 2004.

(37) Leitch GJ, He Q.Cryptosporidiosis – an overview. Journal of Biomedical Research. 25(1): 1-16. 2011.

(38) Feng Y, Y Ortega, G He, P Das, M Xu, X Zhang, R Fayer, W Gatei, V Cama, L Xiao. Wide geographic distribution of Cryptosporidium bovis and the deer-like genotype in bovines. Veterinary Parasitology 144:1-9. 2007

(39) Chalmers RM, Giles M. Zoonotic cryptosporidiosis in the UK - challenges for control. Journal of applied microbiology 22(109):1487-1497. 2010.

(28)

28

(40) Muñoz P, Fredesb F, Díaz Leeb A, Mercadoc R, Ozakid LS. Deteccion de Cryptosporidium spp. en terneras de lecherias de la Region Metropolitana mediante Ziehl Neelsen y confirmada por inmunocromatografia y ensayo molecular. Archivos de Medicina Veterinaria 43(2):111-11. 2011.

(41) Cieloszyk J, Goñi P, García A, Remacha M a, Sánchez E, Clavel A. Two cases of zoonotic cryptosporidiosis in Spain by the unusual species Cryptosporidium ubiquitum and Cryptosporidium felis. Enfermedades infecciosas y microbiología clínica 30(9):549–51. 2012.

(42) Kumar S, Smith W, Kumar A. Revisiting the global problem of

Cryptosporidiosis and recommendations. Tropical parasitology 7(1): 8–17. 2017.

(43) Karanis P, Ongerth J, Efstratiou A. Waterborne transmission of protozoan parasites: Review of worldwide outbreaks - An update 2011-2016. Water research 114 14-22. 2017.

(44) Uribarren T. Criptosporidiosis. Recursos en parasitología UNAM. 2016. (45) Mayorga D. El murciélago: siempre amenazado, poco comprendido. Revista pesquisa Javeriana. 2016.

(46) Won E, Kim S, Kee S, Shin J, Suh S. Multiplex Real-Time PCR Assay Targeting Eight Parasites Customized to the Korean Population: Potential Use for Detection in Diarrheal Stool Samples from Gastroenteritis Patients. PLoS ONE 11(11): e0166957. 2016.

(47) Hadfield, S, Robinson G, Elwin, K, Chalmers M. Detection and Differentiation of Cryptosporidium spp. in Human Clinical Samples by Use of Real-Time PCR. Journal of Clinical Microbiology, 49(3), 918–924. doi:10.1128/jcm.01733-10. 2010.

(48) Duffy T, Cura C, Ramirez J, Abate T, Cayo N, Parrado R, Diaz Z, Velasquez E, Muñoz A, Juiz N, Basile J, Garcia L, Duarte A. Analytical performance of a multiplex Real-Time PCR Assay using taqman probes for quantification of

Trypanosoma cruzi satellite DNA in blood samples. PLos Negl Trop Dis 7(1). 2013.

(49) Cavalcanti M, Silva D, Gomes Y. Comparison of real time PCR and conventional PCR for detection of Leishmania: a mini review. Journal of venomous animals and toxins including tropical diseases. 2010.

(50) Murakoshi F, Koyama K, Akasaka T, Horiuchi N, Kato K. Molecular and histopathological characterization of Cryptosporidium and Eimeria species in bats in japan. J Vet Med Sci. 1395-1399. 2018.

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ANEXO 1

Tabla 1. Código de identificación de los murciélagos capturados con su respectivo sexo.

Código Sexo Género

MT 88 Hembra Carollia MT 111 Hembra Carollia MT 112 Hembra Carollia MT 113 Hembra Carollia MT 116 Hembra Carollia MT 117 Hembra Carollia MT 118 Macho Carollia MT 119 Hembra Carollia MT 121 Macho Carollia MT 122 Hembra Carollia MT 123 Macho Carollia MT 124 Macho Carollia MT 125 Macho Carollia MT 126 Macho Carollia MT 127 Macho Carollia MT 128 Macho Carollia MT 129 Hembra Carollia MT 130 Macho Carollia MT 131 Macho Carollia MT 141 Macho Carollia MT 142 Hembra Carollia MT 152 Macho Carollia MT 155 Macho Carollia MT 156 Macho Carollia

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30 MT 161 Hembra Carollia MT 173 Macho Carollia MT 176 Hembra Carollia MT 177 Macho Carollia

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