PREINFORME-C1 (1)

(1)

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE INGENIERÍA FACULTAD DE INGENIERÍA

ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

TÍTULO: TÍTULO:

INGENIERÍA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES EMPLEANDO UNA INGENIERÍA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES EMPLEANDO UNA CEPA DE

CEPA DEPiPichia schia sttiippiittiiss NRRL Y-7124, USANDO XILOSA COMO FUENTE DE NRRL Y-7124, USANDO XILOSA COMO FUENTE DE CARBONO

CARBONO ALUMNOS:

ALUMNOS:

Arroyo Lozano Junior Yorkei

Huincho Aquiño Sonia Marisol

Luera Dominguez Royder Santos

Urrutia Vega Nataly

Vásquez Villacorta Nelly Sofía

CURSO: CURSO:

Laboratorio de Ingeniería de

Laboratorio de Ingeniería de Bioprocesos

Bioprocesos

DOCENTE: DOCENTE:

(2)

(3)

ÍNDICE ÍNDICE

I.

I. OBJETIVOSOBJETIVOS... ... 22

II.

II. METODOLOGÍA EXPERIMENTALMETODOLOGÍA EXPERIMENTAL ... ... ... 33

III.

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOSMATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS ... ... 2323

IV.

IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREASCRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS ... ... 2626

V.

V. REFERENCIAS REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICABIBLIOGRÁFICASS ... ... ... 2828

VI.

(4)

PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO

TÍTULO: «INGENIERÍA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES TÍTULO: «INGENIERÍA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES EMPLEANDO UNA CEPA DE P

EMPLEANDO UNA CEPA DE Piichchiia sa sttiippiittiiss NRRL Y-7124, USANDO XILOSA NRRL Y-7124, USANDO XILOSA COMO FUENTE DE CARBONO»

COMO FUENTE DE CARBONO»

I.

I. OBJETIVOSOBJETIVOS

1.1

1.1 Generales:Generales:



 Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lDiseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces,otes en matraces,

empleando una cepa de

empleando una cepa de Pichia stipitis Pichia stipitis NRRL Y NRRL Y – – 7124, evaluándose el 7124, evaluándose el

efecto de la fuente de carbono y la velocidad de agitación en la cinética de efecto de la fuente de carbono y la velocidad de agitación en la cinética de crecimiento y la producción de etanol.

crecimiento y la producción de etanol.



 Determinar los parámetros cinéticos de la cepaDeterminar los parámetros cinéticos de la cepa Pichia stipitis Pichia stipitis NRRL Y - NRRL Y

-7124. 7124.

1.2

1.2 Específicos:Específicos:



 Diseñar el medio líquido de cultivo.Diseñar el medio líquido de cultivo. 

 Activación celular y desarrollo del inóculo.Activación celular y desarrollo del inóculo. 

 Determinar la cinética de crecimiento de lDeterminar la cinética de crecimiento de la biomasa.a biomasa. 

 Determinar la cinética de consumo de la Determinar la cinética de consumo de la fuente de carbono.fuente de carbono. 

 Determinar la cinética de producción de Etanol.Determinar la cinética de producción de Etanol.



 Determinar elDeterminar el





,,



y los r y los rendimientos del nutriente limitante en célulasendimientos del nutriente limitante en células

y en etanol, además de las respectivas productividades en células y en y en etanol, además de las respectivas productividades en células y en etanol.

etanol.



(5)

II.

II. METODOLOGÍA EXPERIMENTALMETODOLOGÍA EXPERIMENTAL

Antes de iniciar con el desarrollo experimental del cultivo del microorganismo, Antes de iniciar con el desarrollo experimental del cultivo del microorganismo, es importante recalcar, cuál será la metodología experimental a utilizar, a fin de es importante recalcar, cuál será la metodología experimental a utilizar, a fin de evitar problemas y/o errores experimentales, los mismos

evitar problemas y/o errores experimentales, los mismos que podrían darse en: lasque podrían darse en: las técnicas asépticas, en la obtención de cultivos puros, en la preparación de los técnicas asépticas, en la obtención de cultivos puros, en la preparación de los medios de cultivo, en las tomas de muestra, en el crecimiento del microorganismo, medios de cultivo, en las tomas de muestra, en el crecimiento del microorganismo, entre otros factores.

entre otros factores.

Es necesario recordar que, cualquier medio de cultivo de levadura debe Es necesario recordar que, cualquier medio de cultivo de levadura debe proporcionar los

proporcionar los requerimientos requerimientos nutritivos nutritivos básicos, que básicos, que incluyen: una incluyen: una fuente fuente dede carbono, agua, una fuente de nitrógeno, fósforo, azufre,

carbono, agua, una fuente de nitrógeno, fósforo, azufre, y varios minerales, comoy varios minerales, como el hierro, magnesio, cloro, entre otros. A este tipo de medio de cultivo se llama el hierro, magnesio, cloro, entre otros. A este tipo de medio de cultivo se llama definido o sintético, porque se conoce exactamente su composición química. Sin definido o sintético, porque se conoce exactamente su composición química. Sin embargo, en el trabajo de laboratorio rutinario, a menudo se emplean también embargo, en el trabajo de laboratorio rutinario, a menudo se emplean también medios complejos. Por ejemplo, el

medios complejos. Por ejemplo, el extracto de levaduras y las extracto de levaduras y las peptonas (proteínaspeptonas (proteínas hidrolizadas). Estos materiales proporcionan una gran variedad de fuentes de hidrolizadas). Estos materiales proporcionan una gran variedad de fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo y azufre en forma de péptidos y aminoácidos; y una carbono, nitrógeno, fósforo y azufre en forma de péptidos y aminoácidos; y una mezcla de cofactores, como por ejemplo las vitaminas. Un caldo de cultivo es mezcla de cofactores, como por ejemplo las vitaminas. Un caldo de cultivo es unun medio líquido en el que los componentes se disuelven simplemente en agua medio líquido en el que los componentes se disuelven simplemente en agua destilada. La adición de agar (un

destilada. La adición de agar (un carbohidrato complejo extraído de algas marinascarbohidrato complejo extraído de algas marinas da lugar a un medio sólido). El agar es un agente solidificante ideal para los da lugar a un medio sólido). El agar es un agente solidificante ideal para los medios microbiológicos por sus

medios microbiológicos por sus propiedades reológicas y porque no posee nipropiedades reológicas y porque no posee ningúnngún valor nutritivo para la inmensa mayoría de bacterias y hongos. El agar sólido valor nutritivo para la inmensa mayoría de bacterias y hongos. El agar sólido funde entre 90

(6)

2.1. DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

A la hora de diseñar un medio de cultivo no solo hay que tener en cuenta los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los microorganismos, asimismo nos interesa cuanto de biomasa se desea producir.

Para la formulación del diseño de cultivo se tiene en cuenta los siguientes requerimientos nutricionales de la Pichia stipitis NRRL Y – 7124.

Macronutri entes : C, N, Mg, S, K y P

Mi cronutri entes : Ca, Cl, Zn, Fe, Cu Co, B

pH : 4.5

2.1.1. Estado: Medio líquido

2.1.2. Volumen del medio: 30 – 40 % del volumen del fermentador

2.1.3. Temperatura: 30°C

2.1.4. Velocidad de Agitación: 240 rpm en shaker.

2.1.5. pH: 4.5

2.1.6. Requerimientos nutricionales: Para ello utilizamos un Medio de cultivo definido.

Fuente de carbono

y energía Xilosa













Fuente de N Sulfato de amonio

(

_

)

_



_

Fuente de Mg y S Sulfato de magnesio heptahidratado



_

.7

_



(7)

2.1.7. Solución de sales concentradas

Fuente de Ca Cloruro de calcio dihidratado



_

.

_



Fuente de Zn Óxido de zinc



Fuente de Fe Sulfato ferroso heptahidratado



_

.7

_



Fuente de Cu Sulfato de cobre pentahidratado



_

.5

_



Fuente de Co Cloruro de cobalto hexahidratado



_

.6

_



Fuente de B Ácido bórico



_



_

Fuente de Cl Ácido clorhídrico



COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN, ACTIVACIÓN Y FERMENTACIÓN PARA Pi chia stipitisNRRL Y – 7124 PARA LA

PRODUCCIÓN DE ETANOL

Medio de Mantención:

Tabla 1

Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50 mL)

NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (g/L) PARA 0.05LPESO (g)

Extracto de Levadura 3 0.15

Peptona 5 0.25

Extracto de Malta 3 0.15

(8)

Medio de Activación:

Tabla 2

Concentración de Nutrientes para un medio de activación (20 mL)

NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (g/L) PESO (g) PARA 0.02L Xilosa 10 0.20 Extracto de levadura 3 0.06 Extracto de malta 5 0.10 Solución de sales 5(mL/L) Medio de Fermentación: Tabla 3

Concentración de Nutrientes para un medio de fermentación (200mL)

(Para un volumen de medio = 40% del volumen del matraz) (Volumen del matraz=500 mL)

(Para una concentración celular final = 2 g/L)

NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (g/L) PARA 0.200 LPESO (g) Xilosa 14 2.80 Extracto de levadura 3 0.60

(



)

_





3 0.60









2 0.40





.





1.1 0.22 Solución de sales 5ml/L Tampón citrato Ph 4.5

(9)

Tabla 4

Composición del medio mínimo de cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124 para un crecimiento en biomasa de 2.0g/L

ELEMENTO Compuesto Fórmula % en célula % en compuesto YX/S(g/g) S0 (g/L) S’0 (g/L)

C Xilosa C5H10O5 46.57 40 0.52 3.85 3.85

N Sulfato de amonio (NH4)2SO4 9.24 21.21 2.30 0.87 1.305

Mg Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4.7H2O 0.30 9.76 32.53 0.07 0.105

S Sulfato de amonio (NH4)2SO4 0.13 24.24 186.46 0.01 0.015

K Fosfato diácido de potasio KH2PO4 2.50 28.68 11.47 0.17 0.255

P Fosfato diácido de potasio KH2PO4 1.70 22.79 13.41 0.15 0.225

(10)

Tabla 5

Solución de sales concentradas (100 veces) para cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124 en base a su crecimiento de 2.0g/l

ELEMENTO Compuesto Fórmula % en células % en compuesto



 

( )

S0

(g/L) S’0 (g/L) Ca Cl Zn Fe Cu Co B

Cloruro de calcio dihidratado Ácido clorhídrico

Óxido de zinc

Sulfato ferroso heptahidratado Sulfato de cobre pentahidratado Cloruro de cobalto hexahidratado Ácido bórico CaCl2.2H2O HCl ZnO FeSO4.7H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O H3BO3 0.20 0.01 0.01 0.255 0.01 0.01 0.01 27.40 97.22 80.25 21.70 25.30 24.89 17.74 137 9722 8025 85.01 2530 2489 1774 1.460 0.020 0.025 2.325 0.079 0.080 0.113 2.190 0.031 0.037 3.529 0.119 0.120 0.169

(11)

2.2. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

2.2.1. Preparación del Medio de Mantención, según la Tabla 1, para el cultivo de Pi chia stipitisNRRL Y – 7124, para la producción de etanol.

 Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composición del medio de mantención para Pichia stipitis NRRL Y – 7124.

 Luego, de acuerdo a la Tabla 1 anterior se pesan las cantidades requeridas

de cada compuesto, con mucho cuidado, en la balanza analítica.

 Medir en un vaso de precipitados primeramente con agua destilada para diluir todos los compuestos pesados anteriormente.

 Continuar agregando agua destilada hasta llegar a los 50 ml que se requiere.

 Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz; agitando

constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2 minutos.

 Preparar 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 7ml de la mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, e inmediatamente taparlos.

 Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla a presión,

previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de gases.

 Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC y a partir de ello controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la esterilización.

 Ajustar las tapas de los tubos estando estos aún dentro de la olla, luego

(12)

Figura 1. Diagrama de flujo de la preparación del Medio de Mantención

Siembra en Medio de Mantención:

- Materiales y equipos a utilizar:

 Asa bacteriológica

 Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M. O.  Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

- Procedimiento:

-

Esterilizar los materiales y equipos a utilizar.

-

Colocar el asa bacteriológica en el mechero hasta que se torne roja, luego enfriar.

-

Flamear la boca del tubo de ensayo con el agar preparado previamente y con el asa extraer la cepa.

-

Sembrar en la superficie realizando la mayor cantidad de estrías en la superficie.

-

Tapar el tubo de ensayo y repetir el mismo procedimiento con los demás tubos.

(13)

2.2.2. Preparación del Medio de Activación, según la Tabla 2, para el cultivo de Pichia stipitisNRRL Y – 7124, para la producción de etanol.

 Pesar los componentes descritos en la Tabla 2.

 Se esterilizan por separado el extracto de levadura y extracto de mal en un tubo de ensayo (hasta 4 ml con agua destilada), la xilosa en un matraz de 125 ml (con 17ml. de agua destilada); esto para evitar la reacción entre estos dos componentes; y por último las sales en otro tubo de ensayo (hasta 2.925 ml)

 Disolver por separado los componentes. Tener listo el volumen de sales.  Con la ayuda de una micropipeta, agregar las sales minerales al matraz que

contiene el extracto de levadura.

 Esterilizar a 121ºC por 15 minutos; mezclar con los demás componentes en un ambiente aséptico, para evitar la contaminación.

(14)

Figura 2. Diagrama de flujo de la preparación del Medio de Activación Activación de la Cepa: - Materiales y equipos:  Matraz de 125 ml  Algodón  Gasa  Agua destilada  Asa bacteriológica  Shaker

 Mechero Bunsen, trípode y rejilla

- Procedimiento:

-

Esterilizar el asa bacteriológica y el matraz con la flama del mechero.

-

Enfriar el asa.

-

Extraer con el asa la cepa de los tubos de resiembra preparados.

-

Inocular los 30 ml de medio de mantención preparados.

-

Tapar con un tampón de algodón y gasa.

-

Llevar al shaker a 28°C y 220rpm por 24 horas.

-

Notar el desarrollo y crecimiento en biomasa por la turbidez del medio.

2.2.3. Preparación del Medio de Fermentación, según la Tabla 3, para el cultivo de Pi chia stipitisNRRL Y – 7124, para la producción de etanol.

 Pesar los componentes descritos en la Tabla 3

 Disolver completamente cada compuesto con agua destilada de la

siguiente manera:

 Xilosa en un matraz de 0.5 L con 80 ml de agua destilada

 (NH4)2SO4 en un matraz con 50 ml. de agua destilada

 Solución de sales, KH2PO4, (MgSO4).7H2O en un matraz con 50 ml de

agua destilada

 Regular el pH de la solución de xilosa 4.5  Esterilizar las diluciones por separado

 Terminada la esterilización dejar enfriar y guardar en refrigeración hasta

(15)

Figura 3. Diagrama de flujo de la preparación del Medio de Fermentación

(16)

Fermentación de la Cepa: Materiales y equipos

 Matraz de 0.5 L conteniendo el medio de fermentación  pH-metro

 Gasa y algodón  Tubos de ensayo

Procedimiento:

-

Esterilizar los materiales a utilizar.

-

En un matraz de 0.5L, que contiene 180 ml de medio definido, añadir los 20 ml de caldo (medio+biomasa) preparados previamente.

-

Mezclar y tomar 5 ml para el análisis del biomasa y sustrato inicial.

-

Tapar con un tapón de gasa y algodón.

-

Llevar al shaker a 30°C y 240rpm.

-

Recoger y analizar muestras de 5 ml cada hora por 24 horas.

2.3. RESIEMBRA CELULAR (SOLIDO - SÓLIDO)

 Para la resiembra se seguirán las técnicas de asepsia utilizando un mechero que mantenga el ambiente de trabajo estéril.

 El asa bacteriológica se someterá al fuego del mechero hasta alcanzar el rojo

vivo.

 Se debe dejar enfriar por unos segundos; del tubo de ensayo que contenía las

células desarrolladas en medio sólido, se extrae una azada, se flamea el tubo para cerrarlo.

 El procedimiento de resiembra se hace en los tubos de ensayos preparados con medio sólido (con agar).

 La azada se coloca en el tubo desde adentro hacia fuera.  Se llevan a la incubadora a 30 º C durante 48 horas.

(17)

2.4. CULTIVO DEL MICROORGANISMO

Después de la inoculación de una porción de medio con unas pocas células, transcurre un período de tiempo (fase de latencia) antes de que se establezca una velocidad constante de crecimiento, debido a que el microorganismo tiene una intensa actividad metabólica para adaptarse al nuevo medio de cultivo antes de poder duplicarse. Cuando el cultivo alcanzó una velocidad constante de crecimiento se dice que está en la fase exponencial debido a que el número de células se puede expresar como función de 2n, donde n es el número de ciclos de duplicación experimentado por la población.

2.5. ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO

Se llevará a cabo la activación del microorganismo, bajo estrictas normas de asepsia, siguiendo el protocolo establecido por el laboratorio:

-

Para la inoculación partimos con la cepa incubada en medio sólido Pichia stipitis NRRL Y – 7124.

-

Se toma una azada y se inocula en el matraz con los 20 ml del medio de activación

-

Se tapa el tubo con un tapón de gasa y algodón.

-

Se lleva al Shaker a 240 rpm, Tº = 30 ºC y un t = 12min hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del medio.

-

El procedimiento de inoculación se hará por duplicado es decir 2 azadas.

2.6. INOCULACIÓN AL MEDIO DE FERMENTACIÓN

 Inocular los 20 ml de caldo (medio rico + biomasa) a un matraz de 0.5L conteniendo 180 ml de medio definido. A partir de este paso se determinará la cinética de crecimiento de la biomasa.

 Inmediatamente después, se extrae una muestra de 5 ml del caldo y medir X 0

(18)

 La toma de muestras se inicia desde la dilución del medio de activación en el

medio de fermentación.

 Estas se realizarán cada hora y media para la primera muestra y posteriormente

cada hora de la siguiente manera:

 Se extrae 5 mL del medio de cultivo, 3 mL se le agrega al tubo del

espectrofotómetro y el resto se le agrego al tubo de centrifugado.

 Se mide su absorbancia a 640 nm y pH; luego se devuelve al tubo de

centrifugado para completar los 5 ml y se centrifuga a la máxima velocidad por 20 minutos; el sobrenadante se vierte a los viales y se guarda en el

refrigerador con el fin de después determinar el consumo de sustrato.

2.7. MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL

2.7.1. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO)

La preparación del reactivo DNS requiere de lo siguiente:

 10 g/l de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)  200 ml/l de NaOH 2N

 300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un litro.

(19)

Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra:

1.- Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a analizar.

2.- Se mantiene la mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego dejar enfriar.

3.- Se añaden 10 volúmenes de agua destilada.

4.- Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco. 5.- La concentración se obtiene interceptando la medida de

absorbancia en la curva de calibrado.

La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestras de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.

2.7.2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR DENSIDAD ÓPTICA (D. O.)

El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la concentración de microorganismos, esto puede ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640 nm. Para esta determinación es necesario que previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:

(20)

1. Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 5000 rpm durante 20 minutos.

2. Se elimina el sobrenadante y se re-suspende el centrifugado con agua destilada.

3. Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la determinación.

4. Se elimina el sobrenadante, se re-disuelve el precipitado y se seca en la estufa a 80°C hasta peso constante.

2.7.3. DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA.

Materiales y equipos

 Matraz de 0.5 L conteniendo el medio de fermentación  Espectrofotómetro

 pHmetro

 Gasa y algodón  Centrifuga

 Tubos de ensayo

 Capachos de papel aluminio

Procedimiento: Al inicio y cada hora por 10 horas se realizará lo siguiente

˂ 3ml para el tubo de espectrofotómetro y el

resto se le agregó al tubo de centrifugado.˃

˂ 5ml del medio de cultivo ˃

˂ Absorbancia a 640nm y pH ˃

EXTRAER

SEPARAR

(21)

Utilizando la ecuación ln(X/ X0) = μt, se determinan distintos valores de

μ.

Tabular Si vs. μi

Con la ecuación 1/ μ = 1/μm + (K S/ μm) 1/S, se grafica. La intercepción

con el eje y será el valor de 1/μm siendo su inversa el valor de μm, además

la pendiente m= K S/ μm conocido anteriormente μm determinamos K S.

dX / dt = μmX ……….(

X = X0 e μmt

2.7.4. DETERMINACIÓN DE ETANOL POR CROMATOGRAFÍA DE GASES:

a) Reactivos y soluciones

etanol propanol

b) Procedimiento:

Preparación de 50 ml de solución patrón de etanol a 6 g/l Concentración de solución patrón de etanol = 6 g/l

˂ 5ml en el tubo de centrifugado, se devuelve.˃

˂ El sobrenadante en viales y ponerlos en refrigerador ˃

˂ A la máxima velocidad por 20 minutos˃

)

COMPLETAR

CENTRIFUGAR

(22)

Preparación de 50 ml de solución patrón de propanol a 4 g/l Concentración de solución patrón propanol = 4 g/l.

Volumen solución patrón etanol a 4 g/l =50 ml Volumen solución etanol 99.5% = 0.2487 ml

Estándar interno

Análisis cromatográfico

a. Instalar una columna capilar RTx-20 utilizando férulas de grafico para asegurar conexiones herméticas.

b. Encender el cromatógrafo de gases, abrir la válvula de gas portador (helio) y regular cuidadosamente su flujo.

c. Ajustar las condiciones cromatográficas.

Concentración (g/l) Vol. E tanol (ml) Vol. Propanol (ml) Vol. H 2O (ml) 3 5 5 0 2.1 3.5 5 1.5 1.2 2 5 3 0.6 1 5 4 0 0 5 5

d. Abrir las válvulas de otros gases, primero el aire luego el hidrogeno.

e. Con una solución de jabón o detergente. Verificar fugas de gases en todas las conexiones.

f. Encender el detector y obtener una línea de base estable.

Condiciones cromatográficas

Tº inicial del horno 55 ºC

Tº fi nal del horno 120 ºC

Ti empo inicial 3 min

(23)

Velocidad de calentamiento 10 ºC/min (RATE= rampa)

Tº inyector 200 ºC

Volumen de inyección 1µl

Modo de inyección Split

Radio Split 300

Velocidad inicial 32.9 cm/seg

Luego de establecidas las condiciones cromatográficas, se procede a la determinación de los parámetros de estudio

2.7.5. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS:

Preparar 8 tubos de ensayo con diferentes concentraciones de xilosa; para ello, diluir y utilizar la curva de calibración para azúcares reductores, determinando así la concentración en cada matraz.

Inocular los matraces con 1ml e incubar.

Utilizando la curva de calibración determinar a cabo de tiempos determinados la concentración final de las células.

Utilizando el modelo de Michaelis-Menten.

 







=

Determinamos los valores de 

Tabular S vs . Con la ecuación:





=





m













s

graficar y con la pendiente determinar

M

(24)

CRECIMIENTO CELULAR:

CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

Plan de Muestreos y R egi s tro de Datos

Grupo: __________________________________ Día: ___ /___ / ___ Día de la experiencia: __________________________________ Microorganismo: _______________ Fuente Carbono: _______________ PH0: _______ T°C _______ N rpm _______ N° HORA TIEMPO (Horas) Absorbancia (640 nm) Nombre del alumno Observaciones 01 0 Todos

(25)

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

Material Biológico: Cepa liofilizada de Pi chia stipitisNRRL Y-7124

 PREPARACIÓN DE SÓLIDO DE MANTENCIÓN:  Materiales y Equipos:

 Balanza analítica

 Matraz Erlenmeyer de 250 ml  Mechero Bunsen

 Gradilla

 6 Tubos de ensayo con tapas  Pipeta de 10 ml  Vaso de precipitado  Cocina a gas  Olla a presión  Varilla de vidrio  Guantes  Espátula  Reactivos y nutrientes:  Agua destilada  Extracto de levadura  Peptona  Extracto de malta  Agar

 PREPARACIÓN DE MEDIO DE ACTIVACIÓN:  Materiales y Equipos:

 Balanza analítica  2 Matraces de 125 ml

(26)

 Estufa  Algodón  Gasa  Varilla de vidrio  Espátula  Reactivos y nutrientes:  Xilosa  Extracto de levadura  Solución de sales  Agua destilada  Alcohol

 PREPARACIÓN DE MEDIO DE FERMENTACIÓN:  Materiales y Equipos:  Matraz de 500 ml  2 Matraces de 125 ml  Varilla de vidrio  Balanza analítica  Gasa y algodón  Olla a presión  Reactivos y nutrientes:  Xilosa  (NH4)2SO4  KH2PO4  MgSO4.7H2O  Solución de sales  Extracto de Levadura  Agua destilada  Alcohol

(27)

 INOCULACIÓN AL MEDIO DE ACTIVACIÓN:  Materiales y equipos  Matraz de 125 ml  Algodón  Gasa  Agua destilada  Asa bacteriológica  Shaker  Mechero Bunsen  Trípode  Rejilla

 DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO

DEL DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO)

 Materiales y equipos  Espectrofotómetro  Agitador magnético  Mechero Bunsen  Balanza analítica  Espátula

 Papel aluminio - capachitos  2 vasos de precipitados de 1 litro  Matraz aforado de 1 litro

 Pipeta  Gradilla

 Materiales y equipos

 10 g/l de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)  200 ml/l de NaOH 2N

(28)

IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS

DESARROLLO DEL INÓCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE Pichia stipitisNRRL Y-7124

FECHA ACTIVIDAD

02/05/17  Presentación del pre-informe.

05/05/17  Técnicas de asepsia, de esterilización de

medios, materiales de vidrio y equipos.

 Mantenimiento de cepas microbianas.

12/05/17  Preparación de reactivos y medios de

mantención.

 Resembrado de células.

 Obtención de curvas de calibrado de los

métodos analíticos.

19/05/17  Preparación de medios para el inóculo.

Cultivo de medio rico.

 Preparación de medios para la cinética celular

microbiana.

26/05/17  Seguimiento de la cinética de cultivo celular

por lotes.

(29)

PROGRAMACIÓN DE CINÉTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES:

ACTIVIDAD HORARIO

INICIO TÉRMINO

- Preparación de materiales de

trabajo para la inoculación en el medio de activación y medio de cultivo rico para la cinética de fermentación.

7:30 a.m. 8:00 a.m.

- Inoculación de la levadura Pichia stipitis NRRL Y-7124 desde la cepa en agar al medio de activación.

8:00 a.m. 8:10 a.m.

- Tiempo de referencia para que

se lleve a cabo la activación del inoculo en el medio de activación.

8:10 a.m. 11:10 a.m.

- Inoculación de medios para

cinética de fermentación.

11:10 a.m. 11:30 a.m.

- Seguimiento de la cinética de

fermentación a cada hora (registro de datos)

(30)

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap (2009) Biología de los microorganismos (2009), Duodécima Edición, Editorial Pearson.

Joao Paulo A. Silva, Solange I. Mussatto, Ines c. Roberto, José a. Teixeira, (2011)

Fermentation médium and oxygen transfer conditions that maximize the xylose conversión to etanol by Pichia stipitis.

Castillo, A. (2016) Cinética de procesos fermentativos, módulo de clase UNS.

Castillo, A. (2016) Balance de materia, diseños de medios y evaluación en bioprocesos, módulo de clase UNS.

(31)

VI. ANEXOS

CÁLCULOS PARA EL DISEÑO DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN

% del elemento en célula

Fórmula del microorganismo:

CH

_.

O

_.

N

_.

Peso molecular:

C: 12

= 12 

H: 1 ×1.79 = 1.79

O: 16 ×0.60=9.60

N: 14 ×0.17=2.38

25.77 ̅

Peso molecular: 25.77 g/mol

% de Carbono en célula

25.77⟶100%

12⟶

 = 12×100

_25.77

=.%

% de Nitrógeno en célula

25.77⟶100%

2.38⟶

 = 2.38×100

_25.77

=.%

El valor del resto de elementos se sacó de la siguiente tabla:

Tabla 6

Composición química de las células microbianas

ELEMENTO % EN PESO, BASE SECA

BACTERIAS LEVADURAS MOHOS Carbono Hidrógeno Oxígeno Nitrógeno Magnesio Fósforo Azufre 46 - 53 6.5 - 7.5 18 - 32 10 - 14 0.1 - 0.5 2.0 - 3.0 0.1 - 1.0 46-51 6-8 28-35 6-10 0.1-0.5 0.8-2.6 0.01-0.24 45 - 55 8 - 12 18 - 24 3 - 7 0.1 - 0.3 0.4 - 4.5 0.1 - 0.5

(32)

COMPUESTO Proteínas Carbohidratos Lípidos Ácidos nucleicos Cenizas 45-60 6-15 5-10 15-25 4-10 35-45 30-45 5-10 5-15 4-10 25 - 40 40 - 55 5 - 10 2 - 10 4 - 10

Nota. Recuperado de Balance de materia, diseño de medios y evaluación de cultivos en Bioprocesos. (Castillo, A., 2016)

% de Magnesio en célula:

.+.



=0.30%

% de Azufre en célula:

.+.



=0.13%

% de Potasio en célula:

.+.



=2.50%

% de Fósforo en célula:

.+.



=1.70%

% de Calcio en célula:

.+.



=0.20%

% de Hierro en célula:

.+.



=0.255

%

Para el resto de elementos, tales como: Cl, Zn, Cu, Co, B; se consideró un porcentaje del elemento en célula de 0.01%.