Universidad de Los Andes
Cuantif icación espacio-temporal de la comunidad fitoplanctónica y los
pigmentos fotosintéticos en el lago de Tota- Boyacá, Colombia
Luisa Alexandra Peña Prieto
Mayo 2005
1. INTRODUCCIÓN
Desde el punto de vista ecológico, los ecosistemas acuáticos son considerados como un conjunto de subsistemas al interior de los cuales se desarrollan procesos biológicos y relaciones ecológicas que integrados entre si y con el medio ex terno determinan el comportamiento total del ecosistema (Donato, 1996). El análisis de la comunidad se puede realizar desde diferentes puntos de vista, estructuralmente y dinámicamente. Estructuralmente definido por la variación de riqueza, abundancia de las especies (Robinson & Sandgren, 1984; Odum & Odum, 1980) y por su posición en el espacio. La estructura presenta variaciones espacio-temporales que determinan la dinámica de una comunidad.
Entre los métodos mas utilizados para la determinación de la biomasa y estructura de la comunidad fitoplanctónica, encontramos la técnica de sedimentación de Utermöhl (Utermöhl, 1958). Esta técnica tiene como fin determinar e identificar las especies presentes en cuerpo de agua, al igual que definir el aporte de cada grupo de algas al bio-v olumen total. La técnica de Utermöl presenta una serie de desventajas, como son el consumo de tiempo excesivo en los conteos de células cuando es necesaria una estimación de biomasa. Adicionalmente la identificación de especies demanda un alto entrenamiento especializado. Debido a que pocos sistemas se pueden monitorear continuamente por el tiempo que se consume en cada conteo, se han desarrollado otras técnicas cuantitativas que permiten la estimación de biomasa fitoplanctónica en menor tiempo.
La determinación cuantitativ a de los pigmentos fotosintéticos en las algas es uno de los más frecuentes análisis realizados para los sistemas acuáticos. Las concentraciones de clorofila a rutinariamente es usada para estimar la biomasa fitoplanctónica y productiv idad. Tradicionalmente las clorofilas son determinadas por espectrofotometría usando una v ariedad de solventes y ecuaciones (e.g. Parsons & Strickland, 1963; Lorenzen, 1967; Riemann, 1976; Nush, 1980) en ambientes tanto marinos (Strickland & Parson, 1972) como en dulceacuícolas (Talling, 1969; Wetzel & Westake, 1969). Los productos de degradación de los pigmentos pueden interferir, no permitiendo una adecuada cuantificación de la clorofila a, para lo cual se implementa la técnica de acidificación con el fin de diferenciar entre la clorofila a y los productos de degradación de los pigmentos libres de magnesio (Lorenzen, 1967).
A partir de estos métodos se pretende caracterizar y predecir el comportamiento temporal y espacial de la comunidad fitoplanctónica del Lago de Tota, Boyacá Colombia.
ÍNDICE DE TEMAS PÁGINA 1. INTRODUCCIÓN ………... 2 2. MARCO TEÓRICO ... 8 2.1. FITOPLANCTON ... 8 2.1.1. Sucesión De Especies... 12 2.2. CUANTIFICACIÓN DE PIGMENTOS... 13 2.2.1. Clorofila ... 13
2.2.1.1. Estructura Y Deriv ados De Las Clorofilas... 14
2.2.2. Técnicas De Ex tracción... 16
2.2.2.1. Solv entes De Ex tracción... 16
2.2.2.1.1. Acetona ... 16
2.2.2.1.2. Metanol ... 17
2.2.2.1.3. N.N – Dimetilformamida... 17
2.2.3. Técnicas Cuantitaiv as De Análisis De Pigmentos ... 17
2.2.3.1. Espectrofotometría ... 18 2.2.3.2. Acidificación ... 20 3. JUSTIFICACIÓN ... 22 4. OBJETIVOS ... 22 4.1. Objetiv o General ... 22 4.2. Objetiv os Específicos ... 22 5. MATERIALES Y METODOS... 23
5.1. DESCRIPCIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO... 23
5.1.1. Características Generales De La Laguna De Tota... 23
5.2. DETERMINACIÓN DE LA CLOROFILA. ... 28
5.2.1. Fase De Campo ... 30
5.2.1.1. Determinación De Clorofilas Por Medio De Espectrofotometría... 30
5.2.1.2. Ex tracción ... 30
5.2.2. Fase De Laboratorio ... 30
5.2.2.1. Ex tracción ... 30
5.2.2.2. Determinación De Clorofilas Por Medio De Espectrofotometría... 30
5.2.2.2.2.Determinación de clorofila a en presencia de feopigmentos (Monocromático)... 32
5.3. ESTUDIO DE LA COMUNIDAD DE FITOPLANCTON... 33
5.3.1. Fase de campo ... 33
5.3.2. Fase de laboratorio ... 34
5.4. MANEJO E INTERPRETACIÓN DE DATOS……… 34
5.4.1. Estudio de la comunidad de fitoplancton... 35
5.4.2. Caracterización de la información... 35
5.4.3. Correlación de la información... 35
6. RESULTADOS ………... 37
6.1. CARACTERISTICAS FISICAS Y QUIMICAS... 37
6.2. NUTRIENTES ………... 42
6.3. FITOPLANCTON ………... 43
6.3.1. Composición………... .... 43
6.3.2. VARIACIÓN ESPACIO-TEMPORAL………. 44
6.3.3. DIVERSIDAD ………... 46
6.3.4. ANALISIS DE ORDENACIÓN (ACC) ………... 48
6.4. CLOROFILAS ………... 51
6.4.1. Método monocromático………... 51
6.4.2. Método tricromatico ………... 53
7. ANÁLISIS DE RESULTADOS………. 55
7.1. VARIABLES FISICOQUÍMICAS……….... 55
7.1.1. Variables de proporcionalidad constante ( pH y conductiv idad)... 55
7.1.2. Estructura térmica del agua……….... 56
7.1.3. Ox igeno Disuelto ………... 56
7.1.4. Elementos De Proporcionalidad Variable (Nutrientes)... 57
7.2. ASPECTOS ECOLOGIGOS………... 58
7.3. VARIACIÓN ESPACIAL ………... 59
7.4. DIVERSIDAD ………... 60
7.5. RELACION ENTRE LAS VARIABLES AMBIENTALES Y EL FITOPLANCTON (ACC). 61 7.6. VARIACIÓN DE LA CLOROFILA………... 62
8. CONCLUSIONES ... 64
.Anex o N° 1 ………... 65
Anex o N°2 ………... 66
Anex o N°3 ………... 67
Anex o N°4 ………... 68
9. Bibliografía ………... 69
ÍNDICE DE TABLAS PÁGINA Tabla 1. Distribución de pigmentos fotosintéticos en la div isión y clases de algas según Christense 9
Tabla 2. Ecuaciones para análisis de mezclas clorofilas disueltas en v arios solv entes... 18
Tabla 3. Fórmulas para la cuantificación espectrofotométrica de clorofilas... 19
Tabla 4. Síntesis de los procedimientos adoptados para la estimación de la clorofila a por espectrofotometría, Marker et al (1980) ... 21
Tabla 5. Espectro de absorción máxima de las clorofilas a y b con acetona al 90 %... 31
Tabla 6. Formula para la cuantificación espectrofotométrica de Jeffrey & Humphrey (1975).. 31
Tabla. 7 Valores de partición de v arianza de las variables ACC... 48
Tabla. 8 Porcentaje de ex plicación para las especies y muestras en el ACC... 49
ÍNDICE DE FIGURAS PÁGINA Figura 1. Rango de absorción de la clorofila a y b... 14
Figura 2. Estructura de la clorofila a y b. ... 15
Figura.3 Localización lago de Tota, Boyacá Colombia... 24
Figura 4. Promedios de precipitación máx ima, media y mínima en el Lago de Tota entre el periodo de 1985-1998 (IDEAM) ... 25
Figura.5 Promedios de los niveles máx imos, medios y mínimos en el Lago de Tota entre el periodo de 1973-2001 (IDEAM) ... 26
Figura.6 Promedios de la temperatura máx ima, media y mínima en el Lago de Tota entre el periodo de 1985-1998 (IDEAM) ... 27
Figura. 7 Promedio mensual del brillo solar en el Lago de Tota entre el periodo de 1985-1998 (IDEAM)...27 Figura 8. Piscicol, punto de muestreo en el lago Chico... 28 Figura 9. Los Pozos, punto de muestreo del lago Chico... 29 Figura 10. Valores De Conductiv idad (µS/cm), Temperatura Del Cuerpo De Agua (°C), pH Y Ox ígeno Disuelto (mg/L) Para El Lago De Tota. ... 38 Figura. 11 Diagramas de caja para el comportamiento del pH en los diferentes meses de muestreo (Diciembre 2004 al Marzo 2005) en el Lago de Tota ... 39 Figura. 12 Diagramas de caja para el comportamiento del pH en los diferentes puntos de muestreo en el Lago de Tota ... 39 Figura. 13 Diagramas de caja para el comportamiento de la conductiv idad en los diferentes meses de muestreo (Diciembre 2004 al Marzo 2005) en el Lago de Tota... 40 Figura. 14 Diagramas de caja para el comportamiento de la conductiv idad en los diferentes puntos de muestreo en el Lago de Tota ... 40 Figura. 15 Diagramas de caja para el comportamiento del oxigeno disuelto (mg/L) en los diferentes meses de muestreo (Diciembre 2004 al Marzo 2005) en el Lago de Tota... 41 Figura. 16 Valores de Nitratos (NO3) (mg/L) para el Lago de Tota... 42 Figura. 17 Valores de Ortofosfatos (mg/L PO4) encontrados para el Lago de Tota... 42 Figura. 18 Aporte de las principales clases a la abundancia total del fitoplancton en el lago de Tota. 43 Figura. 19 Aporte a la abundancia total de las principales clases de fitoplancton en los diferentes meses de muestreo en el Lago de Tota. ... 44 Fig.20 Diagramas de caja de la abundancia de la comunidad fitoplanctónica en los diferentes meses de muestreo (Diciembre 2004 al Marzo 2005) en el Lago de Tota... 45 Fig.21 Diagramas de caja de la abundancia de la comunidad fitoplanctónica en los estratos de muestreo (Diciembre 2004 al Marzo 2005) en el Lago de Tota ... 45 Figura. 22 Valores de diversidad (índice de Shannon-Weaner) para las algas del fitoplancton del lago de Tota ... 46 Figura. 23 Valores de riqueza para las algas del fitoplancton del Lago de Tota... 47 Figura. 24 Valores de uniformidad de especies para las algas del fitoplancton del Lago de Tota 47
Figura. 25 Valores de dominancia (Simpson 1/ Dominancia) para las algas planctónicas del Lago de
Tota.
... 48
Figura. 26 Graficas de ACC para las especies y las variables ambientales para el Lago de Tota. 50 Figura. 27 Graficas de ordenación de ACC para los meses de muestreo en el Lago de Tota. 51Figura 28. Valores de concentración de la clorofila a (mg/m3) en los diferentes meses de muestreo (Nov iembre 2004 al Marzo 2005) en el Lago de Tota ... 52 Figura 29. Valores de la concentración de la feofitina (mg/m3) en los diferentes meses de muestreo (Diciembre 2004 al Marzo 2005) en el Lago de Tota ... 52 Figura 30. Valores para la concentración de la clorofila a (mg/m3) en los diferentes meses de muestreo (Nov iembre 2004 al Marzo 2005) en el Lago de Tota ... 53 Figura. 31 Valores para la concentración de la clorofila b (mg/m3) en los diferentes meses de muestreo (Nov iembre 2004 al Marzo 2005) en el Lago de Tota ... 53 Figura. 32 Valores de la concentración de la clorofila c (mg/m3) en los diferentes meses de muestreo (Nov iembre 2004 al Marzo 2005) en el Lago de Tota... 54
2. MARCO TEORICO
2.1. FITOPLANCTON
El término de plancton se refiere a un grupo de organismos que flotan en la superficie de ríos, lagos y océanos. El término de plancton proviene de la raíz griega ¨errante¨, que quiere decir, que los organismos planctónicos flotan libremente en el agua y viven a merced de sus movimientos. La gran mayoría de los organismos planctónicos son por si solos inmóviles, otros tienen una capacidad de locomoción limitada que les permite cambiar su posición en el cuerpo de agua.
El termino de fitoplancton es usado en un gran grupo de plantas planctónicas que viven en la superficie del agua. Hay un gran debate de que organismos exactamente deben incluirse en este grupo tales, entre organismos unicelulares y simples formas multicelulares, es incierto cual es la mejor manera de clasificación y en ocasiones es difícil distinguir entre animales y plantas. La gran may oría de fitoplancton son algas y pertenecen a un diverso grupo de plantas inferiores que no presentan ningún carácter diagnostico diferente del resto de plantas, por lo cual son consideradas como un grupo artificial y no natural (Donato, 1996)
La falta de caracteres morfológicos ha obligado a los taxónomos a usar un amplio rango estructural, bioquímico (que hacen referencia principalmente a las clorofilas, carotenoides y biliproteinas) y otros caracteres celulares para clasificar estos organismos (Tabla.1). Las relaciones ev olutiv as entre los grupos mas grandes se ven claramente en la estructura del flagelo (si esta presente), en la composición de pigmentos, la estructura del cloroplasto y la relación entre el cloroplasto y la envoltura nuclear (Coombs & Greenwood, 1976).
Tabla 1. Distribución de pigmentos fotosintéticos en la div isión y clases de algas según Christensen (1962)
a Strain Y-100 contiene clorofila b a través de una simbiosis con una chloropyte
b La mayoria de las Dinophyceae contienen clorofila c1 y ademas contienen fucoxantinas o unpigemento químico relacionado c Ausencia en Pelagococcus subviridis, Chrysospherella brevistrina y Giraudyopsis stellifera
d Ausencia en C. Brevistrina
e ausencia en siete especies de diatomeas pennales ∫
Originalmente esta identificado por Ricketts (1966 ); Withelm (1987) presenta evidencia que este pigmento es clorofila c1 , pero Jeffrey & Wright
(1987) creen que es MgDVP.
Algunos factores ambientales de importancia interaccionan para regular el crecimiento temporal y espacial del fitoplancton, a parte de requerimientos fisiológicos básicos como son la luz y la temperatura, ex isten otros factores como son; la concentración de nutrientes, pH, oxigeno disuelto, conductividad, etc que juegan un papel importante en la sucesión de las poblaciones algales.
Pigmentos de clorofila División Clase a b c1 c2 c3 D Procariota Cnenophyta Cyanophyceae + - - - Prochlorophyta Prochlophyceae + + - - - - Eucariota Rhodophyta Rhodophyceae + - - - - ± Chromophyta Cryptophyceae + - - + - - Dinophyceae + ± a ± b + - - Chrysophyceae + - ± c ± d ± - Synurophyceae + - + - - - Prymnesiophyceae + - + + ± - Bacillariophyceae + - +e + ± - Tribophyceae + - + + - - Eustigmatophyceae + - - - Phaeophyceae + - + + - - Chlorophyta Euglenophyceae + + - - - - Chlorophyceae + + - - - - Prasinophyceae + + ±∫? - - -
Charophyceae + + - - - -
A continuación se describirán las características más sobresalientes de las principales clases de algas, a las cuales pertenecen las especies que conforman las comunidades de fitoplancton en los ecosistemas epicontinentales.
• Cyanophyceae
Conocida con el nombre de Myxophyta o Cianobacteria, según el sistema de clasificación utilizado, y mas recientemente como Nostocophyceae, es el único grupo de algas que posee una estructura procariota igual a de las bacterias (carecen de núcleo, mitocondrias, cloroplastos y membranas internas). Entre sus pigmentos posee ficobilinas, clorofila a y varios carotenoides. Tiene un amplio rango de distribución como poseedoras de un robusto rango de tolerancia a muchos factores.
Se consideran como organismos primitiv os responsables de la acumulación de ox igeno en la atmósfera terrestre (Bold & Wy nne, 1985); presentan además una gran diversificación morfológica, pero siempre bajo la condición procariótica: unicelulares, coloniales y filamentosas (Fritsch, 1977). Gran parte de las algas azules planctónicas se encuentran dentro de la familia crococáceas (Anacystis= Microcystis, Gomphosphaeria= Coelosphaerium) y las familias filamentosas oscilatoriáceas, nostocáceas y rivulariáceas.
Algunas cianofíceas tienen la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico (N2) y almacenar hidrogeno orgánico, generalmente por células modificadas denominadas heterocistes en algas del orden nostocales, aunque también puede ser fijado por cianofíceas carentes de heterocistes. Además de la fotosíntesis oxígenica en las cianofíceas se presenta una fotosíntesis anox ígenica (Donato, 1996).
Las cianofíceas dominan en ciertas circunstancias (hipertrofia), y se provocan florecimientos que inhiben el crecimiento de otras algas, por excreción de toxinas (Shapiro, 1973; Roldan, 1992). Esto presenta una importancia ecológica al modificarse los ecosistemas.
• Chlorophyceae
Las clorofíceas es un grupo de algas grande y diverso, que se encuentran restringidos casi en su totalidad a aguas dulces. Poseen principalmente clorofila a y b que enmascaran a los carotenos y xantofilas.
Al igual que las cianofíceas, es un grupo que se desarrolla bajo una gran variedad de condiciones que van desde agua oligotróficas hasta las aguas marinas y supersaturadas con solutos. Se presentan especies bénticas, planctónicas y de hábitats subaereos.
a. Miembros planctónicos: conformados por los órdenes Volvocales y Chlorococcales presentan ubicuas distribuciones en aguas de diferente salinidad, dentro los márgenes limnológicos normales. Abundan preferencialmente en lagunas o en pequeños lagos productiv os. Algunos de ellos son heterótrofos facultativ os.
b. Botrycoccus: abundan en condiciones muy variadas por lo que resulta difícil determinarlo ecológicamente. Parece ser un fotótrofo que no requiere ningún tipo de v itamina para su crecimiento. c. Desmidiaceae: la distribución de las desmidiáceas y conjugales se relacionan con la concentración
baja de cationes divalentes de calcio y magnesio. Aunque no se encuentran restringidas a aguas de baja salinidad, son las mas comunes en este tipo de aguas, y presentan la mayor diversidad en cuencas graníticas e ígneas y en espcial en aguas con alto contenido de materia orgánica disuelta (Wetzel, 1981)
• Euglenophyceae
Son un grupo relativ amente grande y diverso. Casi todas eugleniodes son unicelulares, carecen de una pared celular bien definida y poseen uno o más flagelos. La mayoría fotosintetizadotes, aunque algunos carecen constante o eventualmente de clorofila, por locuaz son heterótrofos facultativ os o obligados, bien sea osmotróficos o fagotróficos (Fritsch, 1977; Hutchinson, 1957).
Las principales fuentes de nitrógeno para este grupo son el amonio y los compuestos de nitrógeno orgánico, por lo cual su desarrollo se concentra en lugares con alto contenido de amonio y ricas en materia orgánica (Margalef, 1978; Wetzel, 1981).
• Dinophyceae
Son algas flageladas unicelulares, muchas de las cuales son móv iles, presentes en aguas marinas, estuarinas y dulces. Al lado de las especies fotosintetizadoras, ocurren especies heterótrofas diferenciadas en distintos patrones; saprofíticos, parasíticos, simbióticos y holozoicos (Bold & Wynne, 1985).
La distribución de los dinoflagelados en relación con las principales características del agua, muestran que algunas especies como Ceratium y Peridinium son oblicuas y de amplio rango de tolerancia, mientras que la mayoria son muy especificas en sus tolerancias respecto al calcio, pH, temperatura y materia orgánica disuelta (Wetzel, 1981).
• Bacillariophyceae
Las diatomeas al igual que las desmidias, constituyen uno de los grupos mas importantes del fitoplancton en aguas dulces, a pesar de que la mayoría de sus especies se encuentran asociadas a comunidades litorales y sean sésiles (Duque & Donato, 1988). La característica principal de las diatomeas se deriva de su pared silicificada (Round, 1984; Wetzel, 1981). La pared celular de las diatomeas esta conformada por dos estructuras superpuestas, en donde el elemento mayor recibe el nombre de epivalva y el de menor hipovalva (Fritsch, 1977; Wetzel, 1981)
Se le div ide a las diatomeas dependiendo de su simetría en dos: “Centrales” aquellas con simetría radial (Cyclotella y Melosita), y “Pennales” de simetría bilateral (Gomphonema). Este último grupo se asocia a un ambiente litoral-bentonico, por su capacidad de locomoción sobre el bentos por acción del rafe (hendiduras longitudinales en las valvas) o por su poder de agarre por medio de pedúnculos, mientras que el orden Central se asocia al ambiente planctónico (Darley, 1987).
Las características ya antes mencionadas del orden Pennal le permiten distribuirse mas ampliamente en una div ersidad de ambientes (oligotróficas hasta hipertróficas).
• Chrysophyceae
Poseen una gran variedad de formas flageladas, tanto unicelulares como coloniales y muy rara vez son filamentosas. La distribución de la mayoría de las Chrysophyceae se presentan en aguas duras y en épocas de baja temperatura (Smith, 1955). Los requerimientos fuera de los normales para su desarrollo son algunas vitaminas como la tiamina y la biotina; sin embargo algunas especies como el Dinobryon pueden crecer en ambientes con baja concentración de fosfatos (Donato & Donato, 1988b).
Las formas planctónicas más importantes se agrupan en los ordenes Ochromonadales (Chrysomonadales) y Chromulinales. Para Colombia se han reportado hasta ahora Dinobryon y Phalansterium, ambos pertenecientes al orden Ochromonadales.
2.1.1 Sucesión de especies
Los rangos ecológicos de muchos factores ambientales fluctúan en el tiempo (temperatura, fotoperiodo, insolación, viento, mezcla, etc) y producen variaciones visibles en la abundancia, composición, dominancia de las especies fitoplanctónicas, alterando la estructura de la comunidad que se ajusta continuamente a los cambios (Margalef, 1963).
Cuando las condiciones físicas y químicas de los lagos se ven afectadas, se generan situaciones de disturbio que alteran la disponibilidad de la luz y nutrientes disponibles para las algas y esto conduce a un cambio en la div ersidad y dominancia de las especies.
La sucesión es el producto de reajustes estacionales en la estabilidad de la columna de agua y de la respuesta del fitoplancton; sin embargo en aguas tropicales debido a la ausencia de la estacionalidad en los regimenes fisicos, la sucesión de especies se nota débilmente y la variabilidad puede presentarse a escalas diarias o mensuales debido a la importancia de las fluctuaciones de la lluvia y mezcla vertical (Harris 1986).
En los ecosistemas acuáticos la sucesión del fitoplancton se da en tasas mas rápidas debido a que su tamaño y rápidos tiempos de regeneración; y dicha sucesión de especies esta dirigida por las estrategias adaptativas que favorecen a las especies, permitiéndoles mantener su dominancia (Reynolds 1997).
2.2. CUANTIFICACIÓN DE PIGMENTOS 2.2.1 CLOROFILA
La clorofila es un pigmento fotosintético muy importante en la captación y conversión de la energía electromagnética proveniente de la radiación solar en energía termoquímica, la cual es responsable de los procesos que conduce la fotosíntesis. En este tipo de reacción se forman numerosas células a partir del poder fosforilativ o (ATP) y reductivo (NADPH) generado en la cadena de transporte de electrones dentro de la membrana tilacoide, la cual prov oca a su vez una perdida de la energía inicial capturada de la luz (Rowan, 1989).
Se reconocen varias tipos de clorofilas que se han designado como a,b,c,d y e, entre las cuales la mas importante es la clorofila a y a que esta presente en todas las algas y plantas superiores. Por lo anterior, la concentración de clorofila a puede ser un indicador de la actividad biológica y para inferir procesos complejos que se presentan en cuerpos de agua.
Los pigmentos son sustancias que absorben luz, su color esta dado por las longitudes de onda que reflejan, es decir por los colores no absorbidos. El pigmento verde común a todas células fotosintéticas absorbe todas las longitudes de onda excepto, la de color verde, color que es reflejado y captado por nuestros ojos. La clorofila a absorbe energía a las longitudes de onda de 440nm y 680nm correspondientes a los colores azul y rojo (mínima y máxima longitud de onda) (Fig 1), mientras que la clorofila b y c tienen una banda de absorción máxima que se encuentra entre 665nm a 435nm y 630-635nm a 444-452nm, respectiv amente.
Figura. 1 Rango de absorción de la clorofila a y b
La clorofila a constituy e aprox imadamente el 1% - 2% del peso seco de la materia orgánica de todo el fitoplancton; convirtiéndose el mejor estimador de la biomasa algal. La clorofila varia con la especie o grupos tax onómicos, siendo afectada su concentración por el estado funcional de la población (edad y rango de crecimiento) y adicionalmente por v ariables fisicoquímicas como son la luminosidad y disponibilidad de nutrientes (Cabrera).
La clorofila b por otro lado, se encuentra solamente en las Clorofíceas y en las Euglenofíceas, y su función principal es traspasar la energía lumínica acumulada a la clorofila a para la quimiofotosintesis primaria (Gov indjee & Braun, 1974).
2.2.1.1 Estructura y derivados de las clorofilas
La clorofila a, b y d son derivados de hidroporfirinas con distintos sustituy entes (Holt, 1961; Jackson, 1976). Con un átomo de magnesio entre cuatro anillos pirrólicos y una cadena de fitol (alcohol) (Fig 2).
Figura 2. Estructura de la clorofila a y b
Las clorofilas presentan derivados naturales que son responsables del 40 % de la sobreestimación de la clorofila a en una cuantificación, debido a que estos grupos presentan el mismo espectro de absorción o similar al de sus parentales (Marker, 1972) la concentración obtenida para la clorofila a será la suma de la clorofila a mas sus derivados. La presencia de estos feopigmentos derivados es usualmente en células muertas dentro de una muestra o por degradación que ocurre durante la ex tracción.
Los más comunes productos de degradación en las clorofilas son los derivados libres de magnesio, feofitinas o feoporfirinas, formados rápidamente cuando el pH es bajo. La separación del grupo fitol del cuarto anillo pirrólico por activ idad hidrolitica es otra ruta común de degradación, formando clorofilidas. Cuando tanto la cadena fitol y el magnesio se pierden, el producto es feoforbidos (Lorenze y Jefrrey, 1980).
Clorofila - Mg Feofitina - Fitol Feofórbido Clorofila -Fitol Clorofilida -Mg Feofórbido
Otros factores responsables de la degradación de las clorofilas que dan origen a derivados que interfieren en la cuantificación de la misma, son la activ idad enzimática de los propios tejidos, temperatura, la acidificación, luz y oxidación (Rowan, 1989).
Sobre una acidificación, incluso con ácidos débiles, el átomo de magnesio es liberado de la porfirina y es reemplazado por dos átomos de hidrogeno. Como resultado la banda de absorción azul es cambiada ligeramente hacia el v ioleta y intensificado , mientras que el espectro de absorción rojo cambia a longitudes de onda mas largas y decrece en casi un 50%.
2.2.2 Técnicas de extracción
Los solventes posibles para la ex tracción de los pigmentos de las células vegetales son muchos y los procedimientos, pese a algunos intentos, no han llegado a estandarizarse. Para desconcierto de muchos las técnicas de ex tracción utilizadas pueden llegar a ser bastante antagónicas, ex tracción en frió o en caliente, rápida o lenta, triturada o no,... Sin embargo se pueden agrupar en dos formas de ex tracción con variaciones en las mismas: una rápida, donde se pueden obtener resultados en menos de una hora. Consiste en una ex tracción en metanol al 100% por 15 minutos en un baño de agua caliente (55°C). Después se la filtra la solución, se ajusta a un v olumen determinado, se homogeniza y se mide en el espectrofotómetro. La otra forma, mas lenta, se hace usando acetona o etanol, en ausencia de luz y a una temperatura aprox imada de 4°C durante toda la noche , o por 18-24 horas (Cabrera).
En gran medida, la elección del solvente fuerza el empleo de determinadas alternativ as. Los solventes mas empleados son acetona, metanol, etanol, N,N,-dimetilformamida y el dimetlsulfóxido. La elección del solvente debe realizarse sopesando las ventajas y desventajas de cada uno de los solventes, como, por ejemplo la facilidad de uso, la extención de los coeficientes específicos de absorción, toxicidad, etc.
2.2.2.1 Solventes de extracción
2.2.2.1.1 Acetona
La acetona es uno de los solventes mas usados por muchos años para la ex tracción de pigmentos en plantas superiores, como en oceoanografía y limnología. Normalmente se usa a una concentración 80% (Plantas superiores) o al 90% (Fitoplancton). Barrett & Jeffrey (1971) muestra que la concentración sobre 90% inhibe la enzima clorofilasa, responsable de la hidrólisis de la clorofila a y b a sus respectiv as clorofilidas.
El efector inhibidor de la clorofilasa regularmente es menos importante que la eficiencia en la ex tracción de todos los pigmentos , y a pesar de la eficiencia de la acetona como inhibidor; muchos investigadores muestran que la acetona es menos eficiente que otros solventes respecto a la ex tracción (Sand-Jensen, 1967; Garside & Riley, 1969; Seely et al., 1972; Marker, 1972; Nush, 1980; Duncan & Harrison, 1982; Pechar, 1987), especialmente cuando se trata de clorofices y cianobacterias (Jones, 1977). Esto hace necesario que sea necesario triturar el material si se desea una determinación cuantitativ a.
La acetona, a distintas diluciones, es el solvente para el que se han calculado más coeficientes específicos de absorción para las distintas clorofilas. Los coeficientes difieren entre autores, por la pureza de la preparación de los pigmentos y así como el tipo de espectrofotómetro utilizado.
En plantas superiores se han empleado los coeficientes de MacKinney (1941) utilizados en las formulas de Arnon (1949). Trabajos posteriores (Strain et al., 1963; Jeffrey & Humprey, 1975) indican que aquellos valores son 8% inferiores a las nuevas medidas. Es aconsejable utilizar las formulas de Jeffrey & Humprey (1975), especialmente en calculos que incluyen la clorofila c.
2.2.2.1.2 Metanol
Numerosos trabajos indican la superior capacidad de ex tracción del metanol respecto a la acetona. Esto permite una ex tracción pasiv a, sin trituración, en materiales finos. Puede realizarse sumergiendo el filtro durante 20 horas a 4°C y a oscuras. En plancton de agua dulce, donde puede abundar clorofíceas y cianobacterias, su empleo es mas aconsejable que la acetona. Los inconvenientes que presenta el metanol son dos. Por un lado, su facilidad a acidificarse, y por otro, el que no ex istan coeficientes específicos de absorción para todas las clorofilas.
Los coeficientes específicos de absorción obtenidos para la clorofila a en metanol absoluto a 665nm han sido 74.5 (Mackinney, 1941; Seely & Jensen, 1965) y 75 (Lentz & Zeitzchel, 1968). Riemann (1978 a) sugirió un valor de 77.9 basandose en la comparación de pigmentos transferidos de acetona a metanol y viceversa. En la conocida formula de Talling & Driver (1963) se emplea un coeficiente de 78 y para la feofitina uno de 47.
El etanol presenta características intermedias entre la acetona y el metanol, tanto en el poder de ex tractor como en el comportamiento frente a la acidificación (Arvola, 1981; Marker & Jinks, 1982).
2.2.2.1.3 N,N- dimetilformamida
La N,N- dimetilformamida pertenece al grupo de solventes de reciente introducción. Su ventaja mas notable es la gran capacidad de extracción que posee, ya que incluso en plantas superiores ex trae pasiv amente los pigmentos. Como inconvenientes presenta su toxicidad y la ausencia de coeficientes de absorción para la clorofila c. La formula que se pueden aplicar es la de Inskeep & Bloom (1985), no debe emplearse la de Moran (1982).
2.2.3 Técnicas cuantitativas de análisis de pigmentos 2.2.3.1 Espectrofotometría
La cuantificación de clorofilas a, b y c mediante la lectura al espectrofotómetro de las absorbancia de los ex tractos vegetales a unas longitudes de onda determinadas es, con diferencia, el método mas utilizado. Este simple método asume que la clorofila a predomina, y las longitudes de onda que se seleccionan corresponden a puntos singulares de los espectros de absorción de los pigmentos puros. Normalmente se trata de los máximos de absorción en la zona roja del espectro, región donde no hay interferencia por parte de los carotenos.
Una vez se tiene los ex tractos, la espectrofotometría proporciona de forma rápida la concentración de las distintas clorofilas, siendo necesario únicamente efectuar medidas absorbancia a dos o tres longitudes de onda y aplicar a estas formulas que dan directamente la concentración de las clorofilas. Estas formulas se basan en mediciones de los coeficientes de absorción específicos de los distintos pigmentos. El comentario de estos y de las correspondientes formulas que se derivan se han hecho al tratar los diferentes solventes de ex tracción de uso común (Catalan)(Tabla 2.).
Tabla 2. Ecuaciones para análisis de mezclas de clorofilas disueltas en varios solventes (concentración en mg/L)
Clorofilas Solv ente Ecuaciones Referencia
a y b Acetona 100% a=9,78E662- 0,99E664 Holm (1954), Nybom (1955)
b=21,40E664- 4,65E662
a=12,3E663- 0,86E645 Maclachlan & Zalik (1963)
b=10,3E645- 3,6E663
Acetona 90% a=11,93E664- 1,93E647
b=20,36E647- 5,50E664
Acetona 85% a=10,3E663-0,91E664 Hoffman & Werner (1966) Acetona 80% a=12,7E663-2,7E645
b=22,9E645- 4,7E663 MacKinney (1941), Arnon (1949) a=11,78E664- 2,29E647 Ziegler & Egle (1965)
b=20,05E647- 4,77E664
a=11,63E663- 2,39E649 Vernon (1960)
b=20,11E649- 5,18E663
a=11,73E664- 1,97E647 Jeffrey et al. (1974)
b=20,56E647- 5,42E664
a + b= 27,8E652 Bruinsman (1961) Dietil eter a=9,93E660- 0,78E642,5 Comar & Zscheile (1942)
a=9,95E661- 0,95E642,5 Dav idson (1985)
b=15,7E642,5- 2,31E661
a=10,10E662-1,01E664 Smith & Benitez (1955)
b=16,40E640- 2,57E662
a=9,93E660- 0,78E642,5 Frech (1960)
b=17,6E642,5- 2,81E660
a + b=100,50E600 Smith & Benitez (1955) Etanol a=13,70E665- 5,76E649 Wintermans & De Mots (1965)
b=25,80E649- 7,60E665
Metanol a=16,50E665- 8,30E650 Hoffman & Werner (1966)
b=33,80E650- 12,50E665
a, b,c1,& c2 Acetona 90% a=11,58E664- 1,54E647- 0,08E630 Jeffrey & Humphrey (1975) b=-5,45E664+ 21,03E647-
2,66E630 c1 + c2=-1,67E664-760E647+
24,52E630 a, c1, & c2 a=11,47E664-0,46E630 Jeffrey & Humphrey (1975)
c1 + c2=24.36E630- 3,63E664
a & c2 a=11,43E663- 0,64E630 Jeffrey & Humphrey (1975)
c2= 27,09E630-3,63E663
a, b, & c a=11,36E663- 2,16E645+ 0,10E630 SCOR-UNESCO (1966) b=-3,94E663-
14,81E645-3,66E630 c=-5,53E663-14,81E645+ 54,22E630
En la tabla 3 se resumen, las formulas monocromáticas, dicromáticas y tricromáticas mas utilizadas Tabla 3. Formulas para la cuantificación espectrofometrica de clorofilas (mg/l)
Clorofilas Solv ente Formula Referencia Aplicación a y b Acetona 80% a=12,70E663- 2,69E645 Arnon (1949) Plantas superiores
a=11,63E663- 2,39E649 Vernon (1960) Plantas superiores
b=20,11E649- 5,18E663
Acetona 90% a=11,93E664- 1,93E647 Jeffrey & Humphrey (1975) Plantas superiores
b=20,36E647- 5,50E664
N,N
dimetlformamida a=12,70E664- 2,79E647
b=20,70E647- 4,62E664,5 Inskeep & Bloom (1985) Plantas superiores a, b y c Acetona 90% a=11,58E664- 1,54E647- 0,08E630 Jeffrey & Humphrey (1975) Fitoplancton
b=-5,45E664+ 21,03E647-
c1 + c2=-1,67E664-760E647+ 24,52E630
a Metanol a=13,90E665 Talling & Driver (1963) Fitoplancton
La precisión de estas medidas se ven estrechamente relacionadas con las características del extracto a analizar y de las medidas de absorbancia realizadas con el espectrofotómetro. Las distintas formulas están diseñadas para una determinada mezcla de pigmentos. En consecuencia, entre mas se parezcan el ex tracto a la mezcla de pigmentos utilizada para la derivación de la formula mas precisa será la medida. Así por ejemplo, es un error utilizar ecuaciones dicromáticas cuando los ex tractos presentan clorofila c.
Cabe señalar que los productos de degradación de la clorofila introducen errores en la cuantificación, ya que son indistinguibles espectrofotométricamente.
2.2.3.2 Acidificación
Para determinar que cantidad de la absorbancia corresponde a la clorofila a o feopigmentos a, es necesario convertir la clorofila a a feopigmento y por medio de un cociente entre la absorbancia antes de acidificar div idida por la absorbancia después de acidificar, es posible deducir que parte corresponde a la clorofila y que es interferencia (Lorenzen, 1967; Marker,1972).
Lorenzen (1967) describe el método para estimar clorofila a y sus principales productos de degradación feofitina a y feofórbido a en un extracto acetonico al 90%. Este método ha sido ampliamente usado y poco criticado. Se basa en el cambio que se produce en la absorbancia a 665nm al transformarse la clorofila en feopigmentos por acción de un ácido.
La relación entre las absorbancias a 665nm de una misma cantidad molar de clorofila a y feofitina a v ale 1.7 en acetona al 90%. En muestras con distintas proporciones de ambos compuestos la relación entre la absorbancia a 665nm antes y después de acidificar, estara comprendida entre 1, si todo es feofitina, y 1.7, en caso de que todo sea clorofila (Catalan).
Este procedimiento se ha ex tendido a otros solventes diferentes a la acetona, aunque los valores de acidificación varian entre solventes. En la mayoría de los casos se tienen valores paralelos entre el metanol y etanol con el método usual de acetona, auque con un valor significativ amente menor (Marker & Jinks, 1982).El metanol forma una serie de interferencias en el espectro de las feofitinas a (Livingstone et al., 1953). Cambios similares en el espectro se dan en soluciones etanólicas, metanólicas y acetonicas debido a la formación de monocatinones y dicationes por feofitinas (Usacheva, 1971).La concentración final de HCl estimada para la no formación de feofitinas dicationicas es 0.01M, para acetona al 90%, 0.004 M, para etanol al 80% (Moed &
Hallegraff, 1978), y 0.006M, para etanol al 90% (Nush, 1980) (Tabla 4). Para el metanol la acidificación excesiv a es mucho mas difícil de controlar. Así pues que su empleo incluso con un 10% o 20% de agua, no es recomendable si se va acidificar.
Algunos otros problemas se presentan con la acidificación excesiva como son la ruptura de los epox icarotenos, estos se transforman en compuestos que absorben a longitudes de onda cercanos a 665-700nm (region roja e infrarroja), introduciendo errores tanto en la lectura a 665nm, como en la corrección de turbidez a 750nm (Riemann, 1978b).
Tabla 4. Síntesis de los procedimientos adoptados para la estimación de la clorofila a por espectrofotometría, Marker et al (1980) Autores Solv ente Concentración del ácido agregado Concentración final en el ex tracto Minutos después de la acidificación Condiciones de neutralización Coeficiente máximo de acidificación Interferencia por dicationes de feofitinas Lorenzen (1967) Acetona 90% 10-2 M HCl <1 Nulo 1,7 No Marker et
al, (1980) Acetona 90% 10°M HCl 10-2 M HCl <3 Nulo 1,7 No 10-1M HCl 10-3 M HCl 10 – 60 Nulo 1,7 No Marker et
al, (1980) Metanol 90% 10-2 M HCl <3 10-2N 1,6 neutralización Antes de la base orgánica 1,6 Nush & Palme (1975) Etanol 90% 6 x 10-3 M HCl 10 – 60 Nulo 1,7 No Nush (1980) Etanol 90% 6 x 10-3 M HCl 3 - 30 Nulo 1,7 No Moed & Hallegraeff (1978) Etanol 80% 4 x 10-3 M HCl <30 Nulo 1,7 No Holm-Hansen & Riemann
(1978) Metanol 95-100% 3 x 10-3 M HCl 3 MgCO3 25 mg neutralización Antes de la por ml de solvente
3. JUSTIFICACIÓN
El lago de Tota, es un sistema semiregulado que presta una serie de utilidades al medio circundante, como una fuente de riego para la agricultura, piscicultura, turismo, industria entre otros. Actualmente esta siendo afectado por los aportes alóctonos generados por el incremento en la acuacultura, expansión de la agricultura, erosión e irrigación al igual que por el desarrollo de centros recreacionales. Esta situación esta aumentando el grado de trofía, la composición de la comunidades y la calidad del sistema.
Debido a esto, se pretende dar a conocer la composición actual de la comunidad y reconocer algunos aspectos ecológicos, que nos permitan establecer las condiciones actuales del lago. El lago de Tota es un sistema epicontinental de gran importancia no solo para el departamento de Boyacá sino para toda Colombia, al ser uno de los embalses naturales más importantes.
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Determinar, como la comunidad de fitoplanctónica varía espacio temporalmente en el lago de Tota y a que posibles variables fisicoquímicas se les puede atribuir estos cambios en composición en la comunidad.
4.2. Objetivos específicos
• Ev aluar los cambios en la concentración de los pigmentos fotosintéticos y de la estructura fitoplanctónica en un periodo de seis meses, en el que se abarca la época de transición de mayor precipitación a sequía (noviembre), sequía (diciembre a febrero) y precipitación (marzo). • Determinar diferencias espaciales en la composición de la comunidad fitoplanctónica en siete
puntos de muestreo en el Lago de Tota.
• Relacionar los cambios en la estructura de la comunidad fitoplanctónica con las variables fisicoquímicas.
• Establecer si existen diferencias significativas en la cuantificación de la clorofila a por medio de dos métodos; espectrofotometría monocromática y tricromática.
5. MATERIALES Y METODOS
Para establecer la variación espacio-temporal de la concentración de los pigmento fotosintético y composición de la comunidad fitoplanctónica en el Lago de Tota, es necesario la realización de observ aciones mensuales del comportamiento de la comunidad fitoplanctónica y de la concentración los pigmentos, por medio dos técnicas; espectrofotometría y sedimentación. La espectrofotometría y sedimentación son técnicas cuantitativ as utilizadas comúnmente en la estimación de pigmentos fotosintéticos y fitoplancton, respectivamente. Adicionalmente se realizará un seguimiento de las variables fisicoquímicas del cuerpo de agua, con el fin de establecer posibles relaciones entre estas variables y la composición de la comunidad fitoplanctónica.
5.1. Descripción del área de estudio
Dentro de los ambientes lénticos altoandinos en Colombia el Lago de Tota ocupa lugar preferencial por su importancia como recurso biótico, paisajístico y socio-económico. Está localizada sobre la Cordillera Oriental en del departamento de Boyacá a una altitud de 3015 msmn, bajo la jurisdicción de los municipio de Aquitania, Tota y Cuítiva. Geográficamente, esta ubicado entre las coordenadas 5°28´13”, 5°39´14” N; 72°51´38” y 73°0´00” W (Donato, 2001) (Fig3).
5.1.1. Características generales de la laguna de Tota
El lago propiamente dicho presenta un área de 6000 ha y valores de 64, 31.6 y 0.7 metros para la profundidad máxima, media y relativa, respectiv amente. Posee un área de cuenca de 20500 ha y almacena un volumen de 1920mm3 (Donato, 2001).
Corresponde a lo que geológicamente se conoce como un valle ahogado de la morfología y su origen (tectónico) se asocia con los movimientos estructurales que formaron la cordillera oriental. Estratigráfiamente (Groose, 1928) están representadas las formaciones Villeta (Sureste y Noreste de Aquitania), Guadalupe (Sur, Oeste) y Guaduas (cercanías de Playa Blanca , Oeste).
El Llano de Aquitania (parte plana, costado Este) se considera como un deposito sedimentario (Cuaternario) formado por el río Tobal y quebradas vecinas. La cuenca hidrográfica alcanza hasta los 3700m s.n.m; en ellas se establecen diversas comunidades vegetales que pertenecen a las formaciones Selva andina – alta, Subpáramo y Páramo según Donato (2001).
El lago esta conformada por dos cubetas, Lago grande y Lago Chico, con profundidades máximas de 61 y 40 m respectivamente, separadas por una cadena de montañas que continúan desde el sur hasta el noreste y conforman las penínsulas Daitó y Susacá, y las islas San Pedro y Cerro chico.
Posee zonas en donde el litoral presenta pendientes abruptas de casi el 70%, seguida de plataformas que alcanzan rápidamente profundidades de 30 m. En las zonas del este y noreste la línea de costa es menos ev idente, ya que este sector de Aquitania y Los pozos y Llano Alarcón y Hato laguna presenta un litoral plano el cual se ha dedicado al desarrollo intensivo de cultivos de cebolla.
El lago de tota recibe aportes principalmente de cuatro afluentes Río Olarte, Hatolaguna, Tobal y La quebrada los Pozos, los cuales nacen en la v ertiente oriental de la cuenca. El lago posee además una serie de quebradas que drenan solo en época de lluvias, o bien recogen aguas residuales de la población dispersa y agroquímicos de las zonas de cultivo. Tal es el caso del río Tobal, que además transporta los v ertimientos de la cabecera municipal de Aquitania. Estos afluentes cargan una gran cantidad de sedimentos aguas arriba, como consecuencia de la erosión que presenta las microcuencas, en los últimos años y en especial en época de lluv ias.
Respecto a las variables climáticas encontramos que la laguna de Tota presenta un régimen de lluv ias bioestacional con un leve descenso de promedios máximos en septiembre. La época de lluvias se presenta entre marzo y nov iembre con un promedio cercano a los 100 mm y con un pico máx imo de lluvias en mayo. La época seca (diciembre-febrero) presenta promedios inferiores a 41 mm y se registran en enero los menores valores (0 mm). La precipitación promedio anual multianual para la región es de 894 mm (Fig.4).
Precipitación 0 20 40 60 80 100 120 140 160 EN ER O F EBR ER O MA R Z O ABR IL M AYO JUNI O JU LI O A GOS T O SEPT IE M B R E OC T U B R E N O VI EM BR E DI CI M E B R E P reci p it aci ó n m m Medios Maximos Minimos
Figura 4. Promedios de precipitación máxima, media y mínima en el Lago de Tota entre el periodo de 1985-1998 (IDEAM)
Según lo reportado por el IDEAM en el periodo de 1973 a 2001 los niveles máximos del lago se presentan en nov iembre y diciembre, mientras que los promedios mensuales más bajos se presentan en marzo, abril, mayo y junio, presentándose en mayo el menor valor (13 mm) (Fig. 5).
Niveles
0 50 100 150 200 250 300 EN ER O F EBR ER O MA R Z O AB R IL MA Y O JUNI O JU L IO A GOS T O SEP T IEM BR E OC T U B R E N O VI EM BR E DI CI M E B R E MEDIOS MAXIMOS MINIMOSFigura.5 Promedios de los niveles máximos, medios y mínimos en el Lago de Tota entre el periodo de 1973-2001 (IDEAM)
La temperatura media mensual es de 10.41 °C, oscilando entre 9 y 11 grados. Las mayores temperaturas se presentan en febrero, abril y mayo con un valor máximo medio mensual de 12.1 y 12.2 °C. Las menores temperaturas se registran durante julio, agosto y diciembre, presentándose en julio el v alor más bajo (8.3°C) (Fig. 6). Temperatura 0 2 4 6 8 10 12 14 EN ER O F E BR ER O MA R Z O ABR IL MA Y O JUNI O JU LI O AG O S T O SEPT IE M B R E OC T U B R E N O V IEM BR E DI CI M E B R E C° Medios Maximos Minimos
Figura.6 Promedios de la temperatura máxima, media y mínima en el Lago de Tota entre el periodo de 1985-1998 (IDEAM)
La humedad relativ a media mensual multianual es de 74 % oscilando entre 70.4 y 78 por ciento. El promedio anual de máxima humedad es 97.3% en mayo, en tanto los mínimos valores corresponden a enero-febrero con el 57 y 51 por ciento.
El Brillo solar es superior durante los meses de enero, febrero y marzo, siendo enero el mes con mayor brillo solar (269.4). Por el contrario el mes con menor brillo solar según lo reportado por el IDEAM (1985-1998) es abril con un valor de menor al 70 (Fig. 7).
Brillo So lar 0 50 100 150 200 250 300 EN ER O F EBR ER O MA R Z O ABR IL M AYO JUN IO JU L IO AG O S T O SEPT IE M BR E OC T U B R E N O VI EM BR E DI CI M EB R E Medios Maximos Minimos
Figura. 7 Promedio mensual del brillo solar en el Lago de Tota entre el periodo de 1985-1998 (IDEAM) 5.2. Determinación de la clorofila.
El estudio se desarrollo durante los meses noviembre a marzo, tiempo en el que se determino la v ariación de la concentración de la clorofila, del mismo modo se observo la variación en la composición de la comunidad fitoplanctónica y a partir de los resultados obtenidos, se hizo una predicción de qué factores determinan las variaciones tanto de clorofila como de la estructura de la comunidad en el lago.
5.2.1. Fase de campo
Esta fase comprende la toma de muestras de agua del lago de Tota en siete puntos, tres de los cuales corresponden al lago Chico (La Mugre, Los Pozos y Piscicol) (Fig. 8 y 9), uno a la intercepción de ambos lagos
(La Bocana) y los tres últimos al lago Grande (El Tunel, Playa Blanca y Hato Laguna). Estos puntos fueron seleccionados anteriormente por su ubicación y lo representativ os que son para cada zona durante monitoreos que se realizaron previamente.
Figura 8. Piscicol, punto de muestreo en el lago Chico.
La muestras de fitoplancton se tomaran mensualmente, por medio de la botella tipo Van Dorn de dos litros de capacidad, a dos profundidades 50 cm y 10m, debido a que la transparencia del lago oscila entre 10 a12 m (Donato, 1991).
De cada punto se tomo un volumen aproximado 2000 ml que se depositan en frascos de plásticos marcados con la información correspondiente al tipo de muestra, punto de muestreo, así como la fecha y hora colectada. Según Cabrera y Catalan et al.,(1990)para cuerpos oligotróficos como la laguna de Tota se deben colectar un volumen de 2 a 5 litros y para cuerpos ricos (Eutróficos) un volumen aproximado de un litro.
De manera complementaria se toman muestras en cada punto de muestreo, con el fin de medir algunos aspecto fisicoquímicos como son los fosfatos (PO4), nitratos (NO3), oxigeno disuelto, conductiv idad, pH, temperatura y profundidad. Los análisis de fosfatos y nitratos fueron realizados por Analquim Ltda.
5.2.2. Fase de laboratorio
Para determinar la biomasa de clorofila se sigue el método de Standard Methods (1998), en el que se filtra un volumen de 2000ml correspondiente a cada punto de muestreo con filtros de fibra de v idrio tipo AC. Sartorius de 45 µm, el filtro Sartotius al igual que el Whatman GF/ C son recomendados por Marker et al. (1980) por su buena capacidad de retención y no poder abrasivo en caso de trituración. Adicionalmente se usa una bomba de vació Emerson con una presión no superior de 2 a 3 atmósferas o 570 mm Hg esto para ev itar la fragmentación de organismos delicados, Catalan et al., (1990). Los filtros son guardados en tubos de ensayo cubiertos de aluminio, marcados y posteriormente almacenados en nitrógeno liquido no por mas de dos meses antes del análisis espectrofotométrico.
5.2.2.1. Extracción
La ex tracción de los pigmentos fotosintéticos se realizo sonicando cada uno de los filtros en 3ml de una solución de acetona al 90% (dilución usada normalmente para la extracción de fitoplancton (SCOR-UNESCO, 1966)), en ausencia de luz durante 15 minutos. Posteriormente se transfiere la muestra a un tubo de centrifuga
de 15 ml y se ajusta a un volumen final de 10ml con acetona al 90%, la muestra debe mantenerse en oscuridad durante 2 horas a 4 ºC.
A continuación, para clarificar la muestra embebida en acetona se centrifuga durante 20 minutos a 2500 rpm en una centrifuga HERMLET Z200A, el producto decantado es transvasado a un nuevo tubo de centrifuga donde se mide el volumen total.
5.2.2.2. Determinación de clorofilas por medio de Espectrofotometría
La espectrofotometría es uno de los métodos más usados y simple en la estimación de las clorofilas, el cual se realiza mediante la lectura de longitudes de onda determinadas. Las longitudes que se seleccionan corresponden a los puntos máximos de absorción de las clorofilas en la zona roja del espectro, región en la que no existe interferencia por parte de los carotenos.
5.2.2.2.1.Método Tricromático
La lectura de este método se hace a transfiriendo 3ml de ex tracto clarificado en una cubeta de 1 cm y a una longitud de onda de 664, 647 y 630 nm correspondientes a longitudes de absorción de a la clorofila a, b y c respectivamente. Adicionalmente se realizara una lectura a una longitud de onda de 750nm a un blanco (solvente usado en la ex tracción) y a las muestras como una corrección de turbidez. Cualquier diferencia de absorbancia entre el solvente de referencia y la muestra a esta longitud de onda, se tomará como turbiedad y no deberá exceder un valor de 0.005 (Marker et al., 1980) si así ocurre, la muestra será recentrifugada por 20 minutos a 2500rpm.
Las formula utilizada en la cuantificación espectrofotométrica de clorofilas se encuentra estrechamente relacionadas con la variedad de coeficientes determinados para una variedad solv entes en especial para acetona al 90% entre los mas utilizados son los obtenidos por Vernon (1960); Ziegler & Egle (1965); Parson & Strain, et al., (1963) y Marker (1972), sin embargo en nuestra medición se usara el coeficiente determinado por Boto & Bunt (1978) y Jeffrey & Humphrey (1975), coeficientes utilizados en la formula de Jeffrey & Humphrey (1975), recomendada por Catalan et al., (1990)para muestras de fitoplancton que contienen clorofila c y son ex traídas con acetona al 90 % (Tabla 5 y 6).
Tabla 5. Espectro de absorción máxima de las clorofilas a y b con acetona al 90 % Solv ente Maxima absorción ( nm ) Referencia
Azul Rojo Clorofila a
Acetona 90% 430,2 663 Ziegler & Egle (1965)
430,2 665 Vernon (1960)
430,2 665 Parsons & Strickland (1963) 430,2 664,3 Jeffrey & Humphrey (1975)
432 664 Boto & Bunt (1978)
430 662 Marker (1972)
Clorofila b
Acetona 90% 455 646 Ziegler & Egle (1965)
455 648 Vernon (1960)
455 645 Parsons & Strickland (1963)
455 646,8 Jeffrey & Humphrey (1975)
459 647 Boto & Bunt (1978)
Tabla 6. Formula para la cuantificación espectrofotométrica de Jeffrey & Humphrey (1975).
Clorofilas Fórmula
A 11.85 * Abs 664 - 1.54 * Abs 647 - 0.08 * Abs 630 B - 5.43 * Abs 664 + 21.03 * Abs 647 - 2.66 * Abs 630 C - 1.67 * Abs 664 - 7.60 * Abs 647 + 24.52 * Abs 630
Después de determinar la concentración del pigmento en el ex tracto, se calcula la cantidad de pigmento por unidad de volumen como sigue:
Clorofila a, mg/m3 = *Ca X volumen ex traído, L Volumen de la muestra, m3
*Ca = concentración de clorofila a en mg/L
Las ecuaciones tricromaticas a pesar de ser las más utilizadas, no son completamente útiles en la cuantificación de pigmentos en presencia de productos de degradación; teniendo como resultado sobreestimaciones de las clorofilas (Jeffrey & Hallegraeff, 1980; Lorenzen & Jeffrey, 1980; Marker et al., 1980), es decir, la concentración de la clorofila a que tengamos realmente será la concentración de la clorofila a mas la clorofilida a.
5.2.2.2.2.Determinación de clorofila a en presencia de feopigmentos (Monocromático)
Los feopigmentos son productos derivados de las clorofilas, que presentan longitudes de absorción parecidas a las de la clorofila a; por ejemplo, la clorofila a tienen el mismo espectro de absorción que la clorofilida a. Pero la feofitina a se puede determinar midiendo la disminución de la densidad óptica a 665 nm después de haber acidificado la solución de pigmentos con un par de gotas de ácido (Lorenzen, 1967).
El procedimiento espectrofotometrico consiste en transferir 3 ml del ex tracto clarificado a una cubeta de 1cm y realizar una lectura a una longitud de onda de 750 y 664nm. Posteriormente el extracto se acidifica con 0.1ml 0.1N HCl, para convertir la clorofila a en feofitina a por la perdida del átomo de magnesio. Gentilmente se agita el ex tracto acidificado y se lee a una longitud de onda de 750 y 665nm, 90 segundos después de la acidificación (Standard methods, 1998). El volumen del extracto y el ácido y del tiempo después de la acidificación son críticos con la consistencia de los resultados.
La concentración de la clorofila y feofitina son calculados en mg/m3:
(
)
L
V
V
b
a
m
mg
Clorofila
×
×
−
=
2
1
)
665
664
(
7
.
26
/
,
3(
)
[
]
L
V
V
a
b
m
mg
Feofitina
×
×
−
=
2
1
664
665
7
.
1
7
.
26
/
,
3 donde,V1= Volumen del ex tracto, L. V2= Volumen de la muestra, m3 L= Longitud del camino de luz, cm.
664b , 665a = Densidad óptica en un ex tracto de acetona al 90% antes y después de la acidificación, respectivamente.
El valor de 26.7 es la corrección de la absorbancia y es igual a A x K
A= es el coeficiente de absorción para la clorofila a a 664nm = 11.0, y K= proporción expresada para la acidificación.
43
.
2
0
.
1
7
.
1
7
.
1
665
664
665
664
665
664
=
−
=
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
−
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
=
pura
a
feofitina
a
b
pura
a
clorofila
a
b
pura
a
clorofila
a
b
En soluciones de clorofila pura en acetona, el indice D665/D665 acificado tiene un valor de 1.7
5.3. Estudio de la comunidad de fitoplancton
El estudio de la comunidad fitoplanctónica se ha convertido con el tiempo uno de los métodos mas utilizados para la caracterización de un ecosistema acuático. Para determinar el tipo de correlación que presenta la estructura de la comunidad fitoplanctónica con las variables fisicoquímicas y espacio-temporales, se estudiara la composición de la comunidad durante un periodo de cuatro meses que va abarca desde diciembre del 2004 a marzo del 2005.
5.3.1. Fase de campo
Se toman muestras directas en los diferentes puntos de muestreo por medio de una botella de Van Dorn la cual es un mecanismo de fácil uso. La botella se baja lentamente a una profundidad de 50 cm y 1 metro, en lo posible sin generar turbulencia, se deja suspendido por unos segundos sobre el punto de registro, luego se cierra empleando un mensajero (Donato, 2002b). En un recipiente de 250ml previamente rotulado e identificado se fijan las muestras con lugol (Solución de Yoduro de potasio), adicionando 1ml por cada 100ml de muestra (APHA 1998).
5.3.2. Fase de laboratorio
Para determinar la composición de la comunidad de fitoplancton en cada época de muestro, se realizara un recuento, a partir del conteo de un total de 100 a 400 células de las especies de algas dominantes. Lo anterior obedece a que este tipo de conteo permite trabajar con cifras comparables y coherentes y maneja errores de recuento del 5% al 10 % de acuerdo a lo indicado por Margalef (1983).
Para el análisis cuantitativ o se utilizan cámaras de sedimentación de 5 cm de alto por 2 con de diámetro y un microscopio invertido tipo Leica MDIL. Para cada cámara se deposita un v olumen determinado (varia de acuerdo con la abundancia de organismos y turbidez de la muestra) que se deja sedimentar tres horas por cada centímetro de altura depositado en la cámara (Lund et al., 1958; Wetzel & Likens, 2000) En el anterior paso se evitara la formación de remolinos mientras se sirve la muestra así como fuentes de vibración que puedan mostrar distribución no aleatoria mientras se sedimenta la muestra (APHA 1998).
Para la determinación e identificación tax onómica se realizará dibujos de las algas encontradas que se comparan con claves regionales o entre otras las siguientes (Álvaro 1998; Donato, 2002b): Parra et al., (1982 a,1982b, 1982c, 1983), Comas (1996), Gonsalez & Mora – Osejo (1996), Coesel (1997), Metzeltin & Lange – Bertalot (1998).
Una vez obtenidos realizados los conteos se estimaran los valores de abundancia en células ml-1 con la siguiente fórmula
(Wetzel & Likens, 2000).
a
sedimentad
muestra
de
Volumen
contados
campos
de
No
campo
un
de
Area
camara
la
de
total
area
contadas
celulas
de
No
l
ml
Celulas
No
×
×
×
=
∗
−.
.
15.4. Manejo e interpretación de datos
5.4.1. Estudio de la comunidad de fitoplancton
A partir de la información obtenida de los conteos y densidad celular en cada cámara de conteo, se establecerá la estructura y la abundancia de la comunidad de algas en cada periodo muestreado. Basados en los resultados de densidad celular, se calculará los índices de diversidad de Shannon, dominancia de Simpson, riqueza y uniformidad por medio de los paquetes estadístico de Biotools y Biodiversity.
La diversidad y la dominancia basadas en la biomasa, son calculadas respectivamente con las siguientes fórmulas:
B
bi
B
bi
u
H
s I 2 1 ´log
∑
=−
=
2 1∑
=⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
=
S i bB
bi
D
Donde:bi: es la biomasa de cada especie
s: es el numero de especies en la muestra
Obedece a que de acuerdo con Sommer (1993), la div ersidad obtenida por este modo representa adecuadamente el estado de la comunidad de fitoplancton en comparación a la obtenida a
partir del conteo de células.
5.4.2. Caracterización de la información
La información de la estructura de la comunidad como de los aspectos fisicoquímicos se presentaran en forma de tablas, diagramas y gráficos, de modo que se pueda observar los variaciones de comportamiento de las muestras a trav és de los muestreos.
Se realizará una descripción de la comunidad fitoplanctonica, por medio del cálculo de medias, v arianza, desviación estándar, máximos y mínimos para cada uno de los aspectos evaluados. A partir de estos valores se establecerá la fluctuación de los parámetros como la tendencia de comportamiento.
5.4.3. Correlación de la información
Para realizar las comparaciones entre las abundancia del fitoplancton presente en las muestras se aplica un análisis de v arianza (ANOVA) teniendo en cuenta tanto las v ariables ambientales estudiadas de los perfiles o de otras como la concentración de nutrientes, si los datos se distribuyen normalmente, de lo contrario se realizarán pruebas no paramétricas como lo son Friedman o Krukal Wallis equivalentes a las anteriores (Dy tham 1999). Para conocer con mayor exactitud las diferencias significativas de las v ariables medidas y estimadas se realizan pruebas de comparación de medias (Tuckey).
De los resultados de abundancia de fitoplancton se establecerá una correlación con la concentración de nutrientes (nitratos y fosfatos) y de variables ambientales, por medio del método de ordenación de análisis de correspondencia canónica (ACC). Para el análisis se saca de la matriz las especies que presentan una
∑
==
s ibi
B
1frecuencia de aparición menor al 5%, posteriormente cada una de las matrices de los datos primarios con excepción del pH, son transformadas en Ln(n+1). A partir de la matriz transformada se realiza un test de permutación de Monte Carlo con 1000 repeticiones y sobre estos datos se aplica la técnica de análisis de correspondencia canónica.
El ACC esta diseñado para detectar los patrones de v ariación en los datos de las especies que se ajusten a una combinación de las v ariables ambientales observadas. Por lo tanto, no solo se muestra el patrón de composición de especies, sino también la relación principal entre las especies y cada una de las variables ambientales. El ACC selecciona las variables ambientales que maximizan la dispersión de los valores de las especies. Una vez se haya ex traído el primer eje, el segundo eje y los ejes adicionales se seleccionan de modo que también maximicen la distribución, pero sin que los nuevos ejes se correlacionen con los ejes ex traídos prev iamente.
6. RESULTADOS
6.1 CARACTERISTICAS FISICAS Y QUIMICAS
En general el pH presentó v alores básicos, oscilando entre 7,885 y 9,36, con un promedio de 8,14 (Anexo N°1). El máx imo valor se registro en la mugre en noviembre y el mínimo en el túnel en el mes de diciembre (Fig.10). La v ariación espacio-temporal del pH es significativo para los meses (P=0.0001*, N=7) y puntos (P=0.0009*, N=5), observándose diferencias entre el mes de diciembre con resto de meses, mientras que para los puntos se muestran div ergencias entre La mugre y Piscicol con los puntos del Túnel y Play a blanca (Fig. 11 y 12).
La conductividad por otro lado, mostró un valor promedio de 88,34µS/cm. El menor valor se registro en el punto de Hato laguna (febrero) y el máx imo en Piscicol (enero). La variación-espacio temporal para la conductividad es significante para los meses (P=0.00*, N=7) y los puntos (P= 0.00*, N=5); tendencia reflejada, en las diferencias observadas entre los meses de diciembre y enero con el resto de meses (Fig. 13); de la misma manera, el punto de Hato laguna difiere significativ amente de Los pozos, Playa blanca, Piscicol y La mugre, así como Piscicol y la mugre del resto (Fig. 14).
Figura. 10 Valores de conductividad (µS/cm), temperatura del cuerpo de agua (°C), pH y oxigeno disuelto (mg/l) para el Lago de Tota. 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Boca na El tu nel Hato lagu na La m ugre Los pozo s Piscic ol Playa Blan ca C ond uc ti v id a d ( u S ) Nov-04 Dic-04 Ene-05 Feb-05 Mar-05 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Boca na El tun el Hato lagu na La m ugre Los pozo s Pisc ic ol Playa blan ca T e m p er a tu ra ( C °) Nov-04 Dic-04 Ene-05 Feb-05 Mar-05 7.2 7.4 7.6 7.8 8 8.2 8.4 8.6 8.8 9 9.2 Boca na El tu nel Hato laguna La m ugre Los poz os Pisc ic ol Playa blan ca pH Nov-04 Dic-04 Ene-05 Feb-05 Mar-05 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Boca na El tun el Hato lagun a La m ugre Los poz o s Pisci col Playa blan ca Ox ig e n o ( m g /l ) Nov-04 Dic-04 Ene-05 Feb-05 Mar-05
7 7 7 7 7 N = FECHA Marzo Febrero Enero Diciembre Noviembre PH 9,2 9,0 8,8 8,6 8,4 8,2 8,0 7,8 24 26 4
Figura. 11 Diagramas de caja para el comportamiento del pH en los diferentes meses de muestreo (Diciembre 2004 al Marzo 2005) en el Lago de Tota
5 5 5 5 5 5 5 N = PUNTOS Play a blanca Los pozos El t unel Hato laguna Bocana Mugre Piscicol PH 9,2 9,0 8,8 8,6 8,4 8,2 8,0 7,8 9 4
Figura. 12 Diagramas de caja para el comportamiento del pH en los diferentes puntos de muestreo en el Lago de Tota
60 65 70 75 80 85 90 95 100
Nov-04 Dic-04 Ene-05 Feb-05 Mar-05
C onduc ti v ida d ( u S /c m )
Figura. 13 Comportamiento de la conductividad en los diferentes meses de muestreo (Diciembre 2004 al Marzo 2005) en el Lago de Tota
0 20 40 60 80 100 120
La mugre Piscicol Los pozos Bocana Playa Blanca Hato laguna El tunel C o n duc ti v ida d ( u S /c m )
Figura. 14 Comportamiento de la conductividad en los diferentes puntos de muestreo en el Lago de Tota
Los perfiles de temperatura que se realizaron no muestran diferencias significativ as en la columna de agua (P= 0.0588, N=70), ni tampoco espacio-temporalmente (P=0.4060 N=7, P=0.2218, N=5) según la prueba de Friedmann . En general el promedio de la temperatura del cuerpo de agua es de 17,33°C, con un rango entre 13,8 a 29°C (Fig.10).
