SÍNDROME DE X FRÁGIL DIAGNÓSTICO
INMUNOHISTOQUÍMICO EN PACIENTES CON
RETARDO MENTAL DE CAUSA NO CONOCIDA QUE
ACUDAN AL INSTITUTO ESPECIALIZADO DE SALUD
DEL NIÑO Y HOGAR CLÍNICA SAN JUAN DE DIOS
DE AGOSTO DEL 2004 A FEBRERO DE 2005 CON
FINES PREVENTIVOS EN FAMILIAS EN RIESGO
2006
DRA GALLARDO JUGO BERTHA
DRA KLEIN ZIGHELBOIM EVA
RUÍZ FARFÁN EVA MARÍA
NOLI ERQUINIO. LEDLI
DR. CHÁVEZ PASTOR MIGUEL
DRA. RODRIGUEZ O’DONNEL ADA
I.
TÍTULO
SÍNDROME DE X FRÁGIL DIAGNÓSTICO INMUNOHISTOQUÍMICO EN PACIENTES CON RETARDO MENTAL DE CAUSA NO CONOCIDA QUE ACUDAN AL INSTITUTO ESPECIALIZADO DE SALUD DEL NIÑO Y HOGAR CLÍNICA SAN JUAN DE DIOS DE AGOSTO DEL 2004 A FEBRERO DE 2005 CON FINES PREVENTIVOS EN FAMILIAS EN RIESGO.
TITULO EN INGLES
FRAGILE X SYNDROME: IMMUNE HYSTOCHEMICAL ANTIBODY DIAGNOSIS IN PATIENTS WITH MENTAL RETARDATION OF UNKNOWN AETHYOLOGY FROM THE INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DEL NIÑO AND FROM THE HOGAR CLINICA SAN JUAN DE DIOS, FOR PREVENTION IN AT RISK FAMILIES.
II. AUTORES
Dra Gallardo Jugo Bertha, médico jefe (e) del servicio de Genética del Instituto Nacional de Salud del Niño.
Dra Klein Zighelboim Eva, médico asesor del servicio de Genética del Instituto Nacional de Salud del Niño.
Ruíz Farfán Eva María, Bióloga de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos Noli Erquinio. Ledli, Bióloga de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Dr. Chávez Pastor Miguel, médico asistente del servicio de Genética del Instituto Nacional de Salud del Niño.
Dra. Rodriguez O’Donnel Ada, médico jefe del servicio de Bioquímica del Instituto Nacional de Salud del Niño.
III. ÍNDICE
Resumen en castellano 2
Resumen 3
Introducción 4
Antecedentes 6
Objetivos Generales y Específicos 7
Materiales y métodos 7 Resultados 8 Discusión 14 Conclusiones 16 Recomendaciones 16 Referencias Bibliográficas 16
IV. RESUMEN EN CASTELLANO
En el presente estudio se empleó el método inmunohistoquímico que detecta la proteína FMRP en raíz de pelo como prueba de tamizaje para determinar su utilidad en el diagnóstico de Síndrome X-Frágil. Para evaluar la expresión de la proteína FMRP se utilizaron los criterios de Willemsem et al ( 1999) siendo los rangos para varones , de 0-40% “mutación completa”, 77 – 100 % “normal” y en mujeres los valores por debajo de 55 % se consideran“mutación completa” . Se incluyó un rango adicional entre 41% a 76% de expresión para varones, la que denominamos “Sospecha de mutación”.
Se realizo el estudio en 200 pacientes con los siguientes criterios de inclusión : retardo mental ( 49.5% ), autismo ( 12.5% ), problemas de lenguaje ( 17 % ) y problemas de aprendizaje ( 15.5 % ), el 5.5 % de pacientes presentó mas de un criterio de inclusión.
Encontrándose dentro del rango de mutación completa en 6 ( 6.06 %) pacientes con retardo mental y 1 ( 4% ) con autismo demostrando la utilidad de la prueba para el
diagnóstico del Síndrome de X frágil sobre todo en pacientes con retardo mental. Se observó 7 pacientes en rangos de sospecha de mutación que requieren el estudio molecular para conocer su real estado génico.
El estudio se amplió a 12 familiares mujeres con sospecha de estado portador, cuya expresión de la preteina fue normal en el 100% probablemente por el efecto de lionización del cromosoma X; siendo por ello indispensable el estudio molecular para determinar su real estado génico por el riesgo de transmitir la enfermedad a su futura descendencia.
Esta prueba es de ayuda para el diagnóstico de Sindrome de x frágil en pacientes con retardo mental . En pacientes con rangos de sospecha de mutación y en mujeres con riesgo de ser portadoras se requiere el estudio molecular para conocer su real estado génico
PALABRAS CLAVES
X frágil, FMRP, retardo mental, Técnica inmunohistoquímica , prueba en raíz de pelo
V. RESUMEN
We employed the immunohystochemical method to detect the presence of the FMRP protein in hair roots as a screening procedure to determine its usefulness in the diagnosis of the Fragile X syndrome. To evaluate the expression of the FMRP protein we used the criteria of Willemsen et al (1999), the range for males is between 0 - 40 % for the “complete mutation”, 77 – 100% “normal” and for women, below 55% is considered a “complete mutation”. We added an additional range between 41 and 76% for males, considered as “suspicious for mutation”.
Two hundred patients were studied, using as inclusion criteria: mental retardation (49.5%), autism ( 12.5% ), speech delay ( 17% ) and learning problems (15.5%). Six (6.06%) patients with mental retardation we found in the range of “complete mutation” and
one ( 4% ) with autism, demonstrating the usefulness of the test for the diagnosis of Fragile X syndrome, especially in patients with mental retardation. .
Seven patients were found in the “suspicious for mutation range and they require the molecular study to determine their real genome.
The study was enlarged to incluye 12 female family members without clinical manifestations but who could be carriers. One hundred per cent showed normal expression probably due to X chromosome lionization. This makes it indispensable to perform the molecular test to determine the true genetic state for the risk of transmission of the disease to future generations.
The immunohystochemical method is useful for the diagnosis of Fragile X syndrome, especially in patients with mental retardation. Both suspicious for mutation range patients and possible women carriers require the molecular study to determine their real genome.
PALABRAS CLAVES
Fragile X, FMRP, mental retardation, antibody test hair root
VI. INTRODUCCIÓN
El retardo mental (RM) se presenta en el 1-10% de la población general ( 1 ). Su etiología es heterogénea y desconocida en el 51 % de los casos ( 2 ). El Síndrome de X Frágil (SFX), es la causa más frecuente de retardo mental hereditario y la segunda de retardo mental de causa genética, después del síndrome Down ( 3 ) Su frecuencia es de 1/4000 en varones y de 1/6000 en mujeres ( 4 , 5 ). Se presenta en el 5 - 7.5 % de personas con retardo mental( 6, 7 ) y entre el 30-40% de todos los casos de retardo mental ligados al X (8) Por ser de naturaleza hereditaria, en una misma familia se encuentra más de un afectado.
En la mayoría de los casos (98%) ( 9 ), el origen de esta enfermedad se debe a una mutación en el gen FMR-1 (Fragile X Mental Retardation) localizado en el cromosoma X a nivel de su brazo largo, en el punto q27.3 (locus) ( 10 ). Esta mutación ocasiona la amplificación de los tripletes CGG ubicados en las islas CpG cercanas al primer exón, lo que causa inestabilidad para la trascripción de su producto génico: la proteína FMRP
(Fragile X Mental Retardation Protein). Con respecto a los estados del gen FMR- 1, se considera una copia “Normal” la presencia de 6 a 52 repeticiones de los tripletes CGG ; “Premutación”, de 52-200 repeticiones y “Mutación Completa” cuando su número es mayor a 200 repeticiones. La mutación completa produce hipermetilación o silenciamiento transcripcional del gen y la consecuente ausencia de la proteína FMRP ( 11, 12, 13), ocasionando entre sus manifestaciones más frecuentes; retardo mental, autismo, retardo del lenguaje y problemas de aprendizaje ( 14, 15, 16, 17 ).
La mujer puede presentar un cromosoma X con la copia “Normal” del gen FMR-1 y el otro cromosoma X con la copia alterada ( más de 52 repeticiones del triplete CGG ), lo que la convierte en portadora de una Premutación o de una Mutación Completa. En ellas, se da el fenómeno de la lionización de uno de sus cromosomas X ( inactivación ) que es al azar y es por ello que presentan manifestaciones clínicas muy variadas. Aproximadamente 30-35% de ellas tienen un coeficiente intelectual en el rango normal ( 9 ), frecuencia aumentada de partos múltiples ( 18 ) y aproximadamente 30-35 % de ellas tienen un coeficiente intelectual en el rango normal ( 9 ). Estas características en una mujer con SXF incrementan su riesgo de transmitir la enfermedad a su descendencia.
A pesar de la importancia del sindrome de X Frágil como causa de retardo mental heredado, en el Perú existen muy pocos pacientes con este diagnóstico (19,20 ), y esto es debido a que los métodos de detección son complejos y de alto costo. El Método Citogenético sólo detecta la fragilidad del cromosoma X en el 60% de casos y no detecta portadores ( 21 ). El Método Molecular detecta los afectados y los portadores, pero su costo es elevado y no es accesible a la población en estudio. Sólo se realiza cuando la sospecha clínica es muy alta ( 22 ).
El Método inmunohistoquímico con fosfatasa alcalina indirecta es una técnica no invasiva, fácil, rápida y de bajo costo, y que detecta tanto pacientes afectados como portadores de SXF con una eficacia de 100 y 70 % respectivamente ( 9, 23 ). Se basa en la detección de la ausencia de la proteína FMRP (producto génico del gen FMR-1 ) en el bulbo piloso ( 23, 24, 25, 26 ).
En el presente estudio se ha aplicado la técnica inmunohistoquímica en pacientes menores de 18 años que acudieron al Instituto Nacional de salud del Niño (INSN) y
Hogar Clínica San Juan de Dios ( H.C.S.J.D.) por presentar, retardo mental, autismo, retardo del lenguaje y problemas de aprendizaje, pacientes que fueron captados con la finalidad de detectar el síndrome de X frágil, dirigir su manejo y dar asesoramiento a los familiares de los pacientes afectados.
VII. ANTECEDENTES
El síndrome de X frágil, es la causa más frecuente de retardo mental hereditario y la segunda de retardo mental de causa genética después del síndrome Down ( 3). Desde que fue descubierta la etiología genética del SXF se ha trabajado en diversos métodos que ayuden al diagnóstico.
Entre las técnicas de diagnóstico empleadas tenemos al Método Citogenético que detecta el sitio frágil q27.3 del cromosoma X y trabaja con sangre periférica (de origen mesodermal ) pero su eficacia esta en un 60 %, con probabilidades de falsos positivos por la presencia de otros sitios frágiles cercanos y falsos negativos, además que no permite la detección de portadoras ( 21 ) y es de alto costo por los medios especializados que utiliza para llevarse a cabo. El Método Molecular, tanto el PCR como el Southern blot que utiliza la sonda STB 12.3 permite la determinación del numero de repeticiones del triplete CGG en el gen FMR-1 y la identificación del verdadero estatus génico del paciente por lo que su eficacia bordea el 100% ( 13 ). El mayor inconveniente es el elevado costo de la prueba, también utiliza muestra de sangre periférica (de origen mesodermal ) . Es así, que en 1995, Willemsen et al. describen un método de diagnostico alternativo para el Síndrome de X Frágil, basado en la ausencia de expresión de la proteina FMRP, producto génico de FMR-1 en linfocitos (de origen mesodermal) en pacientes con retardo mental. Esta prueba inmunohistoquímica identifica a los pacientes que no mostraban FMRP en el citoplasma de sus linfocitos. Las ventajas de la técnica son la economía, la rapidez y el estudio directo de la presencia de la proteína, con independencia del defecto molecular existente. El test mostró especificidad en los varones, no así en mujeres con la mutación completa debido al proceso de inactivación de uno de sus cromosomas X (Lionización) ( 24 ). La técnica fue validada en 1997 ( 25 )
En 1999, el mismo grupo holandés, mejoró la eficacia de la técnica para la detección del SXF al realizarla en tejido de origen ectodermal como lo es la raíz de pelo, cuya procedencia es la misma del sistema nervioso ( 26 ).
En el año 2003 se pudo predecir la función cognoscitiva de la mujer portadora del S.X.F usando el método inmunohistoquímico en raíz de pelo ( 27 ).
Así, el Método inmunohistoquímico con fosfatasa alcalina indirecta detecta tanto pacientes afectos como portadores de SXF con una eficacia de 100 y 70 % respectivamente ( 9,19) a diferencia de los otros métodos mencionados.
En el Perú existen muy pocas familias diagnosticadas con SXF, teniendo en cuenta que es la causa más frecuente de retardo mental heredable ( 15, 16 ) , los pocos estudios que se han realizado emplearon evidencias clínicas o estudios citogenéticas ( 20, 21 ).
VIII. OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÌFICOS
Objetivo General:
Detectar el Síndrome de X Frágil en niños menores de 18 años con retardo mental de causa no conocida, que acudan al Instituto Especializado de Salud del Niño y al Hogar Clínica San Juan de Dios desde Agosto 04 a Febrero 05.
Objetivos Específicos:
1.-Detectar mediante el método inmunohistoquimico pacientes con Síndrome de X Frágil en niños menores de 18 años con retardo mental de causa no conocida, que acudan al Instituto Especializado de Salud del Niño y al Hogar Clínica San Juan de Dios desde Agosto 04 a Febrero 05
2.- Identificar familiares con SXF por el reconocimiento de un caso de SXF 3.- Elaborar una propuesta para la prevención del SXF en familias portadoras
Los pacientes seleccionados que acudieron al l consultorio de genética del INSN y HCSJD presentaron retardo mental, autismo, retardo del lenguaje y problemas de aprendizaje de causa desconocida El estudio se realizo de Octubre 2005- Octubre 2006. Luego de firmar el consentimiento informado (apéndice 1) y el llenado del registro del paciente (apéndice 2) se procedió a la extracción de la muestra de 20 raíces de pelo para luego realizar el procesamiento mediante el método inmunohistoquímico de fostatasa alcalina indirecta modificado para bulbo piloso (apéndice 3).
Las raíces de pelo marcadas fueron examinadas al microscopio de luz de campo claro observándose: Coloración roja ( positiva ) como presencia de proteína y ausencia de coloración ( negativo ) como ausencia de proteína. Estos resultados se reportaron en valores de porcentaje de expresión de la proteina en estudio (Apéndice 5),tomándose en cuenta los siguientes criterios :
Criterios de Willemsen (25).:
En varones
Sujetos con expresión normal de la proteina o alelo normal : 77-100% de expresión Sujetos con Mutación completa : 0-40% de expresión
Los rangos de 41-76 % de expresión no están determinados.
En mujeres
Se considera mutación completa rangos de expresión menores del 55%.
Nota : En los varones en los que los rangos de expresión no están determinados, sospechamos mutación en el gen por lo que de ahora en adelante denominaremos como rango de “ Sospecha de Mutación “ : 41 – 76 % de expresión
En los pacientes con rangos de mutación completa y sospecha de mutación se extendió el estudio a los familiares en riesgo (hermanos, madre, abuela y tías maternas previo asentimiento ó consentimiento informado. La detección de portadores y afectados permitió su asesoramiento.
Método Estadistico
Los resultados fueron analizados mediante el sistema SPSS versión 12.0 en frecuencia y porcentajes.
X. RESULTADOS
1.-En el presente estudio se incluyeron 200 participantes, de los cuales el 77.5% (155) procedieron del INSN y 22.5% (49) del HCSJD. Se amplio el estudio a 12 familiares de los pacientes afectados que correspondieron al INSN 66.6% (8) y 33.3% (4) al HCSJD.
De los participantes 151 (75.5%) fueron del sexo masculino y 49 (24.5%) del sexo femenino. La distribución por edades fue 54.5% en niños de 5 años o menos, 35% entre los 6 y 10 años ,0.5% entre 11 y 15 años y 2% de 16 años o más. (Grafico1). El 100% de los familiares (12) fueron mujeres y mayores de 16 años.
Grafico 1 : Distribución de pacientes según grupo Etario
35%
2%
8.5%
54.5 %
0-5 años
6-10 años
11-15 años
16 años a más
2. Los diagnósticos de inclusión en el estudio fueron: 49.5% retardo mental, 17% retardo del lenguaje 15.5% problemas de aprendizaje, 12.5% autismo, 4.5% retardo mental con autismo, 1% retardo lenguaje con autismo (grafica 2). Los familiares estudiados no tuvieron sintomatología aparente.
Gráfica 2: Distribución de pacientes estudiados según su Diágnostico Previo
16%
49.5%
1%
12.5%
15.5%
4.5%
Retardo Mental (R.M) Autismo (A)Problemas de Aprendizaje (P.A) Retardo de Lenguaje (R.L) R.M y A
R.L y A
Donde RM, Retardo Mental; A, Autismo; P.A., Problemas de aprendizaje; R.L.,Retardo de Lenguaje. 3. En los varones se observo que 74 (49%) presentan retardo mental, 23 (15.2%) autismo, 21 (13.9%) problemas de aprendizaje, 23 (15.2) retardo del lenguaje, 8 (5.3%) retardo con autismo y 2 (1.3%) autismo con retardo mental.
En las mujeres se encontró que 25 (51%) presentan retardo mental, .2,(4.1%) autismo.10 (20.4%) problemas de aprendizaje, 11 (22.4%) retardo del lenguaje, 1 (1%) retardo mental con autismo. (Gráfico 3).
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60%
%
R.M Autismo (A) Prob Apren(P.A)
Ret. Lenguaje (R.L)
R.M y A R.L y A
Diagnóstico de inclusión
Gráfica 3: Cuadro comparativo Diagnóstico de inclusión por sexo
Mujeres Varones
Donde RM, Retardo Mental; A, Autismo; P.A., Problemas de aprendizaje; R.L.,Retardo de Lenguaje.
En varones, 139 de los pacientes estudiados (92.1%) presentaron normalidad en la expresión de la proteína FMRP (77-100%); 7 (4.6%) tuvieron valores en rango de sospecha de mutación (41-76%) y 5 (3.3%) tuvo rango de mutación completa (0-40%) (Gráfico 4 )
Gráfica 4: Rangos de Expresión de la
proteina FMRP en pacientes varones
4.6% 3.3 % 92.1 % 77 - 100 41 - 76 0 - 40
Expresión
de FMRP
En las pacientes mujeres 48 (98%) presentaron normalidad de la expresión de la proteína y 1(2%) presento mutación completa (Gráfico 5).
Todos los familiares estuvieron en el rango de expresión normal de
la proteína.
Gráfico 5: Rangos de Expresión de la proteina FMRP en pacientes mujeres
98% 2 %
77 - 100 56 - 76 0 - 55
4.- Las frecuencias encontradas en varones con el diagnóstico de inclusión y rangos de expresión de la proteína fueron: de 74 pacientes con retardo mental, 4 (5.4%) estuvieron en el rango de sospecha de mutación y 4 presentaron mutación completa (5.4%)
(Gráfico 6).
Gráfica 6: Porcentaje de Expresión de FMRP en varones con diagnóstico de RETARDO MENTAL 5.4% 89.2 % 5.4% 77 - 100 41 - 76 0 - 40
Expresión
de FMRP
Expresión de FMRPDe 23 pacientes con autismo, 2(8.7%) estuvieron en el rango de sospechosos de mutación y 1 (4.3%) en el rango de mutación completa. (Gráfico 7)
Gráfica 7: Porcentaje de expresión de FMRP en varones con diagnóstico de AUTISMO 87% 4.3% 8.7 % 77 - 100 41 - 76 0 - 40
En los problemas de aprendizaje de 21, 1 (4.8%) es sospechoso de mutación (Gráfico 8)
Gráfica 8: Porcentaje de expresión de FMRP en varones con diagnóstico Problemas de Aprendizaje 5% 95% 77 - 100 41 - 76 0 - 40
6.- En pacientes con expresión de la proteina FMRP en el rango de mutación completa, 4 (80%) de ellos tienen retardo mental y uno (20%) presenta Autismo. Se determinó sospecha de mutación en 4 (57.1%) pacientes con diagnóstico de retardo mental, 2 (28.6%) con autismo y uno (14.3%) con problemas de aprendizaje. (Gráfico 9).
Expresión
de FMRP
Expresión
de FMRP
0% 20% 40% 60% 80% 100% % de pacientes 77 - 100 41 - 76 0 - 40 R a n g o s d e E x p re s ió n d e F M R P
Gráfico 9: Relación de los Rangos de expresion de FMRP según los Diagnósticos de Inclusión en varones R. M. AUTISMO P. A P.L R.M y A R.L. Y A
Donde RM, Retardo Mental; A, Autismo; P.A., Problemas de aprendizaje; R.L.,Retardo de Lenguaje.
En pacientes mujeres solo una de ellas presenta retardo mental (4%) y está en el rango de mutación completa (Gráfico 10).
Gráfico 10: Porcentaje de expresión en mujeres con diagnóstico de RETARDO MENTAL 4% 96% 77-100 56 - 76 0 - 55
XI. DISCUSIÓN
En el presente estudio se observó una frecuencia mayor de pacientes procedentes del I.E.S.N. por ser un centro de referencia nacional.
Expresión de FMRP
La frecuencia de pacientes de sexo masculino respecto a los femeninos fue mayor una relación de 3.08/1, lo cual explicaría porque todos los diagnósticos de inclusión el estudio presentan mayor incidencia en varones (27, 28, 29, 30).
El mayor número de pacientes estuvo entre los rangos 0 - 5 años, seguido del grupo de 6 - 10 años, por ser el grupo etario que con más frecuencia acuden a estos centros .
De los diagnósticos de inclusión se observó con mayor frecuencia retardo mental, problemas del lenguaje y del aprendizaje, las cuales son manifestaciones frecuentes en el SXF.
El autismo se presentó con menos frecuencia, lo cual concuerda con su incidencia en la población general, en comparación a los transtornos mencionados anteriormente (27,28,29,30.). En el estudio se evidenció mayor frecuencia de autismo en varones lo que concuerda también con la literatura. (28).
Encontramos 7 (4.6%) pacientes en rangos de 41-76% de expresión de la proteína correspondiendo a un grupo no catalogado por Willemsen. En este grupo sospechamos la presencia de alguna mutación del gen por lo que se le denomino como SOSPECHA DE MUTACIÓN. Esto podría ocasionar un aumento del número de falsos positivos, en los cuales debería efectuarse la prueba molecular para determinar su estatus génico real y definir la fiabilidad de este rango.
En varones se detectó mayor número de afectados por el SXF en una relación de 5/1 con las mujeres. Estas observaciones concuerdan con lo esperado (4,5). La ausencia de pacientes mujeres en el rango de sospecha de mutación es debido a la gran variabilidad en la expresión de la proteína FMR1 como consecuencia de la preferencia de la inactivación hacia el cromosoma X que presenta la mutación (9,25). Por ello en mujeres con rangos de expresión normal de la proteína con alta sospecha de ser portadoras (madre de un afectado ) requieren siempre la confirmación mediante la prueba molecular.
En nuestro estudio de 99 pacientes con retardo mental obtuvimos 5 pacientes con disminución de la expresión de la proteína FMRP, lo que concuerda con lo observado en la literatura ( 1 ).. Por ello esta prueba es de ayuda en la detección del SXF en pacientes con retardo mental.
Se observó un paciente con autismo ( 4.3 % ) con disminución de la expresión de la proteína FMRP, a pesar de que el SXF se observa en el 18.5% de pacientes con autismo. La baja detección se explicaría por los problemas diagnósticos que el autismo tiene ( ).
En varones, el retardo mental y el autismo nos llevan a sospechar pacientes afectados con el síndrome de X frágil, (27,28). En la detección de pacientes con sospecha de mutación, el retardo mental, autismo y problemas de aprendizaje, son importantes manifestaciones tanto en pacientes portadores de una premutación como de la mutación completa. (29, 32, 33).
XII. CONCLUSIÓN
El estudio inmunohistoquímico es una herramenta de ayuda para el diagnóstico del Síndrome de X- frágil en pacientes con retardo mental.
XIII. RECOMENDACIONES
1.- Evaluar el estatus génico en todo paciente mujer con alto sospecha de ser portadora (madre de un hijo afectado).
2.- Evaluar el status génico en paciente con rangos de expresión de la proteína FMRP menores de 76-41 %
XIV. REFERENCIAS BIBLIOGRÀFICAS
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