CONTROL DE LA BIOCONTAMINACIÓN EN AMBIENTES CLASIFICADOS

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CONTROL DE LA

BIOCONTAMINACIÓN EN

AMBIENTES CLASIFICADOS

Antonio Rodríguez Acosta

Facultativo Especialista Análisis Clínicos Responsable de Calidad

Unidad de Producción Celular HRU Carlos Haya (Málaga)

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1. Iniciativa Andaluza de Terapias Avanzadas

2. Plan general de control ambiental

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Impulsar el desarrollo y la traslación

clínica de nuevas terapias basadas

en los resultados de los 3 programas

de investigación relacionados

con las terapias avanzadas

PROGRAMA ANDALUZ DE

TERAPIA CELULAR Y

MEDICINA REGENERATIVA

GENÉTICA CLÍNICA Y

MEDICINA GENÓMICA

NANOMEDICINA

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UBICADOS EN CENTROS DE INVESTIGACIÓN:

CABIMER: acreditado.

LABORATORIO ANDALUZ DE REPROGRAMACIÓN CELULAR: en validación.

UBICADOS EN HOSPITALES:

Hospital Virgen de las Nieves: acreditado.

Hospital Reina Sofía: acreditado.

Hospital Carlos Haya : en validación.

UBICADOS EN BANCOS DE TEJIDOS:

Banco de Tejidos de

Málaga: acreditado.

Banco de Tejidos de Granada: en validación.

Banco de Tejidos de Sevilla: en validación.

Banco de Tejidos de Córdoba: en validación.

Laboratorios GMP Públicos de Terapia Celular en

ANDALUCÍA

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5

Plan General de

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CONTROL DE LA BIOCONTAMINACIÓN

Plan general de actuación

• Medicamentos usados en terapia celular: “fabricación aséptica” (media-

fill):

– carga microbiana del ambiente de fabricación: clave para garantizar la esterilidad de los productos fabricados.

• Biocontaminación: contaminación de materiales, equipos, superficies,

líquidos y gases con partículas viables.

• Control de la biocontaminación:

– establecer principios y metodología para controlar los niveles de contaminación microbiológica.

– definir las medidas de control adecuadas para disminuir el riesgo de contaminación.

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Plan general de actuación

Principales vías de entrada de microorganismos a las instalaciones:

– Personal:

• Partículas generadas por la descamación de la piel:

– personal de producción/control de calidad; – operarios de mantenimiento de instalaciones; – personal implicado en la cualificación de equipos; – operarios de limpieza.

• Comportamiento en el área clasificada – Materiales:

• introducción de materiales y reactivos; • introducción de equipos/instrumentos;

• actuaciones de mantenimiento en la instalación (sustitución de elementos).

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Plan general de actuación

Procedimientos que pueden afectar al nivel de biocontaminación

– entrada de personal y vestuario; – introducción de materiales;

– limpieza y desinfección de instalaciones y equipos; – métodos de control microbiológico del área clasificada.

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Principios generales

Control microbiológico

– identificación de riesgos para el producto; – probabilidad de que éstos ocurran;

– medidas de prevención y control;

– designación de las zonas de riesgo, determinación de los puntos y

procedimientos de muestreo;

– establecimiento de límites que aseguren el control microbiológico (niveles

de alerta y acción);

– medidas correctoras a realizar cuando se superen los niveles de alerta y acción.

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Principios generales.

Durante la puesta a punto de la instalación (condición “en reposo”) se establecerá un NIVEL BASAL DE CONTAMINACIÓN que posteriormente ha de ser monitorizado “en funcionamiento” con el fin de detectar aumentos en los niveles de contaminación.

Niveles de alerta y acción

– Nivel de “alerta”:

• ESTABLECIDO POR EL USUARIO;

• proporciona una alarma temprana ante el desvío de las condiciones normales;

• implica un aumento de la atención sobre el proceso.

– Nivel de “acción”:

• (ESTABLECIDO POR EL USUARIO); • requiere intervención inmediata;

• investigación de la causa;

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Metodología general control microbiológico

• Muestreo, incubación, recuento e identificación si procede de

partículas viables mediante:

– métodos adecuados;

– plan de muestreo preestablecido (puntos y frecuencia).

• Minimizar el riesgo de contaminación debido a los propios métodos de

muestreo.

• Preferible muestrear con la instalación “en funcionamiento” (equipos y personal realizando operaciones habituales).

• No debe comprometerse de ninguna manera las operaciones de fabricación ni poner en riesgo la calidad del producto.

• Las condiciones de muestreo (ej: número de operarios en la zona) deben quedar registradas o trazadas.

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Frecuencia de muestreo

• Ha de estar previamente establecida (ej: semanal y mensual) y

revisarse según sea necesario en los siguientes casos:

– superación reiterada de los niveles de alerta o de acción; – paradas prolongadas de las instalaciones;

– realización de trabajos de mantenimiento importantes en los sistemas de ventilación;

– obtención de resultados inusuales;

– cambios en los procedimientos de limpieza o desinfección;

– acontecimientos inesperados que puedan favorecer la biocontaminación.

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Identificación de las muestras

• Mantener la trazabilidad con la siguiente información:

– punto de muestreo; – fecha y hora;

– personal que realiza el muestreo;

– actividad realizada en la sala durante el muestreo;

– lote y medio de cultivo usado;

– equipos utilizados para el muestreo e incubación;

– desviaciones sobre el plan de muestreo.

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Procesamiento de muestras. Medios de cultivo.

• Medios de cultivo

• Condiciones de incubación

• No selectivos:

– capaces de soportar el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos; – medios con base tripticasa de soja son ampliamente aceptados (TSA y TSB).

• Garantizar la calidad de los medios empleados:

– especificaciones;

– certificados de análisis.

• Demostrar crecimiento según condiciones de incubación establecidas en

cada Unidad:

– ensayos de promoción de crecimiento.

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Procesamiento de muestras. Condiciones de incubación.

– Otras condiciones de incubación: siempre y cuando se demuestre que

proporcionan el ambiente adecuado para promover el crecimiento de los microorganismos presentes en la instalación.

– Sospecha microorganismos con necesidades exigentes de crecimiento:

medios de cultivo, períodos y condiciones de incubación adecuados.

– Control de estufas: las condiciones de incubación han estar monitorizadas.

– Observación periódica de las placas durante la incubación.

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– 2-5 días (30-35 ºC) bacterias;

– 5-7 días (20-25 ºC) hongos y levaduras

Generalmente aceptados cuando el número de partículas viables es pequeño.

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Recuento e Identificación de microorganismos aislados

• El nivel de caracterización dependerá de la criticidad del área clasificada:

– morfología celular mediante tinción de Gram (ej, áreas no críticas); – identificación a nivel de género y especie (áreas críticas).

• Los identificaciones obtenidas pueden ayudar a:

– evaluar procesos de limpieza y desinfección implantados (aparición de resistencias);

– identificar las posibles fuentes de contaminación.

• Si los resultados indican:

– superación de los límites establecidos;

– cambio en el estatus microbiológico de la instalación.

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ACCIONES CORRECTIVAS

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Métodos de control

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Métodos de control microbiológico

• Niveles de control :

– aire:

• muestreo pasivo: sedimentación de partículas viables;

• muestreo activo: volumétrico de aire por impacto de partículas viables en medios sólidos

;

– superficies; – (vestimenta); – (líquidos).

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Sedimentación de partículas viables.

• Microorganismos en ambiente: transportados por partículas de diferentes tamaños provenientes principalmente de:

» descamación de piel humana; » aerosoles (saliva) ;

» polvo.

• El tamaño de partícula determina la velocidad de sedimentación (media 0.46 cm/s, puede variar entre 0.2 y 3 cm/s* )

• Medida de la sedimentación de partículas viables sobre las superficies

Valoración directa de la probabilidad de contaminación del producto.

*W. Whyte and NDS Bell, “The prediction of airborne contamination of

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Sedimentación de partículas viables.

• Límites de aceptación (Anexo I, NCF):

• Placas de 90 mm de diámetro (64 cm2_).

• Deshidratación del medio por exposición al ambiente: reducción en la

viabilidad de los microorganismos (máxima exposición 4 horas).

• La contaminación del producto mediante partículas viables presentes en el ambiente es directamente proporcional a:

– área de la “boca” de los contenedores (ej, flask de cultivo);

– tiempo en que los contenedores están abiertos (tiempo de exposición); – calidad microbiológica del aire.

20

GRADO Ufc /placa de 90 mm

diámetro.

A < 1

B 5

C 50

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Sedimentación de partículas viables.

• Relacionando el área y tiempo de exposición del producto y placas de sedimentación se puede calcular la probabilidad de contaminación del producto:

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Sedimentación de partículas viables

.

• Ventajas:

– económico;

– monitorización de procesos: pueden colocarse muy próximas al área donde el producto está expuesto;

– no interfiere con el flujo de aire de la zona (monitorización en CFL, grado A); – riesgo bajo para la calidad del producto y la esterilidad del proceso;

– no es necesaria la participación de personal adicional.

• Inconvenientes:

– Debido a los bajos niveles de contaminación esperados, presenta poca sensibilidad, a menos que los períodos de muestreo sean amplios.

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Muestreo volumétrico de aire

23

• Recolección de partículas viables mediante un instrumento de muestreo

apropiado y de acuerdo con un plan de muestreo.

• Estimación de la cantidad de microorganismos suspendidos en el aire y por tanto nos proporciona una medida indirecta del riesgo de contaminación del

producto.

• Muestreador de aire: aspira e impacta (a velocidad de 11 m/s) todas las

partículas de tamaño superior a 1 μm sobre una superficie de agar nutritivo (también en medios líquidos).

GRADO Ufc permitidas/m3

A < 1

B 10

C 100

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Muestreo volumétrico de aire

24

• Volumen a muestrear: 1 m3_.

• Tamaño recomendado de las placas usadas: 90 mm de diámetro (64 cm2_).

• Corrección estadística de FELLER: a mayor cantidad de microorganismos,

mayor probabilidad de que penetren varios microorganismos por el mismo orificio de la tapa y se solapen las ufc que aparecen tras incubación.

• Muestrear desde las zonas de mayor a las de menor grado.

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Control microbiológico de superficies

• Objetivo: determinar la eficacia de los procedimientos de limpieza rutinarios • Fuentes de contaminación de superficies:

– sedimentación de partículas viables. – contacto directo con el operador.

• Los medios usados han de poseer agentes neutralizantes que inactiven los residuos de los productos de limpieza usados:

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GRADO Ufc /placa 55 mm

A < 1

B 5

C 25

D 50

Desinfectante Neutralizante

Fenólicos Polisorbato 80 (Tween 80)

Clorados Tiosulfato sódico

Iodados Tiosulfato sódico

Compuestos de amonio cuaternario Lecitina + Tween 80

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Control microbiológico de superficies

Muestreo con placas de contacto

• Se aplica un medio nutritivo sólido sobre una superficie de área conocida.

• Placas de 55 mm de diámetro (25 cm2₎ _{tipo RODAC (Replicate Organisms}

Detection And Counting).

• Las ufc obtenidas son una imagen de los microorganismos presentes en el área analizada.

• El medio nutritivo ha de estar en contacto con la superficie durante unos segundos, ejerciendo una presión uniforme en toda la placa y en ausencia de movimientos.

• Limpiar cuidadosamente con solución desinfectante (alcohol 70%) y toallita

estéril el área muestreada con el fin de eliminar los restos de medio de cultivo.

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Control microbiológico de superficies

Muestreo con hisopos

• Hisopos previamente humedecidos: muestreo de zonas irregulares o inaccesibles a las placas de contacto.

• Se han de realizar trazadas paralelas por la superficie que se desea analizar. Posteriormente se repite la operación en el mismo área y con el mismo hisopo pero con trazadas perpendiculares a las anteriores. El hisopo al mismo tiempo ha de rotarse.

• Posteriormente el hisopo se introduce en medio líquido y agita. Se realiza una siembra e incubación de este medio líquido en placas de medio sólido.

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Principales fuentes de biocontaminación

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Microorganismo Estado Principales fuentes de contaminación

Cocos gram +

(Micrococos) Formas vegetativas.

Partículas de descamación de la piel y aerosoles (tos).

Staphylococcus Formas vegetativas. Pelo, piel, heridas, abscesos, ropa y polvo.

Bacillus Formas vegetativas.

Esporas

Aire, polvo, cartón, papel, agua y ropa.

Hongos

filamentosos

Formas vegetativas.

Esporas

Suelo, polvo, cartón y papel.

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Conclusiones

• La función principal de la monitorización microbiológica es identificar

tendencias que sugieran una pérdida del control ambiental.

• Medidas para contener la contaminación:

– Entrenamiento y formación del personal. – Evitar acceso de personal no autorizado.

– Mantener en adecuado estado las instalaciones (filtros, temperatura, humedad, presiones).

– Correctas medidas de desinfección de materiales.

– Adecuado sistema de entrada y vestimenta del personal.

– Eficaz sistema de limpieza (personal entrenado y desinfectantes adecuados).

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Bibliografía

• ISO 14644: Cleanrooms and controlled environments:

– Part 1:Classsification of air cleanliness

– Part 2: Specifications for testing and monitoring

• ISO 14648: Cleanrooms and associated controlled environments. Biocontaminacion

control:

– Part 1: General principles and methods.

– Part 2: Evaluation and interpretation of biocontamination data.

• Guidelines on test methods for environmental monitoring for aseptic dispensing

facilities. Second edition.

• Garcia, Lynne S. (2010). Clinical Microbiology Procedures Handbook, Volumes 1-3 (3rd

Edition). American Society for Microbiology (ASM).

(http://www.knovel.com/web/portal/browse/display?_EXT_KNOVEL_DISPLAY_bookid=4194&VerticalID=0)

• WHYTE, W. In support of settle plates. PDA Journal of Pharmaceutical Science and

Technology, 50, pp. 201-204, 1996

• Evaluation of Irradiated Count-Tact 3P Performances bioMérieux Industry Culture

Media Group, Chemin de l’Orme, 69280 Marcy l’Etoile, France.