Solicitud de sobretiros: Dr. Anselmo Otero-González. Unidad de Hibridomas y Anticuerpos Monoclonales, Instituto de Medicina Tropical “Pedro
RESUMEN.
Se revisa la generación de anticuerpos monoclonales de ratón mediante la tecnología de hibridomas que utiliza la fusión de células somáticas. Una abreviada introducción teórica es seguida de los protocolos más importantes cita-dos en los textos y artículos clásicos, así como algunos provenientes de la experiencia del autor. La tecnología de hibridomas sigue siendo hoy día una poderosa herramienta para la obtención de grandes cantidades de anticuerpos de estructura homogénea y especificidad constante, útiles en el diagnóstico, y en algunos casos en el tratamiento de diversas patologías.
palabras clave: Anticuerpos-monoclonales, inmunoglobulinas, hibridomas.
SUMMARY.
MOUSE MONOCLONAL ANTIBODIES: DESCRIPTION OF TECHNICAL PROTOCOLS. Monoclonal antibodies generation by somatic cell fusion technology is reviewed. A brief theoretical introduction is followed by the most popular protocols cited in classical texts and articles. Some are derived from the personal author’s experience. Nowadays, hybridoma technology is a powerful tool for obtaining large amounts of homogeneous antibodies of predefined specificity, useful for both diagnosis and, in some cases, in the treatment of several pathologies.
key words: Monoclonal-antibodies, immunoglobulins, hybridoma.
Anticuerpos monoclonales
murinos: descripción de
proto-colos técnicos.
Anselmo Otero-González.
Unidad de Hibridomas y Anticuerpos Monoclonales, Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”, La Habana, Cuba.
Introducción.
El 7 de Agosto de 1975, apareció en la revista Nature, un artículo cuya trascendencia provocaría una revolución en las investigaciones biológicas (1) . Este trabajo de César Milstein y George Kohler, realizado en Inglaterra, describió la obtención de anticuerpos de especificidad predeterminada, mediante la fusión celular de esplenocitos de ratón inmunizados con hematíes y células de una línea celular de un plasmacitoma de ratón derivada de linfocitos B. Fueron éstos los primeros anticuerpos monoclonales (Mabs) obtenidos por fusión celular.
Este resultado constituyó la culminación de una larga carrera de inmunólogos e inmunoquímicos en el rescate de la función productora de anticuerpos en una estirpe celular de crecimiento indefinido, que permitiera disponer de una fuente prácticamente ilimitada de anticuerpos muy específicos.
En este sentido fueron precursores los trabajos de Potter (2) en el logro de líneas celulares derivadas de linfocitos B de ratón, que se conocieron desde entonces como los mielomas de Potter. Estas líneas produjeron cantidades apreciables de inmunoglobulinas de estructura homogénea que mucho ayudaron en la comprensión de la estructura básica de los anticuerpos.
Ya en la década de los 50, Burnet, Jerne, Ledelberg y Talmage habían postulado que cada linfocito B estaba predeterminado para sintetizar una molécula de anticuerpo de estructura única (idiotipo), que en algún momento de la maduración se expresaba en la superficie celular como receptor para el antígeno (3).
Por otra parte, para el advenimiento de la Tecnología de los Hibridomas, resultó decisivo el diseño de un medio selectivo para el crecimiento de híbridos obtenidos a partir de plasmacitomas de Potter mediante la deficiencia en la enzima Hipoxantina-Guanina-Fosforibosil-Transferasa (HGPRT) y su complementación con un medio que contenía Hipoxantina, Timidina y Aminopterina (que es un bloqueador de la síntesis de novo de los ácidos
nucleícos)(4).
Se conoce desde hace bastante tiempo que es posible fusionar células de diferentes tipos y de diferentes especies para formar híbridos. Sin embargo, la retención de características altamente diferenciadas se pierden si los parentales no provienen de un linaje igual o muy relacionado y en un estadio similar de diferenciación (5).
Una línea celular productora de anticuerpos generada por esta tecnología, proviene de la integración física, mediante un agente fusógeno, de células productoras de anticuerpos de un animal inmunizado y células de una línea de plasmacitoma con un similar estadio de diferenciación. El hibridoma resultante puede preservar la capacidad de secretar inmunoglobulinas específicas y la posibilidad de reproducirse indefinidamente, además de la capacidad (selectiva) de expresar actividad HGPRT que le ha permitido sobrevivir. Esta metodología ha resultado muy exitosa con células de ratón y rata. Menos espectacular se ha mostrado con célula humanas y poco trabajo se ha experimentado con otras especies. Una vía alternativa para la obtención de hibridomas humanos es la inmortalización de linfocitos de sangre periférico con el virus de Epstein-Barr (EBV) (6).
Hoy en día la Ingeniería Genética ha irrumpido exitosamente e el campo de los monoclonales y ya se han obtenido anticuerpos quiméricos, humanizados (ratón-humano) y fragmentos de anticuerpo expresados en fagos (scfv) que permiten el clonaje y manipulación de repertorios de linfocitos B murinos y humanos. Con esta potencialidad pueden obtenerse anticuerpos que no existen en la naturaleza como los catalíticos y es posible provocar maduración “in vitro” de la afinidad de los anticuerpos recombinantes (7).
En esta revisión centraremos la atención en la tecnología de los hibridomas obtenidos por fusión celular.
Líneas de plasmacitoma celular.
Las células de plasmacitoma que se utilizan en los experimentos de fusión celular tienen una
y la adición de hipoxantina 100 µmol/L, timidina 16 µmol/L y amínopterina 0.5 µmol/L. En la práctica se preparan soluciones concentradas lOOx de cada uno de estos aditivos. La adición de 2 mercapto etanol (50 µmol/L), muy utilizada en los primeros tiempos de la tecnología para asistir el crecimiento de los hibridomas, ha caído en desuso últimamente. Se prepara una solución concentrada, se filtra y se conserva a -8OoC.
Suplemento de suero fetal bovino.
Usualmente se inactiva en baño a 56oC por 30 min. Los lotes de suero varían considerablemente en su capacidad para promover el crecimiento de los hibridomas por lo que resulta conveniente probar diferentes lotes antes de adquirirlos (10). También se puede obtener productos ya probados para este fin como Hybrimax de Sigma Chemical Co., USA. Se pueden utilizar aditivos que contienen factores de crecimiento como suero de cordón umbilical humano, medio condicionado por macrófagos peritoneales o líneas de macrófagos transformados.
Medio tamponado por HEPES.
Resulta una práctica habitual utilizar un tampón combinando el sistema bicarbonato de sodio (2 g/L) y atmósfera de CO2 al 5% con el tampón “zwiteriónico” HEPES (15-18 mmol/L), que tienen un pKa en rango más fisiológico que el bicarbonato. Concentraciones de HEPES mayores de 18 mmol/L pueden resultar tóxicas para las células.
Inmunización de los ratones.
Animales de 3-4 meses (15-18 g), preferible-mente hembras, son adecuados para la inmunización. El protocolo de inmunización depende de la naturaleza del inmunógeno de la misma forma que se diseña para la obtención de anticuerpos policlonales. En general deben inmunizarse varios animales por pro-tocolo. Es muy importante determinar el titulo de los animales que se han de seleccionar para la fusión. Un deficiencia en la enzima HGPRT por lo cual han sido
seleccionadas para crecer en presencia de una droga -como la 6-Tioguanina (2xlO-5 mol/L)- que impida la replicación celular. Sólo los mutantes deficientes en la enzima sintetizan DNA a partir de sus componentes primarios y escapan así la selección letal. Estas células son incapaces de crecer en un medio que contenga Aminopterina la cual bloquea la síntesis de novo de DNA, por lo cual mueren en el medio HAT. Los linfocitos parentales complementan esta deficiencia en los híbridos en proceso de fusión celular y son capaces de sobrevivir en el medio HAT (4).
Las líneas de plasmacitoma son crecidas en medio RPMI 1640 o Medio Esencial Mínimo de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con glutamina y suero fetal bovino al 10%. Aunque algunos autores recomiendan el uso de antibióticos, los cultivadores experimentados de células prefieren trabajar las líneas sin antibióticos para no enmascarar contaminaciones por lo que resulta más adecuado reservar su uso en el momento de la fusión.
Las líneas de plasmacitoma más utilizadas son la P3X63Ul, P3X63Ag8.653 (8), Sp2Agl4 y la P3-Ns1Ag4-1; son variantes no secretoras y HAT sensibles de la línea original MOP21. Estas líneas crecen como tumor ascítico en ratones isogénicos Balb/C.
Fusógenos.
El fusógeno originalmente usado en el trabajo de Milstein y Kohler fue el virus Sendai inactivado con radiación U.V. Por razones prácticas éste ha sido reemplazado por el polietilenglicol 4000 - 6000 (PEG) que se prepara al 5O% (p/v) en medio de cultivo sin suero y se esteriliza en autoclave (9).
Medio HAT.
Este medio se utiliza para seleccionar los hibridomas y contiene los componentes ya mencionados para el cultivo del plasmacitoma con la diferencia que el suero fetal bovino se utiliza al 2O%
punto debe quedar claro: la tecnología de hibridomas requiere de animales respondedores y por tanto no substituye la falta de respuesta.
En general es usual utilizar un ensayo para evaluar a los animales similar al que será empleado para evaluar a los híbridos. En muchas ocasiones este ensayo se pone a punto precisamente con los sueros de ratones con título. Aunque será tratado posterior-mente, el sistema de ensayo de los hibridomas tiene que estar muy bien diseñado y listo en el momento de la inmunización (por tanto antes de la fusión) . Des-pués de que ésta se produce y en un intervalo entre 10 y 14 días será necesario evaluar entre 150 a 300 sobrenadantes en 48 horas y tomar una decisión que implica desechar a los hibridomas no positivos en el primer ensayo. Esto significa que no puede esperarse a este momento para pensar en el ensayo. En el caso de inmunógenos particulados o células completas un posible protocolo de inmunización pudiera ser: dos inyecciones intraperitoneales (ip) de 107 células en solución tamponada de fosfatos (PBS) separadas por 4 semanas y un “booster” o reactivación tres días antes de la fusión. Un protocolo alternativo puede ser la inyección de 107 células (ip) en los días 0, 14 y 21 y el “booster” de igual forma (11) . Cuando los ratones son inmunizados con células humanas es posible encontrar una fuerte respuesta antiespecie. Para evitar la reactividad de estos antígenos selectivos se puede utilizar una táctica de recubrimiento con anticuerpos de ratón antes de inmunizar lo cual inhabilita la respuesta dominante contra estos epítopes.
Los inmunógenos administrados por vía endovenosa pueden provocar choque anafiláctico debi-do a que generalmente llegan al bazo rápidamente. Un tratamiento preventivo consiste en aplicar una inyección sensibilizadora con el inmunógeno al ani-mal unas horas antes por vía ip.
Cuando se inmuniza con moléculas solubles, se pueden utilizar diferentes protocolos. Uno de ellos implicaría una inyección de 100 µg de antígeno emulsificado en adyuvante completo de Freund (CFA) por vía sub-cutánea (sc) en 0.1 mL seguido de una reactivación de 100 µg en PBS por vía ip (0.5 mL)
con intervalos de 30 días. Cuando el animal tenga el título adecuado se procede al booster final que puede ser endovenosa cuidando la posibilidad de muerte por embolismo.
Algunos autores prefieren evitar el CFA que puede inducir granulomas e interferencias post-fu-sión. En su lugar pudiera utilizar entre otros el precipitado de alúmina con Bordetellla pertusis como inmunoestimulante.
Si uno o varios animales muestran un título adecuado (como por ejemplo 1/10000 en ELISA con respecto a suero de animales no inmunizados), enton-ces se procede, si todas las condiciones están creadas, a administrar el “booster” que a los tres días provo-cará una gran cantidad de linfocitos en tránsito o blastos.
Metodología de fusión celular.
El plasmacitoma parental debe encontrarse en fase exponencial de crecimiento para lo cual se deben sembrar 3-4 frascos de 75 cm2 con 2 x105 células por mL dos días antes de la fusión. Veinticuatro horas después (un día antes de la fusión) el medio es cambia-do sin antibióticos para evitar el enmascaramiento de alguna contaminación que sería aconsejable de-tectar antes de emprender la fusión.
La metodología original de Milstein y Kohler ha sufrido muchas modificaciones. Las dos más im-portantes son la sustitución del virus Sendai por el polietilenglicol (PEG) y el empleo de plasmacitomas no secretores de inmunoglobulinas (Ig). Protocolos muy populares han sido los de Galfré (9) y Kennett (12). En general cada laboratorio elabora su propia metodología siguiendo principios básicos que se ex-plicarán a continuación. Si un protocolo en particular no es exitoso se recomienda repetirlo ya que la experien-cia obtenida en la primera oportunidad repercutirá muy favorablemente en la segunda y subsiguientes. Una cosa que debe quedar bien establecida desde el principio. Se tendrán híbridos si:
contaminaciones.
2.- Se controla y evalúa previamente la no toxicidad de los componentes y aditivos.
3.- Se siguen los principios básicos de la fusión celular.
Protocolo tipo de fusión celular (13).
1.- El plasmacitoma se suspende y se lava 3 veces (3x) en medio RPMI con sus aditivos ya menciona-dos (incluyendo antibióticos) sin SFB y se centrifuga a 1000 rpm por 10 min. Después del último lavado es resuspendido en 10 mL y se cuenta el número de células por exclusión en Azul de Tripano.
2.- Se sacrifica el o los ratón(es) y se sumergen brevemente en etanol 70%. En el gabinete de flujo laminar se aplica un corte en la parte inferior del abdomen (perpendicular a la línea alba) y se abre el ratón hasta que quede expuesto el peritoneo. Con un juego de instrumental estéril, se corta la membrana y sin tocarlo con las pinzas, se localiza el bazo. Se cambia el instrumental por otro limpio y se toma el bazo cortándolo y liberándolo de grasa y se pasa a una placa de Petri con 10 mL de medio sin suero y antibióticos a doble concentración (2x). Se mantiene allí por 5 min y se cambia a otra placa con igual contenido. Se repite la operación otra vez.
3.- Se perfunde el bazo con una jeringuilla de 10 mL y aguja No. 20 hasta que la decoloración indique una buena cosecha de esplenocitos. Se lava 3x en iguales condiciones que el plasmacitoma y se cuenta por exclusión en Azul de Tripano. Los linfocitos en tránsito (blastos) son mayores que los maduros no estimulados. Los eritrocitos son amarillentos y de menor tamaño.
4.- Se mezcla 107 células de plasmacitoma y 108 en un tubo plástico de 50 mL y se centrifuga en iguales condiciones. Si no se alcanza tales cantidades de
células, se mantiene la proporción 1:10.
5.- Se decanta el sobrenadante y se remueve el “Pellet” contra la meseta ranurada del gabinete para aflojar la masa celular. Se Adiciona 0.5 mL de PEG el 50% en medio sin suero lentamente goteando por las paredes del tubo durante 2 min. Se mantiene el “pellet” en baño a 4oC durante un min. Se adiciona lentamente en iguales condiciones 5 mL de medio sin suero en 5 min. Se completa a 10 mL en otros 2 min y se tapa el tubo e incuba por 10 min. a 37oC. 6.- Se centrifuga a 1000 rpm por 10 min. y se resuspende en n x 10 mL de medio con SFB 20% (n=número de millones de células de plasmacitoma en la proporción 1:10 y también el número de placas que se sembrarán).
7.- Se siembra 100 µL se suspensión celular sobre placas de 96 pocillos en las cuales se han sembrado, 24 horas antes, macrófagos peritoneales de ratón a razón de 5 µL de lavado peritoneal por placa. Si se prefiere la promoción del crecimiento a base de esplenocitos, sacrifique un animal y extraiga los linfocitos de bazo siguiendo igual metodología y siembre 1x106 células alimentadoras por placa. 8.- Al día siguiente se remueve la mitad del medio a cada pocillo y se adiciona 50 µL de medio HAT 2x para iniciar la selección.
Entre 10 y 15 días los hibridomas se verán crecer a simple vista. No obstante evalúelos bajo el microscopio y seleccione para ensayo aquéllos que hallan llenado más de un 60% de la superficie dispo-nible. En la medida que pasa el tiempo vendrán nuevas oleadas de hibridomas que coexistirán con los que ya han sido evaluados y seleccionados. La técnica aséptica debe ser muy refinada para evitar contaminaciones.
Evaluación de sobrenadantes.
La técnica seleccionada deberá estar muy rela-cionada a aquélla en la cual se desea que funcione el monoclonal sobre todo si se destina al diagnóstico. En general se distingue una evaluación primaria con-tra el inmunógeno y una secundaria para detectar reacciones cruzadas u otras posibles propiedades del monoclonal como capacidad neutralizante, aglutinadora, etc.
Una prueba de evaluación de sobrenadantes de hibridomas debe satisfacer los siguientes criterios: 1.- Debe ser sencillo y posible de realizar con la asistencia técnica que se dispone en el laboratorio. 2.- Debe tener un conveniente grado de automatización para enfrentar una gran cantidad de sobrenadantes simultáneamente.
3.- Debe ser capaz de detectar 1-10 µg/µL de anti-cuerpo.
4.- Los resultados del test deben estar listos como máximo al día siguiente a la cosecha de los sobrenadantes para establecer la conducta a seguir con los hibridomas seleccionados.
5.- Debe contar en su diseño con controles positivos y negativos confiables.
6.- Si se incluye una preparación anti-Ig de ratón debe asegurarse que ésta reconozca a todas las variantes o que se tenga exacta cuenta de las limitaciones. 7.- Debe ser lo menos costoso posible en vistas del número de muestras a procesar en cada ocasión.
Se describe aquí un ELISA tipo para monoclonales destinados al diagnóstico de antígenos solubles o particulados.
1.- Placas de cloruro de polivinilo (PVC).
2.- Recubrir con 100 µL de anticuerpo policlonal monoespecífico que reconoce al antígeno con el que se inmunizó (10 µg/mL) en tampón carbonato de sodio 0.1 mol/L (pH 8.9). Incubar toda la noche a 4oC.
3.- Lavar 4x con PBS-Tween 0.05% (PBS-T). 4.- Bloquear con 150 µL de albúmina bovina l% en PBS por 1h a 37oC.
5.- Lavar 4x con PBS-T
6.- Añadir 100 µL de antígeno en una concentración saturante del anticuerpo de recubrimiento en PBS-T (previamente determinada) Incubar 1h a 37oC. 7.- Lavar 4x con PBS-T.
8.- Añadir 100 µL de sobrenadantes de hibridomas, PBS-T como blanco, sobrenadante de un monoclonal no relacionado como control negativo y control po-sitivo (si no se dispone de éste último, hacer una dilución del suero del ratón positivo 1:5000-1:10000 y entonces incluir también igual dilución de suero de ratón normal). Incubar 1 h a 37oC.
9.- Lavar 4x con PBS-T.
l0.- Añadir 100 µL de conjugado anti IgG ratón (molécula completa) a una dilución recomendada por el proveedor en PBS-T conteniendo 4% de SFB. Incubar por 1h a 37oC.
11.- Lavar 6x con PBS-T.
12.- Añadir 100 L de solución de sustrato: 10 g de Ortofenilendiamina (OPD). 10 L de peróxido de hidrógeno 30% y 25 mL de tampón citrato fosfato pH 5. Incubar por 15 min. hasta desarrollo de color. 13.- Detener la reacción con 50 µL de ácido sulfúri-co al 12.5%.
14.- Leer densidad óptica en lector de microplacas a una longitud de onda de 492 nm.
Clonaje de las líneas de hibridomas.
El clonaje de los hibridomas positivos es indis-pensable para garantizar la monoclonalidad del hibridoma ya que colonias y poblaciones concomitantes de excresión no relacionada pueden hacer desaparecer en pocas generaciones a la población de interés.
Se han descrito dos métodos principales. El clonaje en agar semi-sólido y por dilución limitante en medio líquido. El primero se utiliza poco y se basa en el aislamiento de las colonias en medio solidificado que pueden capturarse con un asa de platino y llevarse a pocillos independientes de una placa de 96. Se des-cribirá el segundo método.
Clonaje de células por dilución limitante (14): 1.- Resuspenda las células y cuéntelas por exclusión de Azul de Tripano.
2.- Distribuir en una placa a razón de 10 células por pocillo en la fila A, 5 células por pocillo en la fila B, 1 célula por pocillo en las filas C, D y E y 1/2 célula por pocillo en las filas F, G y H en medio con SFB 20%. 3.- Las placas pueden contener como células alimentadoras macrófagos peritoneales de ratón y células esplénicas obtenidos ambos como se describió más arriba.
4.- Evalúe los sobrenadantes como se describió para los hibridomas en sus placas originales.
Recolección de sobrenadantes y fluido ascítico. Para obtener cantidades óptimas de monoclonales en sobrenadantes haga crecer los hibridomas hasta una alta densidad que acidifique el medio pero no ocurra sobrecrecimiento, ya que éste provoca la muerte celular muy rápidamente.
Centrifugue a 1000 rpm x 10 min, separe el pellet y añada azida sódica en concentración de 0.1%. Con-sérvelo a 4OoC.
Fluido ascítico.
1.- Inyecte, vía ip, ratones Balb/c de 3-4 meses con 0.5 mL de Pristane (2, 6, 10,14 tetrametil pentadecano), aceite mineral o adyuvante incomple-to de Freund, 1-3 semanas antes de inocular los hibridomas.
2.- Inyecte a cada ratón 106 - 107 células en PBS. Los hibridomas crecerán como un tumor líquido y el fluido contendrá 10-500 veces más monoclonal que los sobrenadantes.
3.- Para colectar la ascitis manipule los animales e introduzca una aguja No. 18 en la zona baja del abdomen hinchado y deje gotear el líquido en un tubo.
4.- Centrifugue, decante y congele a -20o en alícuotas de 1 mL.
5.- De los animales se puede obtener ascitis, general-mente, al menos una vez más.
Control de Calidad: Líneas celulares y prepa-raciones de anticuerpos.
Congelación de hibridomas.
Una sencilla técnica de congelación se describe a continuación:
1.- Utilice células en fase exponencial. Centrifugue a razón de 107 células por criovial.
2.- Remueva el sobrenadante y resuspenda las células en 1 mL de SFB 95%, dimetil sulfóxido 5% frío. 3.- Transfiéralas a viales de criopreservación
debida-mente rotulados con marca y fecha.
4.- Ubique los viales en cajas de polipropileno de paredes de 1 cm de ancho e introdúzcalo en un congelador de -80o. A las 72 horas pase el contenido a nitrógeno liquido evitando aumentos de temperatura. Descongelación.
1.- Tome el ámpula del nitrógeno líquido y deposítela en un recipiente con agua tibia. Lo más rápidamente posible desinfecte el ámpula en su exterior y pase el contenido a un frasco de 25 cm2 con 10 mL de medio con SFB al 10%.
2.- 24 horas más tarde centrifugue las células a 1000 rpm por 10 min y resiémbrelas en iguales condicio-nes.
Tanto los hibridomas como los sobrenadantes y ascitis deben ser evaluados periódicamente para conocer si la actividad de los anticuerpos se mantie-ne. Si ésta disminuye en los hibridomas debe procederse a efectuar series de clonaje.
Caracterización de anticuerpos monoclonales. La caracterización primaria consiste en la determinación de la clase y subclase de inmunoglobulina para lo cual se han de disponer de antisueros clasificadores que pueden emplearse en la prueba de Ouchterlony (15) para sobrenadantes concentrados o un test de ELISA (16). Una vez conocida esta clasificación se pro-cede al diseño de la estrategia de purificación cromatográfica que puede llevar un paso previo de precipitación salina en dependencia del grado de pureza deseado y de la susceptibilidad del monoclonal a este tratamiento. En general la cromatografía de afinidad en Proteína A muestra buenos dividendos en cuanto a rendimiento, pure-za y actividad biológica del anticuerpo (17).
Aplicaciones generales de los anticuerpos monoclonales.
Las aplicaciones de los monoclonales en la clínica y sobre todo en el diagnóstico son variadas. Realmente en la terapéutica su valor ha sido probado como herramienta en el control del rechazo de tras-plantes (anti CD3), pero como elementos de terapia pasiva no están pasando por su mejor momento, ya que la Federal Drugs Administration (FDA) de Esta-dos UniEsta-dos ha rechazado varios ensayos clínicos de monoclonales terapéuticos en los últimos años.
El caso de la utilidad de los Mabs como méto-do diagnóstico es distinto. Los Mabs han desplazaméto-do a las tradicionales preparaciones policlonales, mucho más caras y difíciles de estandarizar, y hoy en día se han convertido en una selección rutinaria para las grandes empresas comercializadoras de juegos diag-nósticos. Además, los Mabs han ganado terreno en la elucidación de mecanismos de acción y en la investi-gación en general.
Aunque las famosas “balas mágicas” de Paul Erhlich todavía no han dado en el blanco directamente (en algunas áreas como el cáncer no son precisamente las balas, sino las dianas las que no están bien precisa-das), éstas ya se encuentran en camino o por lo menos las mechas se encuentran encendidas.
REFERENCIAS.
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